鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明提供鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法，属于生物工程领域。所述疫苗活性成分为灭活的鸡新城疫病毒LaSota株和传染性法氏囊病毒NJ09株CGMCC?NO：7758。本发明提供该疫苗的制备方法，将鸡新城疫病毒LaSota株病毒液与传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别浓缩、灭活，然后混合均匀，得到混合病毒液；将混合病毒液与佐剂混合均匀。本发明灭活疫苗，含有灭活的传染性法氏囊病毒NJ09株，该毒株是超强的流行毒株、免疫原性强、攻毒保护性好；该二联灭活疫苗免疫后抗体水平高，免疫攻毒保护率高，对传染性法氏囊标准强毒株、超强毒株攻毒保护率达到90%以上，免疫持效期达到5个月。
【专利说明】鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]鸡新城疫又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病，OIE将其列为A类疫病。鸡新城疫(Newcastle diseaSe，ND)是由鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。该病死亡率高，对养鸡业危害严重。1926年首先发现于印度尼西亚，不久又在英国新城发现，世界各国均有流行记载。
[0003]传染性法氏囊病毒(Infect1us bursal disease Virus,缩写为IBDV)隶属于双RNA病毒科双RNA病毒属，此病主要损害鸡体淋巴器官造成免疫抑制，从而导致多种疫苗免疫无效及对其它疾病如新城疫、球虫病等的易感性增高而引起经济损失。传染性法氏囊病(Infect1us bursal disease, IBD)于 1957 年首次发生于美国 Delware 州南部 Gumboro地区，我国于1979年相继在广州、北京、上海发现本病，对实际养殖生产造成重大损失，IBDV疫苗研究随即展开，至今国内外已开发出弱毒、中等毒力活疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗，对该病防控起到一定作用。但是近年来，我国一些地方，特别是在法氏囊母源抗体高低不齐的蛋鸡和肉鸡饲养区， 仍然屡有传染性法氏囊病(IBDV)的发生和流行，其原因主要为:一是超强毒株出现。IBDV在野外环境中变异能力很强，每年均有超强毒力的IBDV野毒出现，这一类毒株的毒力极有可能突破现有疫苗的保护，从而导致免疫鸡群出现感染发病、死亡的现象。二是弱毒疫苗无法突破母源抗体。现行免疫程序中IBDV弱毒苗一般在14~18日龄免疫，接种后进入鸡体内的活病毒会被母源抗体捕获、中和而失去复制活性，因而不能达到保护效果。同时雏鸡体内母源抗体由高逐渐消减，虽有一定保护力但开始有部分鸡暴露在感染威胁当中。三是传染性法氏囊灭活疫苗研究落后。目前市场上使用的灭活疫苗一类是法氏囊全病毒灭活疫苗，使用传染性法氏囊病毒株适应细胞制备，另一类是基因工程疫苗，采用大肠杆菌表达传染性法氏囊病毒VP2基因制备。这两种疫苗可以产生一定的免疫保护效果，但是，对于出现基因变异的超强毒株，会出现保护性下降的情况。因此，针对目前我国鸡传染性法氏囊病发病趋势，分离法氏囊超强毒流行毒株，筛选其中免疫原性好、且可以适应细胞繁殖的种毒制备疫苗，对于该病的预防具有极其重要的意义，是符合生产实际需求的重要产品。
[0004]目前新城疫、传染性法氏囊严重危害家禽养殖业的发展，在各种防控措施中，疫苗的免疫仍为最重要的措施。针对新城疫、传染性法氏囊，已有相应的灭活单苗及二联灭活苗，但是免疫剂量大，抗体水平低，保护率不高，给免疫鸡群带来一定的风险。因此，研制出免疫剂量小，免疫效果更好的新城疫、传染性法氏囊二联苗是一项具有重要意义的工作。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗，含有灭活的传染性法氏囊病毒NJ09株，该毒株是超强的流行毒株、免疫原性强、攻毒保护性好；该二联灭活疫苗免疫后抗体水平高，免疫攻毒保护率高，对传染性法氏囊标准强毒株及目前流行的法氏囊超强毒株攻毒保护率达到90%以上，一次免疫，免疫持效期达到5个月。
[0006]本发明的另一目的在于提供鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，该方法简单，安全、成本低。
[0007]本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0008]一种鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗，其活性成分为灭活的鸡新城疫病毒La Sota株和传染性法氏囊病毒NJ09株，所述传染性法氏囊病毒NJ09株的保藏号为CGMCCNO:7758o
[0009]本发明还提供所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液与传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别浓缩、灭活，然后混合均匀，得到混合病毒液；将所述混合病毒液与佐剂混合均匀，得到所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗。
[0010]在本发明中，将鸡新城疫病毒La Sota株接种鸡胚进行培养，收获鸡胚液作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液；将传染性法氏囊病毒NJ09株接种DF-1细胞或Ve1细胞进行培养，得到所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液。 [0011 ] 在本发明中，所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液的病毒含量大于等于108_0EID50/ml，所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液的病毒含量大于等于107_°TCID5(l/ml。
[0012]优选的技术方案中，所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至原体积的1/4-1/2，所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液浓缩至原体积的1/5-1/7。
[0013]优选的技术方案中，所述浓缩后的鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别灭活后，按照体积比2: (1-3)混合均匀，得到混合病毒液。
[0014]在本发明中，将混合病毒液与吐温-80按照体积比96: 4混合均匀，得水相；将注射用白油和司本一 80按照体积比为94:6混匀，得油相；将油相和水相按照体积比2:1混合均匀，获得鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗。
[0015]有益效果:
[0016](I)鸡新城疫病毒La Sota株，是我国鸡新城疫疫苗制造的标准毒株，规模化生产工艺成熟、稳定，免疫原性好，安全。
[0017](2)传染性法氏囊病毒NJ09株，是超强的流行毒株、免疫原性强、攻毒保护性好且适应细胞规模化培养。
[0018](3)本发明二联灭活疫苗中含有的鸡新城疫病毒为标准制苗株La Sota株，成品按照20 μ I/羽份免疫SPF鸡后21天，新城疫抗体水平不低于41og2，达到效力检验标准；传染性法氏囊病毒NJ09株，是超强的流行毒株、免疫原性强、攻毒保护性好且适应细胞规模化培养。本发明二联灭活疫苗免疫后，抗体水平高，免疫攻毒保护率高，对传染性法氏囊标准强毒株及目前流行的法氏囊超强毒株攻毒保护率达到90%以上，一次免疫，免疫持效期达到5个月。
[0019]本发明制备鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的方法，简单、安全、成本低。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是IBDV NJ09株F1、F2代细胞毒RT-PCR扩增产物的电泳图，其中泳道1-Fl代细胞毒；2_F2代细胞毒；3_法氏囊病毒标准阳性对照；4_阴性对照；M-Marker。
[0021]保藏信息如下:
[0022]保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0023]单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0024]参椐的生物材料(株):NJ09株。
[0025]分类命名:传染性法氏囊病毒。
[0026]保藏号:CGMCCN0.7758。
[0027]保藏日期:2013年6月20日。
【具体实施方式】
[0028]鸡新城疫病毒La Sota株:购自中国兽医药品监察所。
[0029]传染性法氏囊病毒(Infect1usbursal disease Virus)BC6/85 株、B87 株来源:
[0030]购自中国兽医药品监察所。
[0031]【具体实施方式】
[0032]实例I传染性法氏囊病毒NJ09株的分离与鉴定
[0033]1.NJ09株的分离
[0034](I)病料
[0035]病料为无菌采集疑似法氏囊病死亡病鸡的法氏囊组织、心血、肝、脑、肺。
[0036](2)组织触片
[0037]将病料作心血涂片及各脏器的病毒组织触片，并进行染色镜检，发现病毒组织触片染色镜检结果为阴性。
[0038](3)细菌培养
[0039]将上述病料，分别用马丁肉汤和绵羊血培养基培养(按现行《中国兽药典》附录方法配制)，结果显示无菌落生长，说明所述病料中不含有细菌。
[0040](4)病料处理
[0041]将上述病料在无菌容器中剪碎、磨碎，用含青链霉素的灭菌生理盐水(每毫升生理盐水含2000单位的青霉素和2000单位的链霉素)作1: 5倍稀释，反复冻融三次后，3000r/min离心20分钟，取上清液保存于_20°C备用。
[0042](5)病毒分离、细胞驯化及收获
[0043]将本实施例标题4中获得的上清液，尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚，每胚接种量0.2ml，接种后置37°C条件孵化。接种24小时以内死亡胚弃去，收获24小时以后死亡鸡胚尿囊膜及胚体，组织捣碎后，用含青链霉素的灭菌生理盐水(每毫升生理盐水含1000单位的青霉素和1000单位的链霉素)作1: 2倍稀释，反复冻融三次后，3000r/min离心20分钟，取上清液，即为通过鸡胚传代获得的抗原毒(鸡胚组织毒)El代，并连续通过鸡胚传至E4代，测定红细胞凝集价及病毒含量。将红细胞凝集价测定为阴性，病毒含量不低于105 0ELD50/0.2ml的抗原液1ml，接种已长成单层的DF-1细胞(由ATCC引进)，再加入9ml维持液(MEM营养液，购自默克密理博所属北京清大天一科技有限公司，按商品说明现配现用)，37°C培养。培养时间达到120小时，收获细胞毒，置一 20°C反复冻融3次，离心取上清液连续盲传26代，然后接种DF-1细胞出现典型病变，收获细胞毒抗原液标记为Fl代；继续在DF-1细胞上传I代，收获细胞毒抗原液，标记为F2代。取F2代细胞毒进行VP2基因序列测定。F2代细胞毒VP2全基因的RT-PCR扩增结果表明:扩增产物长度为1300bp (见图1)与设计片段大小完全相符测序，表明为鸡传染性法氏囊病毒，置一 20°C保存。将F2代细胞毒通过DF-1细胞扩繁获得的种毒(细胞毒)，命名为传染性法氏囊病毒CV02株，缩写为IBDV CV02 株。
[0044](6)纯化获得NJ09株
[0045]采用细胞或鸡胚分离的病毒液中可能会混有I种或I种以上可以繁殖的其他病毒，需要通过纯化试验去除CV02株中混杂的野毒，分离到纯净、均一生长的传染性法氏囊病毒。按《中国兽药典》2010版附录44页方法制备CEF(鸡胚成纤维细胞)，细胞数为
1.0-1.5XlOVml,铺96孔细胞板，每孔加入0.1ml细胞悬液。将CV02株先10倍梯度稀释至10_4，再2倍梯度、3倍梯度、5倍梯度分别稀释至2_1(1、3_1(1、5_1(1。各稀释度病毒接96孔细胞板，每孔接0.2ml，接毒后置37°C培养5天，每天观察细胞病变情况。待细胞孔出现单个蚀斑时，把此孔细胞毒单独回收，反复冻融3次，-20°C保存备用。选择稀释度最高的蚀斑毒按此方法重复克隆两次。测定第三次挑选的蚀斑毒病毒含量，共挑选蚀斑毒三株，其中第一株病毒含量为171TCID50M,高于另外两株106 5TCID5(l/ml、106_7TCID5Q/ml。选择病毒含量最高蚀斑毒命名为NJ09株,做为制苗用种毒，作为基础种毒Fl代,并通过DF-1细胞连续传至F15代。
[0046]2.NJ09株鉴定和性质
[0047](I)无菌检验
[0048]按现行《中国兽药典》附录进行检验，NJ09株Fl代种毒样品接种后，无菌生长。
[0049](2)病毒含量测定
[0050]将NJ09株Fl代病毒液10倍系列稀释后，取10'10'10_8、10_9四个稀释度，分别接种96孔细胞板上的单层鸡胚成纤维细胞，置37°C孵育120小时。120小时后，逐孔观察细胞病变，以接种细胞出现典型病变判为感染，按Reed-Muench方法计算病毒含量。结果表明:NJ09株Fl代种毒的病毒含量为107_ 1TCID5cZmL
[0051](3)特异性试验
[0052]将NJ09株Fl代病毒液用灭菌生理盐水作1: 100稀释，与购自中国兽医药品监察所的鸡传染性法氏囊标准阳性血清混合，置37°C中和60分钟后，接种鸡胚成纤维细胞，0.2ml/孔(中和组)。同时设病毒对照组和阴性对照组各5孔，分别接种NJ09株Fl代病毒液1: 100稀释液及灭菌生理盐水，0.1ml/孔。接种后置37°C培养5天，每天观察细胞病变情况。中和组、阴性对照组细胞无病变，病毒对照组所有孔全部出现典型病变，说明该毒株具有特异性，是传染性法氏囊病毒，命名为传染性法氏囊病毒(Infect1us bursaldisease Virus) NJ09株，缩写为IBDV NJ09株或传染性法氏囊病毒NJ09株或NJ09株，并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
[0053](4)毒力测定
[0054](a)VP2基因序列分析
[0055]RT-PCR 扩增 IBDV NJ09 株的 VP2 基因，序列如 SEQ ID NO:1 所示。IBDV NJO9 株的VP2基因序列与已报道强毒(HarBin-1)同源性99%，提示IBDV NJ09株具有强毒力。
[0056](b)对SPF鸡的毒力试验
[0057]攻毒用组织毒制备:将IBDV NJ09株病毒(105BID/0.1ml)与IBDV经典制苗株B87株(105 5ELD/0.2ml)、IBDV标准攻毒毒株BC6/85株病毒液(105BID/0.1ml)，分别按照1: 10稀释，点眼感染SPF鸡，72小时后剖检，分别收获各毒株感染鸡法氏囊组织，捣碎后加入组织体积3倍的生理盐水，即为攻毒用组织毒BI代，按此方法，用BI代组织毒再次感染SPF鸡并收获法氏囊组织，即为B2代组织毒。制备IBDV NJ09株B1、B2代组织毒，BC6/85株B1、B2代组织毒，B87株因是弱毒株，连续两次感染SPF鸡均不能使试验鸡发病。
[0058]毒力对比试验:取NJ09株病毒Bl、BC6/85株B2和B87株E5代分别对SPF鸡进行攻毒，统计攻毒后72小时内SPF鸡的死亡数、感染数，结果如表1所示。从表1看出，NJ09株点眼感染SPF鸡后，可引起试验鸡72小时内50 %死亡，感染率100 % ；BC6/85株可引起试验鸡100%感染，但不致死；B87株为制苗弱毒株，即便通过点眼、静脉注射接种，也未能引起试验鸡感染发病。各毒株攻毒试验结果说明，NJ09株毒力比IBDV标准攻毒毒株BC6/85株更强，是超强流行毒株，不仅能引起试验鸡100%感染，而且还会造成50%死亡。
[0059]表1各毒株对SPF鸡毒力比较试验结果
[0060]
【权利要求】
1.一种鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗，其活性成分为灭活的鸡新城疫病毒LaSota株和传染性法氏囊病毒NJ09株，所述传染性法氏囊病毒NJ09株的保藏号为CGMCC NO:7758。
2.权利要求1所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液与传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别浓缩、灭活，然后混合均匀，得到混合病毒液；将所述混合病毒液与佐剂混合均匀，得到所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗。
3.根据权利要求2所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在将鸡新城疫病毒La Sota株接种鸡胚进行培养，收获鸡胚液作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液；将传染性法氏囊病毒NJ09株接种DF-1细胞或Ve1细胞进行培养，得到所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液。
4.根据权利要求3所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液的病毒含量大于等于108_ °EID50/ml，所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液的病毒含量大于等于107』TCID5(l/ml。
5.根据权利要求4所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至原体积的1/4-1/2，所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液浓缩至原体积的1/5-1/7。
6.根据权利要求5所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述浓缩后的鸡新城疫 病毒La Sota株病毒液和传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别灭活后，按照体积比2: (1-3)混合均匀，得到混合病毒液。
7.根据权利要求6所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于将混合病毒液与吐温-80按照体积比96: 4混合均匀，得水相；将注射用白油和司本一80按照体积比为94:6混匀，得油相；将油相和水相按照体积比2:1混合均匀，获得鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗。
【文档编号】A61P31/14GK104069489SQ201410326770
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】于漾, 朱亚露, 揭鸿英, 毕志香, 褚轩, 何家惠, 侯继波 申请人:江苏省农业科学院