专利名称：改进的酮还原酶多肽、其编码基因以及表达该多肽的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的酮还原酶多肽、其编码基因以及表达该多肽的细胞。
背景技术：
去氧肾上腺素(phenyl印hrine)又名苯肾上腺素，其化学学名为3_ (2- (N-甲基氨基)-1-羟基)苯酚。它在临床上常用于阵发性室上性心动过速，可通过收缩血管，升高血压使迷走神经反射的兴奋而心率减慢。去氧肾上腺素的合成方法包括化学法和生物法，将其酮底物立体选择性还原成具有手性结构的产物。采用生物法制备去氧肾上腺素需要使用具有立体选择性的酮还原酶。 然而，现有的野生型酮还原酶KRED，其催化活性很低，例如，10g/l粗酶粉20小时只能完全转化lg/1的酮底物，无法满足工业化生产的需要。目前对于去氧肾上腺素的生物制备，还没有一种既具有一定立体选择性，又具有较好催化活性的酮还原酶。
发明内容
本发明一方面提供了一种该改进的酮还原酶多肽的酶活性高于野生型酮还原酶多肽的酶活性；所述酶活性是指催化酮类化合物发生还原反应生成手性醇的酶活性；所述野生型酮还原酶多肽具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列，且来源于高加索乳酸杆菌 Lactobacillus kef iri DSM 20587 ；所述改进的酮还原酶多肽包含与SEQ ID No. 2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且该改进的酮还原酶多肽的氨基酸序列中对应于SEQID No. 2所示氨基酸序列中的第94位残基为酪氨酸残基。在本发明的一个具体实施方案中，所述酶活性是指催化底物1-(3-羟基苯基)-2_[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮发生还原反应生成3- ((R)-2- (N-苄基-N-甲基氨基)-I-羟基)的酶活性。3- ((R) -2- (N-苄基-N-甲基氨基)-I-羟基)的酶活性经过还原反应脱去苄基后生成去氧肾上腺素。在本发明的一个具体实施方案中，所述改进的酮还原酶多肽具有如SEQ IDNo. 4所示氨基酸序列。在本发明的一个具体实施方案中，该改进的酮还原酶多肽的酶活性是所述野生型酮还原酶多肽的酶活性的至少2倍。本发明另一方面还提供了编码上述改进的酮还原酶多肽的基因，其包含与SEQ IDNo. I所示核苷酸序列有至少90%序列同源性的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方案中，该基因具有如SEQ ID No. 3所不核苷酸序列。本发明再一方面还提供了一种细胞，该细胞表达上述的改进的酮还原酶多肽。
优选的，所述细胞属于乳酸杆菌或大肠杆菌。更优选的，所述乳酸杆菌属于高加索乳酸杆菌。在本发明的一个具体实施方式
中，所述大肠杆菌为E. coli. BL21 (DE3)。
具体实施例方式下面将通过实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容。因此，所举的例子并不限制本发明的保护范围。实施例I一、制备能够表达如SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的改进的酮还原酶多肽的宿主细胞步骤I :全基因合成如SEQ ID No. I所示核苷酸序列步骤2 :引入对第94位氨基酸的饱和突变为了将饱和突变引入SEQ ID No. I所示核苷酸序列，我们以含有SEQ ID No. I所示核苷酸序列的质粒pET21b-KREDlk作为PCR反应模板，并设计了以下两对引物上游引物Fl: 5，-AGGGCTGCATATGACTGATCGTTTAAAACAC-3’ (SEQ ID No. 5)下游引物Rl: 5’ -CTCAAGCTTTTATTGAGCAGTGTATCCACC-3，(SEQ ID No. 6)上游引物Fl和下游引物Rl序列中标注下划线处表示酶切位点突夺引物F2:5’ -CAATGCCGGAAGTNNSGTCCTCAAGAG-3，(SEQ ID No. 7)突夺引物R2:5’ -CTCTTGAGGACSNNACTTCCGGCATTG-3，(SEQ IDNo. 8)突变引物F2和突变引物R2序列中标注下划线处表示突变位点的简并碱基以质粒PET21b_KREDlk为模板，进行第一轮PCR反应，按以下次序，将各成分在灭菌 EP 管中混合，采用 25 u I 反应体系ddH20 16. 3 u I, PCR Buffer 2. 5u I, dNTP 2u I,引物 Fl(10iimol/L)2ii 1，$*R2(10iimol/L)2iil，pET21b-KREDlk I u I, Pfu DNA 聚合酶(5U/u 1)0. 2 u I。扩增条件为94°C 2min, 一个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 20s, 30 个循环；72°C，lOmin，一个循环。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收在300bp处的特异性条带，使用博大泰克DNA片段快速回收试剂盒进行回收。然后进行第二轮PCR反应，反应体系为ddH20 16. 3 u I, PCR Buffer 2. 5u I, dNTP 2u I,引物 F2 (10 y mol/L)2u I,引物 Rl(10iimol/L)2ii l，pET21b-KREDlk I u I, Pfu DNA 聚合酶 0. 2 y I。扩增条件为94°C 2min，一个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，30 个循环；72°C，lOmin，一个循环。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收在500bp左右的特异性条带。然后，以 前二轮PCR的产物为模板，进行第三轮PCR，反应体系如下ddH20 14. 3 u I, PCR Buffer2. 5 iil, dNTP 2 iil, $*Fl(10iimol/L)2iil,引物 Rl (10 y mol/L) 2 y 1，第一轮 PCR 回收产物Iu 1，第二轮PCR回收产物I iil，Pfu DNA聚合酶0. 2iil。扩增条件为94°C 2min，一个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 50s，30个循环；72°C，lOmin，一个循环。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收在SOObp左右的特异性条带。该片段中则包含了具有饱和突变的所有突变序列。步骤3 :构建突变核苷酸序列的表达载体在含有氨苄青霉素(Amp，100 U g/ml)的LB培养基中接种含有质粒pET21b的大肠杆菌ToplO菌株，于37°C摇床中培养过夜。取3ml菌液转入EP管中，12000rpm离心lmin，收集菌体，根据博大泰克小量质粒制备试剂盒说明书操作提取pET21b质粒。
酶切质粒pET21b 的反应体系为NEB Buffer 25 u I, pET21b 43 u I1NdeIIu I1Hind III I yl，于37°C水浴中保温4h。然后酶切步骤2获得的突变后的基因片段，依次加入如下试剂NEB Buffer25u I,基因片段 43 yl, NdeI Iu I1Hind III lyl，于 37°C水浴中保温4h。随后向两个反应体系中分别加入IOii 16*loading buffer,进行凝胶电泳检测，胶回收被切成线性的DNA分子。在EP 管中分别加入 H2O 3. 5 u I, T41igase Buffer Iu I, pET21b (Ndel, HindIIIdigested) 2u I,步骤3所得片段被Ndel, HindIII酶切过的回收产物3 yl，T4DNAIigaseO. 5 y 1，于 16°C连接 5h。将连接产物转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌种取一管BL21 (DE3)感受态细胞(天根生化科技有限公司)，将10 Ul连接产物和100 ill感受态细胞混合，冰水浴中放置30min，42°C热激90s，置于冰上5min，然后加入LB800iil，于37°C摇床中培养40min。14, OOOrpm离心，弃800 ill上清，用剩余液体悬浮沉淀的细胞，涂布于含有100 u g/ml Amp的LB平板 上，37°C培养箱中培养12-16h即可得到转化子。然后对转化子进行菌落PCR鉴定(使用Fl，Rl为引物)，将含有约800bp插入片段的转化子作为阳性克隆。于96孔深孔板中每孔加入LB+Amp培养基1ml，挑选94个阳性克隆接种入96孔板，在37°C摇床中震荡培养16h，此即为突变体库。步骤4 :将步骤3获得的酮还原酶突变体库进行诱导发酵将培养过夜的突变体库每孔取80 U I菌液接种入一个新的96孔板，该板每孔内含新鲜LB+Amp培养基1ml，细胞在37°C，160rpm条件下生长至OD6tltl值达到0. 8^1. 0，随后加A IPTG至终浓度为I. OmM,于30°C诱导培养16小时。离心，弃上清，收集菌体供检测活性。步骤5 :筛选表达酮还原酶多肽的宿主细胞(大肠杆菌BL21 (DE3)/pET2Ib-KRED)利用酶促反应筛选表达改进的酮还原酶多肽的宿主细胞。0. 6毫升的酶促反应体系，其中包括10g/L2_ (N-苄基-N-甲基氨基)_1_ (3_羟基)苯乙酮，0. lg/L NADPH, ImM Mg2+，500mM 磷酸钠缓冲溶液(pH=6. 5)，10g/L 步骤四离心获得的宿主细胞。于30°C反应24h，加入等体积乙腈终止反应，10，OOOrpm离心5min，吸取上清液至一块新的96孔板上。使用HPLC分析来检测酶活(方法检测柱=CNW 柱(0 4.6 X 150 mm，5um);波长214nm ；流动相A 相(H20+0. 1%TFA) -B 相(CH3CN+0. 1%TFA)，流速为 I. Oml/min,等度洗脱，23%B+77%A 10. Omin stop,柱温 28°C )，将获得的产物峰的面积与BL21 (DE3) /pET2 Ib-KREDIk发酵菌液的反应峰面积做比较，超过BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDlk活性30%的即为筛选出的活性有所提高的突变体。步骤6:鉴定为了从所筛选出的(表达改进的酮还原酶多肽)的宿主细胞中获得酮还原酶的序列，将其所对应的菌种送测序，测序结果显示含有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列，编码SEQID No. 4所示氨基酸序列。该菌种命名为BL21 (DE3)/pET2 Ib-KREDmu。二、验证表达本发明的一种改进的酮还原酶多肽的宿主细胞(上述步骤5获得的大肠杆菌 BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDmu)的效果以表达野生型酮还原酶多肽(SEQ ID No.2所示氨基酸序列)的大肠杆菌BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDkl作为对照，验证上述步骤5获得的宿主细胞表达的改进的酮还原酶多肽的酶活性。
制备R型苯酚产物的50ml反应体系10g/L 2- (N-苄基-N-甲基氨基)-1- (3_羟基)苯乙酮，10g/L酮还原酶菌体(大肠杆菌 BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDkl 或者大肠杆菌 BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDmu)，10g/L 葡萄糖脱氢酶菌体，200g/L葡萄糖,0. lg/LNADP+, ImM Mg2+, 50mM磷酸钠缓冲溶液(pH=6. O)。反应装置利用250mL的三口瓶，30°C油浴，利用磁力搅拌。首先精确称取0. 5克底物和10克葡萄糖，加入到反应瓶中。然后加入40mL去离子水，ImM硫酸镁，50mM, pH6. 0磷酸钠缓冲液，快速搅拌lOmin，使反应体系充分混匀。此时测定pH约为4. 7，用2. 5N的NaOH将pH调节至5. I。向体系中加入500mg酮还原酶菌体细胞，500mg葡萄糖脱氢酶菌体细胞和5mg的氧化型辅酶II (NADP+钠盐)。整个反应过程中pH控制在5. 05-5. 15之间，温度控制在30°C。反应20h后HPLC分析(如步骤5所述)。HPLC分析结果显示具有SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的改进的酮还原酶多肽在筛选条件下能完全转化苯乙酮底物；而具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的野生型酮还原酶只能转化10%不到的苯乙酮底物。 同时，为了确定突变体的立体选择性，使用了低浓度底物作反应，以确保底物被完全转化为产物，反应体系为lg/L 2- (N-苄基-N-甲基氨基)-1_ (3-羟基)苯乙酮，0. Ig/L NADPH, ImM Mg2+，500mM磷酸钠缓冲溶液(pH=6. 5)，10g/L 的 BL21 (DE3) /pET2Ib-KREDkl 或BL21 (DE3)/pET2Ib-KREDmu，于30°C反应24h。反应产物进行手性HPLC分析，结果显示突变体可以将2- (N-苄基-N-甲基氨基)-1- (3-羟基)苯乙酮还原为3- ((R)-2- (N-苄基-N-甲基氨基)-I-羟基)苯酚，其立体选择性不低于野生型酮还原酶，e. e.值>99. 9%。
权利要求
1.一种改进的酮还原酶多肽，其特征在于， 该改进的酮还原酶多肽的酶活性高于野生型酮还原酶多肽的酶活性； 所述酶活性是指催化酮类化合物发生还原反应生成手性醇的酶活性； 所述野生型酮还原酶多肽具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列，且来源于高加索乳酸杆菌 Lactobacillus kefiri DSM 20587 ； 所述改进的酮还原酶多肽包含与SEQ ID No. 2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且该改进的酮还原酶多肽的氨基酸序列中对应于SEQ ID No. 2所示氨基酸序列中的第94位残基为酪氨酸残基。
2.如权利要求I所述的改进的酮还原酶多肽，其特征在于所述酶活性是指催化底物I-(3-羟基苯基)-2-[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮发生还原反应生成3-((R)-2-(N-苄基-N-甲基氨基)-I-羟基)的酶活性。
3.如权利要求I所述的改进的酮还原酶多肽，其特征在于所述改进的酮还原酶多肽具有如SEQ ID No. 4所示氨基酸序列。
4.如权利要求I所述的改进的酮还原酶多肽，其特征在于该改进的酮还原酶多肽的酶活性是所述野生型酮还原酶多肽的酶活性的至少2倍。
5.一种编码如权利要求1-4中任意一项所述改进的酮还原酶多肽的基因，其特征在于 编码所述改进的酮还原酶多肽的基因包含与SEQ ID No. I所示核苷酸序列有至少90%序列同源性的核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于该基因具有如SEQID No. 3所示核苷酸序列。
7.一种细胞，其特征在于该细胞表达权利要求1-4中任意一项所述的改进的酮还原酶多肽。
8.如权利要求7所述细胞，其特征在于所述细胞属于乳酸杆菌或大肠杆菌。
9.如权利要求8所述细胞，其特征在于所述乳酸杆菌属于高加索乳酸杆菌。
10.如权利要求8所述细胞，其特征在于所述大肠杆菌为E.coli. BL21 (DE3)。
全文摘要
本发明涉及一种改进的酮还原酶多肽，该改进的酮还原酶多肽的酶活性高于野生型酮还原酶多肽的酶活性；所述酶活性是指催化酮类化合物发生还原反应生成手性醇的酶活性；所述野生型酮还原酶多肽具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列，且来源于高加索乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM 20587；所述改进的酮还原酶多肽包含与SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且该改进的酮还原酶多肽的氨基酸序列中对应于SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第94位残基为酪氨酸残基。
文档编号C12N15/53GK102776157SQ201210299300
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者孙勇, 文军, 王娟, 王波, 郭浩 申请人:尚科生物医药(上海)有限公司