专利名称：一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖的试剂盒，特别涉及利用滤纸干血片中的总半乳糖与NAD反应生成荧光物质NADH的原理，快速检测新生儿体内总半乳糖浓度水平的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对新生儿足跟血干血片样品中的总半乳糖浓度水平进行快速判断，从而辅助新生儿半乳糖血症的确诊。
背景技术：
新生儿半乳糖血症(galactosemia),是临床上较为常见的一种染色体隐性遗传代谢病。是由于半乳糖转变成葡萄糖的代谢途径中相关酶的先天性缺陷导致半乳糖正常代谢 途径受阻，体内的半乳糖通过焦磷酸酶旁路途径、半乳糖醇及半乳糖酸途径等代谢半乳糖，从而使得半乳糖及其旁路代谢产物堆积引起半乳糖血症。目前已知有三种酶缺乏会造成新生儿代谢障碍，分别是半乳糖激酶(galactokinase)、半乳糖-I-憐酸尿昔酸转移酶(galactose-l-phosphateuridyl transferase)及尿苷二憐酸半乳糖-4-异构酶(UDP galactose-4-epimerase),其中以半乳糖-I-磷酸尿苷酰转移酶缺失为经典乳糖血症。新生儿体内由于半乳糖-I-磷酸尿苷酰转移酶的缺失，从而阻断体内半乳糖代谢，导致半乳糖以及中间产物半乳糖-I-磷酸积聚，进而侵犯新生儿肝、肾、脑等身体器官，严重时新生儿在婴幼儿时不能存活。目前，该代谢缺陷病在欧美人群中发病率约为1/30000，我国发病率较低，但近年来也呈上升趋势。由于半乳糖血症的临床表现并无特异性，所以其诊断较多地依赖于实验室检查，目前实验室常用的诊断方法有酶学检测以及代谢产物检测。酶学检测发展起始于1966年，主要方法为Beutler实验简介检测红细胞中GALT酶活性的方法。该方法的原理在于若GALT活性正常，在全血或者血滤纸片中加入混有尿苷-二磷酸葡糖、半乳糖-I-磷酸(Gal-I-P)、三磷酸吡啶核苷酸(TPN)混合物，孵育一段时间后，生成的α-I-磷酸葡糖在变位酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)存在的情况下可以将氧化型TPN可以还原成还原型的ΤΡΝ，后者在波长为465 μ m的紫外灯的激发下产生荧光。此方法虽简单易操作，并且是诊断半乳糖血症的金标准，但相关研究表明，温度及湿度过高均会引起假阴性或假阳性结果，同时该诊断方法依赖于G6H)的存在，G6PD的缺陷同样出现假阳性结果。代谢产物检测半乳糖血症的直接表现是机体或体液中异常高浓度的半乳糖及旁路代谢产物(主要是半乳糖-I-磷酸)的积聚，因而目前常根据检测新生儿体内的代谢产物浓度来进行半乳糖血症的诊断。现阶段，对半乳糖代谢产物的检测常采用细菌抑制法、串联质谱法、气相-液相色谱法以及荧光分析法等手段。其中细菌抑制法因涉及细菌的培养，对采血要求较高，同时细菌老化、噬菌体和细菌含量比例，以及突变株稳定性均影响诊断结果，故不建议采用。串联质谱法和气相-液相色谱法对技术要求较高，且成本较高、不易于操作，亦不适宜大规模筛查工作。荧光分析法是现阶段疾病筛查常用的一种方法，主要是利用某些物质受紫外光或可见光照射激发后，能发出比激发光波长更长荧光的特性的一种定性、定量分析方法。荧光分析是一种较为先进的分析方法，它比质谱法、光谱法等应用更为普及。荧光分析法的最大特点是灵敏度高，比分光光度法的灵敏度高2-3个数量级；其次选择性强；最后操作简便、省时、成对相对低廉。有利于大规模疾病筛查工作的顺利进行。本发明人利用荧光分析法技术发明一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖的试剂盒，应用于新生儿体内半乳糖及旁路代谢产物半乳糖-I-磷酸的总量检测，辅助于新生儿半乳糖血症的诊断。国内目前现有的对新生儿半乳糖血症的实验室诊断，通常利用尿液作为检测样本，但尿液并不能真实反映新生儿体内总半乳糖含量，同时其不便于运输和保存，使新生儿筛查工作复杂，同时成本增加。与现有技术不同，本发明采用滤纸干血片为载体，采集新生儿足跟血，滴制血片，晾干。与常规新生儿筛查项目标本一致，无需另外采集，减轻筛查工作 负担。同时新生儿总半乳糖在滤纸干血片中(2-8) °C中稳定性好，活性不易下降，更适合于临床应用。本发明的试剂盒作为国内首个新生儿总半乳糖定量测定的试剂盒，选用新生儿足跟血滤纸干血片为检测样本，并整合荧光分析法，其性能达到并超过对照同类雷勃公司的进口半乳糖血症检测试剂盒，具有灵敏度高、稳定性好、操作简便、省时高效、成本低廉等显著优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用荧光分析技术进行新生儿总半乳糖定量测定的试剂盒。其基本原理是利用机体中总半乳糖(游离半乳糖+半乳糖-I-磷酸酶解半乳糖)在GDH催化下与NAD反应转变成半乳糖内酯，同时伴随发生NAD减少，NADH(可发荧光)增加的原理，依据波长355nm激发光和波长460nm发射光下NADH荧光强度。通过标准曲线，从而对新生儿体内总半乳糖含量进行定量测定。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案I)根据和对照同类进口试剂盒进行临床测值比较，对试剂盒所使用的原料进行筛选，从而确定最佳的原料，这一筛选过程包括校准品配制原料纯度、校准品配制基质、碱性磷酸酶(AFOS)使用浓度、半乳糖脱氢酶(GDH)使用浓度、氧化型辅酶I (NAD)使用浓度、白色遮光反应板的本底及变异大小。2)确定试剂盒的组分及配方，包括反应缓冲液配方、铜试剂配方等，并公开了碱性磷酸酶(AFOS)稀释液和半乳糖脱氢酶(GDH)稀释液配方。I)本发明提供的一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖试剂盒，包括(I)校准品滤纸干血片、质控品滤纸干血片、透明反应板、白色遮光反应板、反应缓冲液、碱性磷酸酶(AFOS)冻干品、半乳糖脱氢酶(GDH)冻干品、氧化型辅酶I (MD)冻干品、铜试剂，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶、板、片的包装盒。根据本发明一个优选的实施方案，校准品滤纸干血片和质控品滤纸干血片由半乳糖-I-磷酸溶解在校准品和质控品基质中，并滴制在市售滤纸上。校准品和质控品滤纸干血片根据半乳糖-I-磷酸浓度不同分别编号A-F和Cl、C2，其中半乳糖-I-磷酸可使用市售产品，市售滤纸优选Whatman903#滤纸。编号A-F的校准品滤纸干血片和C1-C2的质控品干血片加入半乳糖-I-磷酸如下表所示
权利要求
1.一种突光分析法定量测定新生儿总半乳糖(Total Galactose)的试剂盒,试剂盒包括分别装有反应缓冲液、铜试剂、碱性磷酸酶(AFOS)冻干品、氧化型辅酶I (NAD)冻干品、半乳糖脱氢酶(GDH)冻干品并加盖封密的多个试剂瓶，五块96孔透明反应板、五块96孔白色遮光反应板、五套校准品滤纸干血片、五套质控品滤纸干血片，和分隔并集中包装这些试剂瓶、板、片的包装盒，其特征还在于对新生儿足跟血滤纸干血片样品中的总半乳糖浓度水平进行快速检测。
2.根据权利要求I的试剂盒，其特征还在于反应缓冲液由Tris-HCl(lOOmmol/L，ρΗ8· 6)组成。
3.根据权利要求I的试剂盒，其特征还在于铜试剂由CuSO4(I. 5mmol/L)、Na2CO3(62. 5mmol/L)与 KNaC4H4O6 · 4H20(lmmol/L)组成。
4.根据权利要求I的试剂盒，其特征还在于碱性磷酸酶(AFOS)冻干品的浓度为25U/ml、稀释液组分为 Tris-HCl (1 Ommol/T,, pH8. O)、MgCL2 · 6H2O(lmmol/L) >KCl (50mmol/L);氧化型辅酶I (NAD)冻干品的浓度为150mg/ml、溶剂为水溶液；半乳糖脱氢酶(GDH)冻干品的浓度为 6U/ml、稀释液组分为(NH4)2SO4 (2. 2mol/L)、EDTA(O. 8mmol/L)、BSA(O. 02% )，pH =6· O。
5.根据权利要求I的试剂盒，其特征还在于校准品滤纸干血片制备方法为脱纤维绵羊全血，使用无菌生理盐水洗涤6次后调整红细胞压积至O. 55，加入半乳糖-I-磷酸原料，配制不同浓度的校准品，60 μ I/滴滴到Whatman903#滤纸上，滤纸应平放室内自然晾干，2-8°C保存，各点校准品浓度如下_半乳糖(mg/dl) AO B5 C10 D20 E40_F_60_
6.根据权利要求I的试剂盒，其特征还在于质控品滤纸干血片制备方法为脱纤维绵羊全血，使用无菌生理盐水洗涤6次后调整红细胞压积至0. 55，加入半乳糖-I-磷酸原料，配制不同浓度的校准品，60 μ I/滴滴到Whatman903#滤纸上，滤纸应平放室内自然晾干，2-8°C保存，各点校准品浓度如下_半乳糖(mg/dl)Cl6(4. 2-7. 8) C2 15.5(10.85-20. 15)
7.根据权利要求I的试剂盒，其特征还在于采用样本类型为新生儿足跟血滤纸干血片。
全文摘要
本发明涉及一种荧光分析法定量测定新生儿总半乳糖的试剂盒，特别涉及利用滤纸干血片中的总半乳糖与NAD反应生成荧光物质NADH的原理，快速检测新生儿体内总半乳糖浓度水平的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对新生儿足跟血干血片样品中的总半乳糖浓度水平进行快速判断，从而辅助新生儿半乳糖血症的确诊。
文档编号G01N21/64GK102816833SQ201210309949
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者李明, 李庆, 吴英松, 程林, 董志宁, 程钢, 何蕴韶 申请人:广州市达瑞抗体工程技术有限公司