分子检测系统的制作方法

专利名称：分子检测系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子检测系统。具体但不排他地，本发明涉及分子传感器， 其利用被称为二色性的光学现象识别特定分子在物质中的存在。
背景技术：
就其本性而言，有机体含有许多复杂的分子和分子聚集体。 一些最重 要的分子和聚集体是大的，并且具有高纵横比(即，与任何其它轴相比，一 个轴的长度显著更大)。利用光学设备特定地检测这些高纵横比的分子是已 知的。这种设备依赖于这些长的分子与偏振光(即，具有仅在一个方向上建 立的电场的光)相互作用的方式。
在上述设备中利用的现象被称为二色性。可以使入射光线性偏振产生
线性二色性(LD)，或使其圆偏振产生圆二色性(CD)。 LD是一些分子结构 由于沿两条正交轴有差异地吸收线性偏振光所表现出的性质。CD涉及对 左和右圆偏振光的吸收的差异。能够选择性地吸收光的分子被称为生色 团。二色性分子，即表现出二色性性质的那些，是一类特别的生色团。二 色性材料的实例是某些天然晶体、拉伸聚合物，以及其它非各向同性分子。 生物分子含有广泛的生色团(包括芳族侧链、核苷酸和肽主链)。
为了能够观察二色性效应，生色团必须相对于入射偏振光束排列，或 至少部分排列。此要求的优点在于，允许在非排列的分子的环境中仅从排 列的分子提取数据。然而，到目前为止，此要求也使上述技术的应用主要 限于具有高纵横比的大的分子的研究，因为这些分子易于排列。如果一条 轴显著长于另一条轴，则认为分子具有高纵横比。适宜的分子可以具有棒、 盘或十字形的形状。取决于分子的劲度，100:1的纵横比可能足以促进排 列，但是优选大于1000:1的纵横比。已经被成功排列的令人感兴趣的部分 的一些实例包括DNA形式的线型生物分子、纤维状蛋白和膜(包括膜蛋 白)(Marrington R， Small E， Rodger A， Dafforn TR， Addinall SG， "FtsZ纤维成束是由结合GTP中的构象变化引起的(FtsZ fiber bundling is triggered by a conformational change in bound GTP)，'生物《七学杂;志(J Biol Chem)2004; 279(47): 48821-48829; DaffomTR， RajendmJ， HalsallDJ， SerpellLC， Rodger A，"用于小体积、低波长的微量流动池中的结构测定 和动力学的蛋白纤维线性二色性(Protein fiber linear dichroism for structure determination and kinetics in a low-volume, low-wavelength couvette flow cell)"生物物理学杂志(Biophys J)2004; 86(1Ptl): 404-410; DaffornTR， Rodger A，"生物分子的线性二色性:出路在哪？ (Linear dichroism of biomolecules: which way is up )"结构生物学新观点(Curr Opin Struct Biol) 2004; 14(5): 541-546; Halsall DJ， Rodger A， Daffom TR，"用于检测单 碱基X寸突变的线性二色性(Linear dichroism for the detection of single base pair mutations)"化学通讯(Chem Commun) (Camb) 2001(23): 2410-2411)。
使这种分子排列的特别方便的方法是制备包括所述分子的溶液，然后 使该溶液流动。归因于分子的伸长本性，由流动所产生的剪切力导致出现 排列，从而使得该样品适合于表现出线性二色性的效应。
在已知的设备中， 一旦感兴趣的分子己经排列，就引导线性偏振光从 基本上垂直于排列的分子的轴的方向通过溶液。因为在特定波长处，辐射 的电场在特定方向上推动分子中的电子，所以在分子内发生光的吸收。当 数个分子被类似地排列时，每个分子中的电子的特征都在于相同的优选净 位移方向。LD是入射光的吸光度在两个正交偏振化之间的差异的量度。 改变入射光的波长并且检测从样品出射的光，可以得到示出样品的吸光度 相对于波长的谱图。
分子的LD谱图提供存在的生色团的信息，包括生色团的取向(以及因 而的分子构象)和生色团相对于偏振轴的取向。此信息对于了解分子的结构 是重要的。注意的是，LD是样品的整体性质的量度。吸光度的强度可以 用于量化在样品中存在的靶分子的数量。此外，由于LD对排列的变化极 为敏感，因而可以检测分子结构中的异常。例如，LD可以检测在DNA的 1300bp(碱基对)片段中由单个的错配氢键导致的变形。
此外，LD对络合物的形成极为敏感，因为排列的分子与第二分子的 结合具有以下两种可测量的效果。1) 排列部分的形状被改变，而这导致其排列也被改变，这导致观察到 的LD谱图的变化。
2) 第二分子由于其附着到排列的分子，所以本身变得被排列。这导致 第二分子的原先未排列的生色团产生LD信号。因而，可以获得关 于络合物结构的信息。
上述两种效果导致了可用于检测络合物形成的可检测的现象。不仅可以得 到关于络合物本性的结构信息，还可以确定相互作用的亲和力。
不幸的是，大部分分子不具有高纵横比，而是具有纵横比小于约5:1 的更接近于球的形状。为了使这些分子排列，必须将靶分子连接到本身具 有高纵横比的受体上。这种排列方法已经被实现并且应用于研究结合到天 然可排列受体(例如DNA)上的配体(例如顺式铂氨)。然而，此方法在其应 用上也是有限的，因为仅可以研究结合到天然可排列受体上的那些分子。
因此，本发明的目的是扩展二色性分析的应用。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供一种分子传感器，所述分子传感器包含 流路，所述流路被配置用于使潜在地含有靶分子的溶液流动；偏振光的源； 检测器，所述检测器被布置用于在来自所述源的光已经通过所述流路以 后，接收所述光；和传感器元件，所述传感器元件包含在使用中被安置在 所述流路内、具有高纵横比的支架部分，以及附着到所述支架部分的用于 所述靶分子的受体部分。
在本说明书中，术语"高纵横比"表示至少75:1，并且优选至少100:1 的纵横比。
根据本发明的第二方面，提供一种用于本发明第一方面的传感器的传 感器元件，所述传感器元件包含具有高纵横比的支架部分和附着到其上的 受体部分，所述受体部分对感兴趣的靶分子具有选择性结合亲和力。
因此，本发明的第一方面提供一种可以用于检测溶液中是否存在靶分 子的分子传感器。有利地，使用可排列的支架部分作为用于受体部分的附 着的基体意味着受体部分本身和靶分子均不需要固有的排列性质。类似 地，支架部分本身不需要是发色的。归因于传感器的排列能力，可以评价靶分子的二色性性质。因此，既可以通过得到的二色性谱图识别排列的分 子，也可以将传感器用于量化排列的分子并且检测分子异常如错配的存 在。还可以使用传感器研究受体部分和靶分子的结合性质。二色性分子的 固有本性意味着传感器极为灵敏。
优选地，靶分子是二色性的。备选地，或者另外，受体部分可以是二 色性的。在靶分子不是二色性的情况下，关键的是受体部分的二色性信号 通过与靶分子结合而变化。优选地，支架部分不是二色性的。
优选地，传感器包含多个支架部分。
优选地，支架部分或每个支架部分具有多个附着到其上的受体部分。 优选将各个受体部分布置得与相同的靶分子结合。备选地，可以将受体部 分布置得与不同的靶分子结合。
优选地，将支架部分或每个支架部分锚固在流路中，从而在使用中， 支架部分或每个支架部分能够在流中排列，但是其位置被固定在流路中。
尽管将支架部分作为单个的实体提及，但是将理解的是，支架可以由 起到不同功能(例如，在流路中的锚固、对受体的附着，或其它物理或化学 功能)的两个以上的组件构成。
优选地，将流路安置在流动池如微量流动池(cuvette flow cell)或毛细管
流动池中，使其旋转以在溶液中产生流动。备选地，将流路安置在管道中， 并且使溶液经过管道通过而产生流动。在各个情况下，应当理解靶分子的 稳定排列需要剪切流。
优选地，以水相提供溶液，从而使得样品易于流动。备选地，溶液可 以以均可以流动的气体或粉末的形式。
优选地，对光源进行配置以发射线性偏振光束。更优选地，对光源进 行配置以发射线性偏振光的两个正交束。
优选地，光源是线性二色性分光镜。
优选地，对检测器进行配置，以产生示出溶液的吸光度相对于波长的 谱图。
优选地，对光源和检测器进行布置，以分别发射和检测垂直于流动方 向通过的光。
根据本发明的第三方面，提供一种用于感应流动溶液中的靶分子的方法，所述方法包括在流路中提供支架部分，所述支架部分具有高纵横比 并且具有附着到其上的用于所述靶分子的受体部分；使潜在地含有靶分子 的溶液沿所述流路流动；使偏振光通过所述流路；以及在所述偏振光已经
通过所述流路以后，检测所述偏振光。应当理解，溶液流动将支架/受体部 分随流动的方向排列。它还允许耙分子与受体部分结合。这样一来，耙分 子也在流内排列，从而使得它们可以通过它们的二色性性质被检测。
本发明的第三方面提供一种用于感应靶分子的方法，所述靶分子之前 是不可检测的，因为它们是不可排列的。使用可排列的支架部分作为用于 受体部分的附着的基体意味着受体部分本身不需要固有的排列性质。因 此，上述方法可以用于检测耙分子，所述耙分子不是固有可排列的并且不 与固有可排列的受体部分结合。这样，本发明的第三方面具有广泛的应用，
并且可以用于例如检测到现在为止不可检测的DNA、蛋白和有机化合物。 除上述之外，本发明的第三方面提供一种用于感应靶分子的简单方
法。因为涉及相对少的组件，所以该方法使用起来相对便宜并且坚固。 本发明的上述三个方面的可能应用包括在流动的液体中例如管道或
毛细管中的化学或生物分子的排列和检测。因此，允许在流动注射装置或
在水分配管道中对这种分子进行检测或化验。
附图简述


图1A示意性地示出根据本发明的分子传感器；
图1B显示图1A的分子传感器的一部分的放大视图，示出了本发明 的方法；
图2A示意性地示出根据本发明的支架； 图2B示意性地示出具有用于受体的附着点的图2A的支架； 图2C示意性地示出具有附着到附着点的受体的图2B的支架； 图2D示意性地示出具有附着的靶分子的图2C的支架。
某些实施方案的详细描述
参照图1A，示出了根据本发明的分子传感器10。传感器IO包括主要 由塑料制成并且不透明的以伸长的管道12形式的流路。管道12的中心部分被配置为观察窗14，并且由对所使用的光的波长透明的材料制成。在此 具体实施例中，观察窗14由对可见光透明的玻璃石英制成。因此，在此
实施例中，对观察窗14进行配置，以允许在约400 nm至700 nm的波长 范围内的光通过其穿过。观察窗14的相邻一侧是光源16。将光源16配置 得发射两个正交线性偏振光束，所述两个正交线性偏振光束通过观察窗 14，并且因而通过流路。与光源16相反、在观察窗14和流路的另一侧配 置的是检测器18。对检测器18进行配置，从而一旦由光源16发射的光束 通过观察窗14和流路，就检测它们。
如图1B中所示，在观察窗14的区域内安置多个传感器元件19。每 个传感器元件19包括支架部分20和受体部分24。每个支架部分20具有 纵横比为约1000:1的伸长的分子结构，并且可以被认作是刚性连接体。将 每个支架部分20的一个末端经由锚固区22附着到观察窗14的内部，所 述锚固区22将每个分别的支架部分20的末端保持在观察窗14内的固定 位置上。将每个支架部分20的自由端与受体部分24连接。将受体部分24 以这样的方式附着到支架部分20，使得受体部分24与其缔合的耙分子26 自由结合。因此，受体部分24可被认作是耙分子26的"诱饵"。
在使用中，包含靶分子26的液体溶液28在由图1A和1B中的箭头 30表示的方向上流经管道12。此流30导致支架部分20以规则方式沿观 察窗14的长度排列。当耙分子26充分接近受体部分24流动时，它们将 结合到受体部分24上。由于支架部分20全部规则排列，所以全部受体部 分24也规则排列。因此，当靶分子26与受体部分24结合时，它们也被 排列。 ，
一旦受体/耙分子络合物被排列，它们将开始吸收由光源l'6发射的线 性偏振光的一些。因此，当存在靶分子26时，较少的光将到达检测器18。 这使得检测器18可以确定在溶液28中是否存在靶分子26。检测器18能 够产生示出溶液28的吸光度相对于波长的谱图。此信息可以用于监测耙 分子26的本性、排列、数量和结构，因为这些因素中每一个的变化将导 致观察到的谱图的变化。随时间监测流30还可以收集关于受体部分24和 靶分子26之间相互作用的亲和力的信息。因此，本发明的分子传感器IO 可以作为在线连续流动测量装置。存在可以作为合适的可排列支架部分20的各种结构。具体而言，已 显示，尽管膜蛋白在流体流动中不是固有可排列的，但是囊泡形式的膜是 可排列的。在图2A中示意性地示出了这样的膜囊泡40。在这种情况下，
由箭头42表示的流诱导膜囊泡40的变形成随流42排列的伸长的椭圆体。 包含在膜囊泡40中的任何的膜蛋白(未示出)也类似地随流42排列。
通过本发明已将膜囊泡40的上述用途扩展，以促进以配体48形式的 任何靶分子的排列，如图2D中所示。在这种情况下，使用挤出制备图2B、 2C和2D中所示的脂质囊泡40，。优选地，囊泡40，是长度约100 nm的磷 脂囊泡。这种囊泡40'不是二色性的，因此它们产生非常小的干扰信号。 平均长度在100 nm至140 nm之间的类似囊泡40'也是合适的。除了用于 制备已知囊泡40的标准脂质以外，这些囊泡40'包括被设计得与受体的互 补区域形成紧密络合物的以衍生脂质46形式的附着点，在这种情况下， 所述受体为蛋白44。适宜的衍生脂质46的一个实例是1,2-二油酰基-511-甘油基-3-UN(5-氨基-l-羧基戊基)亚氨基二乙酸]琥珀酰〉的镍盐 (DOGS-NTA-Ni)。作为囊泡40'结构的一部分的这种特别的脂质衍生物46 能够与蛋白44中的组氨酸簇(histidine cluster乂未显示)形成紧密络合物。六 -组氨酸簇形成用于固定蛋白的最普遍方法的基础(经由蛋白上的六个组氨 酸标记)，并且这样提供了用于附着到囊泡40，上的蛋白44的理想部分。 因此，在此实施方案中，囊泡40'构成支架部分，而蛋白44构成受体部分。 应当指出，每个囊泡40'包含多个受体部分。如图2D中所示，蛋白44的 以配体48形式的靶分子能够与受体部分(蛋白44)的结合域结合。由于囊 泡40'在流42中的排列，配体48当附着到蛋白44时也被排列，因而它们 可以被图1A中所示的分子传感器检测。
上述实施例中的支架部分20可以在自由流中使用，或可以直接附着 或锚固到观察窗14上。在一个实施方案中，可以将支架部分20(例如囊泡 40，)作为薄膜应用到观察窗14的内表面上。备选地，可以将观察窗14的 内表面化学衍生，以允许支架部分20的附着。
用于将受体部分连接到脂质囊泡上的备选附着体系可以使用能够被 添加到脂质中然后结合到囊泡中的任何共价或非共价键合。这种体系可以 包括硫醇和氨反应性基团或生物素的使用。这些设计者-囊泡(designer-vesicle)的重要特征在于，它们仅与选择的蛋白(或其它受体)(例 如，含有被指定用于附着的分子部分例如六-组氨酸标记的那些)形成络合 物。这是重要的，因为如果可排列的支架和受体之间的相互作用没有选择 性，则被研究的流体(这些可以是例如血液或血清的复杂混合物)中的其它 组分可能附着到支架上，并且产生将干扰真正信号的LD信号，从而导致 误测。在所述的实施方案中，选择将六-组氨酸标记用在选择性纯化中，从 而消除任何不适宜的结合。可以使用能够提供必须的选择性的其它体系， 比如生物素-抗生物素蛋白键合。
可以对本发明的分子传感器10施加控制以消除由非定向结合导致的 吸收数据。例如，可以使用包括负荷不同的受体部分24(即蛋白44)的一系 列支架部分20(即囊泡40')，并且可以使一系列普遍可得的、不含用于附 着的分子部分的分子在溶液中流经支架部分20，并且使用LD测定任何结 合。然后可以将得到的信号作为背景噪声的指标，并且在将设备用于仅检 测靶分子26时，此信息可以用于产生更大的信噪比。
根据本发明的另一个备选体系涉及长链有机聚合物的使用，所述长链 有机聚合物在含有可以用受体部分衍生的官能性化学基团的同时，具有对 于形成可排列支架部分而言正确的流体力学性质。这种有机聚合物应当具 有高纵横比，并且可以是盘形、十字形或棒形。适宜的支架部分的具体实 例包括甲壳质和聚乙二醇。
本发明的又一个实施方案使用噬菌体。丝状噬菌体如M13是由围绕 DNA片段的蛋白的长管(大约长度500nm且直径5nm)形成的。因此，噬
菌体可以作为能够在剪切流中排列的支架部分。 一旦排列，本申请人发现 噬菌体内的蛋白就产生可以被测量的大的LD信号。他们还指出，配体向 噬菌体表面上受体的结合改变其LD信号。尽管此LD信号的改变可以是 噬菌体的流体力学性质的总体变化或来自现已排列的配体的光谱特征的 外观的结果，但是本申请人已指出这可以被用于测量配体与噬菌体的亲和 力。
有利地，可以作为受体的噬菌体表面上的免疫球蛋白或其它蛋白对特 定靶分子具有亲和力。因此，不仅可以将特定的噬菌体菌株用于检测特定 细菌如大肠杆菌、难辨梭菌、MSRA或VRSA的存在，还可以制备转基因的噬菌体以检测配体如SARS、结核、HIV和肝炎的存在。因此，本发明 的实施方案可以在大量的应用中使用。
在图1A和1B的实施方案中，伸长的管道12不需要是塑料的，而可 以由其它生物相容性材料制成。观察窗14可以由允许可见光透射的蓝宝 石或由对紫外线波长透明的石英或CaF制成。通常，约180nm至800nm 的波长范围对于大多数应用是合适的。然而，可以使用其它合适的材料形 成具有所需透射性质的观察窗14。
本领域的技术人员应当认识到，在不偏离本发明的范围的情况下，可 以对上述实施方案进行各种改变。例如，尽管以上讨论主要涉及生物分子 的排列和检测，但是本发明相等地可应用于其它分子。
权利要求
1.一种分子传感器，所述分子传感器包含流路，所述流路被配置用于使潜在地含有靶分子的溶液流动；偏振光的源；检测器，所述检测器被布置用于在来自所述源的光已经通过所述流路以后，接收所述光；以及传感器元件，所述传感器元件包含在使用中被安置在所述流路内、具有高纵横比的支架部分，以及附着到所述支架部分的用于所述靶分子的受体部分。
2. 根据权利要求1所述的分子传感器，其中所述受体部分是二色性的。
3. 根据权利要求1或2所述的分子传感器，其中所述支架部分不是二 色性的。
4. 根据前述权利要求中的任一项所述的分子传感器，所述分子传感器 包含多个支架部分。
5. 根据前述权利要求中的任一项所述的分子传感器，其中所述支架部 分或每个支架部分具有多个附着到其上的受体部分。
6. 根据权利要求5所述的分子传感器，其中每个受体部分对于特定靶 分子具有相同的结合亲和力。
7. 根据前述权利要求中的任一项所述的分子传感器，其中将所述支架 部分或每个支架部分锚固在所述流路中，使得在使用中所述支架部分或每 个支架部分能够在流中排列，但是它的位置被固定在所述流路中。
8. 根据前述权利要求中的任一项所述的分子传感器，所述分子传感器 还包含流动池，所述流动池在使用中可旋转以在所述溶液中产生流动。
9. 根据权利要求1至7中的任一项所述的分子传感器，所述分子传感 器还包含管道，从而在使用中使所述溶液通过所述管道而产生流动。
10. 根据前述权利要求中的任一项所述的分子传感器，其中所述光源 是线性偏振光束的源。
11. 根据前述权利要求中的任一项所述的分子传感器，其中所述光源是线性二色性分光镜。
12. 根据前述权利要求中的任一项所述的分子传感器，其中所述检测 器是产生示出所述溶液的吸光度相对于波长的谱图的检测器。
13. 根据前述权利要求中的任一项所述的分子传感器，其中对所述光 源和检测器进行布置，以分别发射和检测垂直于所述流动方向通过的光。
14. 一种用于根据权利要求1至13中的任一项所述的分子传感器的传 感器元件，所述传感器元件包含具有高纵横比的支架部分和附着到其上的 至少一个受体部分，所述至少一个受体部分对感兴趣的靶分子具有选择性 结合亲和力。
15. —种用于感应流动溶液中的靶分子的方法，所述方法包括 在流路中提供支架部分，所述支架部分具有高纵横比并且具有附着到其上的用于所述靶分子的受体部分；使潜在地含有靶分子的溶液沿所述流路流动； 使偏振光通过所述流路；和在所述偏振光己经通过所述流路以后，检测所述偏振光。
全文摘要
一种分子传感器(10)，其包含被配置用于使潜在地含有靶分子(26)的溶液(28)流动的流路(12)。提供偏振光的源(16)，并且布置检测器(18)，以在来自所述源的光已经通过所述流路以后，接收所述光。提供传感器元件(19)，其包含在使用中被安置在所述流路内、具有高纵横比的支架部分(20)，以及附着到所述支架部分的用于所述靶分子的受体部分(24)。还描述了一种用于感应流动溶液中的靶分子的方法。
文档编号G01N21/19GK101553722SQ200780042414
公开日2009年10月7日 申请日期2007年11月19日 优先权日2006年11月17日
发明者蒂莫西·理查德·达福隆, 马修·希克斯 申请人:伯明翰大学