一种银纳米簇传感器及其制备方法和在检测病毒基因中的应用
【专利摘要】本发明提供了一种银纳米簇传感器及其制备方法和在测定病毒基因中的应用，该传感器为DNA荧光传感器，所述DNA为分子信标型多功能DNA序列，在其3'端修饰有猝灭剂。其制备方法包括设计多功能DNA序列、形成分子信标型DNA序列和制备银纳米簇传感器三个步骤。本发明构建的传感器能够同时检测多种病毒基因，有效弥补单一基因检测结果不准确的缺陷。
【专利说明】
一种银纳米簇传感器及其制备方法和在检测病毒基因中的应用
技术领域
[0001]本发明属于化工领域，具体涉及一种银纳米簇传感器及其制备方法和在检测病毒基因中的应用。
[0002]
【背景技术】
[0003]临床疾病诊断中经常需要检测各种病毒基因，而病毒往往存在多个基因亚型，现有的方法通常一次只检测一种基因，需要结合多次检测的结果来进行临床诊断，增加了操作的步骤，而且多次检测会对诊断的准确性产生较大影响。
[0004]生物传感器是目前生物传感器中报道最多的一种，其中，由于荧光分析法的诸多优点而使荧光生物传感器的应用又最为广泛。荧光生物传感器是将探针进行荧光标记或与荧光物质结合，当探针与目标物质作用时荧光信号发生变化，将识别信息转换为可检测的荧光信号，从而实现对目标物质的分析。近年来，荧光生物传感器的研宄内容主要集中对特定序列、蛋白质、药物、小分子、无机离子等目标分析物的存在和含量进行定性、定量分析。
[0005]银纳米簇是由几个到几十个银原子组成的分子级聚集体。银纳米簇作为一类新型荧光纳米材料具有独特的光学性质，在生化传感和生物成像领域均具有广泛的应用。目前，银纳米簇的制备方法主要是通过以寡核酸作为稳定剂来还原银前驱体。其中，以富含胞嘧啶碱基的寡核苷酸为模板合成的银纳米簇具有良好的水溶性、生物相容性和稳定荧光的优点。
[0006]
【发明内容】
[0007]解决的技术问题:本发明的目的是解决单一基因检测不准确的问题，提出一种激活型银纳米簇传感器，该传感器能够同时检测多种病毒基因。
[0008]技术方案:
一种银纳米簇传感器，该传感器为DNA荧光传感器，所述DNA为分子信标型多功能DNA序列，在其3’端修饰有猝灭剂。
[0009]所述银纳米簇传感器的粒径为I?2nm。
[0010]所述的银纳米簇传感器的制备方法，包括以下步骤:
步骤I，设计多功能DNA序列，该多功能DNA序列从5 ’端到3 ’端依次为银纳米簇的模板序列、识别序列及其部分互补序列，在3 ’末端修饰有猝灭剂；
步骤2，形成分子信标型DNA序列，将步骤I的多功能DNA序列进行热变性并退火，即得；步骤3，制备银纳米簇传感器，以步骤2所得分子信标型DNA序列作为稳定剂，依次加入硝酸银和硼氢化钠发生还原反应，得到银纳米簇传感器。
[0011]进一步地，步骤3中多功能DNA序列、硝酸银、硼氢化钠的摩尔比为1: 6: 6。
[0012]所述的银纳米簇传感器在同时检测不同病毒基因中的应用。
[0013]所述的银纳米簇传感器在同时检测不同流感病毒亚型基因中的应用。
[0014]有益效果:
1.本发明的激活型银纳米簇传感器仅仅在识别待测物后，原本熄灭的信号才被激活，从而进行激活型荧光检测，以免去洗涤步骤并提高检测的灵敏度；
2.本发明的激活型银纳米簇传感器能够同时检测多种靶标如基因序列、小分子物质和生物大分子物质；
3.本发明的激活型银纳米簇传感器能够推广并应用于细胞成像及活体成像领域。
[0015]
【附图说明】
[0016]图1为实施例1中银纳米簇传感器多靶标同时检测示意图；
图2为实施例1中多色银纳米簇传感器的荧光光谱图；
图3为实施例1中多色银纳米簇传感器中加入两种禽流感病毒亚型基因HlNl和H5N1后的荧光发射光谱图。
[0017]
【具体实施方式】
[0018]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0019]一种银纳米簇传感器，该传感器为DNA荧光传感器，所述DNA为分子信标型多功能DNA序列，在其3’端修饰有猝灭剂。利用本发明的银纳米簇传感器同时检测两种病毒亚型基因的过程如图1所示，其原理为:设计多功能DNA序列，5’端到3’端依次为银纳米簇模板序列、识别序列和部分互补序列，经过热变性并退火，形成发夹构型DNA序列，作为稳定剂，基于硼氢化钠还原硝酸银的反应，合成激活型分子信标型银纳米簇。通过改变模板序列，结合不同的识别序列，制备出具有不同靶向的分子信标型多色银纳米簇。所用的多功能DNA序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，分别制备得到HlNl靶向分子信标型绿色银纳米簇和H5N1靶向红色银纳米簇。当不存在靶标基因时，分子信标型中银纳米簇与猝灭剂BHQ相互靠近，发生荧光共振能量转移，荧光猝灭；当存在一种靶标HlNl或H5N1时，由于靶标基因与传感器的分子信标环状区的识别序列发生特异性结合，形成双链DNA，打开发夹结构，使银纳米簇远离荧光猝灭分子，激活一种颜色银纳米簇的荧光信号，实现对单一基因的高灵敏检测;而当同时存在两种靶标基因时，激活两种颜色银纳米簇的荧光信号，从而实现多靶标基因同时检测。
[0020]
实施例1
所用溶液的准备:
称取0.1052g柠檬酸氢二钠和0.47056g柠檬酸三钠，用超纯水定容至10mL，调节溶液pH为7，即得20 mM柠檬酸缓冲溶液。将0.1698g AgNO3溶解于10mL超纯水中配置成浓度为1mM的AgNO3工作溶液;称取0.0378g NaBH4溶解于10mL水中配制成浓度为1mM的NaBH4工作溶液;将DNA链溶解于柠檬酸缓冲溶液(20 mM, pH7)中，配制成ΙΟΟμΜ储备液。
[0021 ]银纳米簇传感器的制备:
步骤I，多功能DNA序列设计
多功能DNA序列包含三部分，如图1所示，从5 ’端到3 ’端依次为银纳米簇的模板序列(功能片段I)、识别序列(功能片段II)、与识别序列5’端序列部分互补的6碱基序列(功能片段III)，3’末端修饰有猝灭剂BHQl分子。具体序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示步骤2，制备分子信标型DNA序列
在1.5mL规格离心管中加入500仙柠檬酸缓冲溶液(20mM，pH7)，取90 yL多功能DNA序列(ΙΟΟμΜ)，混合均匀，放入95° C水浴锅使之变性10分钟，快速放入冰水浴中使之保持I小时，由于识别序列与部分互补序列发生特异性杂交，在上述条件下形成分子信标型DNA序列，5 ’端为银纳米簇模板序列，3 ’端为猝灭剂BHQl分子。
[0022]步骤3，制备银纳米簇传感器
以形成的两种发夹型DNA序列分别作为稳定剂，放入冰水浴中保持10分钟，加入5.4nL硝酸银工作溶液震荡2分钟使之混合均匀，避光放入冰水浴中继续冰浴15分钟;加入5.4pL新鲜制备的硼氢化钠工作溶液，快速混匀使之反应5分钟，避光放入4° C冰箱保存使之过夜，得到激活型分子信标型银纳米簇。实验中反应物摩尔比DNA模板:硝酸银:硼氢化钠=1:
6: 6o
[0023]为了确定激活型银纳米簇传感器的激发波长和发射波长，以未修饰猝灭剂BHQ的分子信标型多功能DNA序列作为稳定剂，按照同样的过程制备出常亮型分子信标型银纳米簇。表征合成出的银纳米簇荧光:绿色银纳米簇的激发波长为445 nm，发射波长为520 nm；红色银纳米簇的激发波长为525 nm，发射波长为595 nm。
[0024]各取100uL制备得到的分子信标型绿色银纳米簇和红色银纳米簇溶液，混合均匀，加入500 nM HlNl(SEQ ID N0.3)或者H5N1基因序列(SEQ ID N0.4)，充分混合均匀至少5分钟，设定激发波长为445 nm，监测其在520 nm波长处的荧光强度，或者设定激发波长为525 nm，测定其在595 nm波长处的荧光强度。由图2可知，未加入靶标基因时，520nm和595nm波长处几乎无荧光信号；如图3所示，加入500 ηΜΗΙΝΙ和H5N1后，出显著激活的荧光信号，
二者强度在同一数量级，表明建立的方法能够有效实现两种病毒基因的同时检测，有望应用临床检测。
[0025]本发明的多色银纳米簇能够拓展到不同基因同时检测，为临床基因诊断提供了新方法。
【主权项】
1.一种银纳米簇传感器，该传感器为DNA荧光传感器，其特征在于:所述DNA为分子信标型多功能DNA序列，在其3 ’端修饰有猝灭剂。2.根据权利要求1所述的银纳米簇传感器，其特征在于:其粒径为I?2nm。3.权利要求1所述的银纳米簇传感器的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤I，设计多功能DNA序列，该多功能DNA序列从5 ’端到3 ’端依次为银纳米簇的模板序列、识别序列及其部分互补序列，在3 ’末端修饰有猝灭剂； 步骤2，形成分子信标型DNA序列，将步骤I的多功能DNA序列进行热变性并退火，即得；步骤3，制备银纳米簇传感器，以步骤2所得分子信标型DNA序列作为稳定剂，依次加入硝酸银和硼氢化钠发生还原反应，得到银纳米簇传感器。4.根据权利要求3所述的银纳米簇传感器的制备方法，其特征在于:步骤3中多功能DNA序列、硝酸银、硼氢化钠的摩尔比为1: 6: 6。5.权利要求1所述的银纳米簇传感器在同时检测不同病毒基因中的应用。6.权利要求1所述的银纳米簇传感器在同时检测不同流感病毒亚型基因中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105838790SQ201610248826
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】刘国良, 冯大千, 周伟程, 石亚鹏
【申请人】盐城工学院