抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，设及抗绵羊包虫病感染的基因巧g.myophilin分 子工程疫苗、其制备方法及应用技术
【背景技术】
[0002] 细粒棘球蝴虫病，俗称包虫病，目前尚没有商品化的疫苗。当前已有十余种候选分 子，如Eg95、rEgl4-3-3重组疫苗、铁蛋白重组疫苗、GST重组疫苗等，其中最早证实EG95是 一种绵羊保护性细粒棘球蝴疫苗，其对绵羊的保护力为96-98%，其中国内康强等也在绵羊 身上对EG95进行保护力验证，得到了 90 %的保护力。遗憾的是Eg95首先由国外研发成功 的，即使开发成为真正的商品，其知识产权也不属于我们。而目前绝大部分包虫病候选疫苗 分子都是通过小鼠继发感染实验完成，缺乏直接的应用价值，因为包虫感染主要通过其虫 卵经消化道感染而不是继发感染；再者，小鼠亦不是细粒棘球蝴病（包虫病）主要的天然适 宜宿主。
[0003] 由于细粒棘球蝴主要寄生于人的肝脏，故该病又称为肝包虫病。它呈世界性分布， 是全球性的公共卫生问题。据近年普查，我国有25个省、市和自治区有该病的病例报道，其 中W新疆、宁夏、甘肃、青海、西藏、四川、内蒙古7个省（区）流行最为严重，高发区约占全 国面积的44%，受威胁人口约5千万。该病已被列为我国重点防治的寄生虫病之一。
[0004] 包虫病严重危害人类的健康和农牧业经济的发展。包虫病对人危害主要表现为在 肝脏、肺、脑或肾等器官形成占位性包囊病变，W机械压迫与营养消耗等形式造成运些重 要器官的严重损害，甚至导致个体死亡；而对于家畜而言，包虫病将会造成家畜的减产、品 质下降等重大经济问题，并且作为寄生虫感染生活史的重要一个环节对人民生命财产安全 带来巨大隐患。
[0005] 目前，人包虫病的首选治疗方法是外科手术，但由于该病发病早期可无自觉症状， 等到入院就诊时，相应的脏器已经受到严重的损伤并且手术本身对机体也有损伤，从而使 患者在健康和经济上都蒙受了极大的损害。对于较早期小棘球蝴或有手术禁忌的病例可采 用阿苯化挫或甲苯咪挫等药物进行化疗，临床发现运些药物存在严重的毒副作用，部分患 者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性。因此，无论是手术治疗，还是药物治疗，对于 包虫病治疗都有很大的不足。对于家畜而言，目前很少有相应的诊疗措施。
[0006] 要想从源头上防控包虫病，疫苗的研发将是必然选择。近年来，随着分子生物学技 术的迅速发展及在医学科学中的广泛应用，利用基因工程技术对病原体进行分子疫苗的预 防研究引起了人们的广泛关注。从目前的研究情况来看，国内外对细胞粒棘球蝴虫研究较 为成功的重组疫苗有Eg95,它已在人工感染的牛和羊群获得了较好的免疫保护水平，免疫 保护力达到96-98%。
[0007] 羊作为细粒棘球缘虫最主要的天然中间宿主，是细粒棘球蝴缘虫感染生活史的重 要环节，制备出羊的包虫病疫苗，预防家畜羊的感染，阻断寄生虫生活史进而减少传染给人 的几率，具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是针对目前没有羊包虫病疫苗的现状，提供一种基因 分子巧g.myophilin在制备抗绵羊包虫病感染疫苗上的应用，同时提供运种疫苗及其制备 方法。 阳009] 本发明技术方案如下： 阳010] 抗绵羊包虫病感染的基因巧g.myophilin分子工程疫苗，是从细粒棘球蝴中国株 提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophilin基因，再通过克隆、诱导表达、纯化获得的疫苗， 其保藏号为：CCTCCM2015426。
[0011] -种抗绵羊包虫病感染的基因巧g. myophilin分子工程疫苗的制备方法，首先从 细粒棘球蝴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg. myophi 1 in基因，该基因收录在GenBank 数据库，序列号：DQ679473,Eg. myophilin亚克隆于表达载体祀T-28a，再转化到大肠杆菌 化21 0E3) PlysS中诱导表达，再用含Ni化的His-bind树脂纯化试剂盒纯化蛋白；
[0012] 巧g.myophilin基因分子应用于制备抗绵羊包虫病感染的疫苗。
[0013] 本发明在细粒棘球蝴重组疫苗myophilin在小鼠身上进行免疫保护验证，免疫保 护力达到了 92%。该疫苗有望在肝包虫防治中发挥巨大的作用。
【附图说明】
[0014] 图1显示采用ELISA法分别检测了血清中巧g.myophilin抗原特异性IgGJgGU IgG2与I姐抗体水平。 阳01引图2显示ELISA细胞因子试剂盒检测结果，疫苗组IFN-丫与比-2显著升高，表明 Thl型介导的细胞免疫应答显著激活；而与化2型细胞因子IL-4亦显著升高，表明体液免 疫应答亦明显上调，与抗体升高结果一致。
【具体实施方式】 [0016] 疫苗制备： 阳017] -种抗绵羊包虫病感染的基因巧g. myophilin分子工程疫苗的制备方法，首先从 细粒棘球蝴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg. myophi 1 in基因，该基因收录在GenBank数据库，序列号：DQ679473,Eg. myophilin亚克隆于表达载体祀T-28a，再转化到大肠杆菌 化21 0E3) plysS中诱导表达，再用Novagen公司的含Ni化的His-bind树脂纯化试剂盒纯 化蛋白；
[0018] 为了证实重组抗原疫苗巧g.myophilin的抗包虫病感染的免疫保护力，本发明W 绵羊天然感染包虫虫卵为基础，通过初次免疫-加强免疫（prime-boost)进行预防接种 巧g.myophilin,采用分子生物学、细胞生物学、免疫学等手段，评价该疫苗抗包虫感染的保 护力及其免疫保护机制。
[0019] 1、实验动物与细粒棘球虫卵的准备
[0020] 4-6月龄雄性绵羊，利用原头蝴粗抗原包被检测绵羊血清巧LISA)阴性的入组，随 机分为3组：疫苗巧g.myophilin接种组、FCA(完全福氏佐剂）组、PBS组，每组10只。细 粒棘球缘虫虫卵由兰州兽医所提供，具体制备过程如下：从新疆购买6月龄±犬3只，于兰 州兽医所试验站隔离饲养，用化哇酬对实验犬进行驱虫，并注射地塞米松W降低其免疫力。 一周后，给实验犬喂食含有原头蝴的包囊，感染后45d对其进行粪便检测，粪便细粒棘球缘 虫虫卵阳性时，注射乌拉坦安乐处死（实验犬于处死之前禁食2地，W减少小肠内容物），沿 腹中线剖开腹部，自幽口至小肠下段结扎，剪下小肠，分离肠系膜，将其纵向剪成大小适宜 的片段4-5段，放在含有37°C生理盐水的小烧杯中稍微晃动W洗掉其内容物，再次更换新 的生理盐水，将其放在水浴锅中37°C解育比，使细粒棘球缘虫成虫从小肠肠壁自行脱落。 用注射器将细粒棘球缘虫虫体吸出，滴数滴于载玻片上，在显微镜下检测并判断其是否成 熟，收集成熟的细粒棘球缘虫虫体于生理盐水中，用注射器吸取，每管吸取20个成熟虫体， 保存备用，用于实验绵羊包虫病的人工感染。（细粒棘球缘虫虫卵获取的整个实验过程中， 操作人员均穿戴一次性防护服，实验完后对隔离的实验犬舍地面及周围喷洒碱石灰糊状 液（1:4)，并对整个实验过程中用到的所有实验器材喷洒10.0%次氯酸钢溶液W杀灭有可 能残留的细粒棘球缘虫虫卵，另外，实验过程中用到的一次性防护用品全部销毁，W消除对 周围环境的污染。）
[0021] 2、免疫接种与细粒棘球虫卵感染
[0022] 分别在第1周与第4周免疫接种绵羊。疫苗过滤除菌，用PBS调节浓度至50yg/ ml,颈部注射Iml的疫苗。第一次免疫：重组疫苗：完全弗氏佐剂（CFA) = 1:1。第二次免 疫：第一次免疫后四周，重组疫苗：不完全弗氏佐剂（IFA) = 1:1。虫卵37°C解育40min， 采用胶囊包装的形式经口攻击感染细粒棘球虫卵。每只羊攻入约3000个左右虫卵。
[0023] 3、不同时间点采血
[0024] W第一次免疫作为0周起始点，分别在0、1、2、4、6、9、12w、20、36与44周进行采颈 部静脉血5ml离屯、收集血清-80°C保存，共计10次（在0、4、8和44周先采血然后相对应的 进行两次免疫、攻虫感染和剖杀处理）。
[0025] 4、包囊统计及保护力的计算
[00%] 包囊检测：把绵羊处死之后取肝，首先仔细检查并记录肝脏表面的包囊个数，然后 再用刀把肝切成片，3mm左右/片，仔细检查并记录肝脏内部包囊个数。纤维化和巧化的包 囊视为不可用包囊。保护力的计算，通过减囊率来计算保护力，保护力计算公式：免疫保护 力（％) = (1-免疫组包囊均数/对照组包囊均数）X100%。经包囊统计与计算，该疫苗 获得了 92%的保护力，具体如下表所示。
[0028] 5、检测血清抗体
[0029] 采用ELISA法分别检测了血清中！"Eg.myophilin抗原特异性IgG、IgGl、IgG2与 I姐抗体水平。结果发现经免疫接种后，疫苗组运四种特异性抗体显著升高。如图I所示。
[0030] 6、检测血清细胞因子 阳03UELISA细胞因子试剂盒检测表明，经免疫接种后，疫苗组IFN-丫与比-2显著升高， 表明Thl型介导的细胞免疫应答显著激活；而与化2型细胞因子IL-4亦显著升高，表明体 液免疫应答亦明显上调，与抗体升高结果一致。如2图所示。 本申请所设及的生物保藏单位名称：中国典型培养物保藏中屯、地址：中国湖北省武汉 市武汉大学；保藏日前：2015年7月3日；保藏编号：CCTCCNO:M2015426 ;分类命名：大肠 杆菌BL21/pET-28曰/Eg.MyophilinEscherichiscoliBL21/pET-28曰/Eg.Myophilin。
【主权项】
1. 抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗，是从细粒棘球蝴中国株提 取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophi1in基因，再通过克隆、诱导表达、纯化获得的疫苗，其 保藏号为：CCTCCM2015426。2. -种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗的制备方法，首先从细 粒棘球蝴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophi1in基因，该基因收录在GenBank 数据库，序列号：DQ679473,Eg.myophilin亚克隆于表达载体pET-28a，再转化到大肠杆菌 BL21 (DE3)plysS中诱导表达，再用含Ni2+的His-bind树脂纯化试剂盒纯化蛋白。 3. rEg.myophilin基因分子应用于制备抗绵羊包虫病感染的疫苗。
【专利摘要】本发明涉及一种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗，是从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.myophilin基因，再通过克隆、诱导表达、纯化获得的疫苗，其保藏号为：CCTCC？M2015426。本发明还涉及rEg.myophilin基因分子应用于制备抗绵羊包虫病感染的疫苗。本发明在细粒棘球蚴重组疫苗myophilin在绵羊身上进行免疫保护验证，免疫保护力达到了92％。该疫苗有望在肝包虫防治中发挥巨大的作用。CCTCC NO：M201542620150703
【IPC分类】C12N15/12, C07K14/435, A61K48/00, C12N15/70, A61K39/00, A61P33/10
【公开号】CN105343872
【申请号】CN201510703525
【发明人】赵巍
【申请人】宁夏医科大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年10月27日