专利名称:双重荧光pcr－改良分子信标检测食源性致病菌的方法
技术领域：
本发明涉及荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法。
背景技术：
食源性疾病发病率较高，例如霍乱弧菌引起霍乱，伤寒沙门氏菌和志贺氏菌分别引起伤寒和痢疾。霍乱、伤寒、痢疾属我国的重点传染病。副溶血弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、变形杆菌等引起的食物中毒，其发病率在我国食源性疾病发病率中占较高的比例。目前这些食源性致病菌仍以传统细菌分离培养和鉴定的方法进行检测。这种传统检测方法操作繁琐，耗时耗力，一般需5天时间，最长的还需要一个月的时间，而且生化试验和血清学试验不稳定；检测灵敏度较低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如中国专利公开号为CN1526825的专利申请，披露了一种利用副溶血弧菌pR72H序列的特异性，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等现代分子生物学手段检测副溶血弧菌的方法。然而该PCR技术易污染，造成检测失败，还需电泳。自1995年美国PE公司提出实时PCR检测原理后，实时PCR以其快速、定量、无需后电泳、无交叉污染等突出优点而被广泛采用。
分子信标是1996年Tyagi等提出来的一种具有颈环构型的分子探针，是基于核酸碱基配对原则和荧光共振能量现象设计的，在PCR扩增的退火阶段，分子信标与生成的靶序列结合发出荧光，在延伸阶段，则脱离靶序列而不干扰扩增，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与模板量成正比。
但目前所采用的实时PCR方法为单一荧光PCR方法，只能检测一种致病菌，且检测速度和灵敏度仍不能满足要求。随着生态环境的变化和抗生素的滥用，许多致病菌引起的临床症状越来越不典型，常常需要同时检测多种细菌才能确定病原。这就对快速诊断技术提出了更高的要求又快又能同时检测多种病原微生物。因此急需开发同时快速诊断多种细菌的方法。
发明内容
为了克服现有技术操作繁琐、耗时长等缺点，以及不能同时快速地检测多种食源性致病菌的缺陷而提供一种双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是，一种双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，根据待测两种致病菌的特异基因序列设计一对引物1和改良分子信标探针1，以及一对引物2和改良分子信标探针2，采用荧光PCR-改良分子信标扩增待测两种致病菌特异基因的序列，利用分子信标与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或40阴性；Ct小于38阳性。
荧光PCR-改良分子信标扩增基因序列的反应体系为1×PCR缓冲液MgCl20.5～5mmoldNTP各 0.05～1.5mmol引物1 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol引物2 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol探针1 0.1～1.0μmol探针2 0.1～1.0μmolTaq酶 0.2～10U模板 1～20μl总体积 20～100μl所述荧光PCR-改良分子信标扩增特异基因序列的反应条件是90～100℃预变性3～10分钟，40～50个循环中92～95℃变性15～60秒，50～60℃退火15～60秒，70～72℃延伸15～120秒。
所述检测的食源性致病菌为选自霍乱弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌，以及O157H7大肠杆菌中的一种或两种的组合。
所述致病菌的特异基因序列分别为霍乱弧菌肠毒素基因ctxA序列、副溶血弧菌耐热直接溶血素基因TDH序列、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因NUC、单增李斯特氏菌的溶血素基因hly的序列、沙门氏菌的侵袭基因ivnA序列、志贺氏菌的编码侵袭性质粒抗原H基因ipaH序列，以及O157H7大肠杆菌的溶血素基因rfbE序列。
所述改良分子信标的引物和探针分别为ctxA基因的一对引物ctxA-F5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，ctxA-R5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′ctxA基因的探针HEX-5′-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，TDH基因的一对引物TDH-F5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，TDH-R5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，TDH基因的探针FAM 5′-CCGGGGTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，NUC基因的一对引物NUC-F5’-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3’NUC-L5’-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3’NUC基因的探针ROX-5’-CGATGCAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3’-DABCYLhly基因的一对引物hly-F5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’hly-L5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’hly基因的探针
FAM-5’-CGCGCTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3’-DABCYLinvA基因的一对引物invA-F5’-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3’invA-L5’-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3’invA基因的探针5’-FAM-CCGCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3’ipaH基因的一对引物ipaH-F5’-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3’ipaH-L5’-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3’ipaH基因的探针CY55’-CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3’-DABCYLrfbE基因的一对引物rfbE-L5’-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3’rfbE-R5’-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3’rfbE基因的探针5’-FAMCGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3’，其中划线部分为改良分子信标探针的靶序列。
所述的双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，还进一步包括对待测样品处理和模板提取步骤。
所述样品包括食品样品、粪便、呕吐物标本，其中处理粪便、呕吐物标本及提取模板是根据粪便和呕吐物量的多少，用100-200μL生理盐水悬浮，煮沸，10000rpm离心2分钟，取5μL上清液即可用于实时PCR反应；食品样品的处理和模板的提取是将食品样品在针对待测细菌的增菌液中增菌后，共取1.2mL增菌液10000rpm离心5分钟，弃其上清液后，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于实时PCR反应；或弃其上清液后加入裂解液裂解，经酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于实时PCR反应。
本发明的有益效果是本发明在改良分子信标技术的基础上，建立了双重实时PCR同时检测两种细菌的方法，此方法(1)根据不同需要，可随机组合两种细菌同时进行检测；(2)灵敏度高，样品含32-100cfu/ml细菌即可检出；(3)特异性强，与对照组十几种细菌无交叉反应；(4)操作简单，结果观察直观明了，可一次检测96份标本(含阴阳性对照)；(5)检测速度快，检测大便和呕吐物标本仅需2小时检测时间，检测食品样品仅需1-2天时间(包括样品的前期处理)。
图1至图3为本发明荧光PCR-改良分子信标检测曲线图。
具体实施方式
本发明以7种食源性致病菌的检测为例，可随机两两组合，来分析双重荧光PCR-改良分子信标的检测方法，从而实现快速准确地同时检测两种致病菌。
改良分子信标探针是为了提高杂交效率，在原来分子信标原理基础上提出的。改良分子信标的突出特点是将分子信标的臂部分也作为靶识别序列，而不仅仅是用于形成发夹结构的无关添加序列。对于同样长度的检测靶序列，改良分子信标比分子信标更短，而且由于臂序列不再悬空，因而与靶序列的结合更趋紧密。改良分子信标比分子信标更易设计且成功率更高，同时对扩增条件要求不严格，因此对于多个靶序列的同时检测，改良分子信标的优势更加明显。
根据GenBank公布的7种食源性致病菌的毒素基因或侵袭基因的保守序列，即霍乱弧菌的ctxA、副溶血弧菌的TDH、沙门氏菌的invA、志贺氏菌的ipaH、金黄色葡萄球菌的NUC和单增李斯特氏菌的hly基因，O157H7大肠杆菌的溶血素基因rfbE，分别设计引物和改良分子信标探针，用不同的荧光剂标记7条探针，同时以十几种细菌作对照，建立荧光PCR-改良分子信标检测7种食源性致病菌的反应体系。并将此检测体系应用于常见细菌性食物中毒的快速诊断。用双重荧光PCR检测食源性致病菌的方法主要包括以下步骤(1)根据GenBank公布的食源性致病菌的毒素基因或侵袭基因的保守序列，分别设计引物和改良分子信标探针；(2)待测样品处理和模板提取；(3)荧光PCR扩增；(4)检测荧光信号，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准。
其中步骤(2)样品处理和模板提取，样品适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物等标本。对于粪便、呕吐物标本，根据粪便和呕吐物量的多少，用100-200μL生理盐水悬浮，煮沸，10000rpm离心2分钟，取5μL上清液即可用于实时PCR反应。食品样品的处理和模板的提取是将食品样品在针对待测细菌的增菌液中增菌后，取1mL增菌液于10000rpm离心5分钟，弃其上清液后，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于实时PCR反应；或弃其上清液后加入裂解液裂解，经酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于实时PCR反应。
步骤(3)的荧光PCR扩增的反应体系为1×PCR缓冲液MgCl20.5～5mmoldNTP各 0.05～1.5mmol引物1 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol引物2 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol探针1 0.1～1.0μmol探针2 0.1～1.0μmolTaq酶 0.2～10U模板 1～20μl总体积 20～100μl
以上试剂组分10×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自中国大连宝生物公司。反应条件是94～95℃预变性3～10分钟，40个循环中94～95℃变性15～30秒，50～55℃退火15～30秒，72℃延伸15～30秒。
步骤(4)检测荧光信号的Ct值，是采用iCycler实时PCR扩增仪(Bio-Rad公司)或MX4000荧光PCR扩增仪退火阶段检测荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳对照)。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果Ct值为0或40表示呈阴性；Ct小于38表示呈阳性；Ct在38-40之间时，样品需重新检测。检测大便和呕吐物标本仅需2小时检测时间，检测食品标本仅需1-2天时间(包括样品的前期处理)。
例一本例中以双重荧光PCR-改良分子信标检测霍乱弧菌和副溶血弧菌为例。根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因(ctxA)的序列和副溶血弧菌耐热直接溶血素基因(TDH)序列并比较分析，分别设计一对引物和探针。
ctxA基因的引物1和探针1ctxA-F5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，ctxA-R5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′ctxA-ProbeHEX-5′-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，TDH基因的引物2和探针2TDH-F5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，TDH-L5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，TDH-ProbeFAM 5′-CCGGGGTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，试验用菌株12种细菌共104株菌株。包括1株沙门氏菌(Salmonella)、1株志贺氏菌(Shigella)、5株产毒性大肠杆菌(EnterotoxinEscherichia coli)(1株菌株血清学试验为阳性，4株菌株血清学试验和肠毒素试验阳性)、1株金黄色葡萄球菌(S.aureus)、1株蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、1株李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、1株溶藻弧菌(V.algionolyticus)、1株河弧菌(V.fluvialis)、1株创伤弧菌(V.vulnificus)、1株变形杆菌(Proteus)、40株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和50株霍乱弧菌(V.cholera)。溶藻弧菌和创伤弧菌由广东省疾病预防控制中心微生物检验所提供，其余菌株均购自中国药品生物制品检定所。霍乱弧菌的分离鉴定和肠毒素实验按照《霍乱防治手册》(1999年版)操作。其他11种细菌的分离和鉴定以及产毒性大肠杆菌的肠毒素试验均按照中华人民共和国颁布的《食品微生物学》国家检验标准操作。
利用上述PCR体系同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的方法还包括以下步骤(1)样品处理和模板提取样品适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物等标本，粪便、呕吐物标本的处理及提取方法与前述方法相同；食品样品25g食品放在225mL碱性蛋白胨水中增菌6-8小时后，取1mL增菌液，10000rpm离心5分钟，弃取上清液，加入30μL水溶解，煮沸，取5μL上清液用于实时PCR反应。
(2)荧光PCR扩增，其反应体系为1×PCR缓冲液MgCl22.5μLdNTP各 1.5mmol引物1 0.05mmol引物2 0.2μmol+0.2μmol探针1 0.2μmol探针2 0.2μmolTaq酶 1U模板 10μl总体积 25μl
实时PCR反应条件为95℃预变性5分钟，45个循环中94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)检测采用iCycler实时PCR扩增仪(Bio-Rad公司)退火阶段检测荧光，将含反应液的PCR管逐一放到荧光PCR扩增仪进行检测。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果Ct值为0或40阴性；Ct小于38阳性；Ct在38-40之间样品需重新检测，仪器检测时间2小时。
用本例的双重荧光PCR-改良分子信标检测含霍乱弧菌和/或副溶血弧菌的体系。图1(a)为不含霍乱弧菌或副溶血弧菌的空白体系的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线，图1(b)为双重荧光PCR检测同时含有霍乱弧菌和副溶血弧菌的荧光强度曲线，图1(c)为荧光PCR检测含有霍乱弧菌的荧光强度曲线，图1(d)为双重荧光PCR检测含有副溶血弧菌的荧光强度曲线。由图1比较分析，双重荧光PCR检测两种细菌，无交叉反应，相互之间没有干扰和抑制作用，荧光信号没有减弱，且特异性强。
共采集148份样品，48份食物中毒样品和100份海产品。148份样品用前述双重荧光PCR进行检测，同时采用传统细菌培养方法进行验证。荧光PCR方法和传统检测方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度高于传统检测方法。见表1。
表1 传统检测方法和荧光PCR检测方法的比较
(4)特异性分析特异性检测以沙门氏菌、志贺氏菌、产毒性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、李斯特氏菌、溶藻弧菌、河弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌的DNA作对照，对霍乱弧菌和副溶血弧菌进行ctxA和TDH改良分子信标实时PCR扩增。特异性分析结果表明，只有含ctxA基因的霍乱弧菌和含TDH基因的副溶血弧菌有荧光信号，其他细菌无荧光信号，进一步证明了荧光PCR的特异性。见表2。
表2 霍乱弧菌和副溶血弧菌双重实时PCR特异性分析
由表2可见，本发明的荧光PCR-改良分子信标探针特异性强，与对照组10种细菌无交叉反应，尤其与霍乱弧菌毒力因子相似的产毒性大肠杆菌也无交叉反应，即本例中所采用的4株肠毒素实验为阳性的菌株也无荧光信号产生。
(5)灵敏度分析分别选1株小川型霍乱弧菌和1株副溶血弧菌作为灵敏度分析的代表株。菌液灵敏度分析菌株经碱性蛋白胨水(APW)增菌过夜后，进行10倍稀释，共做10个稀释度，然后依次取10个稀释度的1mL菌液进行实时PCR反应。同时相对应的按中华人民共和国颁布的《食品微生物检验标准》做细菌总数计数。本发明的荧光PCR方法灵敏度高，32-69cfu/mL细菌，即可检出。
(6)重复性试验分别对1株小川型霍乱弧菌和1株副溶血弧菌重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.1个循环。
例二根据GenBank公布的沙门氏菌的侵袭基因(ivnA)和志贺氏菌的编码侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的序列并比较分析，分别设计一对引物和探针。
invA基因的引物1invA-F5’-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3’invA-L5’-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3’invA基因的探针15’-FAM-CCGCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3’ipaH基因的引物2ipaH-F5’-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3’ipaH-L5’-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3’ipaH基因的探针2ROX5’-CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3’-DABCYL试剂组分10×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自中国大连宝生物公司。
试验用菌株14种细菌共132株菌株。包括1株产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)、1株侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli，EIEC)、1株O157H7大肠杆菌(O157H7)、1株致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli，EPEC)、1株枸橼酸杆菌(Citrobacter)、1株大肠埃希氏菌E.coli、1株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、1株霍乱(V.cholera)弧菌、1株金黄色葡萄球菌(S.aureus)、1株单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、1株蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、1株变形杆菌(Proteus)、70株沙门氏菌(Salmonella)(各种血清型)、50株志贺氏菌(Shigella)(各种血清型)。所有菌株均按照中华人民共和国颁布的《食品微生物学》国家检验标准进行分离和鉴定。
利用上述荧光PCR方法同时检测沙门氏菌和志贺氏菌的方法还包括以下步骤
(1)样品处理和模板提取样品适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物等标本；对粪便、呕吐物标本，根据粪便和呕吐物量的多少，用100-200μL生理盐水悬浮，煮沸，10000rpm离心2分钟，取5μL 上清液即可用于实时PCR反应；对于食品样品，其中检测沙门氏菌时，将25g食品放在225mLSC中增菌10个小时；对于志贺氏菌，将25g食品放在225mLGN中增菌10个小时，增菌后，取1mL增菌液，10000rpm离心5分钟，弃其上清液，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于实时PCR反应。
(2)荧光PCR扩增配制双重荧光PCR反应体系1×PCR缓冲液MgCl22.5μLdNTP各 1.5mmol引物1 0.05mmol引物2 0.2μmol+0.2μmol探针1 0.2μmol探针2 0.2μmolTaq酶 1U模板 10μl总体积 25μl实时PCR反应条件为95℃预变性5分钟，45个循环中94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)检测采用iCycler实时PCR扩增仪(Bio-Rad公司)退火阶段检测荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳对照)。结果判断根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果Ct值为0或40阴性；Ct小于38阳性；Ct在38-40之间样品需重新检测。
用前述14种细菌共132株菌株进行实验，用本发明的单一或双重荧光PCR方法分别检测按前述方法配制的不含沙门氏菌或志贺氏菌空白体系、含有沙门氏菌和志贺氏菌的体系、含有沙门氏菌的体系、以及含有志贺氏菌的体系。采用iCycler实时PCR扩增仪检测退火阶段荧光，荧光强度曲线如图2。其中，图2(a)为空白体系的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线，图2(b)为双重荧光PCR检测含有沙门氏菌和志贺氏菌的荧光强度曲线，图2(c)为荧光PCR检测含有沙门氏菌的荧光强度曲线，图2(d)为荧光PCR检测含有志贺氏菌的荧光强度曲线。由图2比较分析，双重荧光PCR检测两种细菌，无交叉反应，相互之间没有干扰和抑制作用，荧光信号没有减弱，特异性强。
共采集350份样品，包括食品样品和食物中毒样品。350份样品用荧光PCR进行检测的同时采用传统细菌培养方法进行验证。按上述方法对样品进行处理及模板的提取后进行检测，传统检测方法和荧光PCR检测方法的比较见表3。
表3 传统检测方法和荧光PCR检测方法的比较
双重荧光PCR方法检测大便和呕吐物标本仅需2小时检测时间，检测食品标本仅需1天时间(包括样品的前期处理)，可同时检测两种细菌。因此双重荧光PCR方法省时省力，准确性高，可满足疾病的快速诊断。而且，荧光PCR方法和传统检测方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度高于传统检测方法。
例三根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(NUC)和单增李斯特氏菌的溶血素基因(hly)的序列并比较分析，分别设计一对引物和探针。
NUC基因的一对引物1NUC-F5’-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3’NUC-L5’-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3’NUC基因的探针1ROX-5’-CGATGCAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3’-DABCYLhly基因的一对引物2hly-F5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’hly-L5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’hly基因的探针2FAM-5’-CGCGCTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3’-DABCYL试剂组分10×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自大连宝生物公司。
试验用菌株13种细菌共85株菌株。包括1株沙门氏菌(Salmonella)(Salmonella)、1株志贺氏菌(Shigella)、1株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、1株霍乱弧菌(V.cholera)、1株O157H7大肠杆菌(O157H7)、1株蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、1株变形杆菌(Proteus)、1株表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、1株葡萄球菌(Staphylococcus)、1株乙型溶血性链球菌(Streptococcus)、20株金黄色葡萄球菌(S.aureus)、22株单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、33株非单增李斯特氏菌(Non L.monocytogenes)。所有菌株均按照中华人民共和国颁布的《食品微生物学》国家检验标准进行分离和鉴定。
利用双重荧光PCR体系同时检测金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌的方法还包括以下步骤(1)样品处理和模板提取其中样品适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物等标本，(a)粪便、呕吐物标本根据粪便和呕吐物量的多少，用100-200μL生理盐水悬浮，煮沸，10000rpm离心2分钟，取5μL上清液即可用于实时PCR反应；(b)食品样品金黄色葡萄球菌25g食品放在225mL 7.5％Nacl增菌液过夜；单增李斯特氏菌25g食品放在225mLLB1中增菌24小时，增菌后，取1mL增菌液，10000rpm离心5分钟，弃其上清液，加入裂解液裂解，经酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于实时PCR反应。
(2)荧光PCR扩增配制双重荧光PCR反应体系1×PCR缓冲液MgCl22.5μLdNTP各 1.5mmol引物1 0.05mmol引物2 0.2μmol+0.2μmol探针1 0.2μmol探针2 0.2μmolTaq酶 1U模板 10μl总体积 25μl实时PCR反应条件为95℃预变性5分钟，45个循环中94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)检测采用iCycler实时PCR扩增仪(Bio-Rad公司)退火阶段检测荧光，将含反应液的PCR管逐一放到荧光PCR扩增仪进行检测，可一次检测96份样品。Ct值为0或40阴性；Ct小于38阳性；Ct在38-40之间样品需重新检测。
用前述13种细菌共85株菌株进行实验，用本发明的单一或双重荧光PCR方法分别检测按前述方法配制的不含金黄色葡萄球菌或单增李斯特氏菌的空白体系、同时含有金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌的体系、含有金黄色葡萄球菌弧菌的体系、以及含有单增李斯特氏菌的体系。采用iCycler实时PCR扩增仪检测退火阶段荧光，荧光强度曲线如图3。其中，图3(a)为空白体系的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线，图3(b)为双重荧光PCR检测含有金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌的荧光强度曲线，图3(c)为荧光PCR检测含有金黄色葡萄球菌弧菌的荧光强度曲线，图3(d)为双重荧光PCR检测含有单增李斯特氏菌的荧光强度曲线。由图3比较分析，双重荧光PCR检测两种细菌，无交叉反应，相互之间没有干扰和抑制作用，荧光信号没有减弱，特异性强。
共采集248份样品，包括食品样品和食物中毒样品。248份样品用荧光PCR进行检测的同时采用传统检测方法进行验证。样品处理和模板提取方法与前述方法相同。传统检测方法和荧光PCR检测方法的比较见表4。
表4 传统检测方法和荧光PCR检测方法的比较
双重荧光PCR方法检测大便和呕吐物标本仅需2小时检测时间，检测食品标本仅需1.5天时间(包括样品的前期处理)，可同时检测两种细菌。因此双重荧光PCR方法省时省力，准确性高，可满足疾病的快速诊断。而且，荧光PCR方法和传统检测方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度高于传统检测方法。
例四根据GenBank公布的O157H7大肠杆菌的溶血素基因rfbE序列并比较分析，分别设计一对引物和探针rfbE基因的引物rfbE-L5’-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3’rfbE-R5’-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3’rfbE基因的探针5’-FAMCGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3’
rfbE的扩增片段为169bp。
与其它实例中的双重荧光PCR-改良分子信标扩增体系、反应条件及结果的检测方法相同，可同时准确地检测O157H7与前述十几种其它致病菌(如沙门氏菌、志贺氏菌、产毒性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、单增李斯特氏菌、变形杆菌、溶血性链球菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌等)的两两随机组合体系，且特异性强、灵敏度高，其荧光强度曲线与图1至3相同。
双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的检测体系可开发成一序列快速检测试剂盒，满足疾病预防控制机构、检验检疫部门和技术监督部门的日常检验和公共卫生突发事件的快速应对，具有重大的社会效益和经济效益。
权利要求
1.一种双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，根据待测两种致病菌的特异基因序列设计一对引物1和改良分子信标探针1，以及一对引物2和改良分子信标探针2，采用荧光PCR-改良分子信标扩增待测两种致病菌特异基因的序列，利用分子信标与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或40阴性；Ct小于38阳性。
2.如权利要求
1所述的双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于所述荧光PCR-改良分子信标扩增基因序列的反应体系为1×PCR缓冲液MgCl20.5～5mmoldNTP各 0.05～1.5mmol引物1 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol引物2 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol探针1 0.1～1.0μmol探针2 0.1～1.0μmolTaq酶 0.2～10U模板 1～20μl总体积 20～100μl
3.如权利要求
1所述的双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于所述荧光PCR-改良分子信标扩增特异基因序列的反应条件是90～100℃预变性3～10分钟，40～50个循环中92～95℃变性15～60秒，50～60℃退火15～60秒，70～72℃伸15～120秒。
4.如权利要求
1至3中任一项所述的双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于所述检测的食源性致病菌为选自霍乱弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌，以及O157H7大肠杆菌中的一种或两种的组合。
5.如权利要求
4所述的双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于所述致病菌的特异基因序列分别为霍乱弧菌肠毒素基因ctxA序列、副溶血弧菌耐热直接溶血素基因TDH序列、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因NUC、单增李斯特氏菌的溶血素基因hly的序列、沙门氏菌的侵袭基因ivnA序列、志贺氏菌的编码侵袭性质粒抗原H基因ipaH序列，以及O157H7大肠杆菌的溶血素基因rfbE序列。
6.如权利要求
5所述的双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于所述改良分子信标的引物和探针分别为ctxA基因的一对引物ctxA-F5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，ctxA-R5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′ctxA基因的探针HEX-5′-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，TDH基因的一对引物TDH-F5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，TDH-R5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，TDH基因的探针FAM5′-CCGGGGTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，NUC基因的一对引物NUC-F5’-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3’NUC-L5’-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3’NUC基因的探针ROX-5’-CGATGCAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3’-DABCYLhly基因的一对引物hly-F5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’hly-L5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’hly基因的探针FAM-5’-CGCGCTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3’-DABCYLinvA基因的一对引物invA-F5’-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3’invA-L5’-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3’invA基因的探针5’-FAM-CCGCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3’ipaH基因的一对引物ipaH-F5’-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3’ipaH-L5’-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3’ipaH基因的探针CY55’-CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3’-DABCYLrfbE基因的一对引物rfbE-L5’-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3’rfbE-R5’-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3’rfbE基因的探针5’-FAMCGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3’，其中划线部分为改良分子信标探针的靶序列。
7.如权利要求
1所述的双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于还进一步包括对待测样品处理和模板提取步骤。
8.如权利要求
7所述的双重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法，其特征在于所述样品包括食品样品、粪便、呕吐物标本，其中处理粪便、呕吐物标本及提取模板是根据粪便和呕吐物量的多少，用100-200μL生理盐水悬浮，煮沸，10000rpm离心2分钟，取5μL上清液即可用于实时PCR反应；食品样品的处理和模板的提取是将食品样品在针对待测细菌的增菌液中增菌后，共取1.2mL增菌液10000rpm离心5分钟，弃其上清液后，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于实时PCR反应；或弃其上清液后加入裂解液裂解，经酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于实时PCR反应。
专利摘要
本发明涉及一种双重荧光PCR－改良分子信标检测食源性致病菌的方法，根据待测两种致病菌的特异基因序列设计对应的一对引物1和改良分子信标探针1，以及一对引物2和改良分子信标探针2，采用荧光PCR－改良分子信标扩增待测两种致病菌特异基因的序列，利用分子信标与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或40阴性；Ct小于38阳性。本发明的方法，灵敏度高，特异性强，操作简单，结果观察直观明了，适用于任意两种细菌随机组合和两种食源性致病菌的快速同时检测以及大量样品的检验。
文档编号C12Q1/68GKCN1796569SQ200410091918
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月29日
发明者扈庆华, 李庆阁, 郑薇薇, 石晓路, 郑琳琳, 王冰, 庄志雄, 刘小立, 张顺祥 申请人:深圳市疾病预防控制中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan