用于疫苗和基因治疗的重组流感病毒的制作方法

专利名称：用于疫苗和基因治疗的重组流感病毒的制作方法
技术领域：
本申请涉及用于疫苗和基因治疗的重组流感病毒。
背景技术：
由克隆的cDNA产生感染性RNA病毒的能力极大地促进了从生物学角度对这些病 原体的理解，因而改进了疾病控制的方法(Palese等人，1996)。然而，与正义RNA病毒相 比，这种进步对负义RNA病毒是相对有限的，因为负义RNA病毒的基因组病毒RNA (vRNA)或 反基因组互补RNA(cRNA)都不可能作为蛋白质合成的直接模板。而且，vRNA在被病毒核蛋 白(NP)包裹之后，必然被病毒RNA多聚酶复合物转录成正义mRNA。因而，由基因组vRNA与 NP和多聚酶蛋白形成了最小复制单位。尽管存在这些障碍，已建立了反向遗传学方法以产 生非区段的负义RNA病毒，包括狂犬病毒(Snell等人，1994)、水疱性口炎病毒(Lawson等 人，1995)、麻疹病毒(Radecke等人，1995)、呼吸道合胞病毒(Collins等人，1995)、仙台病 毒(Garcin等人，1995 ；Kato等人，1996)、牛瘟病毒(Baron等人，1997)、人副流感病毒3型 (Hoffman 等人，1997)和 SV5 (He 等人，1997)。正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviradae)和布尼亚病毒科 (Bunyaviridae)含有区段负链RNA基因组，并包括一些人类和动物病原体如流感病毒A、B 和C型(正粘病毒科)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)(沙粒病毒科)和脑炎病毒 和出血热病毒(布尼亚病毒科、沙粒病毒科)。它们的基因组由两条(沙粒病毒科)、三条 (布尼亚病毒科)或者六到八条(正粘病毒科)负极性(与mRNA互补)单链RNA分子组 成。vRNA与NP和依赖于病毒RNA的RNA聚合酶相互反应形成了核糖核蛋白复合物(RNPs)。 RNPs由宿主细胞的脂肪双分子层包围。嵌在这个包膜中的病毒糖蛋白是受体结合和进入宿 主细胞所必需。因此，从克隆的cDNA产生区段负义RNA病毒提出了一个艰难的挑战，因为 各个基因区段必须分别产生一个vRNA。Bridgen和Elliott (1996)从编码反基因组正义vRNA的三个区段克隆的cDNA制 得了布尼奥罗病毒(布尼亚病毒科)。然而，病毒回收率低。没有完全地从克隆cDNA中得 到一个正粘病毒(包含6个(Thogoto病毒)、7个(流感C型病毒)或8个(流感A型和 B型病毒)〕的负义RNA。在控制流感传染的努力中人们已最尖锐地感觉到进步中的这种滞后。
palese和他的同事(Enami等人，1990)率先采用流感A型病毒(图1A)的反向遗 传学和依赖于辅助病毒的系统。在他们的方法中，在纯化的聚合酶和NP蛋白的存在下从体 外vRNA合成产生RNP复合物，然后用来转染真核细胞。接着用流感A型辅助病毒感染导致 产生含有衍生自克隆的cDNA—个基因的病毒。另一方法是Neumann等人(1994)发展的， 该方法的基础是以RNA聚合酶I体内合成vRNA(图1B)，聚合酶I (Pol I)是种能转录缺少 5'加帽和3'聚A尾的核糖体RNA的胞内酶。用流感病毒感染并用含有侧接小鼠RNA聚合 酶I启动子和终止子序列的克隆的流感病毒cDNA的质粒转染细胞，导致了病毒转染子的产 生。然而，在这两种方法中，必须从大量的背景辅助病毒中挑选转染子，这就需要强的选择 系统并使产生具有生长缺陷的病毒变得复杂。Mena等人发展了一种产生复制不全病毒样颗粒(VLP)的系统(1996)，在该系统 中，将编码一报道基因的流感病毒样vRNA体外转录，并转染入真核细胞中。在T7 RNA聚 合酶启动子的控制下，表达了质粒的所有十种流感报道蛋白质。当被转染的细胞用表达T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒感染时，它们产生了流感VLP。然而，该系统效率低在25%的 试验中，研究者没有检测到报道基因的表达。而且，牛痘病毒表达80种以上的蛋白质，其中 的任何一个都可能影响流感病毒的生命周期。因此，需要一种方法来从克隆的cDNA中制备区段负链RNA病毒，如流感A型病毒 等正粘病毒科病毒。

发明内容
本发明提供至少一种下列已分离和纯化的载体即含有操作性连接于已连接了转 录终止序列的流感病毒PA cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序 列的流感病毒PB1 cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感 病毒PB2 cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒HA cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒NP cDNA的启 动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒NA cDNA的启动子的载 体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒M cDNA的启动子的载体、含有操 作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒NS cDNA的启动子的载体。相对于该启动子， 该cDNA可以是有义或反义取向。因而，本发明的一个载体可编码正粘病毒蛋白质(有义) 或vRNA (反义)。可采用启动子来表达病毒蛋白质。编码vRNA的载体所含的较佳启动子包 括但不限于RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子 和T3启动子。另外，优选RNA聚合酶I启动子是人RNA聚合酶I启动子。编码vRNA的载 体的优选转录终止序列包括但不限于RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止 序列、RNA聚合酶III转录终止序列或者核酶。虽然可以预见病毒的基因可用于本发明的 方法中或载体中，但是优选该载体包含流感cDNA，如流感A型(如包括15HA或9NA亚型之 一的流感A型基因)、B型或C型DNA〔见Fields等人(编辑)的Virology第45章和第 46 章，Lippincott-Raven Publ.，Philadelphia, PA(1996)，本文特别引入作为参考〕。本发明提供一种含有多个本发明正粘病毒载体的组合物。在本发明的一个实施例 中，该组合物包括a)至少两种选自以下的载体，含有操作性连接于已连接了转录终止序 列的流感病毒PA cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒PB1 cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒PB2 cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒HA cDNA的启 动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒NP cDNA的启动子的载 体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒NA cDNA的启动子的载体、含有操 作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒M cDNA的启动子的载体、含有操作性连接 于已连接了转录终止序列的流感病毒NS cDNA的启动子的载体；b)至少两种选自以下的载 体，编码流感病毒PA的载体、编码流感病毒PB1的载体、编码流感病毒PB2的载体、编码流 感病毒NP的载体。优选编码病毒蛋白质的该载体还包括转录终止序列。含有流感病毒cDNA 的载体的启动子优选包括RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启 动子、T7启动子和T3启动子。同样，含有流感病毒cDNA的各载体优选包含转录终止序列， 如RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列或RNA聚合酶III转录终止序 列，或者核酶。优选该载体包含流感病毒DNA，如流感病毒A、B或C型DNA。更优选，包含多个正粘病毒载体的该组合物包括a)至少两种选自以下的载体， 含有操作性连接于已连接了 RNA聚合酶I转录终止序列的流感病毒PA cDNA的RNA聚合酶 I启动子的载体、含有操作性连接于已连接了 RNA聚合酶I转录终止序列的流感病毒PB1 cDNA的RNA聚合酶I启动子的载体、含有操作性连接于已连接了 RNA聚合酶I转录终止序 列的流感病毒PB2 cDNA的RNA聚合酶I启动子的载体、含有操作性连接于已连接了 RNA聚 合酶I转录终止序列的流感病毒HAcDNA的RNA聚合酶I启动子的载体、含有操作性连接于 已连接了 RNA聚合酶I转录终止序列的流感病毒NP cDNA的RNA聚合酶I启动子的载体、含 有操作性连接于已连接了 RNA聚合酶I转录终止序列的流感病毒NA cDNA的RNA聚合酶I 启动子的载体、含有操作性连接于已连接了 RNA聚合酶I转录终止序列的流感病毒M cDNA 的RNA聚合酶I启动子的载体、含有操作性连接于已连接了 RNA聚合酶I转录终止序列的 流感病毒NS cDNA的RNA聚合酶I启动子的载体；和b)至少两种选自以下的载体，编码流 感病毒PA的载体、编码流感病毒PB1的载体、编码流感病毒PB2的载体、编码流感病毒NP 的载体、编码流感病毒HA的载体、编码流感病毒NA的载体、编码流感病毒Ml的载体、编码 流感病毒M2的载体和编码流感病毒NS2的载体。本发明另一实施例包括还含有载体的本发明上述组合物，该载体包含连接于正 粘病毒5'非编码序列的启动子，该非编码序列连接在已连接了转录终止序列的正粘病毒 3'非编码序列的理想的接头上。在能进行正粘病毒复制的宿主细胞中导入这种组合物产 生了重组病毒，该重组病毒包含对应于该载体序列的vRNA，该载体包含连接于cDNA的正粘 病毒5'非编码序列，而该cDNA连接于正粘病毒3'非编码序列。较佳的是，该cDNA是反义 取向的。同样优选该启动子是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III 启动子、T7启动子和T3启动子。同样优选该转录终止序列是RNA聚合酶I转录终止序列、 RNA聚合酶II转录终止序列或RNA聚合酶III转录终止序列，或者核酶。例如，该cDNA可 以编码一个免疫原性表位，如用于癌症治疗或疫苗的表位。本发明多个载体可以用物理方法连接或者各载体可以以单个质粒或其他(如线 性核酸传送载体)形式存在。本发明还提供一种制备流感病毒的方法。该方法包括使细胞与本发明的多种载体 依次或同时接触，例如，使用足以产生感染性流感病毒的量的本发明组合物。本发明还包括从与该组合物接触的细胞中分离出病毒。因而，本发明还提供分离的病毒以及与本发明组 合物或分离的病毒接触的宿主细胞。如下所述，流感A病毒可完全由克隆的cDNA制得。本文所描述的反向遗传方法是 高效的，并能用于将突变导入任何基因节段，以及用于发展以流感病毒为基础的基因传送 系统。例如，用8个质粒转染人胚肾细胞(293T)，各个质粒编码A/WSN/33(H1N1)病毒或A/ PR/8/34 (H1N1)病毒的病毒RNA，两侧连接有人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终 止子，以及用编码病毒核蛋白和PB2、PB1和PA病毒聚合酶的质粒一起转染。该方法在转 染后48小时每毫升上清液中产生了 1X103噬斑形成单位(pfu)以上的病毒。取决于所产 生的病毒，加入能表达所有其余病毒结构蛋白质的质粒导致了大量病毒的产生，产率大于 3X 104pfu/ml。还用该反向遗传方法来产生含有A/PR/8/34病毒的PB1基因以及所有代表 A/WSN/33其他基因的重辅助病毒。通过此方法产生的其他病毒在PA基因中含有突变，或者 在神经氨酸酶蛋白质的头部可有外源表位。而且，也可以对其他病毒使用同样的方法完全地从克隆的cDNA中产生非区段负 链RNA病毒(即副粘病毒科、弹状病毒科和线状病毒科)，或者其他区段负链RNA病毒，如沙 粒病毒科和布尼亚病毒科。另外，在细胞中表达cRNA而不是vRNA可以提高病毒产生的效率。本发明方法基于对流感病毒进行操作，如将减毒突变导入病毒基因组中。另外，由 于流感病毒能诱导强烈的体液和细胞免疫力，本发明极大地提高了这些病毒作为疫苗载体 的能力，特别是从该病毒的自然变种的可获得性看，可以依次使用这些载体，并允许在基因 治疗中反复使用。因而，本发明提供了分离的和纯化的载体或质粒，它们表达或编码流感病毒的蛋 白质，或者表达或编码天然或重组的流感vRNA。因此，本发明的载体或质粒可包含一个感兴 趣的基因或开放读框，如编码可用作疫苗的免疫原性肽或蛋白质的外源基因。优选表达流 感vRNA的载体或质粒包含适合于在具体宿主细胞如鸟或哺乳动物(如犬、猫、马、牛、羊) 或包括人细胞的灵长类动物细胞中表达的启动子，如RNA聚合酶I启动子。同样，该包含用 于制备流感vRNA的DNA的载体或质粒优选包含RNA聚合酶I转录终止序列。对于含有一 个感兴趣的基因或开放读框的载体或质粒，该基因或开放读框优选两侧连接有流感病毒的 5'和3'非编码序列，更优选，该基因或开放读框操作性连接于RNA聚合酶I启动子和RNA 聚合酶I转录终止序列。如下所述，用编码流感A型病毒结构蛋白的质粒和两侧连接有RNA聚合酶I启动 子和终止子的含有绿荧光蛋白(GFP)报道基因的质粒转染293T。这些结构在胞内通过RNA 聚合酶I转录，产生了包装在流感病毒样颗粒中的GFP vRNA。每毫升上清液产生104以上 感染颗粒的该系统，可以用来研究流感病毒复制和颗粒的形成。它还可以很好地用于疫苗 的生产和开发改进的基因治疗载体。因此，本发明还提供一种宿主细胞，该细胞的基因组稳定地增加了(augment)至 少一种重组DNA分子。该重组DNA分子至少包括下列分子中的一种含有在宿主细胞中能 发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有转录停止或终止序列的 DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒HA编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有转录停止或终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接 于流感病毒NA编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组 DNA分子，该启动子连接在已连接于含有转录停止或终止序列的DNA节段的第一 lox位点 上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒Ml编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细 胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有转录停止或终止 序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒NS2编码区域 的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接 在已连接于含有转录停止或终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在 已连接于流感病毒M2编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子 的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有停止或终止序列的DNA节段的第一 lox位 点上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒PA编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主 细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有停止或终止序 列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒PB1编码区域的 第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在 已连接于含有停止或终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接 于流感病毒PB2编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重 组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有转录停止或终止序列的DNA节段的第一 lox位 点上，该DNA节段连接在已连接于流感病毒NP编码区域的第二 lox位点上。优选该宿主细胞中增加了下述含有在该宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组 DNA分子，该启动子连接在已连接于含有转录终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该 DNA节段连接在已连接于流感病毒HA编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发 挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有转录终止序列的DNA节段 的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒NA编码区域的第二 lox位点上； 含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有转 录终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒Ml编码 区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子 连接在已连接于含有转录终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已 连接于流感病毒NS2编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子 的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有转录终止序列的DNA节段的第一 lox位点 上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒M2编码区域的第二 lox位点上。优选该lox位 点是loxP位点。本发明还提供一种制备感染性复制缺陷性流感病毒的方法。该方法包括使经增加 了至少一种本发明重组DNA分子(如编码HA、NA、Ml、M2、NS2、PA、PB1、PB2或NP)的宿主 细胞与重组流感病毒接触，该病毒包括含有Cre开放读框的vRNA以及含有宿主细胞不表达 的流感病毒基因的vRNA。然后从受到接触的细胞中回收病毒。优选该重组病毒还包括含有 所需开放读框的vRNA。或者，使增加了重组DNA分子的宿主细胞与一种载体接触，该载体包 含操作性连接于编码Cre的DNA节段的在宿主细胞中能发挥功能的启动子，和与各含有操 作性连接于在宿主细胞中不存在的流感病毒cDNA的启动子的多个载体接触。然后回收病
本发明还提供一种宿主细胞，该宿主细胞的基因组中增加了一个下述重组DNA分 子含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含 有终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于宿主细胞表面结 合蛋白编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分 子，该启动子连接在已连接于含有终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连 接在已连接于融合蛋白编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动 子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有终止序列的DNA节段的第一 lox位点上， 而该DNA节段连接在已连接于流感病毒Ml编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中 能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有终止序列的DNA节段 的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒NS2编码区域的第二 lox位点 上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含 有终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒M2编码 区域的第二 lox位点上。优选该lox位点是loxP位点。另一实施例是一种宿主细胞，在该宿主细胞的基因组中增加了下列一种重组DNA 分子含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于 含有终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于宿主细胞表面 结合和融合蛋白编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重 组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有终止序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该 DNA节段连接在已连接于流感病毒Ml编码区域的第二 lox位点上；含有在宿主细胞中能发 挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有终止序列的DNA节段的第 一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒NS2编码区域的第二 lox位点上；含 有在宿主细胞中能发挥功能的启动子的重组DNA分子，该启动子连接在已连接于含有终止 序列的DNA节段的第一 lox位点上，而该DNA节段连接在已连接于流感病毒M2编码区域的 第二 lox位点上。优选该lox位点是loxP位点。上述增加了重组DNA分子的宿主细胞可用于制备感染性复制缺陷性流感病毒。例 如，使经编码HA、NA、Ml、M2和NS2的重组DNA分子稳定转化的宿主细胞与多个载体接触， 即与表达含有Cre开放读框的vRNA、含有PA的vRNA、含有PB1的vRNA、含有PB2的vRNA的 载体，以及可任选地表达含有感兴趣基因的vRNA的载体；以及编码PA、PB1、PB2和NP的载 体接触。不需要辅助病毒感染的生产本文所述病毒的方法可用于病毒诱变研究、疫苗生产 (如治疗AIDS、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、鼻病毒、线状病毒、疟疾、疱疹及口蹄疫)和基因 治疗载体(如治疗癌症、AIDS、腺苷脱氨酶缺陷、肌肉营养不良、鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷和 中枢神经系统肿瘤)。因而，提供了一种用于医学治疗(如用于疫苗或基因治疗)的病毒。例如，本发明 提供了一种免疫接种个体以抵抗病原体如细菌、病毒或寄生生物或恶性肿瘤的方法。该方 法包括给予个体一定量的至少一种本发明的分离病毒，可任选地与能有效增强个体免疫力 的佐剂组合给药。该病毒包括含有由病原体编码的多肽或肿瘤特异性多肽的vRNA。还提供了一种方法，该方法能提高或增强由于其内源性蛋白质缺乏或量减少而出 现疾病或症状的哺乳动物的该内源蛋白质的表达。该方法包括给予哺乳动物一定量的本发明的分离的病毒，以有效提高或增加该哺乳动物的此内源蛋白质。较佳的是，哺乳动物是 人。本发明还提供重组产生和正链病毒(如正义RNA病毒)的载体和方法。因而，本 发明提供了一种含有DNA节段的载体，该DNA节段包含操作性连接于另一含有正义RNA病 毒序列的DNA节段的RNA聚合酶I转录起始序列，任选地操作性连接于含有RNA聚合酶I 转录终止序列的第三个DNA节段。本发明还提供了一种使用该载体制备重组病毒的方法。 该方法特别可用于克隆的DNA和转染技术，因而避免了 RNA操作。而且，RNA聚合酶I转录 高效并高度逼真。对于那些基因组RNA未加帽(uncap)的正义RNA病毒(如瘟病毒、丙型 肝炎病毒；小RNA病毒，包括脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒，以及口蹄疫病毒)，将 编码全长基因组的cDNA以基因组取向方式导入RNA聚合酶I启动子和终止子序列之间。 将产生的质粒转染到允许的宿主细胞中，产生用于病毒复制的基因组RNA。大量的正义RNA 病毒含有加帽的基因组RNA (如黄病毒，包括登革热病毒和几种脑炎病毒)。当RNA聚合酶 I转录物没有加帽结构时，使编码具有加帽基因组RNA的RNA病毒的全长基因组的cDNA，以 反基因组取向方式导入RNA聚合酶I转录载体中。将所得到的质粒转染后，胞内RNA聚合 酶I转录了反基因组(未加帽)RNA。而且，为了复制所需的蛋白质而进行的蛋白质表达质 粒的共转染导致反基因组RNA的复制，由此产生得到基因组RNA和最终的传染性病毒。


图1.已建立的反向遗传学系统的示意图。在RNP转染方法㈧中，用体外合成 vRNA将纯化的NP和聚合酶蛋白质装配到RNP中。用RNP转染细胞，接着用辅助病毒转染。 在RNA聚合酶I方法(B)中，将含有RNA聚合酶I启动子的质粒、编码待拯救的vRNA的cDNA 以及RNA聚合酶I终止子转染到细胞中。RNA聚合酶I的胞内转录产生了合成的vRNA，该 vRNA被包装在用辅助病毒感染后的子代病毒颗粒中。通过这两种方法，从辅助病毒种群中 选出转染子病毒(即含有衍生自克隆的cDNA的RNA的病毒)。图2.产生RNA聚合酶I构建物的示意图。通过PCR扩增得自流感病毒的cDNA， 用 BsmBI 消化并克隆到 pHH21 载体的 BsmBI 位点上(E. Hoffmann, Ph. D. thesis, Justus, Liebig-University, Giessen, Germany)，该载体含有人RNA聚合酶I启动子(P)和小鼠RNA 聚合酶I终止子(T)。该终止子序列上游的胸苷核苷酸CT)代表该流感病毒RNA的3'端。 流感A型病毒序列用粗体字表示。图3.提出了用来产生区段负义RNA病毒的反向遗传方法。将含有RNA聚合酶I 启动子的质粒、8个病毒RNA节段每一节段的cDNA和RNA聚合酶I终止子与蛋白质表达质 粒一起转染到细胞中。虽然可用表达PA、PB1、PB2和NP的质粒产生传染性病毒，但是所有 其余结构蛋白质(列在方括弧中)的表达提高了依赖于所产生病毒的病毒生产效率。图4.检测感染了转染子病毒的细胞中的FLAG肽。用抗体染色来鉴别感染了 PR8-WSN-FL79 (A, D)或A/WSN/33野生型病毒(B，E)的MDCK细胞中，或者模拟感染的MDCK 细胞(C，F)中的NA。感染9个小时后，用多聚甲醛固定细胞，用Triton X-10处理并在抗 FLAG(A-C)或抗WSN NA(D-F)单克隆抗体中培育。在阳性样品中(A、D和E)出现了强烈的 高尔基染色(红色)。图5. PA突变体的回收。通过RT-PCR用引物扩增了各病毒的PA基因，产生1226bp
10的节段(mRNA的第677位到1903位，在第1、3和5泳道)，然后用限制性内切酶Bspl20I (在 mRNA的第846位，第4和7泳道)或PvuII (在mRNA的第1284位，第2和6泳道)消化。 PCR产物中Bspl20I或PvuII位点的存在分别产生了 169bp和1057bp,或607bp和619bp 的节段。MW =标记物分子量。图6.用于扩增流感病毒序列的引物。图7.用于产生编码GFP蛋白的流感病毒样RNA的pPoII-GFP质粒。这个质粒含有 在流感A型病毒节段5的5'和3'非编码区域之间以反义取向形式存在的GFP基因(从 pEGFP-Nl获得；Clontech，Palo Alto, CA)，该基因两侧连接连有人RNA聚合酶I启动子和 小鼠RNA聚合酶I终止子。图8. VLP产生策略示意图。将表达单个蛋白质的质粒和含有RNA聚合酶I启动子、 编码GFP报道基因的cDNA和RNA聚合酶I终止子的质粒转染到293T细胞中。通过RNA聚 合酶I的胞内转录产生负极性的GFP vRNA，以倒写字表示。收集含有VLP的上清液，与流感 辅助病毒混合并接种到MDCK细胞中。图9.流感A型病毒的PA、PB1、PB2和NP蛋白质将RNA聚合酶I产生的GFP vRNA 中包入衣壳，引起了 GFP的表达。用表达PB2、PB1、PA和NP蛋白(A)的质粒或者用除表达 NP蛋白(B)之外的所有质粒，和报道基因vRNA胞内合成的RNA聚合酶I-GFP基因质粒一起 转染293T细胞。转染48小时后将细胞固定，用荧光显微镜测定GFP表达。图10.传染性流感VLP的产生。用各达不同病毒结构蛋白(A)的9种质粒或者删 去NP(B)结构的8种质粒，和RNA聚合酶I-GFP基因质粒一起转染293T细胞。转染48小 时后，收集含有VLP的上清液，与A/WSN/33辅助病毒混合，并接种到MDCK细胞中。感染10 个小时后将细胞固定，用荧光显微镜测定GFP表达。图11.使用Cre重组酶在其基因组中增加了重组DNA分子的细胞中表达流感NS2 蛋白的示意图。该细胞的基因组含有一个重组DNA分子，该分子包含连接于一个位点特异 性重组位点(如loxP)的一个启动子，该重组位点连接于转录终止序列上，该终止序列以与 第一个位点特异性重组位点连接于NS2基因的同样取向，连接到第二个位点特异性重组位
；卜.o图12.复制缺陷性流感病毒的制备。
具体实施例方式^X本文所用的“分离的和/或纯化的”指在体外制备、分离和/或纯化本发明的载体 和/或质粒，使其不与体内的物质相结合，或者主要地从体外物质中纯化。本文所用“重组 核酸”或“重组DNA序列或节段”指一种核酸(如DNA)，该核酸虽衍生于或分离自其来源，但 随后在体外发生了化学变化，因此其序列不是天然产生的，或者只是相应于天然产生的序 列，但其所处的位置不是它们在天然基因组中应处的位置。衍生自其来源的DNA的例子应 是经鉴定认为是有用片段的DNA序列，该序列然后可用化学方法合成成为基本纯的形式。 “分离”自某来源的DNA的例子是通过化学方法(如使用限制性核酸内切酶)从所述来源中 切下或取得的有用的DNA序列，这样可通过基因工程方法作进一步处理(如扩增)而用于 本发明。
本文所用“位点特异性重组”包括以下3种情况1)删除两侧连接有位点特异性重 组位点或序列(如loxP位点)的靶DNA节段；2)倒置两侧连接有位点特异性重组位点或 序列(如loxP位点)的靶DNA节段的核苷酸序列；3)相互交换位于在不同DNA分子中最 接近位点特异性重组位点或序列(如loxP位点)的靶DNA节段。位点特异性重组酶系统 包括但不限于噬菌体P1的Cre/loxP系统(美国专利第5658772号)。为了补正位点特异性重组反应的可逆性，可以改变该重组系统的结构。位点特异 性重组序列有可能以该重组反应的产物不再被认为是该逆反应的底物的方式来产生突变， 因此使此种整合或切除稳定化。例如，为去除不需要的序列，将同样取向的lox位点置于该 不需要序列的两侧。其他lox位点包括从大肠杆菌中分离得到的核苷酸序列的loxB、loxL和loxR位 点〔Hoess 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 3398 (1982)〕。lox 位点还可通过本领域熟知 的各种合成技术来产生。例如，产生lox位点的合成技术公开在Ito等人[Nuc.Acid. Res., 10，1755(1982)〕和 Ogilvie 等人〔Science, 214, 270 (1981)〕的著作中。本文所用表达“lox位点”，指一核苷酸序列，其中的ere基因的基因产物能催化位 点特异性重组。loxP是一个有34个碱基对的核苷酸序列，可通过本领域熟知的方法将其 从噬菌体 P1 中分离出来〔见,如 Hoess 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,3398 (1982)〕。 loxP由被8个碱基对间隔区分开的两条13个反向重复碱基对所组成。本文所用的表达“ere基因”，指编码某酶基因产物的核苷酸序列，该产物影响真核 细胞中lox位点外的位点特异性DNA重组。可以通过本领域熟知的方法从噬菌体P1中分 离得到 ere 基因〔见 Abremaid 等人，Cell, 32，1301-1311 (1983)〕。流感病毒的复制流感A型病毒基因组拥有8条编码总共10种蛋白质的单链负义病毒RNA(vRNA)。 流感病毒的生命周期始于血凝素(HA)与宿主细胞表面含唾液酸的受体相结合，随后发生 受体介导的胞吞作用。晚期(late)内体中的低pH引发了 HA构像改变，因而暴露了 HA2亚 单位(即所谓的融合肽)的N末端。该融合肽启动了病毒和内体膜的融合，基质蛋白(Ml)和 RNP复合体被释放到细胞质中。RNP由包裹vRNA的核蛋白(NP)和PA、PB1和PB2蛋白形成的 病毒聚合酶复合体组成。RNP被转运到细胞核中，在那发生转录和复制。RNA聚合酶复合体 催化3种不同的反应具有5'加帽和3'聚A结构的mRNA的合成、全长互补RNA(cRNA)的 合成和用cDNA作为模板的基因组vRNA的合成。新合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白质然后装 配到RNP中，从细胞核中运出，转运到质膜上，在那里发生子代病毒颗粒出芽。神经氨酸酶 (NA)蛋白通过去除唾液酸寡糖的唾液酸在以后的感染中起着重要的作用，从而从细胞表面 释放出新装配的病毒颗粒，并防止病毒颗粒的自我凝集。虽然病毒装配涉及蛋白质-蛋白 质和蛋白质-vRNA之间的相互作用，但是这些相互作用的性质很大程度上还是未知的。ThoRQto 病毒Thogoto病毒(TH0V)代表正粘病毒科的一个新种。它们由蜱传播并已在驯养动 物中(包括骆驼、山羊和牛)发现，因此，TH0V能在蜱和脊椎动物中复制。TH0V基因组包含 6段单链负义RNA节段。由3条最大节段编码的蛋白质显示与流感病毒聚合酶蛋白质PB2、 PB1和PA有显著的同源性。节段5编码一个与流感病毒NP有关的蛋白质。节段4编码的 TH0V糖蛋白与流感病毒HA或NA都没有同源性，但是它的序列显示与杆状病毒糖蛋白有相似性。认为最小节段编码基质蛋白并且不与任何流感病毒蛋白质相似。与流感病毒相似， 启动子活性需要该vRNA的3'和5'端二者，此活性分别位于该vRNA的3'和5'端的末 端14和15核苷酸上。TH0V的mRNA合成最初由宿主细胞衍生的帽结构开始。然而，与流感病毒相反， 只从细胞的mRNA中切割下该帽结构(没有额外的核苷酸)(Albo等人，1996 ；Leahy等人， 1997 ;Weber等人，1996)。体外的切割试验揭示vRNA的5‘和3'端都是核酸内切酶活性 所需要(Leahy等人，1998)，但是如流感病毒所显示的那样(Cianci等人，1995 ；Hagen等 人，1994)，加入模拟的cRNA启动子并不激发核酸内切酶活性(Leahy等人，1998)。已提议 对TH0V使用“钩状”结构(Leahy等人，1997 ；Weber等人，1997)，这与提议对流感病毒使用 螺旋塞结构相类似(Flick等人，1996)。然而，这种“钩状”结构仅见于THOV vRNA启动子 中。cRNA启动子序列不允许其5'端的2和9位之间以及3和8位之间形成碱基对。替换 3位或8位以允许在这些核苷酸之间形成碱基配对会激发核酸内切酶活性，这是对提出的 “钩状”结构强有力支持的证据(Leahy等人，1998)。而且，该结构可能对TH0V生命周期的 调控是关键性的；形成该“钩状”结构的vRNA启动子可以激发PB2核酸内切酶的活性，因而 可进行转录。相反，cRNA启动子可能不形成“钩状”结构，因此可能不能激发核酸内切酶的 活性，因而引起复制。布尼亚病毒科布尼亚病毒科包括导致人出血热或脑炎热(如裂谷热、汉坦病(Hantaan)、La Crosse和Crimean-Congo出血热)几种病毒。球状和有包膜的病毒粒子含有3段单链负 义RNA节段(见Elliott，1997)。最大的节段(L)编码病毒RNA聚合酶蛋白(L蛋白)，而 M节段编码G1和G2两个病毒糖蛋白以及一个非结构性蛋白质(NSm)。最小节段(S)编码 核衣壳蛋白质(N)和另一非结构性蛋白质(NSs)。病毒的复制和转录发生在细胞质中，新装 配的病毒粒子通过高尔基体的膜出芽产生。Bridgen和Elliott (1996)已建立了一种反向遗传系统，以从克隆的cDNA完整地 产生传染性布尼奥罗病毒。他们采用了首先由Schnell等人(1994)描述的用于狂犬病毒 的策略在表达病毒聚合酶和核蛋白的细胞中进行编码正义反基因组RNA(而不是负义基 因组RNA)的cDNA的胞内转录。Bridgen和Elliott (1996)用表达T7聚合酶的牛痘病毒转 染HeLaT4+细胞，然后用表达S、M和L节段编码的蛋白质的质粒转染这些细胞。接着他们 用3个编码两侧连接T7聚合酶启动子和8肝炎病毒核酶的全长反基因组cDNA的质粒转 染这些细胞。为了增加布尼亚病毒相对于牛痘病毒颗粒的数目，该作者使用了蚊子细胞，在 该细胞中复制的是布尼奥罗病毒而不是牛痘病毒。这个方案不仅能用基因工程来改造布尼 亚病毒，还可以产生用不同的布尼亚病毒株共传染不易获得的重配辅助病毒。为了研究转录与复制所需要的布尼亚病毒启动子元件和病毒蛋白质，Dunn等人 (1995)以负义取向克隆了布尼奥罗S RNA节段5'和3'非翻译区域之间的CAT基因。用 表达L和S节段编码蛋白质的结构建钩转染细胞，然后在体内用转录的RNA转染，这样导致 了 CAT活性。布尼亚病毒S节段在重叠的读框中编码两种蛋白质，即N和NSs。为确定这两 种蛋白质是否都是转录和复制所需要，检测了仅表达N或NSs构建物的CAT活性。N蛋白与 L蛋白一起表达导致CAT活性，而用NSs构建物没有检测到CAT活性。因此，对布尼亚病毒 样RNA的转录和复制，L蛋白和N蛋白足以发挥作用。
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对于流感病毒而言，布尼亚病毒RNA的末端序列是互补的且高度保守。也因此 假定这些序列建明确定义了布尼亚病毒启动子并且对于启动子活性有关键作用。该病毒 RNA3'端5个核苷酸的删除极大地减少了 CAT表达(Dunn等人，1995)。相反，在5'端加入 2个核苷酸，或者在3'端加入11个或35个核苷酸并不消除CAT表达(Dunn等人，1995)。 因此，与流感病毒聚合酶复合体一样，布尼亚病毒聚合酶蛋白能明显地在内部启动转录和/ 或复制。本发明将在下面的实施例中作进一步的描述。实施例1材料和方法细胞和病毒.293T人胚肾细胞和Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)分别培育在增加 了 10%胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中和含有5%新生牛血清的改进 的Eagle培养基中。所有的细胞在37°C和5%0)2中培养。使流感病毒A/WSN/22 (H1N1)和 A/PR/8/34(HlNl)在10日龄鸡蛋中增殖。质粒的构津.为产生RNA聚合酶I构建物，将从A/WSN/33或A/PR/8/34病毒RNA 得到的克隆的cDNA导入RNA聚合酶I的启动子和终止子序列之间。简言之，通过PCR用 含有BsmBI位点的引物扩增该克隆的cDNA，用BsmBI消化，并克隆到含有人RNA聚合酶I 启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子的pHH21载体的BsmBI位点中，再通过BsmBI位点分离 (图2)。通过PCR扩增A/WSN/33株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因，扩增时分别 使用下列质粒pSCWPB2、pGff-PBl和pSCWPA(所有的都从加利福尼亚洛杉矶大学的Debi Nayak 博士得到)；pWH17、pWNP152、pT3WNA15 (Castrucci 等人，1992) ；pGT3WM 和 pWNSl。使 用pcDNA774(PBl, Perez等人，1998)作为模板扩增流感A/PR/8/34病毒的PB1基因。引 物的序列见图6。为确保该基因没有不要的突变，根据制造商建议的方案用其自动测序仪 (Applied Biosystem Inc.，CA，USA)测序 PCR 得到的节段。如 Huddleston 等人(1982) 所述克隆了编码A/WSN/33病毒的HA、NP、NA和Ml基因的cDNA，并亚克隆到真核表达载体 pCAGGS/MCS中(由鸡3 -肌动蛋白启动子控制，Niwa等人，1991)，分别产生了 pEWSN_HA、 pCAGGS-WSN-NP0-14、pCAGGS-WNA15 和 pCAGGS-WSN-Ml-2/l。通过 PCR 扩增 了 A/PR/8/34 病 毒的M2和NS2基因，并克隆到pCAGGS/MCS中，产生pEP24c和pCA_NS2。最后，在巨细胞病 毒启动子的控制下，用 pcDNA774(PBl)、pcDNA762 (PB2)和 pcDNA787 (PA)表达 PB2、PB1 和 PA蛋白质。传染件流感颗粒的产牛.用最多17种质粒以不同的量以及根据制造商的说明书 用 Trans IT LT-1 (Panvera，Madision, Wisconsin)转染 293T 细胞(1X106)。简言之，将 DNA和转染试剂混合(每微克DNA用2微升Trans IT-LT-1)，室温共培育45分钟，然后加到 细胞中。6小时之后，用含有0. 3%牛血清蛋白和0.01%胎牛血清的0pti-MEM(Gibco/BRL， Gaithersburg, Maryland)替换该DNA-转染试剂混合物。在转染后的不同时间里，从上清 液中收集病毒并在MDCK细胞上滴定。由于这个步骤不需要辅助病毒，回收的转染子病毒的 分析不必进行麻烦的纯化。质粒-转染细胞产生病毒的百分比的确定.转染后24小时，用0. 02% EDTA将 293T细胞分散成单个细胞。将该细胞悬液稀释10倍，转移到铺满MDCK单层细胞的24孔板 中。用血凝试验检测病毒。
免疫染饩试验.细胞用流感病毒感染9小时后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两 次，并在室温下用3. 7%多聚甲醛(PBS溶液)固定20分钟。接着，用0. Triton X-100 处理，并如Neumann等人(1997)所述的方法进行操作。MM诵i寸翩RNA汰艮口 3禾口 NP■■表汰，^ 牛感染件病毒.虽然用从纯化的病毒颗粒中抽提得到的RNP的混合物转染细胞，产生了感 染性流感颗粒，但是当用8种不同的体外产生的RNP转染时，这种策略不可能有效。为了完 全从克隆的cDNA中产生感染性流感病毒，在体内产生了 8种病毒RNP。因而，制备了含有 A/WSN/33病毒的全长病毒RNA的cDNA，其两侧连接人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合 酶I终止子。原理上，将这8种质粒转染到真核细胞中应能导致所有8种流感vRNA的合成。 蛋白表达质粒共转染产生的PB2、PBUPA和NP蛋白应将vRNA装配到可被复制和转录的功 能性vRNP中，最后形成感染性流感病毒(图3)。用蛋白表达质粒〔1微克pcDNA762(PB2)、 1 微克 pcDNA774(PBl)、0. 1 微克 pcDNA787 (PA)和 1 微克 pCAGGS-ffSN-NPO/14)和 1 微克的 各下列 RNA 聚合酶 I 质粒(pPoII-WSN-PB2、pPoII-WSN-PBl、pPoII-WSN-PA、pPoII-WSN-HA、 pPoII-WSN-NP、pPoII-WSN-NA、pPoII-ffSN-M 和 pPoII-WSN-NS)转染 1 X 106 个 293T 细胞。 使用减少量的pcDNA787(PA)的决定是根据以前的观察(Mena等人，1996)和产生病毒样颗 粒(VLP)最优化条件的数据(未给数据)。293T细胞转染24小时后，发现在每毫升上清液 中有7X 103pfu的病毒(实施例1，表1)，这第一次证明了反向遗传方法能够完整地从质粒 中产生流感A型病毒。^！^用于从克隆的cDNA中产生流感病毒的质粒
15 *用所示的质粒转染293T细胞。24小时(实验1或2)或48小时(实验3_8)后， 测定MDCK细胞上清液中的病毒滴度。!除非有另外的说明，质粒用代表A/WSN/33病毒RNA的cDNA构建而成。流感病毒的产牛和所有病毒结构蛋白质共表汰的效率.虽然病毒NP和聚合酶蛋 白的表达对质粒驱动产生的流感病毒已足够，但其效率改进还有可能。在前面的研究中， 所有流感病毒结构蛋白质(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、Ml、M2和NS2)的表达产生了含有编 码报道物氯霉素_乙酰基转移酶基因的人造VLP (Mena等人，1996)。因而，获得完全互补的结构蛋白质而不是仅仅那些RNA复制和转录所需的蛋白质，可能增加病毒产生的效率。 为此，293T细胞用下列最优化的病毒蛋白表达质粒转染(如由VLP产物所判断；未公开数 据)1 微克 pcDNA762 (PB2)和 pcDNA774 (PB1) ；0. 1 微克 pcDNA787 (PA)，1 微克 pEWSN-HA， pCAGGS-WSN-NPO/14 和 pCAGGS_WNA15 ；2 微克 pCAGGS-WSN-Ml-2/l ；0. 3 微克 pCA_NS2 ；和 0. 03微克pEP24c (M2)，以及1微克各RNA聚合酶I质粒(实验2，表1)。用同样一组的RNA 聚合酶I质粒(但PB1基因例外，其以pPoII-PR/8/34-PBl替代来产生重配辅助病毒)和只 表达PA、PB1、PB2和NP的质粒(实验3，表1)或者表达所有流感结构蛋白的那些质粒(实 验4，表1) 一起转染另一批细胞。转染后24小时(实验1和2，表1)或36小时(未给数 据)的WSN病毒产量并未有明显的差异。然而，当提供所有的流感病毒结构蛋白时(实验3 和4，表1)，发现PR/8/34-PB1的病毒产量增加10倍以上。而缺少表达PA、PB1、PB2和NP 蛋白的质粒之一的诸阴性对照都不产生任何病毒(实验5-8，表1)。因而，取决于所产生的 病毒，所有流感A型病毒结构蛋白的表达明显地促进了该反向遗传系统的效率。接着，使用用来产生具有A/PR/8/34-PB1基因的病毒的一组质粒侧定了细胞转染 后病毒产生的动力学。在3次实试验的二次中，转染后24小时首先侧到病毒，该时间测得 的滴度为> 103pfu/ml，转染后48小时增加到> 106pfu/ml (表2)。为评估正在产生病毒的 质粒转染的细胞的百分比，转染后24小时用EDTA(0. 02% )处理293T细胞以使其分散，然 后进行有限稀释研究。这一试验中，在此时间点上没有发现培养上清液中有游离病毒。该 结果表明在103 3个细胞中有1个细胞产生感染性病毒颗粒。MJ^质粒转染入293T细胞*后病毒产生的动力学 *用8种编码从A/WSN/33病毒(例外的是PB1基因，它衍生于A/PR/8/34病毒) 基因的RNA聚合酶I质粒和9种文中描述的蛋白表达质粒转染293T细胞。在不同的时间 点滴定MDCK细胞培养上清液中的病毒。ND表示未进行测试。含有NP蛋白FLAG表位的流感病毒的回收.为验证该新的反向遗传系统能将突变 导入流感A型病毒的基因组中，产生了含有NA蛋白FLAG表位(Castrucci等人，1992)的病毒。用RNA聚合酶I质粒(pPoII-WSN-NA/FL79)与所需的RNA聚合酶I和蛋白表达质粒一 起转染293T细胞，该RNA聚合酶I质粒含有编码NA蛋白及其头部底端FLAG表位的cDNA。 为证实该回收的病毒(PR8-WSN-FL79)确实表达NA-FLAG蛋白，进行用PR8-WSN-FL79或A/ WSN/33野生型病毒感染细胞的免疫染色试验。用抗FLAG表位的单克隆抗体检测感染了 PR8-WSN-FL79而非感染了野生型病毒的细胞(图4)。PR8-WSN-FL79病毒的回收与未加尾 的野生型病毒的回收一样有效(未给数据)。这些结果表明这种新反向遗传系统允许将诸 突变体导入流感A型病毒基因组中。含有PA突夺的感染件、流感病毒的产牛.为测试含有PA基因突变的病毒，导 入了两个沉默突变，产生了限制性核酸内切酶新的识别序列(Bspl20I识别mRNA的846位、 PvuII识别第1284位)。通过反向遗传学修饰这个基因在以前是不可能的，因为缺少可靠 的选择系统。回收得到转染子病毒PA-T846C和PA-A1284。用两次连贯的有限稀释生物学 方法克隆了该回收的转染子病毒。为证实该回收病毒是真正的具有PA基因突变的转染子， 通过反转录PCR获得PA基因的cDNA。如图5所述，PA-T846C和PA-A1284C病毒含有预期 的PA基因内的突变，如存在新导入的限制性位点所证明的那样。不用反转录步骤而以同样 的病毒和引物作PCR没有产生任何产物(未给数据)，这表明PA cDNA确实起源于vRNA而 不是用于产生病毒的质粒。这些结果阐明了具有突变基因的病毒可在不使用辅助病毒的条 件下产生和回收。碰本文所述的反向遗传学系统允许人们完全从克隆的cDNA中有效地产生流感A型 病毒。Bridgen和Elloitt(1996)还使用反向遗传方法产生了布尼奥罗病毒(布尼亚病毒 科)，但是它仅含有负义RNA的3个节段，且产率低，为102pfu/107细胞。虽然在诸实验中病 毒产量不同，但是所观察的含有8个节段的流感病毒的产量均为> 103pfu/106细胞。对于 上述反向遗传学系统的高效有几种解释RNP不是在体外产生(Luytjes等人，1989)，而是 在体内通过使用RNA聚合酶I的vRNA的胞内合成和病毒聚合酶蛋白与NP的质粒驱动的表 达而产生。而且，采用易于用质粒转染的293T细胞(Goto等人，1997)确保大量的细胞接受 了病毒产生所需的所有的质粒。另外，生长细胞表达最丰富的酶中的RNA聚合酶I产生的大 量转录产物可能对该系统的整个效率有贡献。这些特征导致产生了相当丰富量的vRNA转 录产物和足量的包裹vRNA的病毒蛋白、细胞核中RNP的形成和这些复合体输出到细胞膜， 在那装配并释放新的病毒。先前建立的反向遗传学系统(Enami等人，1990 ；Neumann等人，1994 ；Luytjes等 人，1989 ；Pleschka等人，1996)需要辅助病毒感染和为此而建立的允许从大量的辅助病 毒中回收少量转染子的选择方法。已采用这些策略来生产具有下列cDNA驱动的基因之 一的流感病毒PB2 (Subbarao 等人，1993)、HA (Enami 等人，1991 ；Horimoto 等人，1994)、 NP(Li 等人，1995)、NA (Enami 等人，1990)、M(Castrucci 等人，1995 ；Yasuda 等人，1994)和 NS (Enami等人，1991)。除了那些用于HA和NA基因的选择方法外，大多数选择方法都依赖 于生长温度、宿主范围限制或药物敏感性，因而限制了反向遗传方法在基因产物功能分析 中的应用。即使具有HA和NA基因(可靠的抗体驱动选择系统对此二基因是可利用的)， 还是难于测试具有显著生长缺陷的病毒。相反，本文所述的反向遗传系统不需要辅助病毒， 并允许产生任一基因节段中具有突变或具有严重生长缺陷的转染子。这个优点显示在图5中，该图表示具有PA突变基因的转染子病毒的回收。将活的突变导入流感A型病毒基因组 的技术将使研究者能够说明许多长时间存在的问题，如病毒基因非翻译区域中的调节序列 的性质、病毒蛋白的结构-功能关系，以及宿主范围限制和病毒病原性的分子基础。虽然可得到无活的流感疫苗，但是它们的效力是次优的，部分原因是它们引起局 部IgA和细胞毒T细胞应答能力有限。现在正在进行的冷适应活流感疫苗的临床试验提 示，这种疫苗已被最佳地减毒，所以它们将不会引起流感症状，但是仍将诱导保护性免疫力 (参见Keitel和Piedra的综述，1998)。然而，初步的结果表明这些活病毒疫苗将不会比最 好的无活疫苗有效得多(参见Keitel和Piedra，1998)，这留下了进一步改进的空间。一种 可能性是用上述反向遗传系统修饰冷适应疫苗。或者，可通过使用反向遗传从零(scratch) 开始，测试一种在编码内部蛋白的基因中具有多个减毒突变的“主要”流感A株。本发明上 述的反向遗传系统最引起兴趣的应用是在涉及流感病毒新的HA或NA亚型的可疑流行性疾 病的情况下快速测试减毒活病毒疫苗。这种新反向遗传系统将有可能提高作为疫苗载体的流感病毒的用途。该病毒可进 行基因工程改造，以表达除了流感病毒蛋白质之外的外来蛋白质或免疫原性表位。例如可 以测试具有作为第九个节段的外来蛋白质的病毒(Enami等人，1991)并使用它们作为活疫 苗。流感病毒不仅能激发强烈的细胞介导和体液免疫应答，它们还提供了病毒粒子表面HA 和NA蛋白质的广阔阵列(如15种HA和9种NA亚型以及它们的流行性变体)，允许对同一 靶群反复免疫接种。具有编码报道基因的人造vRNA的流感VLP已通过用牛痘苗_T7聚合酶系统表达 病毒结构蛋白和vRNA而制得(Mena等人，1996)。现在，使用反向遗传系统能产生含有编码 vRNA转录和复制所需蛋白质(即PA、PBUPB2和NP)的vRNA以及编码感兴趣蛋白的vRNA 的VLP。这样的VLP可用作基因传送载体。重要的是，它们缺乏编码病毒结构蛋白的基因将 确保不会在VLP-基因治疗后产生感染性病毒。由于流感病毒基因组没有整合到宿主细胞 的染色体中，该VLP系统将适合于只需要细胞短期转导的基因治疗(如癌症治疗)。与腺病 毒载体相反(Kovesdi等人，1997)，流感VLP可包含HA和NA两种变体，允许对靶群体的重 复治疗。正粘病毒科包括流感A型、B型和C型病毒，以及近来归类的Thogoto病毒。本文 完全地从克隆的cDNA中产生感染性流感A型病毒的策略可用于任何正粘病毒，也许还可用 于其他区段负义RNA病毒(如布尼亚病毒、沙粒病毒)。这种不受技术限制地操纵病毒基因 组的能力，在病毒生命周期及其调控、病毒蛋白的功能和病毒致病性的分子机制的研究中 有着深远的意义。实施例2流感病毒蛋白PB2、PB1、PA和NP的表达导致人造病毒RNA的复制和转录.为产生 流感VLP，体内流感病毒RNA胞内合成采用了 RNA聚合酶I系统(图7)。在这个系统中，反 义取向的编码报道基因的cDNA两侧连接流感病毒RNA的5'和3'非编码区。将这个盒子 插在RNA聚合酶I启动子和终止子之间。将该构建物转染入真核细胞中导致通过胞内RNA 聚合酶I的作用转录该报道基因，因而产生了流感病毒样RNA (Neumann等人，1994)。流感 病毒感染后，病毒聚合酶复合体复制和转录该人造vRNA，导致该报道基因的表达。为确定PB2、PB1、PA和NP蛋白的表达是否引起RNA聚合酶1_衍生的转录产物
19所编码的报道基因的表达，将在鸡0肌动蛋白启动子(pCAGGS-WSN-NPO/14)控制下表达 A/WSN/33 (H1N1)的NP蛋白的质粒(各1微克)、在巨细胞病毒启动子〔pcDNA762 (PB2)、 pcDNA774(PBl)和pcDNA787 (PA)〕控制下表达A/PR/8/34病毒的聚合酶蛋白的质粒和RNA 聚合酶I报道基因构建物(pPoII-GFP)转染人胚肾细胞(293T)中。48小时后，有30-40% 的细胞表达GFP(图9)。相反，在缺少聚合酶或NP蛋白的转染细胞中不能检测到GFP的表 达。这些结果表明，NP蛋白和3种流感病毒聚合酶蛋白形成了复制和转录RNA聚合酶I-衍 生的GFP vRNA的一种功能性复合体。最佳的vRNA转录和复制.为确定最佳报道物GFP表达所需的质粒DNA的量，我们 调整了聚合酶蛋白和NP蛋白的表达。先前的研究已表明，大量的PA减少了报道基因在转录 /复制系统中的表达程度(Mena等人，1996)。因此，逐步减少质粒中PA的表达，确定了 0. 1 微克的pcDNA787 (PA)作为模板产生了最强的GFP表达。对NP这种RNP复合体中的主要结 构成分可能需要大量的蛋白表达质粒。然而，更高数量的质粒并没有明显地影响GFP阳性 293T细胞的数量。另外，不同量的PB2和PB1蛋白表达质粒(从1. 0到0. 03微克)也没有 影响293T细胞中的GFP表达。因此，在接下来的所有实验中，采用0. 1微克pcDNA787 (PA) 和 1. 0 微克的 pcDNA774 (PB1)、pcDNA762 (PB2)和 pcCAGGS-WSN-NPO/14。从克降的cDNA中形成流感VLP.前面牛痘苗T7RNA聚合酶系统的研究表明，流感 VLP的形成需要9种流感病毒蛋白？82、？81、？4、拟、嫩、呢、] 1、]\12和赂2(]^皿等人，1996)。 相反，NS1蛋白对颗粒形成是不必要的(Mena等人，1996)。为建立一个有效的VLP产生的质 粒驱动系统，制备了编码HA、NA、Ml、M2和NS2基因的cDNA。将该cDNA克隆到真核表达载 体pCAGGS/MCS中(受鸡3 -肌动蛋白启动子控制)，分别产生了 pEWSN-HA、pCAGGS-WNA15、 pCAGGS-WSN-Ml-2/U pEP24c和pCA_NS2。通过蛋白质印迹分析证实了各蛋白质的表达。为产生VLP，采用1.0微克的各蛋白表达质粒〔对于pcDNA787(PA)例外，采用0. 1 微克〕和1微克报道基因构建物pPoII-GFP转染106个293T细胞。转染48小时后收集培养 上清液，并将其与A/WSN/33病毒混合，以提供GFP vRNA复制和转录所需的流感病毒蛋白。 然后将该混合物接种到MDCK细胞中。培育10小时后，检测到GFP阳性MDCK细胞，相应于 450个颗粒/毫升上清液(表3)。因而，所有流感病毒结构蛋白的质粒-驱动表达导致了 含有GFP vRNA的感染性流感VLP的形成。而且，GFP vRNA被传送到MDCK细胞中。流感病毒的最佳装配.还研究了表达不同量RNA聚合酶I报道基因构建物以及 HA、NA、Ml、M2和NS2质粒DNA的细胞中VLP的形成。在采用pPoII-GFP的实验中，1. 0微 克的质粒DNA能非常有效地产生VLP，而2. 0微克或3. 0微克效率显著较少。因为在感染后 NS2和M2蛋白表达量低，最佳VLP的形成可能需要相对少量的表达质粒。将M2表达构建物 从1. 0微克减少到0. 1微克，导致GFP阳性MDCK细胞数量增加10倍以上(表3)。进一步 减少质粒到0.03微克并不增加VLP的数目。对于NS2，测试的质粒量较低(0. 1微克)，VLP 的形成效率较低(表3)。Ml蛋白是病毒粒子的主要结构成分。因而，有效形成VLP需要Ml蛋白高水平表 达。在用1. 0微克或2. 0微克Ml质粒DNA转染的细胞中进行VLP形成比较实验中检验了 这一预言。如表3所示，较大量的质粒导致GFP阳性MDCK细胞增加10倍以上。表达HA和 NA蛋白的质粒的两种不同量(1微克2微克)比较，并没有揭示VLP形成有任何显著差 异，因此在接下来的实验中各质粒(pEWSN-HA和pCAGGS-WSN15)选用1微克。总而言之，这
20些研究导致了 VLP形成效率增加100倍以上，并最终导致每毫升上清液中产生104个以上 的感染性流感病毒粒子(图10)。表3.用于形成感染性VLP*的质粒DNA的最佳量 *用所有9种流感病毒病毒结构蛋白的表达质粒和RNA聚合酶I-GFP基因质粒转 染293T细胞。转染48小时后，收集含有VLP的上清液，使其与A/WSN/33辅助病毒混合接 种到MDCK细胞中。感染10小时后固定细胞，并用荧光显微镜检测GFP表达。仅改变Ml、 M2和NS2质粒的量(粗体字)以测定它们在MDCK细胞中GFP表达的最佳用量。!通过计数5个显微镜视野中的GFP阳性细胞数测定VLP形成的相对效率。选择 含有1微克各种质粒的样品(产生450个感染性VLP/毫升上清液)作为参照(值1)。完全从质粒产生VLP的可靠性.为验证VLP以真正流感病毒相同的方式开始感 染，用抗WSN HA抗体中和VLP。将从质粒转染的293T细胞得到的含有VLP的上清液与抗 WSN HA混合单克隆抗体或与抗水泡性口炎病毒(VSV，负控制)G蛋白的单克隆抗体室温共 培育1小时。将没有被抗WSN HA混合单克隆抗体中和的A/PR/8/34辅助病毒加到该混合 物中，并接种到MDCK细胞中。只有抗-WSN-HA-特异性单克隆抗体中和了 VLP，这表明HA介 导了 VLP附着和进入细胞。接着，确定了 VLP形成所需的最小蛋白组。其他学者已确定vRNA复制和转录必 需的3种流感病毒聚合酶和NP(Houda等人，1988)。因此，包括了这4种蛋白中的每一种， 但顺次删去HA、NA、Ml、M2或NS2。排除这些质粒的任何一种都不影响转染293T细胞中的 GFP vRNA的复制/转录。从缺少HA、NA、Ml或NS2蛋白的转染293T细胞得到的上清液并 不促进感染的MDCK细胞中的GFP表达，这表明不存在感染性VLP。删去M2能检测到感染 性VLP，但量少(与整套结构蛋白相比减少500倍)。因而，与从牛痘苗-病毒系统研究得 到的数据一致，有效形成感染性VLP需要所有流感病毒结构蛋白。VSV糖蛋白可取代VLP产生中的HA和NA蛋白.用VSV的G蛋白替换流感病毒HA
和NA蛋白，该G蛋白具有受体结合和融合的功能。在转染了 pPoII-GFP的293T细胞中、最佳量的PB2、PB1、PA、NP、M1、M和NS2表达构建物、1微克VSV-G构建物(pCAGGS-VSV-G)中， 用VSV-G蛋白替换流感病毒糖蛋白并没有对VLP的形成有不利的影响。相反，反复发现当 用VSV-G而不是HA和NA作为病毒糖蛋白时，产生了较高数量的GFP阳性细胞。因而，VSV G蛋白能有效地掺入流感病毒粒子中，并在病毒的释放和进入中具有与HA和NA —样的功 能。一种产生感染性流感病毒颗粒的有效系统可能是研究该病毒的财富(asset)，并 有可能用于疫苗和基因治疗载体的生产。与现有的牛痘苗病毒系统相反，本文所述的VLP 产物策略在细胞最初的转染和VLP的产量(> 104感染性颗粒/毫升上清液)都是非常有 效的。而且，该系统可完全地由表达流感病毒蛋白的质粒(即缺少其他病毒蛋白)所驱动， 这极大地简化了结果的解释。另一主要的优点是能够研究病毒粒子形成、RNP复合体的包 裹、病毒复制的出芽和结合与融合过程中致命突变的影响。另外，上述系统的操作可能与其 他病毒(如副粘病毒和弹状病毒)同等地好。流感病毒HA和NA蛋白在功能上能被VSV糖蛋白G替换。先前已报道当用重组 SV40病毒提供G蛋白时流感病毒不能掺入VSV G蛋白(Nairn等人，1993)。本文所描述的 结果表明HA和NA都不是VLP形成所必需的，虽然不能排除这些糖蛋白在与病毒其他蛋白 的相互作用中起作用，因而影响病毒粒子的结构，正如表达短尾HA、NA及两者的形状伸长 的病毒所提示的那样(Garcia-Sastre等人，1995 Jin等人，1994 Jin等人，1997 ；Mitnaul 等人，1996)。上述以质粒为基础的系统可能特别有用于治疗基因的传送。可制备含有编码转录 和复制所需蛋白质(即NP和聚合酶)的vRNA以及编码感兴趣蛋白质的vRNA的VLP。这些 颗粒是感染性的并可将指定的基因传送到靶细胞中，在那进行复制和转录。因为这些颗粒 不含有完整互补的病毒基因，所以它们不能产生感染性子代病毒。这个特征以及病毒基因 组没有整合到宿主染色体中将确保在人和非人类动物中基因传送的生物学安全性。最后， 15种HA和9种NA亚型及其变体的可获得性将允许VLP的反复给药，因此克服了对载体产 生蛋白质的免疫抗性，这是反复使用其他病毒载体(如腺病毒)所面临的主要障碍之一。该 质粒驱动系统的另一优点是可在仅需要外来蛋白短期表达的情况下(如癌症治疗)使用。实施例3通过使用Cre-loxP系统可产生包装细胞系来进行复制缺陷性病毒的生 产。例如，可制备含有转录终止盒和一个病毒基因的蛋白表达载体(如PBS302 of LifeTechnologies,Bethesda,Maryland ；禾口 Sauer 等人，1993 ；Lasko 等人，1992 ；Pichel 等 人，1993 ；Bolivar 等人，1977 ；Stuhl 等人，1981 ；Stuhl 等人，1985 ；Fiers 等人，1978)，该转 录终止盒两侧连接有两个loxP位点。从启动子序列开始的转录在转录终止位点被阻断。 因而，病毒基因没有被转录和翻译。受这种载体稳定转染的细胞再以缺少vRNA其编码克隆 到loxP系统中的基因的流感病毒感染。此病毒还含有编码Cre蛋白的另一 vRNA。因为缺 乏自己的vRNA，此病毒在正常细胞中不能存活。然而，在包装细胞系中，由vRNA表达的Cre 蛋白导致在loxP位点产生重组，结果该转录终止位点被删除。因而，各病毒基因现在被转 录和表达，使病毒能在这些细胞中扩增(图11)。另外，制备了表达受loxP系统控制的晚期病毒蛋白(即HA、NA、M1、M2和NS2)的 包装细胞系(图12)。可用其他病毒受体结合和融合蛋白(如埃博拉病毒GP、马尔堡病毒GP、布尼亚病毒糖蛋白GP1和GP2、弹状病毒和副粘病毒的G和/或F蛋白、Thogoto病毒糖 蛋白和正链RNA病毒的糖蛋白)替换HA和NA。产生了病毒样颗粒，它含有编码复制/转录 所需蛋白质(即聚合酶和NP蛋白)的vRNA、编码感兴趣基因的vRNA和编码Cre的vRNA。 在该包装细胞系中这些vRNA被包裹到病毒样颗粒里。这些病毒样颗粒可用于疫苗及基因治疗目的，因为(i)它们不含有完整互补的病 毒基因，因而不能形成感染性子代病毒，符合严格的安全性要求；(ii)它们将有可能表达 高水平的外来蛋白；(iii)它们不表达主要抗原的病毒糖蛋白(HA和NA)；因此，宿主对病 毒蛋白的免疫应答应是有限的。参考文献Albo,, C. , Martin, J.和 Protela, A. , T. Virol. ,70,9013-9017(1996)。Baron，M.D.& Barrett, T.，T. Virol. ,71,1265—1271 (1997)。Bolivar 等人，Gene, 2,95 (1977)。Bridgen，A.& Elliott, R. M. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,93, 15400-15404(1996)。Castrucci，M. R. & Kawaoka, Y. , T. Virol. , 69, 2725-2728 (1995)。Castrucci, M. R.，Bilsel, P. & Kawaoka，Y.，T. Virol. , 66,4647-4653 (1992)。Collins, P. L. ，Hill, M. G. ， Camargo, E. ， Grosfeld, H. ， Chanock, R. M. Murphy, B. R.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,92,11563-11567(1995)。Cozelmann，K. K. & Schnell, M.，T. Virol. ,68,712—719(1994)。Dunn, E. F. ， Pritlove, D. C. ， Jin, H.禾口 Elliott， R. M. ， ViroloRY, 211, 133-143(1995)。Elliott, R. M.，Mol.Med.，3，572-577 (1997)。Enami, M. , Sharma, G.，Benham，C. & Palese，P.，ViroloRY, 185, 291-298 (1991)。Enami, M.和 Palese, P.，J. Virol.，65，2711-2713 (1991)。Enami, M. ,Luytjes,ff. ,Krystal,M.和 Palese, P. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 87,3802-3805(1990)。Fiers 等人，Nature, 273,113(1978)。Garcia-Sastre, A.和 P. Palese, Virus Res.，37，37-47(1995)。Garcin, D. ，Pelet, T. ，Calain, P. ，Roux, L. ，Curran, J.禾口 Kolakofsky，D. ，EMBO 14,6087-6094(1995)。Goto, H. , Bethell, R. C.禾口 Kawaoka，Y. ，ViroloRY, 238，265—272 (1997)。Hagen, M. Chung, T. D. Y.，Butcher, J. A.禾口 Krysral，M.，J. Virol.，M， 1509-1515(1994)。He,B. ,Paterson,R. G. ,ffard,C. D.禾口 Lamb，R. A.，ViroloRY, 237，249-260 (1997)。Hoffman, M. A.和 Banerjee, A. K.，J. Virol.，71，4272-4277 (1997)。Honda, A. , K. Ueda, K. Nagata 禾口 A, Ishihama, J. Biochem. (Tokyo)，104, 1021-1026(1988)。Horimoto, T.和 Kawaoka, Y.，J. Virol.，68，3120-3128 (1994)。Huddleston, J. A.和 Brownless，G. G.，Nucl. Acids Res.，10，1029-1037。
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权利要求
一种基于质粒的系统，用于从克隆的病毒cDNA产生感染性流感病毒，其中，该系统含有多个足以在缺少辅助病毒时产生所述病毒的流感病毒载体，其特征在于，所述载体包含(i)至少六种载体，其选自含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒PA cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒PB1 cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒PB2 cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒HA cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒NP cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒M cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒NA cDNA的启动子的载体、含有操作性连接于已连接了转录终止序列的流感病毒NS2 cDNA的启动子的载体；(ii)含有操作性连接于编码流感病毒PA多肽的DNA节段的启动子的载体；(iii)含有操作性连接于编码流感病毒PB1多肽的DNA节段的启动子的载体；(iv)含有操作性连接于编码流感病毒PB2多肽的DNA节段的启动子的载体；和(v)含有操作性连接于编码流感病毒NP多肽的DNA节段的启动子的载体。
2.如权利要求1所述的基于质粒的系统，其特征在于，所述病毒cDNA是突变的。
3.如权利要求1所述的基于质粒的系统，其特征在于，所述基于质粒的系统产生至少 1 X 103pfu/ml感染性流感病毒。
4.如权利要求3所述的基于质粒的系统，其特征在于，所述基于质粒的系统产生至少 3X104pfu/ml感染性流感病毒。
5.如权利要求1所述的基于质粒的系统，其特征在于，所述启动子选自RNA聚合酶I启 动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子和T3启动子。
6.如权利要求5所述的基于质粒的系统，其特征在于，所述启动子是RNA聚合酶I启动子。
7.如权利要求6所述的基于质粒的系统，其特征在于，所述启动子是人RNA聚合酶I启 动子。
8.如权利要求1所述的基于质粒的系统，其特征在于，所述转录终止序列选自RNA聚合 酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、RNA聚合酶III转录终止序列和核酶。
9.如权利要求1所述的基于质粒的系统，其特征在于，两个或多个载体以物理方法连接。
10.如权利要求1所述的基于质粒的系统，其特征在于，所述一个或多个载体在分开的 质粒上。
11.一种宿主细胞，它含有权利要求1所述的基于质粒的系统。
12.—种生产流感病毒病毒粒子的方法，该方法包括在使病毒蛋白和vRNA或cDNA生产 的条件下培养权利要求11所述的宿主细胞。
13.一种制备流感病毒特异性免疫原性组合物的方法，其特征在于，该方法包括从含有 多个权利要求1所述的流感病毒载体的宿主细胞中纯化出病毒粒子，其中，所述载体在不 存在辅助病毒的情况下或在不存在体外核糖核蛋白复合物的情况下被导入所述宿主中。
14.一种免疫原性组合物，其特征在于，它含有根据权利要求13所述的方法制得的流感病毒病毒粒子。
15.权利要求14所述的免疫原性组合物的用途，其特征在于，用于制备用于免疫个体 以抗流感病毒感染的药剂。
16.一种分离的流感病毒，它由权利要求12或13的方法制得。
17.一种无辅助病毒的基于质粒的系统，用于从克隆的病毒cDNA产生感染性流感病 毒，该系统含有足以产生所述病毒的多个权利要求1所述的流感病毒载体。
全文摘要
本发明提供一种用于(如在没有辅助病毒的情况下)制备流感A型病毒的组合物。
文档编号A61K39/00GK101851636SQ20101015562
公开日2010年10月6日 申请日期2000年4月5日 优先权日1999年4月6日
发明者G·纽曼, Y·川冈 申请人:威斯康星校友研究基金会