测定紫杉醇含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒的制作方法

测定紫杉醇含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定紫杉醇含量的时间分辨荧光免疫分析法，以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品中的紫杉醇竞争结合抗紫杉醇的单抗，用稀土离子Eu计标记7-xylosyltaxo1-HSA复合物作为示踪物，以增强液作为发光增强系统，利用间接竞争时间分辨荧光免疫分析法，测定所述样品中的紫杉醇含量。本发明方法及试剂盒的灵敏度高，检测范围宽，稳定性好，无毒性，利于样品的快速高效检测，具良好应用前景。
【专利说明】测定紫杉醇含量的时间分辨荧光免疫分析法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于含量测定的化学方法【技术领域】，具体涉及一种测定紫杉醇(Paclitaxel)含量的时间分辨荧光免疫分析法以试剂盒。
【背景技术】
[0002]紫杉醇是从红豆杉属植物中分离出来的一种三环二萜化合物，具有独特的诱导微管蛋白聚合而抑制细胞分裂的抗肿瘤机制。紫杉醇在1992年被美国食品与药物管理局(FAD)批准作为抗晚期癌症的新药上市,到目前为止仍然是治疗乳腺癌、子宫癌、卵巢癌等癌症的临床一线用药。由于紫杉醇的市场需求量不断增大，其生产的主要原料红豆杉又属于稀缺资源，再加上它在植物中的含量极低，因此紫杉醇医疗价值和研究价值有着很大的上升潜力。
[0003]准确高效的检测方法是紫杉醇研究中必不可少的。当前用于紫杉醇检测的方法有薄层色谱法，毛细管电泳法，高效液相色谱，超临界色谱法，质谱法，生物学化学方法，其中应用最广泛的方法是高效液相色谱法。这些方法尽管有些具有某方面的优势，但总体上存在着设备投入高、操作复杂、样品前处理复杂、时间消耗长等缺点。

【发明内容】

[0004]本发明克服现有技术的样品预处理繁、进行大样本测量分析时耗时长、需要使用大量有毒、昂贵的有机试剂、操作复杂、检测范围窄等上述缺陷，提出了一种测定紫杉醇(Paclitaxel)含量的时间分辨荧光免疫分析法，采用时间分辨荧光免疫分析技术，建立紫杉醇的定量分析方法。本发明方法具有操作简便、时间短、灵敏度高、稳定性好等优点，尤其有利于大样本或低浓度样品的检测。
[0005]本发明提出了一种测定紫杉醇(Paclitaxel)含量的时间分辨荧光免疫分析法，以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品中的紫杉醇(Paclitaxel)竞争结合一定量的抗紫杉醇的单抗；用稀土离子Eu3+标记7-xylosyltaxol-HSA复合物作为示踪物；发光增强系统采用以β_ 二酮体为主的增强液；采用间接竞争时间分辨荧光免疫分析法，从而测定样品中的紫杉醇含量。其中，所述样品包括待测样品或标准品。
[0006]本发明测定紫杉醇(Paclitaxel)含量的时间分辨荧光免疫分析法，包括如下步骤:
[0007](I)以4ug/ml兔抗鼠IgGlOOul/孔包被96孔酶标板，4°C反应过夜；
[0008](2)常温振荡lh，洗涤液清洗3次后，280ul/孔封闭液常温封闭lh，清洗4次，拍干;
[0009](3)取广州市药检局购得紫杉醇标准对照品，配制成溶剂为10%甲醇水的标准品，每孔加入 25ul 标准品，浓度分别为 0ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150ng/ml,400ng/ml、，每个浓度3孔。再加入以稀释缓冲液1: 2000倍稀释的抗紫杉醇皂苷单克隆抗体溶液和1: 300倍稀释的标记抗原复合物，贴封膜，于常温下振荡反应Ih;[0010](4)反应结束后，清洗6次，拍干，加入增强液200ul (该增强液采购于广州市达瑞抗体工程技术有限公司；成分包括:冰醋酸、邻苯二甲酸氢钾、Triton X-100、TOPO、β-NTA、纯化水)，振荡5min后，用荧光免疫分析仪Victor 1420测定其荧光信号。
[0011](5)根据荧光值，建立标准曲线。
[0012]以紫杉醇的标准品建立TRFIA的标准曲线。
[0013]以上步骤(3)中以同样方法配制待测样品，经检测，在步骤(5)中测得待测样品中的紫杉醇含量。
[0014]7-xylosyltaxol-HSA 复合物的制备:在 lmll0mg/mlNa104 溶液中，加入 0.5ml 溶解7-xylosyltaxol5.0mg的甲醇溶液,室温避光搅拌反应lh。将反应混合物加至lml5mg/ml的HSA溶液(50mmol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)中，用lmol/L的Na2CO3溶液调节至pH9左右，搅拌12h，对水透析5次。
[0015]铕标记抗原结合物的制备:将合成的7-xylosyltaxol-HSA复合物用标记缓冲液来纯化、浓缩，再比例加入Eu-DTTA(抗原:Eu-DTTA = 2: I)，充分混匀后放入室温孵育16-20小时后，缓慢加入纯化柱内，然后换成洗脱缓冲液对样品进行洗脱，待蛋白检测仪显示出现蛋白峰时，开始收集样品，1.5ml/管，加BSA溶液至含量0.1 %。分装，部分于_20°C保存，部分于4°C备用。
[0016]其中，所述增强液由南方医科大学抗体技术研究中心提供；成分:冰醋酸、邻苯二甲酸氢钾、Triton X-100、T0P0、β-NTA、纯化水。增强液是以β-二酮体为主的增强液。
[0017]其中，所述方法以稀土离子EU3+标记7-xylosyltaxol-HSA复合物作为示踪物,并用增强-解离系统扩大荧光信号。
[0018]其中，所述方法的检测灵敏度为0.004ug/ml。
[0019]其中，所述方法的含量检测范围为5_400g/ml。
[0020]本发明还提供了一种试剂盒，用于进行本发明测定紫杉醇含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其包括酶标包被板，标准品，抗紫杉醇单克隆抗体，铕标记复合物，洗漆液，稀释液以及增强液。利用本发明试剂盒，以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品中的紫杉醇竞争结合抗紫杉醇的单抗，用稀土离子EU3+标记7-xylosyltaxol-HSA复合物作为示踪物，以增强液作为发光增强系统，利用间接竞争时间分辨荧光免疫分析法，测定所述样品中的紫杉醇含量。
[0021 ] 本发明试剂盒中，所述标准品溶液的浓度分别为Ong/ml、5ng/ml, 15ng/ml, 50ng/ml, 150ng/ml,400ng/ml,加样量25ul/孔；所述抗紫杉醇单克隆抗体在测定前以稀释液稀释2000倍，所述铕标记复合物在测定前以稀释液稀释300倍，按先后顺序分别加入IOOul/孔；所述增强液的加液量为200ul/孔。
[0022]本发明区别于现有技术的改进包括:用三价稀土离子及其鳌合物作为示踪物，并用增强-解离系统扩大荧光信号，利用单克隆抗体技术制造出抗紫杉醇单克隆抗体，使得免疫荧光分析方法应用于中药成分的含量测定。本发明中采用现有技术来制备抗紫杉醇单克隆抗体以及制备紫杉醇与人血清白蛋白复合物。
[0023]区别于现有技术，本发明分析法包括了解离增强步骤和荧光检测环节。
[0024]本发明分析法中包括的解离增强步骤:现有技术中的解离增强镧系元素荧光免疫分析(DELFIA)是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕(Eu)连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。但由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此，在本发明方法中采用解离-增强步骤，通过加入一种增强剂，使Eu从复合物上解离下来，解离下来的自由Eu同增强剂中的另一种螫合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。
[0025]本发明分析方法中包括的荧光检测环节:普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stokes位移的大小。如果Stokes位移小,激发光谱和发射光谱常有重叠,相互干扰,影响检测结果的准确性。而本发明中的荧光检测环节，镧系元素的荧光光谱有较大的Stokes位移,最大可达290nm，激发光谱和发射光谱问不会相互重叠，加上其发射的光谱信号峰很窄，荧光寿命长，铕的荧光寿命可达730us，检测中只要在每个激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式，待短寿命的背景荧光衰变消失后，再打开取样门仪器记录长寿命铕鳌合物发射的特异性荧光，可以避免本底荧光干扰，提高本发明方法的检测精密度。TRFIA的测量仪器是时间分辨荧光计，由三大部分组成:光源:脉冲光源:氙灯(每秒闪烁1000次)；小型N2激光器；输出脉冲波长:337nm突光信号获取系统。
[0026]本发明方法中，以三价铕离子为示踪物，标记结合7-xylosyltaxol-HSA复合物，结合抗紫杉醇单克隆抗体后，经过解离-增强步骤，测定荧光值。TRFIA法用稀土元素离子Eu3+作为示踪物，以其荧光寿命长，激发谱带宽而发射光谱很窄等特点排除非特异性荧光的干扰，具有较高的灵敏度和准确性。至目前为止，尚未见有文献报道如本发明的利用时间分辨荧光免疫分析方法来测定紫杉醇含量的先例及相应的试剂盒。
[0027]本发明分析法及试剂盒具有较高的灵敏度和较宽的检测范围:图1表示使用单克隆抗体的紫杉醇含量测定的TRFIA标准曲线，本发明方法测定紫杉醇含量的灵敏度为
0.004ug/ml，在确保线性良好又有较好的检测结果的情况下，确定本方法的含量检测范围为5-400ng/ml。而现有文献高效液相色谱法的紫杉醇的检测下限为较低的8ug左右。本发明方法的灵敏度是高效液相色谱法的近2000倍。显然本方法更为敏感，且检测范围更宽。
[0028]本发明分析法及试剂盒具有同样的准确性:Chao等比较了高效液相色谱法和酶联免疫吸附法得到的结果之间的相关性，其研究证明，两检测系统测定紫杉醇浓度的相关性系数r = 0.999。本发明方法研究者研究了建立的时间分辨荧光免疫分析法和已报道的酶联免疫吸附法测定各个红豆杉样品的紫杉醇的含量的相关性。图2表示，同样提取方法下，比较ELISA法和TRFIA法的含量测定结果的相关性，r2 = 0.9972。表明，本发明建立的TRFIA分析法与HPLC法、ELISA法有同样的准确性。
[0029]本发明有益效果包括:(I)零背景、高特异性:利用斓系元素极长的荧光衰退时间这一特点，激发后以固定时间检测荧光，在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减消失，从而通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，可以避免本底荧光干扰，提高检测的精密度。利用斓系元素发射光与激发光波长问巨大的Strokes位移这一荧光重要特征。(2)灵敏度高:解离一增强使荧光性大大提高近百万倍，此步骤加入一种增强剂，使Eu从复合物上解离下来，自由Eu同增强剂中的另一种螫合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。(3)高稳定性、高精确度:低分子量原子标记，不影响被标记物的空间立体结构，保证其稳定性。且衰变寿命较长、受环境影响小。标记粒子的鳌合物稳定性强，产生的荧光强度高，又使其灵敏度高、重复性更好、线性范围更宽。时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定稳定可达一年以上。例如在具体实施中，本发明方法的灵敏度为0.004ug/ml，设定其检测范围为5?400ng/ml，批内CV平均值为7.98%，批问CV为7.76%。平均回收率为107.7%，相关系数为0.992。
[0030]本发明分析法(TRFDWi)与HPLC法比较，其取样量少，前处理简单，并可在同一块板上同时测定40多个样品。样品的提取时用少量甲醇，测定过程不需有机溶剂，毒性小，对人体的健康和环境影响小，节省人力、物力。本发明分析法与ELISA法相比，用稀土元素离子Eu3+作为示踪物，以其荧光寿命长，激发谱带宽而发射光谱很窄等特点排除非特异性荧光的干扰，具有较高的灵敏度和准确性。传统的紫杉醇的含量检测方法包括薄层扫描色谱法、高效液相色谱法等。高效液相色谱法要求的样品预处理繁琐，精度要求高，进行大样本测量分析时耗时长，需要使用大量有毒、昂贵的有机试剂。相对于传统的测定方法，本发明方法利用单克隆抗体技术和荧光免疫分析技术，简化样品前处理操作，减少有机试剂的使用，降低对环境和人体健康的的危害；大大提高测定方法的灵敏度；同时可进行多个样本的测定。
[0031]本发明提供了紫杉醇单克隆抗体的制备及使用该单抗建立起的用于紫杉醇检测的间接竞争TRFIA方法。相对于传统的测定方法，本发明TRFIA利用单克隆抗体技术和荧光免疫分析技术，简化样品前处理操作，减少有机试剂的使用，降低对环境和人体健康的的危害；大大提高测定方法的灵敏度；同时可进行多个样本的测定。TRFIA多用于临床生化指标和病原微生物的检测，目前，尚未见其在中药成分含量测定上的应用。本发明中，用三价稀土离子及其鳌合物作为示踪物代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质标记蛋白质、多肽，激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞；当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应，革巴细胞和效应细胞的杀伤反应，核酸探针杂交反应等发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物的荧光强度根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。相较于酶联免疫吸附法的酶标记物不稳定性，荧光衰变周期短。本发明分析法(TRFIA法)用稀土元素离子Eu3+作为示踪物，以其荧光寿命长，激发谱带宽而发射光谱很窄等特点排除非特异性荧光的干扰，具有较高的灵敏度和准确性。本发明方法的灵敏度高，检测范围宽，稳定性好，无毒性，尤其利于大样本的检测时快速、高效，极为良好的广泛应用价值。此外，我国有丰富稀土元素资源，本发明方法具有稳定性好的同时又合理利用了稀土元素资源。至今尚未见有文献报道本发明方法用于中药材成分测定领域。在中药材成分测定领域的应用中，本发明方法可成为一种行之有效的新方法。
【专利附图】

【附图说明】
[0032]图1表示本发明分析法测定紫杉醇的标准曲线。
[0033]图2表示本发明分析法和ELISA法测定红豆杉中紫杉醇含量的相关性。
【具体实施方式】
[0034]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0035]实验仪器和试剂:96孔酶标反应板(丹麦Nunc);半自动VICT0R?1420荧光检测仪(PerkinElmer产品)；紫杉醇(Paclitaxel)标准品(中国药品生物制品检定所)；人血清白蛋白(HSA)(美国Sigma公司);兔抗鼠IgG(Rockland公司);铕离子标记HAS-Paclitaxel复合物；小鼠抗Paclitaxel单克隆抗体(自制)；增强液，洗漆液来自南方医科大学抗体技术研究中心；紫杉醇药材样品来自各药店；其它试剂:蒸馏水，甲醇等为国产分析纯。
[0036]本发明提出的测定紫杉醇(Paclitaxel)含量的时间分辨荧光免疫分析法，是以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品或标准品中的紫杉醇竞争结合一定量的抗紫杉醇的单抗；用稀土离子EU3+标记7-xylosyltaxol-HSA复合物作为示踪物,采用以β - 二酮体为主的增强液作为发光增强系统，利用间接竞争TRFIA法测定红豆杉药材中紫杉醇的含量。
[0037]本发明测定紫杉醇(Paclitaxel)含量的时间分辨荧光免疫分析法，方法建立的基本步骤:
[0038](I)以4ug/ml兔抗鼠IgGlOOul/孔包被96孔酶标板，4°C反应过夜；
[0039](2)常温振荡lh，洗涤液清洗3次后，280ul/孔封闭液常温封闭lh，清洗4次，拍干;
[0040](3)取广州市药检局购得紫杉醇标准对照品，配制成溶剂为10%甲醇水的标准品，每孔加入 25ul 标准品，浓度分别为 0ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150ng/ml,400ng/ml、，每个浓度3孔。再加入以稀释缓冲液1: 2000倍稀释的抗紫杉醇皂苷单克隆抗体溶液和1: 300倍稀释的标记抗原复合物，贴封膜，于常温下振荡反应Ih;
[0041]其中，稀释缓冲液由南方医科大学抗体技术研究中心提供；成分:Tris-base、DTPA、NaCl、Tween-20、BSA、ProClin300、Bovine gamma globulin、PHloxine B。抗紫杉醇皂苷单克隆抗体溶液是以稀释液稀释后的抗紫杉醇单克隆抗体溶液。其中，标记抗原复合物是以3价铕离子标记的已合成的7-木糖基紫杉醇和人血清白蛋白复合物。
[0042](4)反应结束后，清洗6次，拍干，加入增强液(由南方医科大学抗体技术研究中心提供；成分:冰醋酸、邻苯二甲酸氢钾、Triton Χ-100、Τ0Ρ0、β-ΝΤΑ、纯化水)200ul，振荡5min后，用荧光免疫分析仪Victor 1420测定其荧光信号。
[0043](5)根据荧光值，建立标准曲线。
[0044]以紫杉醇的标准品建立TRFIA的标准曲线，见图1。
[0045]在上述步骤(2)中，在每孔加入25ul待测样品，其他步骤及条件相同，则测得待测样品的荧光值。
[0046]7-xylosyltaxol-HSA 复合物的制备:
[0047]在lmll0mg/mlNal04 溶液中，加入 0.5ml 溶解 Paclitaxel5.0mg 的甲醇溶液，室温避光搅拌反应lh。将反应混合物加至lml5mg/ml的HSA溶液(50mmol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)中，用lmol/L的Na2C03溶液调节至pH9左右，搅拌12h，对水透析5次。
[0048]铕标记抗原结合物的制备:
[0049]将合成的7-xylosyltaxol-HSA复合物用标记缓冲液来纯化、浓缩，再比例加入Eu-DTTA (抗原:Eu-DTTA = 2: I)，充分混匀后放入室温孵育16-20小时后，缓慢加入纯化柱内，然后换成洗脱缓冲液对样品进行洗脱，待蛋白检测仪显示出现蛋白峰时，开始收集样品，1.5ml/管，加BSA溶液至含量0.1 %。分装，部分于_20°C保存，部分于4°C备用。
[0050]对于间接竞争法标记免疫分析，1g-1ogit数学模型的计算方法相对简单，且大多数情况下可以得到较好相关性，因此是评价这类试剂盒的首选数学模型。方程式:1gitY = A+B*log X，式中:1git Y = B/B0/(1-B/B0)，同时，曲线最高浓度点和最低浓度点之间，使曲线在规定的剂量范围内有足够的落差，即结合率(Β/Β0%)为25% (或20%)所对应的剂量浓度点应小于曲线最高剂量点，结合率为75%或(80% )所对应的剂量浓度点应大于曲线最低剂量点。本发明分析方法中，以紫杉醇的标准品建立TRFIA的标准曲线利用间接竞争法测定样品中的紫杉醇的荧光值，经1g-1ogit函数处理得标准曲线见图1。间接竞争法测定紫杉醇的突光值，经1g-1ogit函数处理得标准曲线见图1。1gitY = ln[Y/(1-Y)]，Y = B/B0, B0为零浓度点的的荧光值。在测量范围5-400ng/ml问相关系数R2 =
0.992，实验结果表明标准曲线量很高。
[0051]实施例1测定不同种红豆杉不同部位紫杉醇的含量
[0052]样品前处理:将采得的红豆杉分别取茎皮和叶，烘干，分别粉碎，过四号筛，精密称取50mg,加入1ml甲醇,超声处理10分钟，10000r/min离心10min,取上清液,重复3次,合并上清液待溶剂挥干，用甲醇将提取物溶解转移至5ml容量瓶定容。将其适当稀释成含20%甲醇的溶液，进行检测。
[0053]实验方法:测定时，取出包被好的酶反应板，每孔加入25ul标准品/样本，复孔加样。再加入以稀释缓冲液1: 2000稀释的抗紫杉醇皂苷单克隆抗体溶液和1: 300稀释的标记抗原复合物于常温下振荡反应Ih ;反应结束后，清洗6次，加入增强液200ul，振荡5min后，用Victorl420测定其荧光信号，取得样品浓度。实验结果见表3。
[0054]表3TRFIA法测定红豆杉样品中的紫杉醇的含量
[0055]
【权利要求】
1.一种测定紫杉醇含量的时间分辨荧光免疫分析法，其特征在于，以兔抗鼠IgG包被96孔酶标反应板，与样品中的紫杉醇竞争结合抗紫杉醇的单抗，用稀土离子Eu3+标记7-xylosyltaxol-HSA复合物作为示踪物，以增强液作为发光增强系统，利用间接竞争时间分辨荧光免疫分析法，测定所述样品中的紫杉醇含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)以兔抗鼠IgG包被96孔酶标板，4°C反应过夜； (2)常温振荡，洗涤液清洗，常温封闭，清洗，拍干； (3)配制紫杉醇标准品或待测样品，溶剂为10%甲醇水，每孔加入标准品或待测样品，浓度分别为 Ong/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150ng/ml, 400ng/ml ;再加入以稀释缓冲液I: 2000倍稀释的抗紫杉醇皂苷单克隆抗体溶液和1: 300倍稀释的标记抗原复合物，贴封膜，常温下振荡反应； (4)清洗，拍干，加入增强液，振荡后，用荧光免疫分析仪VictOrl420测定其荧光信号； (5)测得标准品的荧光值，建立标准曲线；测得待测样品的荧光值即得为样品的紫杉醇含量。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法以稀土离子Eu3+标记7-xylosyltaxol-HSA复合物作为示踪物，并用增强-解离系统扩大荧光信号。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法的检测灵敏度为0.004ug/ml。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法的含量检测范围为5-400ng/ml ο
6.一种试剂盒，用于测定紫杉醇含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于，包括酶标包被板，标准品，抗紫杉醇单克隆抗体，铕标记复合物，洗涤液，稀释液以及增强液。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述标准品的浓度分别为0ng/ml、5ng/ml, 15ng/ml, 50ng/ml, 150ng/ml, 400ng/ml,加样量25ul/孔；所述抗紫杉醇单克隆抗体在测定前以稀释液稀释2000倍，所述铕标记复合物在测定前以稀释液稀释300倍，按先后顺序分别加入IOOul/孔；所述增强液的加液量为200ul/孔。
【文档编号】G01N33/15GK103884843SQ201410134000
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】晁志, 崔倩 申请人:南方医科大学