玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记及其应用
【专利摘要】本发明公开了玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻的分子标记及其应用，属于作物遗传育种领域。已获得的玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻材料具有明显的节水耐旱表型，本发明根据玉米转录因子ZmPIF1基因的核苷酸序列，在CDS内设计分子标记的引物，运用PCR技术获得ZmPIF1的DNA片段并对该DNA片段进行测序，依据ZmPIF1的特异性片段筛选得到本发明分子标记的引物，从而获得玉米转录因子ZmPIF1转基因水稻特异的分子标记。本发明的分子标记重复性好、扩增稳定、操作简便、成本低廉，可以用来检测水稻背景中的玉米ZmPIF1基因，为今后利用ZmPIF1基因转基因水稻进行分子标记辅助选择提供坚实的基础。
【专利说明】
玉米转录因子ZmP IF1转基因水稻的分子标巧及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记及其应用，属于作物 遗传育种领域。
【背景技术】
[0002] 1、玉米ZmPIFl转录因子简介
[0003] 全球干旱、半干旱地区约占耕地面积的一半，运些地区水分供应不足、森林植被疏 稀、生态环境恶化、水±流失严重、自然灾害频繁；即使在±壤水分充足的情况下，水分亏缺 也常常会发生，从而影响到光合作用、物质运输、蛋白质合成和细胞伸长等生理过程。干旱 会造成植物不同程度的脱水，引起植物体内一系列的生理代谢变化，所W又将干旱、高盐等 非生物胁迫称为水分胁迫或渗透胁迫。
[0004] 植物应答渗透胁迫的过程是一个设及到多基因、多信号途径、多基因产物的复杂 过程，大体上可将运些基因及其表达产物分成两类：即功能蛋白和调节蛋白；功能蛋白是指 在抵抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质;而调节蛋白是在逆境中参与各种信号转导或调控 基因表达，间接起保护作用的蛋白，其主要包括:传递信号和调控基因表达的转录因子等。
[0005] 植物在逆境胁迫下可诱导合成大量抗逆的化合物和蛋白质，运些与抗逆境相关的 化合物和蛋白质又受转录因子在转录水平上的调控。转录因子可W通过与顺式作用元件结 合，启动抗逆相关功能基因的转录，通过抗逆功能基因的表达使植物作出适应逆境胁迫的 代谢调整。近年来，在提高作物抗逆性的分子育种中，研究重点已逐渐从改良个别基因转到 改良或增强一个或多个发挥关键作用的转录因子上，运样能促使多个功能基因发挥作用， W期获得综合抗逆性状改良的植物。
[0006] 光敏色素作用因子（phytochrome-interacting factors ,PIFs)也称PILs (phytochrome interacting factor-like)，属于拟南芥bHLH转录因子家族的第15亚族。植 物PIFs家族转录因子能够与CANNTG序列（又称E-box)发生特异性作用，调节启动子中含E-box元件的功能基因或调控基因的表达，从而参与植物的各种抗逆性反应。目前利用农杆菌 介导的转基因技术获得玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻，通过对其后代群体生理生化功能 的研究，发现ZmPIFl基因的水稻转基因植株具有明显的抗旱表型；但目前还没有追踪玉米 ZmPIFl基因的分子标记，而发展ZmPIFl基因有效的特异分子标记对ZmPIFl转基因材料的后 续利用十分必要。
[0007] 2、分子标记技术的发展
[000引2.1基于分子杂交技术的分子标记
[0009]限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymo巧hism,RFLP)， 1974年Grodzicker等创立了RFLP技术，用作腺病毒溫度敏感突变的遗传标记(Grodzicker et al，1974)，它是一种WDNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记。利用特定的限制性内切 酶切割不同的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，通过凝胶电泳分离出不同带，然后与克 隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。
[0010] 2.2基于PCR技术的分子标记
[0011] 2.2.1 随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymo巧hism DNA,RAPD)
[0012] 1990年由Williams等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法(Williams et al，1990)。它利用随机引物(一般为8~IObp)通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶 电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态 性。但是RATO受反应条件影响较大，因而其检测的重复性较差。
[0013] 2.2.2序列标签位点（Sequence Tagged Sites,STS)
[0014] 1989年Olson等提出，是对W特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统 称。通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基 因组中特定区域，分析其多态性。
[0015] 2.2.3简单重复序列（Simple Sequence Repeat,SSR)
[0016] 也称微卫星DNA(Tautz et al，1989;Love et al，1990)，是一类由 I~6个碱基组 成的基序(motif)串联重复序列，其中最常见是双核巧酸重复和S核巧酸重复，如（CA)n、 (AT)n、（TG)n、(GGC)n、(GAT)n等。每个微卫星DNA的核屯、序列结构相同，重复单位数目一般为 10~60,它们广泛分布于绝大多数真核生物基因组中，其高度多态性主要来源于串联重复 数目的不同。微卫星序列两侧一般是相对保守的单拷贝序列，根据保守序列设计引物，通过 PCR反应扩增微卫星片段，由于核屯、序列串联重复数目不同，因而能够扩增出不同长度的 PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定多态性。SS財示记一般检测到 的是单一的多等位基因位点，而且呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子。但是，传统的 SSR分子标记开发方法工作量大，需花费大量人力、物力，而且效率较低。
[0017] 2.2.4简单重复序列间区（inter-simple sequence repeat, ISSR)
[0018] Zietkeiwitcz等于1994年提出的一种W微卫星为基础的分子标记，它检测的是两 个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。由于SSR序列广泛分布于高等生物的基因组中，所 WISSR具有很强的多态性。目前，ISS财示记已广泛应用于多种植物品种鉴定、遗传作图、基 因定位、遗传多样性等研究中，但在长穗偃麦草中没有进行研究。
[0019] 2.2.5反转座子位点间扩增多态性（inter-retrotransposon ampl if ied polymorphism,IRAP)
[0020] 其原理是根据反转录转座子中LTR的保守序列设计引物，运些引物在PCR过程中可 W与LTR序列退火，从而扩增出相邻的同一家族的反转录转座子成员间的片段。也可W根据 反转录酶基因的相对保守序列设计引物进行扩增化alendar et al.1999)。目前，IRAP分子 标记技术已应用于大麦化alendar et al,1999;Kalendar et al,2000;Lei曲 et al, 2003)、相橘(Bret6 et al, 2001)、网茅(Yannic et al, 2004)、马铃馨等植物的遗传研究 中。
[0021 ] 2.2.6 反转座子微卫星扩增多态性（retrotr an sposon microsatellite amplified polymorphism,REMAP)
[0022] 是一种基于反转录转座子的标记技术化alendar et al, 1999) ,REMAP技术原理是 根据反转录转座子的LTR保守序列和微卫星序列设计引物，然后进行PCR，扩增出反转录转 座子与邻近的微卫星间的片段，从而检测出反转录转座子与邻近简单重复序列之间的多态 性。
[0023] 2.3基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记
[0024] 扩增片段长度多态性(Amplified Rragment Length Polymo巧hism,AFLP)AFLP是 1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DN A多态性的新方法(Zbaeau et al， 1993) dAFLP是RFLP与PCR相结合的产物，先利用限制性内切酶将基因组DNA切割成不同大小 的DNA片段，再使双链人工接头与酶切片段相边接，作为扩增反应的模板DNA，然后W人工接 头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1~3个选择性核巧酸作引 物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙締酷胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片 段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。随着技术的不断完善和发展，AFLP技术已广泛 应用于植物种质鉴定(Thomas et al, 1995)、遗传图谱构建(Ma;rgues et al, 1998)、目的基 因定位及遗传多态性检测(Pakniyat et al, 1997)等方面。
[0025] 2.4基于DNA忍片技术的分子标记
[00%] 2.4.1 单核巧酸多态性（Single Nucleotide Polymo巧hism,SNP)
[0027] Lander于1996年提出的第S代DNA遗传标记，是指在基因组水平上由于单个核巧 酸变异所引起的DNA序列多态性，其多态性频率大于1%。从分子水平上对单个核巧酸的差 异进行检测。
[00巧]2.4.2多样性微阵列技术(Diversity arrays technology,DArT)
[0029] Jaccoud等于2001年开发了 一种新的分子标记技术多样性微阵列技术(Diversity arrays technology,DA巧），并成功应用于水稻研究中。DArT技术是依赖忍片杂交的方法来 区分基因组中座位多态性的差异;将待检测的不同样本的基因组DNA等量混合后经相关限 制性内切酶处理，根据电泳结果选择回收不同大小DNA片段及一系列DNA操作而达到基因组 复杂性减少，该部分DNA即为基因组代表(Genomic r邱resentation)，并通过相关过程将该 部分DNA固定到玻片上形成点阵列的忍片。W不同样本单独经同样内切酶处理所获的基因 组代表为探针，并组成相应的探针组合对忍片进行杂交，由于不同样本的基因组DNA序列有 差异，因而与忍片上同一点序列杂交的效率不一致，忍片上只有与探针DNA互补的点才具有 杂交信号，通过扫描仪可识辨不同颜色杂交信号的强弱或有无来确定待检测样本的遗传差 别。
【发明内容】
[0030] 针对现有技术中存在的缺点与不足，本发明提供了一种玉米转录因子ZmPIFl转基 因水稻分子标记及其应用；已获得的玉米转录因子ZmPIFl基因的转基因水稻材料具有明显 的节水耐旱表型;根据玉米转录因子ZmPIFl基因的核巧酸序列，在蛋白质编码区CDS内设计 本发明分子标记的引物，运用PCR技术获得玉米转录因子ZmPIFl的DNA片段并进行测序，依 据玉米ZmPIFl的特异性片段筛选得到本发明分子标记的引物，而获得玉米转录因子ZmPIFl 转基因水稻分子标记;该分子标记重复性好、扩增稳定、操作简便、成本低廉。
[0031 ]本发明的技术方案如下：
[0032] 本发明所述的玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记，长度为1189bp，其扩 增序列如SEQ ID No. 1所示。
[0033] 本发明所述的玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记的引物，其序列如SEQ ID No.2和沈Q ID No.3所示：
[0034] SEQ ID No.2：ZmPIFl-F 5'CCGAGCCACAATCTGAGTT 3'；
[0035] SEQ ID No.3：ZmPIFl-R 5'AGTATTTGTGGATCTCCGGT 3'〇
[0036] 本发明还公开了玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记在检测转基因材料 或分子标记辅助选择育种中的应用。
[0037] 玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记的制备方法如下:根据玉米转录因子 ZmPIFl的核巧酸序列，在蛋白编码区内设计所述分子标记的引物，运用PCR技术获得玉米转 录因子ZmPIFl的DNA片段并对该DNA片段进行测序，依据玉米转录因子ZmPIFl的特异性片段 筛选得到所述分子标记的引物，从而获得所述玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标 记。
[0038] 本研究W玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻DNA为实验组、W野生型水稻(武运梗7 号)DNA为对照组，通过普通PCR扩增可区分实验组和对照组之间序列的差异片段，运些片段 可视为玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻DNA的特异片段，再结合普通PCR的富集，能高效地 扩增出玉米ZmPIFl的DNA片段;经回收、测序，最后转化成玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻 的分子标记。
[0039] 本发明具有如下的有益效果：
[0040] 1、本发明利用PCR技术，获得玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的特异分子标记1 个，成功效率高达100 %。
[0041] 2、本发明的分子标记重复性好，扩增稳定，操作简便，成本低廉，可W用来检测水 稻背景中的玉米ZmPIFl基因，为今后利用ZmPIFl基因转基因水稻育种中进行分子标记辅助 选择提供坚实的基础。
【附图说明】
[0042] 图1为玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻T2代纯合株系内巧光定量检测；其中，WT-野生型，VC-空载体，OEl-OEll为ZmPIFl转基因水稻；
[0043] 图2(a)和（b)为玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻在±壤中的耐旱性研究；其中， WT-野生型，VC-空载体，OEl、0E3、0E7为ZmPIFl转基因水稻；
[0044] 图3为基因组特异分子标记在不同玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻材料中的扩 增;其中，泳道1-5为ZmPIFl转基因水稻TO代，泳道6为阴性对照，泳道7为阳性对照；
[0045] 图4为玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻基因组特异分子标记的稳定性检测;其中， M为Marker DL2000,泳道1为质粒，泳道2、3为WT、VC，泳道4-14为11个ZmPIFl转基因水稻T2 代纯系。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0047] 实施例1:实验材料的获得
[004引根据ZmPIFl基因的序列设计引物，利用RT-PCR技术从玉米品种郑单958(购于扬州 田源种业公司）总CDNA中扩增得到ZmPIFl基因；利用农杆菌介导法转化到野生型水稻植株 (武运梗7号），获得玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻。
[0049] 实施例2: PCR引物序列
[0050]根据玉米耐旱相关的转录因子ZmPIFl基因的核巧酸序列，在蛋白编码区内设计引 物，引物的序列如下：
[0化1] ZmPIFl-F:5'-CCGAGCCACAATCTGAGTT-3'(沈Q ID No.2)，
[0052] ZmPIFl-R:5'-AGTATTTGTGGATCTCCGGT-3'(SEQ ID No.3)；
[0053] 其扩增片段为1189bp，即为玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记的序列 (沈Q ID No. 1)。
[0化4] 实施例3:玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻阳性植株的鉴定
[0055] 采用SDS酪-氯仿法微量提取水稻基因组DNA，其步骤如下：
[0056] 1.取两片幼嫩叶片（约0.2g)，剪碎装入2ml的离屯、管中，置于液氮中冷却，用俟子 捣碎至粉末状；
[0化7] 2.加入70化1的抽提缓冲液A，轻轻混匀后，于65°C水浴30min(每5min上下颠倒混 匀一次）；
[005引3.取出稍冷却至室溫，加入等体积的酪/氯仿(各35化1)，上下颠倒充分混匀，抽提 IOmin;
[0化9] 4.1200化pm，离屯、5min，吸取上清到一新的离屯、管中；
[0060] 5.加0.7倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室溫放置lOmin，可见絮状沉淀；
[0061 ] 6.12000巧 m，离屯、lOmin，弃去上清；
[0062] 7.加入70化1的70 %的乙醇清洗沉淀；
[0063] 8.12000巧 m，离屯、5min，弃去上清；
[0064] 9.室溫下惊干；
[00化]10.加入30iU的TER溶解，37°C溫浴60min后，-2(TC保存。
[0066] 取Iiil DNA作为模板，W实施例2中的引物进行PCR扩增，扩增条件为：94°C预热 Smin; 94°C，40s，58°C，40s，72°C，2min，共35个循环；72°C，IOmin。W转基因水稻DNA为模板， 能扩增出长度为1189bp的目的片段，证明目的基因 ZmPIFl已经整合入水稻基因组中。
[0067] 实施例4:转录因子ZmPIFl转化水稻后的抗逆分析
[0068] 获得11个纯合转化株系，进行ZmPIFl转基因水稻T2代纯合株系内巧光定量检测， 结果显示在运11个转基因纯合材料中ZmPIFl均表达，并未发生基因沉默(如图1所示）。选取 OEl、0E3和0E7S个转基因材料做进一步分析，主要有W下内容：
[0069] 植株抗干旱的研究。在进行干旱处理时，将±壤中生长40天左右且长势比较一致 的野生型和ZmPIFl转基因株系的植株进行自然干旱胁迫处理，干旱胁迫7天后，将它们重新 置于清水环境中进行恢复培养。如图2所示，在干旱胁迫7天后，野生型植株的叶片表现出严 重的萎黄现象，部分植株并已死亡，而转基因植株虽有部分叶片发生萎黄，但大部分植株的 叶片及茎干仍保持绿色。恢复10天后野生型植株无法恢复而死亡，转基因植株却能恢复生 长变绿。上述试验结果表明，在遭受到干旱胁迫时，转基因水稻比野生型水稻表现出更强的 干旱胁迫耐受性，而且在干旱胁迫处理终止后，转基因水稻比野生型水稻表现出更快的恢 复速度。
[0070] 实施例5:玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻特异分子标记的扩增和稳定性
[0071] 获得的特异分子标记是否稳定对其应用非常重要，利用相同引物对ZmPIFl转基因 水稻阳性材料进行PCR，结果表明所发展的特异分子标记是非常稳定的，可W跟踪玉米 ZmPIFl转录因子。W武运梗7号为背景的玉米ZmPIFl转录因子转基因水稻，选择上述引物对 T0、T2代进行扩增。从图3结果可W看出，所得扩增标记和预期条带大小一致，表明TO代中有 玉米ZmPIFl基因的存在。相同分子标记在同一转基因材料的不同世代中可W稳定遗传，图4 表明该株系T2代均有玉米ZmPIFl基因在不同单株中稳定存在。
【主权项】
1. 玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记，其特征在于，所述分子标记的扩增序 列如SEQ ID No.l所示。2. -种权利要求1所述的玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记的引物，其特征 在于，所述分子标记的引物的序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示： SEQ ID No.2:ZmPIFl-F 5'CCGAGCCACAATCTGAGTT 3'； SEQ ID No.3:ZmPIFl-R 5'AGTATTTGTGGATCTCCGGT 3'。3. -种权利要求1所述的玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记在检测转基因材 料或分子标记辅助选择育种中的应用。4. 一种玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记的制备方法，其特征在于，所述方 法如下：根据玉米转录因子ZmPIFl的核苷酸序列，在蛋白编码区内设计如SEQ ID No. 2和 SEQ ID No.3所示的引物，运用PCR技术获得玉米转录因子ZmPIFl的DNA片段并对该DNA片段 进行测序，依据玉米转录因子ZmPIFl的特异性片段筛选得到如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3 所示的引物，从而获得所述玉米转录因子ZmPIFl转基因水稻的分子标记。
【文档编号】C12Q1/68GK105838789SQ201610247580
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】高勇, 陈建民, 吴美琴, 任小芸, 梁恩兴, 张冬平, 陆怡
【申请人】扬州大学