专利名称：花生△12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法
技术领域：
本发明属于遗传工程，尤其涉及一种花生A12脂肪酸脱氢酶基因高效表达 的方法。
背景技术：
花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一，其种子中富含油酸和亚 油酸。A12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是亚油酸合成的关键酶，催化油酸(18: 1)在 A12位上脱氢生成亚油酸(18: 2)，其一般存在于植物细胞的内质网和叶绿体 膜上。不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸等，在增加膜的流动性中发挥重要作用， 通过改变脂肪酸脱氢酶的活性，调节膜脂的不饱和程度，增加生物体抗盐和抗 寒能力。随着人们对高品质植物油的需求增加，利用基因工程手段调节不饱和 脂肪酸含量的研究受到越来越多的关注。但由于A12脂肪酸脱氢酶本身的特性， 目前还没有有效的方法将其纯化并在蛋白水平作进一步的研究，尚需对其结构 和功能之间以及表达调控进行更深入全面的研究。发明内容本发明的目的是提供花生A12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案 一种花生A12脂肪酸脱氢酶 基因高效表达的方法，是把花生A12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因全长序列插入到 大肠杆菌表达载体pRSETB中，构建融合表达载体pRSET/HO-A，并转化到大 肠杆菌表达菌BL21 (DE3)pLysS中，最后进行IPTG诱导表达。在构建融合表达载体pRSET/HO-A的过程中，先把FAD2基因进行RT-RCR 扩增，目的片段连接入克隆载体pMD18，转化大肠杆菌DH5，获得阳性克隆 pMD/H0-A，最后将pMD/HO-A与表达载体pRSETB连接。在进行IPTG诱导表达的过程中，含有pRSET/HO-A质粒的BL21 (DE3) pLysS单菌落在培养基中振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度 为0.8 1.2mM， 22。C再继续培养10~15h。在进行IPTG诱导表达的过程中，含有pRSET/HO-A质粒的BL21 (DE3) pLysS单菌落在培养基中振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度 为lmM， 22。C再继续培养12h。在上述技术方案中，发明人釆用了pRSET表达载体，PRSET表达系统是源 于PUC19的高拷贝质粒，能产生是pET表达量5倍的基因剂量，从而导致大量
重组蛋白的融合表达。表达载体pRSET包含T7启动子，可通过表达菌株所产 生的T7 RNA聚合酶进行有效的转录，目的基因可插入其6XHis标签下游，形 成N末端融合蛋白，6Xhis标签序列通常不影响表达产物的生物学活性，并且还 可以方便地进行融合蛋白的分离与纯化。另外，表达菌株BL21 (DE3) pLysS 含有pLysS质粒，能降低靶基因的背景但并不干扰由IPTG诱导的表达水平，能 降低外源蛋白对自身的毒害，保持质粒的稳定性。经检测证明，A12脂肪酸脱 氢酶基因获得了稳定表达，表达量高达15.8%，这也是目前所知的脂肪酸脱氢酶 基因在原核生物中的最高表达量。
图1为融合表达载体pRSET/HO-A构建图。图2为A12脂肪酸脱氢酶在大肠杆菌中表达产物的SDSXPAGE分析，其 中A:蛋白标准条带，B: pRESTB空载体，C-D:包涵体蛋白，E-G:可溶蛋白 分别在30°C、 22°C和18°C， H: 22"条件下的总细胞菌蛋白；箭头所指为目的蛋白。图3脂肪酸甲酯的气相色谱和气相色谱/质谱分析图，其中A:油酸甲酯标 准品，B:脂肪酸甲酯分析。
具体实施方式
如图1所示，根据FAD2同源基因序列简并引物，在其两端各加一个特异 酶切位点EcoRI、 BamHI，以花生总RNA为模板进行RT-RCR扩增，获得一条 约1200bp的片段，连接入克隆载体pMD18,转化大肠杆菌DH5，挑取阳性克 隆进行测序，结果显示该核苷酸序列包含一个1140bp的ORF，该序列递交 GenBank，获得接收号为AY900663，命名为pMD/HO-A。将pMD/HO-A和表达 载体pRSETB分别用EcoRI、 BamHI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回 收1140bp目的条带和表达载体2900bp片段，将其按5: 1比例16C连接过夜后， 取lOpl转化大肠杆菌ToplO，次日PCR检菌，鉴定为阳性克隆的单菌落用质粒 提取Kit提取质粒，酶切鉴定正确的质粒进行测序，确定目的基因在pRSETB 中正确的读码框和插入方向。最后将正确的重组质粒转化入表达菌株BL21 (DE3) pLysS中。感受态细胞制备采用Sangon高效感受态细胞转化Kit，重组 质粒的转化、酶切鉴定及阳性克隆的筛选按常规分子生物技术进行。重组质粒 命名为pRSET/HO-A。挑取含有pRSET/HO-A质粒的BL21 (DE3) pLysS单菌落在3ml LB培养基 中活化14h后，按2%接种到20ml培养基中，培养基中加Amp、 Chl抗生素， 振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为lmM， 22。C再继续培养
12h，培养液在4。C温度下经5000rpm离心10min收集菌体。菌体置于-7(TC中保存备用。冷冻的菌体加100.ul 、 20mM 、 pH=7.0的磷酸盐缓冲液，充分悬浮，液 N2速冻后42匸融化，反复冻融4次后，8000rpm 4"C离心5min，取上清液入另 一千净离心管中，分别加100|il 2xSDS-PAGE buffer,取等量蛋白进行 12。/。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白电泳图通过凝胶成像仪进行分析。如 图2所示，可以清楚地看到大小约为43KD的目的蛋白条带，重组质粒 pRSET/HO-A转化的BL21 (DE3) pLysS细胞总蛋白、上清和沉淀中均有相同 大小特异条带，但在空载体中没有相应的目的蛋白条带的表达。初步说明可能 是目的基因的重组蛋白获得了表达；并且大部分是可溶蛋白。凝胶成像仪扫描 分析表明，目的蛋白的表达量约占总蛋白表达量的15.8%。采用Clon-Tech蛋白纯化Kit将重组蛋白纯化，向纯化出来的蛋白中加入底 物油酸和亮胰蛋白酶肽后，在2(TC摇床培养6h，用等体积的氯仿、水与甲醇的混合物抽提，混合物中氯仿甲醇水=2: 1: 2，取氯仿层，加入等体积1%H2S04-甲醇进行甲基化处理，55。C水浴6h后，加入正已烷回溶。以亚油酸甲酯(Sigma) 标准品、空载体转化的大肠杆菌细胞作为对照进行GC分析，如图3所示，只有 前者产生保留时间为8.440min的特殊峰(B)，与亚油酸甲酯标准品的保留时间 -致，而在其他对照中没有出现相应的峰。脂肪酸甲酯的GC-MS定性分析表明 通过NIST/EPA/NIH数据库的计算机检索，特殊峰为亚油酸甲酯，分子量为249。 这些结果表明，pRSET/HO-A所编码的酶将外源式的油酸合成了亚油酸，具有 A12脂肪酸脱氢酶活性。培养条件对pRSET-HO-A/BL21 (DE3) pLysS工程菌的蛋白表达量具有很 大影响。发明人进行了多次试验，确定比较适宜的培养条件为IPTG诱导的浓 度为0.8 1.2mM，最佳诱导时间为10 15h，诱导温度为18 30°C 。并确定IPTG 诱导的最适浓度为lmM，最佳诱导时间为12h，诱导的最理想温度为22"C。其 中诱导温度对蛋白表达量和可溶性蛋白含量均有较大影响，因为温度较低时有 利于蛋白质的正确折叠，增加蛋白质的可溶性，保持酶的活性。
权利要求
1. 一种花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法，其特征在于把花生Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因全长序列插入到大肠杆菌表达载体pRSETB中，构建融合表达载体pRSET/HO-A，并转化到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)pLysS中，最后进行IPTG诱导表达。
2、 如权利要求1所述的花生A12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法，其特 征在于在构建融合表达载体pRSET/HO-A的过程中，先把FAD2基因进行 RT-RCR扩增，目的片段连接入克隆载体pMD18，转化大肠杆菌DH5，获得阳 性克隆pMD/HO-A，最后将pMD/HO-A与表达载体pRSETB连接。
3、 如权利要求1或2所述的花生A12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法， 其特征在于在进行IPTG诱导表达的过程中，含有pRSET/HO-A质粒的BL21(DE3) pLysS单菌落在培养基中振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG 至终浓度为0.8 1.2mM， 22"C再继续培养10 15h。
4、 如权利要求3所述的花生A12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法，其特 征在于在进行IPTG诱导表达的过程中，含有pRSET/HO-A质粒的BL21 (DE3 ) pLysS单菌落在培养基中振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度 为lmM， 22。C再继续培养12h。
全文摘要
本发明公开了一种花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因高效表达的方法，是把花生Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因全长序列插入到大肠杆菌表达载体pRSETB中，构建融合表达载体pRSET/HO-A，并转化到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)pLysS中，最后进行IPTG诱导表达。经检测证明，采用这种方法，Δ12脂肪酸脱氢酶基因获得了稳定表达，表达量高达15.8％，这也是目前所知的脂肪酸脱氢酶基因在原核生物中的最高表达量。
文档编号C12N15/09GK101210242SQ200610128499
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月29日 优先权日2006年12月29日
发明者崔党群, 殷冬梅 申请人:河南农业大学