核苷酸合成酶cad基因在治疗脂肪肝和ⅱ型糖尿病中的功能和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种核苷酸合成酶CAD基因在脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用，属于基因的功能与应用领域。本发明通过高脂饮食诱导的模型研究CAD基因的功能，结果发现HFD组CAD基因敲除小鼠的体重、空腹血糖水平均高于对照组WT小鼠，腹腔注射葡萄糖耐量实验发现CAD基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱；从小鼠肝脏大体外观、肝脏重量、肝脏/体重比值以及脂质成分病理染色结果等均说明HFD组的CAD敲除小鼠脂肪肝病变明显严重，脂质蓄积显著增加，这些结果表明CAD基因敲除显著恶化脂肪肝、Ⅱ型糖尿病。针对CAD的上述作用，CAD可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物。
【专利说明】核苷酸合成酶CAD基因在治疗脂肪肝和II型糖尿病中的功能和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种核苷酸合成酶CAD:氨甲酰磷酸合成酶I1、天冬氨酸氨转移酶和二氢乳清酸酶(carbamoyl-phosphate synthetase II ,aspartate transcarbamylase, and dihydroorotase, CAD)在脂肪肝、II 型糖尿病中的功能和应用，具体是在预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物中应用。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性代谢性疾病，预计到2030年患者的数量将增加到4.39亿，这意味着在全球20-79岁成年人中将会有7.7%是糖尿病患者。在过去的二三十年里，糖尿病患者数量已经翻倍，对全球人类的健康是一个极为严重的威胁。当前儿童、青少年及青年人群中II型糖尿病及II型糖尿病前期发病率剧增，这也意味着未来糖尿病的发病人群将扩大，防治难度将会大增。
[0003]肝脏作为人体的生化工厂，三大能量代谢物质均需在这个工厂加工处理才能转为机体所用，足见肝脏在代谢中重要地位。三大物质代谢紊乱，尤其是糖和脂肪代谢紊乱在II型糖尿病发病和进展中起着促进和恶化作用。随着糖尿病病程的延长，发生肝脏病变的危险性及其病变程度也随之增加。糖尿病性肝损伤是指糖尿病引起的肝脏组织学和功能变化，是糖尿病的一种慢性并发症，持久性高血糖状态能导致肝功能衰退。而另一方面，肝功能异常可导致葡萄糖代谢紊乱，加剧糖尿病。
[0004]由于对糖尿病的病因和发病机制尚未充分明了，缺乏针对病因的治疗。目前强调早期治疗、长期治疗、综合治疗和治疗个体化的原则。国际糖尿病联盟(IDF)提出了糖尿病现代治疗的五个要点，分别是:饮食控制，运动疗法、血糖监测、药物治疗和糖尿病教育。由于II型糖尿病患者很少自发性发生酮症酸中毒等急性并发症，多数患者不需要胰岛素治疗维持生命，(除非在某些阶段，可能需要胰岛素控制代谢紊乱)，所以口服降糖药在II型糖尿病的药物治疗中占有相当大的比例。口服药物治疗方面目前应用比较多的降糖药物主要有四类:促胰岛素分泌剂(磺脲类和格列奈类)、双胍类、α-糖苷酶抑制剂类和胰岛素增敏剂类。这些药物以及胰岛素作用于全身各个代谢器官(α-糖苷酶抑制剂除外)，所以在纠正血糖的同时也会产生很多的副作用，比如增加体重(双胍类除外)，其他副作用具体见下:1)促进胰岛素分泌剂的不良反应主要是低血糖，吃药后会出现心慌、出汗、有饥饿感症状，严重者甚至会出现意识障碍，有时也会出现皮疹等过敏反应以及肝肾功能损害。
[0005]2)双胍类主要是胃肠道反应(患者服药后会有恶心、食欲不振的现象)以及乳酸酸中毒(服用降糖灵后，患者会出现乏力、意识障碍甚至昏迷的症状)，还有一部分病人会有肝肾功能损害和过敏性反应以及大细胞性贫血反应。
[0006]3) α -糖苷酶抑制剂是通过延缓葡萄糖的吸收从而达到降低血糖的目的，由于自身不吸收，对全身的副作用就相对小一些，其最主要的副作用是胃肠道反应，患者服药后会有腹胀、腹痛、腹泻和肠排气过多等现象。
[0007]4)胰岛素增敏剂是通过激活PPAR-而起作用的，其最大的副作用是肝损害以及增加血容量，从而加重心脏负担。
[0008]由于糖尿病人需要终身服药，很多患者对长期服药的副作用比较担心，而这些副作用的控制也往往成为降糖治疗成败的关键因素之一。
[0009]CAD是一种多功能酶,分子量是243kDa,是由氨甲酰磷酸合成酶II (CPSase)、天冬氨酸氨转移酶(ATCase)和二氢乳清酸酶(DHOase)组成的不同区域的单一多肽，是一个嘧啶核苷酸从头合成的酶，是核苷酸结合寡聚结构域2 (N0D2)的相互作用蛋白。胰岛素抵抗(IR)是II型糖尿病(T2DM)的重要机制，贯穿于T2DM的整个发生、发展过程中【I】。最新的研究表明，天然免疫和适应性免疫的促炎反应成为IR的关键因素【2-3】。Schertzer等通过细菌的肽聚糖(PGN)作用于NOD蛋白导致IR，确定NOD蛋白作为天然免疫的成分参与了炎症和胰岛素耐受的发生【4】。同时还有证据指出，N0D2与糖尿病并发症发生有关。临床和动物模型研究表明，先天免疫系统的激活和炎症是糖尿病肾病的重要的致病机制【5-6】。N0D2在天然免疫中扮演着重要的角色，在糖尿病肾病的发病机制中也很重要。Du等发现，在糖尿病肾病中N0D2通过加剧炎症和足突细胞的IR促进肾损伤【7】。此外，已有研究报道，在人的肠上皮细胞中，CAD是N0D2的负调节物，可抑制N0D2的抗菌功能【8】。由此推测CAD基因的表达很可能也影响着胰岛素的功能。
[0010]【参考文献】
1、DingSC，Zhang RZj Liu CG.Type 2 diabetes and insulin resistance andmetabolic syndrome.Mo dern Prey Medj 2009，36(3):564.2、ShiHj Kokoeva MVj Inouye K， et al.TLR4 links innate immunity and fattyacid-1nduced insulin resistance.J Clin Invest, 2006，116 (11):3015-3025.3、Hosoi Tj Yokoyama S， Matsuo S， et al.Myeloid differentiat1nfactor 88 (MyD88)-deficiency increases risk of diabetes in mice.PloS One,2010，5(9):el2537.4、SchertzerJD,Tamrakar AK，Magalhes JG,et al.NODl activators link innateimmunity to insulin resistance.Diabetes，2011，60( 9): 2206-2215.5λ Navarro-Gonzalez JF, Mora-Fernandez C，Muros de Fuentes M，et al.1nflammatory molecules and pathways in the pathogenesis of diabetic nephropathy.Nat R ev Nephrol，2011，7( 6): 327-340.6、Lin M，Yiu WH, Wu HJ, et al.Toll-like receptor 4 promotes tubularinflammat1n in diabetic nephropathy.J Am Soc Nephrol，2012，23( I): 86-102.7λ Du P，Fan B，Han H，et al.N0D2 promotes renal injury by exacerbatinginflammat1n and podocyte insulin resistance in diabetic.Kidney Int，2013，84( 2): 265-276.8、 Richmond AL et al.The nucleotide synthesis enzyme CAD inhibits N0D2antibacterial funct1n in human intestinal epithelial cells.Gastroenterology.2012，142(7): 1483-1492。
【发明内容】
[0011]为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种核苷酸合成酶CAD与脂肪肝、II型糖尿病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的靶基因CAD的新用途，进而把CAD基因应用于脂肪肝和/或II型糖尿病的治疗。
[0012]本发明的目的通过下述技术方案实现:
本发明以野生型C57小鼠与CAD基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity,D1)研究CAD基因的功能,结果发现与野生型WT小鼠对t匕，CAD基因敲除小鼠表现出肥胖，其体重明显高于同种饲料饲养的WT小鼠，并且CAD基因敲除小鼠的空腹血糖水平高于对照组WT小鼠，进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现CAD基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱。从小鼠肝脏大体外观，肝脏重量及肝脏/体重比和病理染色等均发现HFD组(High fat diet,高脂饮食)的CAD-KO小鼠脂肪肝病变严重，脂质蓄积增加显著。这表明CAD基因敲除会加剧恶化脂肪肝、II型糖尿病的发生，CAD能够改善脂肪肝、II型糖尿病。
[0013]本发明人的研究证明了:在高脂诱导的脂肪肝、II型糖尿病模型中，CAD能抑制肥胖，降低血糖，减少肝脏脂质蓄积，保护肝功能，特别是改善脂肪肝、II型糖尿病的作用。
[0014]一种CAD基因在脂肪肝、II型糖尿病中的功能，具体体现在CAD具有改善脂肪肝、II型糖尿病的功能。
[0015]针对CAD的具有改善脂肪肝、II型糖尿病的功能，CAD可在制备用于预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病的药物方面应用。
[0016]一种预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病的药物，包含CAD。
[0017]针对CAD的改善脂肪肝、II型糖尿病的功能，CAD可在制备用于预防、缓解和/或治疗II型糖尿病的药物方面应用。
[0018]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1.本发明发现CAD基因的新功能，即CAD基因具有能够改善脂肪肝、II型糖尿病的作用。
[0019]2.基于CAD在改善脂肪肝、II型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是WT和CAD-KO小鼠的体重、空腹血糖结果图。
[0021]A为小鼠体重结果图；
B为空腹血糖水平统计图
(*:p < 0.05vs WT NC组，**:p < 0.01vs WT NC组，#:p < 0.05vs WT HFD组，
P < 0.01vs WT HFD 组)。
[0022]图2是WT和CAD-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图。
[0023]A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图；
B为各组小鼠糖耐量曲线下面积(area under the curve, AUC)比较图
(*:p < 0.05vs WT NC 组，**:p < 0.01vs WT NC 组，##:p < 0.01vs WT HFD 组)。
[0024]图3是CAD-KO和WT小鼠的肝脏大体外观结果图。
[0025]A为肝脏大体结果图；
B为肝脏重量、肝脏重量与小鼠本身体重比值统计柱状图 (##:p < 0.01vs WT HFD 组)。
[0026]图4是CAD-KO和WT小鼠的肝脏组织脂质成分HE染色和油红O染色图。
[0027]
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0029]实验用动物及饲养:
实验动物种属，性别，周龄及来源:C57BL/6小鼠和CAD-KO小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司；CAD基因敲除小鼠(CAD-K0，购自日本RIKEN公司，货号:RBRC01723)。
[0030]实验动物饲料配方:高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942):热量百分比:蛋白质:20%;碳水化合物:20%;脂肪:60%，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B):热量百分比:蛋白质:20%;碳水化合物:70%;脂肪:10%，总的热量质量比:3.85kcal/g。
[0031]动物饲养及环境条件:所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级动物房(许可证号=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小时交替照明，温度24±2°C，湿度40%-70%，小鼠自由饮水进食。
[0032]【实施例1】小鼠脂肪肝、II型糖尿病模型(D1)获得
1.实验动物分组:选用8周龄，雄性，WT小鼠和CAD-KO小鼠，分别给予两种特殊饲料D12942 高脂饲料(Highfat diet，HFD)和 D12450B 低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即 WTNC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。
[0033]2.高脂饲料诱导模型操作流程:
采用WT和KO小鼠，建立D1模型，进行表型相关分析，明确CAD基因对代谢性疾病发病发挥重要作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和CAD-KO小鼠，分别给予两种特殊饲料D12942高脂饲料(Highfat diet，HFD)和 D12450B 低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即 WT NC 组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量，小鼠空腹体重和空腹血糖每隔4周检测I次。实验第22周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力。第24周终末取材，取出小鼠肝脏拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或0.C.T冰冻切片包埋剂(Tissue Freezing Medium)包埋作为病理分析用。
[0034]【实施例2】小鼠体重，血糖水平测定 (O小鼠空腹体重、食量检测，眶静脉窦采血 I)体重检测
①禁食:上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。
[0035]②称重:分别在第O周、4周、8周、12周、16周、20周、24周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。饲料量检测:待称体重操作完成后，给小鼠加饲料，并在动态电子天平上记录小鼠的饲料量。
[0036](2)空腹血糖水平检测
将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。
[0037]①血糖仪准备:检查血糖仪(美国强生公司，0NET0UCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。
[0038]②固定小鼠:右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。
[0039]③剪尾:眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。
[0040]④血糖检测:将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸,血糖仪倒计时5秒显示读数。
[0041]II型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖等水平，体重、血糖变化结果如图1所示，我们发现WT小鼠在给与HFD饲料饲养后，从第12周开始体重明显高于NC饲料组，给予CAD-KO小鼠24周的HFD饲料和NC饲料饲养后，从第4周开始HFD组的CAD-KO小鼠体重明显高于HFD组的WT小鼠体重，一直持续到第24周(见图1A);经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从第4周开始，空腹血糖水平明显较相应NC对照组升高，且HFD组的CAD-KO小鼠空腹血糖水平从第4周开始明显高于WT小鼠空腹血糖水平，在20W时达到峰值，之后略降低(见图1B)。这表明敲除CAD基因后就显著促进了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢紊乱，表明CAD在高脂诱导引起的II型糖尿病中起到重要作用。
[0042]【实施例3】葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT) 实验第22周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。
[0043]①在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μ L/g计算葡萄糖的注射体积。
[0044]②先检测葡糖糖注射前即O分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。
[0045]③腹腔注射操作方法:①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射:从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。
[0046]④分别于腹腔注射后15分，30分，60分，120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。
[0047]进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucosetolerancetests, IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力,在实验第22周,通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和CAD KO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(O分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且CAD-KO小鼠血糖水平从O分钟至2小时一直处于高于WT小鼠的血糖水平(图2A)。比较各组小鼠血糖曲线下面积(area under the curve, AUC),发现 WT 小鼠 HFD 组的 AUC 显著高于 NC 组，CAD-KO HFD组的AUC显著大于WT HFD组的AUC (图2B)，表明CAD基因敲除显著加剧糖代谢紊乱。
[0048]【实施例4】肝脏大体外观，肝脏组织脂质情况测定
1.终末肝脏组织取材
①小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。
[0049]②用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。
[0050]③迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速拍照，称重。
[0051]④石蜡标本:切取部分肝脏置于10%中性福尔马林中固定。冰冻标本:切取部分肝脏，置于有OCT的锡纸模具中包埋，放在干冰上冰冻固定。
[0052]2.肝脏组织处理及病理染色相关实验
I)肝脏脱水，透明，浸蜡切取10%中性福尔马林中固定好的部分肝叶组织于标记的包埋框内，在小流量流水冲洗30分钟以上。按照以下流程在机器上设置以下程序，①脱水:75%酒精(45分钟)一75%酒精(45分钟)一85%酒精(45分钟)一85%酒精(45分钟)一95%酒精(45分钟)一95%酒精(45分钟)一无水酒精(I小时)一无水酒精(I小时);②透明:二甲苯(I小时)一二甲苯(I小时);③浸蜡(65°C ):石蜡(I小时)一石蜡(I小时)。待组织冲洗完毕后，将包含组织的包埋框装进机器篮筐内，启动上述程序。上述程序完成后，取出组织包埋框送病理室包埋组织，同时清洗机器备用。
[0053]2)肝脏组织切片
使用切片机切片，切片厚度5 μ m。
[0054]3)肝脏组织苏木精-伊红(HE)染色
将肝脏组织石蜡切片放入65°C烘箱(30分钟)一二甲苯中(5分钟X3次)一100%酒精(I分钟)一90%酒精(I分钟)一70%酒精(I分钟)一蒸馏水洗一苏木素(5分钟)一自来水洗去切片上的浮色一1%盐酸酒精(I至3秒)一自来水洗数下一Scott促蓝液(碳酸氢钠
0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100ml) (I分钟)一自来水洗数下一伊红(I分钟)一蒸馏水洗去切片上的浮色一70%酒精一下一90%酒精一下一100%酒精(30秒X3次)一二甲苯(2分钟X 3次)一在二甲苯未干时封片，拍照。
[0055]4)肝脏组织油红O染色
①将冰冻肝脏组织切片在通风橱中风干30分钟，4%多聚甲醛固定10分钟。置于双蒸水中稍洗10分钟，以除去组织表明的多聚甲醛。
[0056]②以60%异丙醇处理I分钟。
[0057]③用油红O (公司sigma，货号00625，浓度0.5克/10ml 100%异丙醇)染色30分钟。
[0058]④之后以60%异丙醇漂洗I分钟X 3次，直至背景干净。
[0059]⑤用Mayer’ s苏木素染液(5滴)淡染细胞核。
[0060]⑥水漂洗，稀碳酸锂水溶液中促蓝，充分水洗，水洗至细胞核蓝化。
[0061 ] ⑦用甘油明胶封片，拍照。
[0062]肝脏大体外观，肝脏组织脂质成分及脂质代谢测定结果见图3所示，通过大体取材拍照，我们观察到在HFD组的CAD-KO小鼠的肝脏体积稍较HFD组的WT小鼠的肝脏大，且前者肝脏色泽泛黄，油脂较多(如图3A)。在HFD组的CAD-KO小鼠无论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠本身体重比值均较HFD组的WT小鼠高，说明CAD-KO小鼠脂肪肝明显(如图3B)。我们进一步通过组织切片，进行HE和油红O染色，显微镜下观察各组小鼠肝脏组织的病理改变。通过肝脏HE染色，我们可以观察到在HFD饲养条件下，WT小鼠和CAD-KO小鼠肝脏组织均有较多的脂肪沉积，可以看到肝细胞发生脂肪变性、空泡化且融合连成片状，肝脏细胞形态已几乎完全破坏，尤其在CAD-KO小鼠更显著，而在NC组小鼠均肝细胞形态较为完整(如图4上)。通过肝脏油红O染色来检测肝组织中脂质，我们可以发现在HFD组的CAD-KO小鼠的肝门静脉周围呈大片红色，有大量的脂质沉积，而在HFD组的WT小鼠的肝门静脉周围则有较少脂质沉积，在NC饲料饲养的两组小鼠脂质沉积最少，且无明显差异(如图4下)。
[0063]上述结果显示CAD-KO小鼠在HFD的诱导下发生的II型糖尿病和脂肪肝病变显著加重。这些结果表明CAD对于改善II型糖尿病和脂肪肝病变具有显著的作用。本发明结果说明CAD基因在脂肪肝和/或II型糖尿病疾病模型中有着重要的保护作用。
[0064]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.核苷酸合成酶CAD在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病药物中的应用。
2.一种预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病的药物，其特征在于:包含核苷酸合成酶CAD。
3.核苷酸合成酶CAD在制备预防、缓解和/或治疗II型糖尿病药物中的应用。
4.一种预防、缓解和/或治疗 II型糖尿病的药物，其特征在于:包含核苷酸合成酶CAD。
【文档编号】A61K38/43GK104069511SQ201410326943
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】李红良, 汪涛, 张晓东, 杜成 申请人:武汉大学