专利名称：：一种鸡肠道β防御素的氨基酸序列与多核苷酸序列及提取方法一种鸡肠道&防御素的氨基酸序列与多核苷酸序列及提取方法本发明涉及黏膜免疫和生物药物
技术领域：
，具体就是鸡肠道e防御素的氨基酸序列与多核苷酸序列。技术背景防御素(Defensins)是生物体在抵御病原微生物侵袭的防御反应过程中产生的一种基本物质，分子量一般在4KD-10KD之间，主要储存在细胞内的小襄泡内。(1)、防御素在机体的防御系统中起重要作用动物每天会直接接触、食入、吸入成千上万的病原微生物而不患感染性疾病，这种抵抗外来致病微生物的能力主要是通过天然免疫的防御机制得以实现的。防御素是所有物种中天然防御机制的重要组成部分，具有广谱的抗菌活性，能杀灭革兰氏阴性菌及阳性菌、真菌(包括酵母菌)、寄生虫、肿瘤细胞、以及一些胞膜病毒如艾滋病病毒、肝炎病毒等。机体容易接触外界环境中病原微生物的部位如皮肤、眼、耳、呼吸道上皮、泌尿生殖道上皮，消化道上皮中的防御素表达较高。防御素还具有提高动物免疫水平和特异性免疫抗体水平，调节雏鸡的生长发育。(2)、哺乳类和禽类防御素的区别根据自然界中防御素的半胱氨酸的排列顺序可以将防御素分成以下五类抗菌肽的分类<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>鸟类和哺乳类同属脊椎动物，然而鸟类和哺乳类在生活特点，解剖结构等方面存在着许多的不同之处。从防御素的分类及表达的物种可以看到，鸟类只表达p-防御素，缺少a-防御素，推测a-防御素的分化时间可能是在脊椎动物进化为哺乳类动物之后分化而来的，大约在310百万年前。(3)、防御素在机体天然免疫和获得性免疫中起桥梁作用防御素通过趋化作用参与机体的获得性免疫过程，实验证明a-防御素能够吸引T细胞，对之有趋化作用，使之回流至炎症部位，从而在细胞免疫反应中发挥作用。防御素的趋化作用有利于炎症效应细胞及效应分子向感染部位的回流，使机体能更有效的杀灭病原微生物。从另一方面来讲，防御素也是获得性免疫反应中效应细胞的重要活性介质。例如在B细胞能合成防御素，对入侵的病源微生物起直接杀菌作用，所以防御素介导天然免疫与机体获得性免疫，在机体抵御外来病源微生物的入侵中起着重要的作用。(4)、防御素有重要的应用价值防御素对很多病原微生物有杀灭作用，包括一些抗生素耐药株，它们能快速杀灭病原微生物而不易产生耐药的突变株，还能促进动物生长，诱导动物的获得性免疫。防御素与一些传统的抗生素、其他抗菌分子、溶菌酵有协同作用。因此更多的研究焦点是将其发展为新的抗微生物药，应用在治疗感染，食品防腐剂，饲料添加剂等领域。鸡在屠宰过程中肠道多被废弃，如何有效利用这些畜产品，变废为宝，是摆在我们面前的问题，目前对防御素的提取有硫酸铵沉淀法和乙酸浸提法。科学技术与工程，2003年第3巻第2期王可洲的《兔圆小囊组织中抗菌肽类物质的分离纯化及抗菌活性研究》介绍了从家兔圆小囊分离抗菌活性物质的方法，但不同动物的防御素差异很大，如何从鸡肠道提取防御素国内还未见报道。应用与环境生物学报，2003年第1期张希春，孙振钧，高锦，侯全民，林桂秋，禚如朋的《蚯蚓抗菌肽EABP-1的分离纯化及部分性质》介绍了经硫酸铵沉淀、超滤和阳离子交换分离，分离蚯蚓抗菌肽的方法。JournalofLeukocyteBiology,199456:661-665:EWEvans,GGBeach,JWunderlich,andBGHarmon,Isolationofantimicrobialpeptidesfromavianheterophils,介绍了从鸡白细胞乙酸提取抗菌肽的例子。由于鸡肠道组织结构复杂，杂蛋白种类繁多，因而采用上述分离纯化方法分离鸡肠道中的防御素不能达到满意的效果。
发明内容本发明的目的在于克服现有的的分离方法的分离效果差，提取率低的缺陷，提取鸡肠道防御素并进行鉴定，同时优化乙酸条件，找出最佳提取工艺，旨在为今后从屠宰鸡肠道中开发绿色环保型词料添加剂或抗微生物药物提供技术。本发明的另一个目在于提供一种新的抗菌物质，帮助解决现有抗生素对环境的危害和耐药性问题。本发明的进一步目是提供这种抗菌物质的氨基酸序列及其多核苷酸序列，提供在生物制药上应用的依据。本发明提供的抗菌物质防御素属于表达在鸡肠道中的防御素。本发明是这样实现的，一种鸡肠道(3-防御素cDNA，其特征在于具有如下序列，TCAGACAGCCAGCTGTGCAGGAACAACCATGGCCACTGCCGGAGGCTCTGCTTCCACATGGAGAGCTGGGCTGGGAGCTGCATGAACGGCCGCCTGCGCTGCTGCAGGTTCTCCACCAAGCAGCCCTTTTCCAACCCTAAACATTCAGTGCTGCACACAGCAGAGCAGGACCCTTCCCCAAGCCTTGGAGGGACGTGA。该p-防御素的氨基酸序列特征是Ser-Asp-Ser-Gln-LeuCys-Arg-Asn-Asn-HisGly-His-Cys-Arg-ArgLeu-Cys國Phe-His-MetGlu-Ser-Trp-Ala-GlySer-Cys-Met-Asn-GlyArg-Leu-Arg-Cys-CysArg-Phe-Ser-Thr-Lys-GlnPro-Phe-Ser-Asn-ProLys-His-Ser-Val-LeuHis-Thr-Ala-Glu國GlnAsp-Pro-Ser-Pro-SerLeu-Gly-Gly-Thr上述的鸡肠道(3-防御素的提取方法，包括以下步骤A、收集破碎鸡肠道黏膜细胞，B、之后破碎小囊泡C、5%乙酸搅拌浸^，离心，取上清，弃沉淀，上清液分装冻存，即为鸡肠道P-防御素粗提物？D、低温下将上清液上样于SephadexG-100凝胶柱，用0.2mol/L乙酸钠洗脱，恒流泵的速度为3xl，经核酸蛋白检测仪检测后自动收集器收集，每管1.5mL,记录仪记录(速度为6cm/h，量程20mv)，E、通过琼脂糖弥散方法检测各收集管液体对巴氏杆菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，真空冷冻干燥保存，F、有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化，蛋白条带电转印至PVDF膜，采用Sanger水解逐段分析法做氨基酸序列分析,G、BLAST软件推导鸡肠道P防御素cDNA序列，所述收集鸡肠道黏膜细胞是指，成年鸡肠道后段，去掉脂肪和内容物，称取10g黏膜并用灭菌生理盐水冲洗。根据表l的不同条件按1:20(W/V)比例加入5%乙酸冰水混合物，经组织捣碎机制成匀浆，IO(TC水浴lOmin,然后迅速冷却，8000r/min离心30min去除沉淀。破碎鸡肠道细胞是指，取鸡肠道后段，去脂肪和内容物，灭菌磷酸盐冲液(0.01Mol/L，PH7.0)清洗。按l:10(w/v)加入含有蛋白酶抑制剂的5%乙酸冰水混合物，低温充分破碎细胞。然后IO(TC水浴10min，迅速冷却至4。C条件下浸提24h，8000r/min离心30min，取上清。所述破碎小囊泡是指，将上清液置冰上超声波裂解30s，按1:1(v/v)加入含有蛋白酶抑制剂的5%乙酸冰水混合物，4'C搅拌浸提12h，8000r/min离心30min，取上清液，将沉淀物用等体积5%乙酸混合，再次搅拌浸提，离心取上清液。所述5%乙酸搅拌浸提，离心，取上清，弃沉淀，上清液分装冻存，即为鸡肠道P-防御素粗提物。是指上清液调pH值至6.0，然后离心，去掉沉淀，保留上清液，上清液分装冻存。所述将鸡肠道抗菌肽粗提物上样于SephadexG-100凝胶柱分离，是指低温下将上清液上样于10x300mmSephadexG-100柱，经核酸蛋白检测仪检测OD值，自动收集器收集各管液体，记录仪记录蛋白浓度和出现蛋白的时间。所述通过琼脂糖弥散方法检测各部分对巴氏杆菌的抗菌活性，具有抑菌作用的部分真空冷冻干燥保存。是指采用真空冷干燥方法保存有抑菌作用的洗脱液。所述有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化，蛋白条带电转印至PVDF膜，釆用Sanger水解逐段分析法做氨基酸序列分析。是指有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化，浓縮胶为6%丁3%<:，分离胶为16。/。T6。/。C，电压80v，电泳3.5h，并对电泳凝胶条带进行分子量分析，小于10ku蛋白条带电转印至PVDF膜，采用Sanger水解逐段分析出Ser-Asp-Ser-Gln-LeuCys-Arg-Asn-Asn-HisGly-His-Cys-Arg-ArgLeu-Cys-Phe-His-MetGlu-Ser-Trp-Ala-GlySer-Cys-Met-Asn-GlyArg-Leu-Arg-Cys-CysArg-Phe-Ser-Thr-Lys-GinPro-Phe-Ser-Asn-ProLys-His-Ser-Val-LeuHis-Thr-Ala-Glu-GlnAsp-Pro-Ser-Pro-SerLeu-Gly-Gly-Thr氨基酸序列。本发明提供的防御素作用具有体外抗巴氏杆菌、致病性大肠杆菌、葡萄球菌等效果，体外对新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒有抑制作用。雏鸡饮水中添加防御素能够提高雏鸡免疫水平和传染性法氏囊疫苗的抗体水平，调节雏鸡的生长发育的功能。本发明的积极效果是1)本发明提供的防御素以新型、高效、天然、无毒、无污染、无残留、无副作用为特点，属于新型的绿色抗微生物药物，这正是绿色药业发展的需要。2)本发明提供的防御素属于天然提取物，在功能上具有广谱抗菌、抗病毒；不产生耐药性，并具有免疫调节作用。3)本发明提供的防御素原料来源丰富，成本低。其原料来自鸡的屠宰加工废弃物，使废弃物高值化利用。因此，本项研究还具有重要的公共卫生学意义，符合构建节约型社会的理念。4)本方法经超声波充分破碎小囊泡，用含有蛋白酶抑制剂的5%乙酸，低温搅拌浸提后，大大提高了提取效率。本发明优化了防御素的分离纯化方法。5)1ug/mL的该防御素可调节动物免疫功能，包括促进中枢免疫功能，增强疫苗的免疫效果。6)该防御素对多种细菌病毒有明显的抑制或杀灭作用，如对多杀性巴氏杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、新城疫病毒、传染性法氏囊炎病毒等均有抑制或杀灭作用，最低杀死细菌浓度0.16mg/mL。具体检测实验方法如下采用微量肉汤稀释法稀释防御素首先用无菌蒸馏水将防御素溶解制成12.8mg/mL的储备液，然后用等量无菌的0.02%乙酸(含0.4%BSA)稀释，再用0.0P/。乙酸(含0.2。/。BSA)溶液对等量稀释后的溶液再进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为6.4、3.2、1.6、0.8mg/mL的系列稀释液，4'C保存备用。将复壮后的巴氏杆菌用灭菌肉汤稀释至105CFU/mL，向无菌的96孔聚丙烯平板的各孔加入100pL的菌液，然后分别逐一加入相应的待测防御素llpL，这样待测防御素的终质量浓度分别为0.64、0.32、0.16、0.08mg/mL，密封好，37°C90r/min培养1824h。同时设阳性对照孔100pL菌液+ll^L青霉素(0.625mg/ml);阴性对照孔lllpL营养肉汤；空白对照lllpL菌液。用酶标仪在492mti下对平板进行扫描，的的最小抑菌浓度以低于空白对照孔的浑浊程度50%的最小质量浓度计算。0.160.32mg/mL的防御素低于空白对照孔(菌液)的浑浊程度50%，即此防御素的最低杀死细菌浓度0.16mg/mL。图1琼脂糖弥散方法检测此防御素纯化洗脱液对巴氏杆菌的抑菌作用；具体实施方式本发明提供了一种防御素的氨基酸序列及其多核苷酸序列，以及该防御素的用途。能够合成有活性的该防御素氨基酸序列Ser-Asp-Ser陽Gln-LeuCys-Arg國Asn-Asn-HisGly-His-Cys-Arg-ArgLeu-Cys-Phe-His-MetGlu-Ser-Trp-Ala-GlySer-Cys-Met-Asn-GlyArg-Leu-Arg-Cys-CysArg-Phe-Ser-Thr-Lys-GlnPro-Phe-Ser-Asn-ProLys-His-Ser-Val-LeuHis-Thr-Ala-Glu-GlnAsp-Pro-Ser-Pro隱SerLeu-Gly-Giy-Thr该防御素cDNA序列为TCAGACAGCCAGCTGTGCAGGAACAACCATGGCCACTGCCGGAGGCTCTGCTTCCACATGGAGAGCTGGGCTGGGAGCTGCATGAACGGCCGCCTGCGCTGCTGCAGGTTCTCCACCAAGCAGCCCTTTTCCAACCCTAAACATTCAGTGCTGCACACAGCAGAGCAGGACCCTTCCCCAAGCCTTGGAGGGACGTGA。鸡肠道P防御素的提取方法，包括以下步骤步骤一，成年鸡肠道后段，去掉脂肪和内容物，称取10g黏膜并用灭菌生理盐水冲洗。根据表1的不同条件按1:20(W/V)比例加入5%乙酸冰水混合物，经组织捣碎机制成匀浆，IO(TC水浴10min，然后迅速冷却，8000r/min离心30min去除沉淀。歩骤二，将上清液置冰上超声波裂解30s，按l:1(Wv)加入含有蛋白酶抑制剂的5%乙酸冰水混合物，4。C搅拌浸提过夜，8000r/min离心30min，取上清液。步骤三，将沉淀物用等体积5%乙酸混合，再次搅拌浸提，离心取上清液。合并两次上清液，调整pH值至6.0，8000r/min离心30min,保留上清液。步骤四，低温下将上清液上样于SephadexG-100凝胶柱，用0.2mol/L乙酸钠洗脱，恒流泵的速度为3xl，经核酸蛋白检测仪检测后自动收集器收集，每管1.5mL，记录仪记录(速度为6cm/h，量程20mv)。步骤五，通过琼脂糖弥散方法检测各收集管液体对巴氏杆菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，真空冷冻干燥保存。步骤六，有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化，浓縮胶为6。/。T3。/。C，分离胶为16%T6%C，电压80v，电泳3.5h，并对电泳凝胶条带进行分子量分析，小于10ku蛋白条带电转印至PVDF膜，采用Sanger水解逐段分析法做氨基酸序列分析。得到鸡肠道e防御素成熟片段氨基酸序列(中国科学院过程研究所Sanger水解逐段分析法)Ser-Asp-Ser-Gln-LeuCys-Arg-Asn-Asn-HisGly-His-Cys墨Arg-ArgLeu-Cys國Phe-His-MetGlu-Ser-Trp-Ala-GlySer-Cys陽Met-Asn-GlyArg-Leu-Arg-Cys-CysArg-Phe-Ser陽Thr-Lys-GlnPro-Phe-Ser-Asn-ProLys-His-Ser-Val-LeuHis-Thr-Ala-Glu-GlnAsp-Pro-Ser-Pro-SerLeu-Gly-Gly-Thr步骤七，BLAST软件推导鸡肠道e防御素cDNA序列TCAGACAGCCAGCTGTGCAGGAACAACCATGGCCACTGCCGGAGGCTCTGCTTCCACATGGAGAGCTGGGCTGGGAGCTGCATGAACGGCCGCCTGCGCTGCTGCAGGTTCTCCACCAAGCAGCCCTTTTCCAACCCTAAACATTCAGTGCTGCACACAGCAGAGCAGGACCCTTCCCCAAGCCTTGGAGGGACGTGA以下内容来自试验报告，用于说明本专利。1:防御素的最低杀死细菌浓度测定方法如下采用微量肉汤稀释法稀释防御素首先用无菌蒸馏水将防御素溶解制成12.8mg/mL的储备液，然后用等量无菌的0.02%乙酸(含0.4%BSA)稀释，再用0.01%乙酸(含0.2%83八)溶液对等量稀释后的溶液再进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为6.4、3.2、1.6、0.8mg/mL的系列稀释液，4'C保存备用。将复壮后的巴氏杆菌用灭菌肉汤稀释至10SCFU/mL，向无菌的96孔聚丙稀平板的各孔加入100hL的菌液，然后分别逐一加入相应的待测防御素llnL，这样待测防御素的终质量浓度分别为0.64、0.32、0.16、0.08mg/mL，密封好，37°C90r/min培养1824h。同时设阳性对照孔100pL菌液+lliaL青霉素(0.625mg/ml);阴性对照孔lllpL营养肉汤；空白对照lllpL菌液。用酶标仪在492nm下对平板进行扫描,的的最小抑菌浓度以低于空白对照孔的浑浊程度50%的最小质量浓度计算。0.160.32mg/mL的防御素低于空白对照孔(菌液)的浑浊程度50%，即此防御素的最低杀死巴氏杆菌浓度0.16mg/mL。其他防御素抑制致病微生物浓度结果见表1。表1本发明提供的防御素抑制致病微生物浓度(mg/mL)多杀性巴氏杆菌大肠杆菌新城疫病毒传染性法氏囊炎病毒最低抑制浓度0.160.320.160.642:鸡肠道P防御素提取优化试验采用两因素，素及水平见表2，试验重复3次。提取时间、提取温度交叉分组设计，浸提试验因9表2乙酸浸提试验因素及水平<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>防御素的浸提工艺试验结果与分析防御素的活性是根据其抑制细菌生长能力来检测的，用的最小抑菌浓度计算抗菌肽的有效质量，然后推算提取率。从试验结果可知(如下表3)，温度和乙酸提取时间均对防御素的提取有极显著的影响(尸O.Ol)，其中温度因素为较优因素，对防御素的提取影响更大。在所设水平条件下，随着温度的升高，防御素的提取率降低，这主要是防御素虽然对热有一定的耐受性，但易被蛋白酶降解，提取温度升高，酶的活性增强，抗菌肽被酶分解的增多。在4t:条件下，提取率随时间的延长而增大，主要是因为防御素储存在细胞内的小囊泡内，需充分破碎细胞和小囊泡才能浸提出来，浸提时间大于24h，提取率虽有提高但影响较小。较优条件是B,A2，即4'C条件下浸提24h。表3乙酸浸提方案与结果分析<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3:抗菌活性的检测，在直径为10cm的平皿内倾倒一层琼脂(含1.2°/。琼脂糖、0.03%营养肉汤粉，pH值为6.0)以及调整好浓度的处于对数生长期的巴氏杆菌，使琼脂内的细菌终浓度为106CFU/mI，倾注厚度为1.5mm，待琼脂冷却凝固后，在琼脂板上打直径为3mm的圆孔，在孔中加入上述分离过程所得到的不同阶段的抗菌肽，每孔上样量为15^1，将平皿倒置于37"C培养18h，以确定不同分离阶段样品的抗菌活性。如图1可以看出防御素纯化洗脱液对巴氏杆菌的抑菌作用表现在标号7—10孔，有透亮清晰的抑菌环。4:如表4可以看出雏鸡免疫传染性法氏囊炎疫苗后血清中传染性法氏囊炎病毒抗体滴度是怎样变化的。为观察防御素与疫苗是否有协同作用，选取90只1日龄健康罗曼褐商品雏鸡，随机分为两组，每组45只(1)防御素组，从1日龄饮水中开始加入防御素，防御素终浓度为lpg/ml.(2)对照组，饮水不加防御素。两组雏鸡隔离饲养，所有雏鸡自由饮水采食。雏鸡在20日龄时，两组雏鸡均经滴鼻、点眼各1滴接种鸡传染性法氏囊中等毒力活疫苗。防御素组，对照组雏鸡于法氏囊疫苗接种后第14、21、28和35天，每组随机抽取5只雏鸡，收集血清，低温保存备检，然后血清进行传染性法氏囊疫苗抗体反应分析。在疫苗免疫后选取一些时间点观察两组雏鸡血清中传染性法氏囊炎疫苗抗体滴度的变化。结果见下表，由结果可见在实验的观察期间，即疫苗免疫后14~35天，防御素组雏鸡血清中传染性法氏囊炎疫苗抗体水平高于对照组，并且在第21天明显高于对照组，且差异显著(P<0.05)。防御素能够提高雏鸡血清中传染性法氏囊炎疫苗抗体滴度的变化。表4雏鸡免疫传染性法氏囊炎疫苗后血清中传染性法氏囊炎疫苗抗体滴度的变化(490nmOD)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>5:下表5是此防御素对鸡免疫器官抗体生成细胞的影响为研究此防御素是否对雏鸡系统免疫有影响，选取90只1日龄健康罗曼褐商品雏鸡，随机分为两组，每组45只(1)防御素组，从l日龄饮水中开始加入防御素，防御素终浓度为lpg/ml.(2)对照组，饮水不加防御素。两组雏鸡隔离词养，所有雏鸡自由饮水采食。防御素组、对照组雏鸡于l、4、7、10、17日龄，每组随机抽取5只雏鸡称重，采取法氏囊，然后固定在多聚甲醛-戊二醛中低温保存备检。在l、4、7、10、17日龄采用间接免疫组织化学方法对雏鸡法氏囊中IgG和IgM抗体生成细胞数量进行了检测。法氏囊内抗体生成细胞数量统计结果见表5，防御素组417日龄雏鸡法氏囊的IgG和IgM生成细胞的数量高于对照组雏鸡，其中4日龄雏鸡法氏囊的IgG生成细胞的数量明显高于对照组0PO.05)，7日龄雏鸡法氏囊的IgM生成细胞的数量明显高于对照组，且差异显著(尸<0.05)。表明防御素能够提高雏鸡法氏囊抗体生成细胞数量。表5Gal-13对雏鸡法氏囊抗体生成细胞数量的影响(Xl(^个细胞/mm2)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>一种鸡肠道e防御素的氨基酸序列与多核苷酸序列表电子文件<110>杨玉荣姜义宝梁宏德王平利焦喜兰"20〉一种鸡肠道P防御素的氨基酸序列与多核苷酸序列<<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>ArgLeuArgCysCysArgPheSerThrLysGinProPheSerAsn354045ProLysHisSerValLeuHisThrAlaGluGinAspProSerPro505560SerLeuGlyGlyThr6权利要求1.一种鸡肠道β-防御素cDNA，其特征在于具有如下序列，TCAGACAGCCAGCTGTGCAGGAACAACCATGGCCACTGCCGGAGGCTCTGCTTCCACATGGAGAGCTGGGCTGGGAGCTGCATGAACGGCCGCCTGCGCTGCTGCAGGTTCTCCACCAAGCAGCCCTTTTCCAACCCTAAACATTCAGTGCTGCACACAGCAGAGCAGGACCCTTCCCCAAGCCTTGGAGGGACGTGA。2、如权利要求i所述的鸡肠道e-防御素，其特征在于该e-防御素的氨基酸序列特征是Ser-Asp-Ser-Gln-LeuCys-Arg-Asn-Asn-HisGly-His-Cys-Arg-ArgLeu-Cys-Phe-His-MetGlu-Ser-Trp-Ala-GlySer-Cys-Met-Asn-GlyArg-L>eu-Arg~Cys-CysArg-Phe—Ser—Thr—Lys—GinPro—Phe—Ser—Asn—ProLys—His—Ser—Val—LeuHis-Thr-Ala-Glu-GinAsp-Pro-Ser-Pro-SerLeu-Gly-Gly-Thr。3、如权利要求l所述的鸡肠道e-防御素的提取方法，其特征在于包括以下步骤A、收集破碎鸡肠道黏膜细胞，B、之后破碎小囊泡，c、5%乙酸搅拌浸提，离心，取上清，弃沉淀，上清液分装冻存，即为鸡肠道e-防御素粗提物，D、低温下将上清液上样于S印hadexG-100凝胶柱，用0.2mo1/L乙酸钠洗脱，恒流泵的速度为3X1，经核酸蛋白检测仪检测后自动收集器收集，每管1.5mL,记录仪记录(速度为6cra/h，量程20mv)，E、通过琼脂糖弥散方法检测各收集管液体对巴氏杆菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，真空冷冻干燥保存，F、有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化,蛋白条带电转印至PVDF腠，采用Sanger水解逐段分析法分析出Ser-Asp-Ser-Gln-LeuCys-Arg-Asn-Asn-HisGly-His-Cys-Arg-ArgUu-Cys-Phe-His-MetGlu-Ser-Trp-Ala-GlySer-Cys-Met-Asn-GlyArg-Leu-Arg-Cys-CysArg-Phe-Ser-Thr化ys-GlnPro-Phe-Ser-Asn-ProLys-His-Ser-Val-LeuHis-Thr-Ala-Glu-GlnAsp-Pro-Ser-Pro-SerUu-Gly-Gly-Thr氨基酸序列，G、BLAST软件推导鸡肠道e防御素cDNA序列。4、如权利要求3所述的鸡肠道e-防御素的提取方法，其特征在于所述收集鸡肠道黏膜细胞是指，成年鸡肠道后段，去掉脂肪和内容物，称取10g黏膜并用灭菌生理盐水冲洗。根据表l的不同条件按1:20(W/V)比例加入59i乙酸冰水混合物，经组织捣碎机制成匀桨，IOO'C水浴10min，然后迅速冷却，8000r/min离心30min去除沉淀。5、如权利要求3所述的鸡肠道e-防御素的提取方法，其特征在于破碎鸡肠道细胞是指，取鸡肠道后段，去脂肪和内容物，灭菌磷酸盐冲液(o.oiMoi/L,ra7.0>清洗。按1:i()u/v)加入含有蛋白酶抑制剂的5%乙酸冰水混合物，低温充分破碎细胞。然后ioox:水浴10min，迅速冷却至4lC条件下浸提24h，8000r/min离心30min，取上淸。6、如权利要求3所述的鸡肠道防御素的提取方法，其特征在于所述破碎小囊泡是指，将上清液置冰上超声波裂解30s,按1:1(v/v)加入含有蛋白酶抑制剂的5%乙酸冰水混合物，4TC搅拌浸提12h，8000r/min离心30min，取上清液，将沉淀物用等体积594乙酸混合，再次搅拌浸提，离心取上清液。7、如权利要求3所述的鸡肠道e-防御素的提取方法，其特征在于所述5%乙酸搅拌浸提，离心，取上清，弃沉淀，上清液分装冻存，即为鸡肠道e-防御素粗提物。是指上淸液调pH值至6.0，然后离心，去掉沉淀，保留上清液，上清液分装冻存。8、如权利要求3所述的鸡肠道P-防御素的提取方法，其特征在于所述将鸡肠道抗菌肽粗提物上样于S印hadexG-100凝胶柱分离，是指低温下将上淸液上样于10X300mmS印hadexG-100柱，经核酸蛋白检测仪检测OD值，自动收集器收集各管液体，记录仪记录蛋白浓度和出现蛋白的时间。9、如权利要求3所述的鸡肠道e-防御素的提取方法，其特征在于所述通过琼脂糖弥散方法检测各部分对巴氏杆菌的抗菌活性，具有抑菌作用的部分真空冷冻干燥保存；是指采用真空冷干燥方法保存有抑菌作用的洗脱液:所述有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化，蛋白条带电转印至PVDF膜，采用Sanger水解逐段分析出Ser-Asp-Ser-Gin-LeuCys_Arg-Asn_Asn-HisGly-His-Cys-Arg-ArgLeu-Cys-Phe-His—MetGlu-Ser-Trp-Ala-GlySer-Cys-Met-Asn-GlyArg化eu-Arg-Cys-CysArg-Phe-Ser-Thr化ys-GlnPro-Phe-Ser-Asn-ProLys-His-Ser-V3l-LeuHis-Thr-Ala-Glu-GinAsp-Pro-Ser-Pro-SerLeu~01y-Gly-Thr氨基酸序列是指有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化，浓縮胶为6%T3%C，分离胶为16%T6%C，电压80v,电泳3.5h，并对电泳凝胶条带进行分子量分析，小于10ku蛋白条带电转印至PVDF膜，采用Sanger水解逐段分析出Ser-Asp-Ser-Gin-LeuC:ys-Arg-Asn-Asn-HisGly-His-Cys-Arg-ArgLeu-Cys-Phe-His-MetGlu-Ser-Trp-Aia-G].ySer-Cys-Met-Asn-GlyArg化eu-Arg-Cys-CysArg-Phe-Ser-Thr-Lys-GlnPro-Phe-Ser-Asn-ProLys-His-Ser-Val-LeuHis-Thr-Ala-Glu-GlnAsp~Pro-'Ser-Pro-SerLeu-Gly-Gly-Thr氨基酸序列。10、如权利要求3所述的鸡肠道e-防御素的提取方法，其特征在于所述收集鸡肠道黏膜细胞是指，成年鸡肠道后段，去掉脂肪和内容物，称取10g黏膜并用灭菌生理盐水冲洗。根据表l的不同条件按1:20(W/V)比例加入5%乙酸冰水混合物，经组织捣碎机制成匀浆，100"C水浴10min，然后迅速冷却，8000r/min离心30min去除沉淀；破碎鸡肠道细胞是指，取鸡肠道后段，去脂肪和内容物，灭菌磷酸盐冲液(0.01Mol/L，PH7.0)清洗。按l:10(w/v)加入含有蛋白醸抑制剂的5%乙酸冰水混合物，低温充分破碎细胞。然后100t:水浴10min,迅速冷却至4TC条件下浸提24h，8000r/min离心30min，取t清-k述破碎小囊泡是指，将上清液置冰上超声波裂解30s,按1:1(v/v)加入含有蛋白酶抑制剂的5%乙酸冰水混合物，4X:搅拌浸提12h，8000r/min离心30min，取上清液，将沉淀物用等体积5%乙酸混合，再次搅拌浸提，离心取上清液'所述5%乙酸搅拌浸提，离心，取上清，弃沉淀，上清液分装冻存，即为鸡肠道e-防御素粗提物。是指上清液调pH值至6.0,然后离心，去掉沉淀，保留上清液，上清液分装冻存;所述将鸡肠道抗菌肽粗提物上样于S印hadexG-100凝胶柱分离，是指低温下将上清液上样于10X300咖S印hadexG-100柱，经核酸蛋白检测仪检测0D值，自动收集器收集各管液体，记录仪记录蛋白浓度和出现蛋白的时间；所述通过琼脂糖弥散方法检测各部分对巴氏杆菌的抗菌活性，具有抑菌作用的部分真空冷冻千燥保存。是指采用真空冷干燥方法保存有抑菌作用的洗脱液；所述有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化，蛋白条带电转印至PVDF膜，采用Sanger水解逐段分析法做氨基酸序列分析。是指有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化，浓縮胶为696T39bC，分离胶为16%T6%C，电压80v，电泳3.5h,并对电泳凝胶条带进行分子量分析，小于10ku蛋白条带电转印至PVDF膜，采用Sanger水解逐段分析出S(;r-Asp-.Ser-Gln-LeuCys-Arg-Asn-Asn-HisGly-His-Cys-Arg-ArgLeu-Cys-Phe-His-Met(.;lu-Ser-Trp-Ala-GlySer-Cys-Met-Asn-GlyArg化eu-Arg-Cys-CysArg-Phe-Ser-Thr-Lys-GlnPro-Phe-Ser-Asn-ProLys-His-Ser-Val-LeuHis-Thr-Ala-Glu-GinAsp-Pro-Ser-Pro-SerLeu-Gly-Gly-Thr氨基酸序列。全文摘要一种鸡肠道β-防御素cDNA，其特征在于具有如下序列，TCAGACAGCCAGCTGTGCAGGAACAACCATGGCCACTGCCGGAGGCTCTGCTTCCACATGGAGAGCTGGGCTGGGAGCTGCATGAACGGCCGCCTGCGCTGCTGCAGGTTCTCCACCAAGCAGCCCTTTTCCAACCCTAAACATTCAGTGCTGCACACAGCAGAGCAGGACCCTTCCCCAAGCCTTGGAGGGACGTGA。该β-防御素的氨基酸序列特征是Ser-Asp-Ser-Gln-LeuCys-Arg-Asn-Asn-HisGly-His-Cys-Arg-ArgLeu-Cys-Phe-His-MetGlu-Ser-Trp-Ala-GlySer-Cys-Met-Asn-GlyArg-Leu-Arg-Cys-CysArg-Phe-Ser-Thr-Lys-GlnPro-Phe-Ser-Asn-ProLys-His-Ser-Val-LeuHis-Thr-Ala-Glu-GlnAsp-Pro-Ser-Pro-SerLeu-Gly-Gly-Thr。其提取方法，包括以下步骤A.收集破碎鸡肠道黏膜细胞，B.之后破碎小囊泡。C.5％乙酸搅拌浸提，离心，取上清，弃沉淀，上清液分装冻存，即为鸡肠道β-防御素粗提物。D.低温下将上清液上样于SephadexG-100凝胶柱，用0.2mol/L乙酸钠洗脱，恒流泵的速度为3×1，经核酸蛋白检测仪检测后自动收集器收集，每管1.5mL，记录仪记录(速度为6cm/h，量程20mv)。E.通过琼脂糖弥散方法检测各收集管液体对巴氏杆菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，真空冷冻干燥保存。F.有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化，蛋白条带电转印至PVDF膜，采用Sanger水解逐段分析法做氨基酸序列分析。G.BLAST软件推导鸡肠道β防御素cDNA序列。文档编号C12N15/12GK101210243SQ20061012846公开日2008年7月2日申请日期2006年12月26日优先权日2006年12月26日发明者姜义宝,杨玉荣,梁宏德,焦喜兰,王平利申请人:河南农业大学