专利名称：血细胞sars冠状病毒荧光分子信标pcr检测技术的制作方法
技术领域：
生物医药体外分子诊断技术二、技术背景传染性非典性肺炎是最近半年来在我国部分省市及世界多个国家和地区蔓延的一种新的传染病。世界卫生组织(WHO)将其命名为严重急性呼吸道综合征(SARS)，SARS的病原是一种新的冠状病毒(Corona virus，CoV)。因而称为SARS-CoV。基因分子诊断和免疫学检查是SARS快速诊断的两个主要检测方法。由于SARS-CoV抗体一般在发病后十天左右才能在血清中检出，而且检出率不是很高。因此，基因分子诊断是SARS快速诊断的主要方法。目前，SARS-CoV的检测多以呼吸道分泌物、血清、尿液和粪便等排泄物作为样本。这些样本由于病毒滴度不均一，病毒基因组RNA易降解等问题，检出率有限，而且不稳定。最新研究表明SARS-CoV可感染人体多种组织细胞，引起多器官损害。血液细胞一方面可以被病毒直接感染。另一方面，血液中的许多免疫细胞能吞噬病毒颗粒。因而SARS-CoV病毒会在血细胞中增殖和潜伏，病毒滴度较高。以血细胞为样本分离并检测病毒基因可提高SARS的检出率和稳定性。事实上，其他RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)、巨细胞病毒等(CMV)，在血细胞的检出率较血清中要高。而我们现有的部分实验结果也证实，以血细胞为标本进行SARS-CoV的基因检测，检出率也较其他样本更高而且稳定。
发明内容
采用荧光分子信标PCR方法检测外周血细胞中的SARS-CoV核酸。在SARS-CoV的聚合酶基因设计一引物，在上下游引物中间再设计一条分子信标探针。探针的5′端标记荧光基团，3′端标记淬灭基团。待检者血清的抽提及运输按照国家疾病预防控制中心公布的操作指南进行。外周血单核细胞(PBMC)的分离和病毒基因组RNA的抽提在生物安全柜中进行。先用淋巴细胞分离液从外周血(加抗凝剂)中分离出单核细胞。然后用SiO2-异硫氰胍法(本室建立)抽提并富集RNA。以从PBMC中抽提的总RNA为模板，采用逆转录PCR(RT-PCR)分子信标法扩增并检测SARS-CoV聚合酶基因。采用动态实时荧光检测法或反应终点荧光检测法对扩增的SARS-CoV核酸进行定性、定量检测。
四、实施方案本技术主要用于对SARS-CoV可疑患者进行快速诊断并适应于SARS患者治疗的疗效观察。抽提待检者外周血液3～5ml加等量淋巴细胞分离液分离出PBMC，用SiO2-异硫氰胍法抽提总RNA，经逆转录合成cDNA后，PCR扩增靶基因片段。PCR扩增及荧光检测可在定量PCR仪上进行扩增和动态实时检测；也可以用普通PCR仪先扩增目的基因片段，然后用荧光检测仪对扩增产物进行终点检测。结果判定标准与其他荧光分子信标PCR技术相同。
权利要求
1.扩增血细胞样本中的靶基因片段来检测SARS-CoV感染。
2.采用聚合酶链反应(PCR)、分子信标和核酸杂交等分子诊断方法检测血细胞中的SARS-CoV。
3.前面所述的血细胞样本包括血液中的所有细胞。
全文摘要
荧光分子信标PCR检测方法是最常用的SARS－CoV分子诊断方法。此方法一般以呼吸道分泌物、血清、尿液及粪便等排泄物样本来检测SARS－CoV靶基因。这些样本病毒滴度差异较大、病毒基因组RNA不稳定，检出率较低、稳定性差。本技术以外周血细胞为样本，分离外周血单核细胞(PBMC)，抽提总RNA。以外周血细胞RNA为模板，用荧光分子信标RT－PCR扩增目的基因片段来检测SARS－CoV，提高了SARS－CoV的检出率和稳定性。
文档编号C12Q1/68GK1453368SQ0314553
公开日2003年11月5日 申请日期2003年6月30日 优先权日2003年6月30日
发明者王虹 申请人:王虹