荧光发生分子的制作方法

专利名称：荧光发生分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及用作标记试剂的荧光发生分子，所述标记试剂用于检测核酸等的生物 体关联物质。更详细地，本发明涉及一种分子，其是具有-O-C(Yl)化2)-队表示的基团的无 荧光性分子，其特征在于，该基团还原为羟基或氧代基时产生荧光。进而本发明涉及含有上 述荧光发生分子的标记试剂、和使用上述荧光发生分子的目标核酸序列的检测方法。
背景技术：
作为用于检测具有特定的目标核酸序列的核酸分子的方法，广泛使用杂交法，该 杂交法使用具有与该目标核酸序列相互补的碱基序列的探针。在杂交法中，准备具有与目 标核酸序列相互补的碱基序列的探针，仅具有与该探针碱基序列相互补的碱基序列的试样 以高的选择性进行杂交。杂交的结果是形成了杂交物，作用用于检测该杂交物的方法，可以 列举用放射性同位素标记探针核酸的方法、用荧光物质标记的方法、利用发光试剂的方法 等。可用于标记核酸的荧光物质可以列举荧光素、四甲基若丹明、Cy3、Cy5等，但对于用这 些荧光物质标记的荧光核酸探针，本底荧光信号高，难以进行高灵敏度测定。

发明内容
本发明是为了解决上述现有技术的问题而作出的发明。即，本发明解决的课题在 于提供基因解析用的荧光on/off型荧光化合物(荧光发生分子体系)，其稳定性高(即长 时间具有活性)、且灵敏度高，能够放大微量的基因信号并进行观察。进而，本发明解决的课 题在于提供使用上述荧光on/off型荧光化合物的、用于检测生物体关联物质的标记试剂。本发明人为了解决上述课题，进行了深入研究，结果成功地合成了一种分子，其是 具有荧光素骨架等荧光物质骨架，且分子内具有-O-CH2-N3表示的基团的无荧光性分子，其 特征在于，该-O-CH2-N3表示的基团如果还原为羟基或氧代基则产生荧光。进而发现，通过 使得用上述无荧光性分子标记了的第一核酸探针、和用具有还原作用的分子标记了的第二 核酸探针与目标核酸序列进行杂交，将第一核酸探针中的无荧光性分子的-O-CH2-N3表示 的基团还原为羟基或氧代基，由此生成荧光，通过检测该生成的荧光，能够检测目标核酸序 列。基于上述知识而完成了本发明。即，根据本发明，提供用下式⑴或⑵表示的化合物。[化1] (式中，X表示氢原子、或者羧酸的保护基团，R表示氢原子、卤原子、或者用于与核 酸结合的反应基团，Yl、Y2、Y3和Y4分别独立地表示氢原子、碳原子数为1 6的烷基、碳 原子数为1 6的烷氧基、碳原子数为6 10的芳基、或者氰基)根据本发明的另一侧面，提供了含有上述本发明化合物的、用于检测生物体关联 物质的标记试剂。优选本发明的标记试剂用于核酸的标记。
优选本发明的标记试剂与还原剂组合使用。根据本发明进而的另一侧面，提供了目标核酸序列的检测方法，其含有下述工序 使具有与目标核酸序列的一部分区域相互补的核酸序列的第一核酸探针、和具有与目标核 酸序列的另一部分区域相互补的核酸序列的第二核酸探针与目标核酸序列进行杂交的工 序，和检测通过将第一核酸探针中的无荧光性分子的-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基团还原为 羟基或者氧代基而生成的荧光的工序；上述第一核酸探针用无荧光性分子标记，所述无荧 光性分子具有选自荧光素骨架、咕吨骨架、试卤灵骨架、香豆素骨架、吲哚骨架、或者喹唑啉 酮骨架中的骨架，且分子内具有-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基团(式中，Yl和Y2表示氢原子、 碳原子数为1 6的烷基、碳原子数为1 6的烷氧基、碳原子数为6 10的芳基、或者氰 基)，上述第二核酸探针用具有还原作用的分子进行了标记。优选上述无荧光性分子使用具有荧光素骨架，且分子内具有-O-C (Yl) (Y2) -N3 (式 中，Yl和Y2表示氢原子、碳原子数为1 6的烷基、碳原子数为1 6的烷氧基、碳原子数 为6 10的芳基、或者氰基)表示的基团的无荧光性分子。优选上述无荧光性分子使用上述本发明的化合物。优选目标核酸序列为RN A0优选检测目标核酸序列的单核苷酸多态性。优选可检测细胞内的目标核酸序列。
优选可用流式细胞仪检测荧光，来挑选发出荧光的细胞。根据本发明，提供以-O-C(Yl)化2)_队表示的基团的还原反应为启动(trigger) 的荧光发生分子体系。本发明的体系可适用于具有羟基的荧光化合物。进而根据本发明， 提供应用该荧光发生分子体系、用于检测生物体关联物质的标记试剂。本发明的标记试剂 可通过结合在目标DNA或RNA分子上、并进行还原而发出荧光。本发明的化合物由于具有 高的信号.本底比，因而可以高灵敏度地进行基因检测，同时可进行细胞内、生物体内的基 因检测成像。进而本发明由于不需要使用其它的试剂、酶，因此是简单.便宜的，不仅在试 管内，而且可进行细胞内或生物体内的基因检测。进而，对于本发明的标记试剂，其稳定性 高(长期具有活性)且灵敏度高，可放大并观察微量的基因信号。进而，本发明的标记试剂 由于不需要使用试剂、酶，因此简单·便宜，不仅在试管内，而且可进行细胞内或生物体内的 基因检测。
具体实施例方式以下，对于本发明的实施方式进行详细说明。本发明开发的荧光发生分子体系可作为荧光on/off型感应体系来普及，该荧光 on/off型感应体系以甲基叠氮基的还原作为启动，引起无荧光性分子的结构变化而发出荧 光(图1)。作为本发明的实施例，合成了将荧光分子荧光素进行化学修饰，导入甲基叠氮基 而得到的分子(图2)。将荧光素单烷基化。接着，通过将羟基进行硫代甲基化，进而加入叠 氮化钠等，得到叠氮化物。最后，通过将烷基进行琥珀酰亚胺化，而得到作为目的物的荧光 素的单甲基叠氮衍生物(图2的化合物4)。另外，遵循同样的合成顺序，得到荧光素的双甲 基叠氮衍生物(图2的化合物8)(图2)。对该荧光素的单甲基叠氮衍生物(图2的化合物4)和双甲基叠氮衍生物(图2 的化合物8)的荧光特性进行解析。单甲基叠氮衍生物(图2的化合物4)和双甲基叠氮衍 生物(图2的化合物8)为无荧光性的，相对于此，将它们用还原剂处理后，叠氮基转变为 羟基，表现出高的荧光性。与处理前相比，荧光强度增加至约300倍(图2的化合物4)，约 2600倍(图2的化合物8)(图3)。进一步地，开发了基因检测用“化学反应探针”，其在核酸链中导入了上述合成的 作为荧光发生分子体系的甲基叠氮衍生物(图2的化合物4)(图2的化合物8)。本发明 开发的2种DNA探针在目标DNA或RNA上与目标序列特异性结合，开始化学反应(还原反 应)并发出高强度的荧光(图4)。通过以该荧光信号的有无或强度作为指标，可以区别或检测核酸序列。本反应不 需要其它的试剂、酶，仅将探针加入到检测样品中即可进行测定。使用本探针，进行了白血病原因基因序列的检测试验。目标DNA序列和合成的探 针示于图6A。为了确认目标序列特异性信号的产生，测定在不存在目标序列的条件下荧光 信号的经时变化并进行比较。其结果是，本探针在目标序列存在时，可显著增大荧光信号。 另一方面，在不存在目标序列的情况下，几乎观察不到荧光信号的增加(图6B:单甲基叠氮 衍生物(图2的化合物4)，图6C 双甲基叠氮衍生物(图2的化合物8))。因此，可知本探 针以目标核酸序列特异性的方式产生荧光信号。另外，也可以识别单核苷酸变异(SNP)(图 6D)。
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进而，本检测反应可在等温条件下，重复(回転)反应循环，放大荧光信号(图5)。 因此，可进行微量样品的测定。即使在细胞内或生物体内，也可以使用本探针进行基因表达 的观测。实际上，当降低目标序列浓度作为转换条件时，可得到约50左右的转换数，因此可 知，本荧光发生体系在等温条件下可进行50倍左右的信号放大(图7)。本发明的化合物(荧光发生分子)是如下式(1)或者(2)所示的化合物。 (式中，X表示氢原子、或者羧酸的保护基团，R表示氢原子、卤原子、或者用于与核 酸结合的反应基团，Yl、Y2、Y3和Y4分别独立地表示氢原子、碳原子数为1 6的烷基、碳 原子数为1 6的烷氧基、碳原子数为6 10的芳基、或者氰基)。对X所表示的羧酸的保护基团的种类没有特别地限定，可以列举碳原子数为1 6的烷基、琥珀酰亚胺基、叠氮基、对硝基苯基、卤素等具有离去能力的官能团。R表示的卤原子可以列举氟原子、氯原子、溴原子、或者碘原子。作为R表示的用于与核酸结合的反应基团，可以列举被保护的酰胺基、氨基、羧酸 基、乙炔基、卤素、叠氮基、硫羟基、醛基等。它们可以具有连接基团。作为酰胺基的保护基 团，可以列举叔丁氧基羰基等的氨基甲酸酯系保护基团、苯甲酰基等的酰基系保护基团、三 苯甲基等的烷基系保护基团、二甲基乙缩醛等的亚胺系保护基团等。取代基优选为可与核 酸反应并结合的反应性基团，可以列举例如卤原子等。作为R表示的用于与核酸结合的反 应基团的具体例子，可以列举-C = C-CH2-NHCO-CH2Br、-N3> -C = CH、_SH、-NH2^-CO2H, -CHO寸。根据本发明，通过使具有与目标核酸序列的一部分区域相互补的核酸序列的第一 核酸探针、和具有与目标核酸序列的另一部分区域相互补的核酸序列的第二核酸探针与 目标核酸序列进行杂交，而将第一核酸探针中的无荧光性分子的-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基团还原为羟基或者氧代基，由此生成荧光，通过检测由此生成的荧光可以检测目标核酸 序列，上述第一核酸探针用无荧光性分子标记，所述无荧光性分子具有选自荧光素骨架、 咕吨骨架、试商灵骨架、香豆素骨架、吲哚骨架、或者喹唑啉酮骨架中的骨架，且分子内具 有-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基团(式中，Yl和Y2表示氢原子、碳原子数为1 6的烷基、碳 原子数为1 6的烷氧基、碳原子数为6 10的芳基、或者氰基)，上述第二核酸探针用具 有还原作用的分子进行了标记。荧光素骨架、咕吨骨架、试卤灵骨架、香豆素骨架、吲哚骨架、和喹唑啉酮骨架的具 体结构如下所示。[化 3] R1 =烷基、酰基、芳基、甲硅烷基 R1 =烷基、酰基、芳基、甲硅烷基R2 =烷基、酰基、芳基、甲硅烷基、烷氧基R3 = 0、N、S、卤素R4 =烷基、horogen、0、N、S R1 =烷基、酰基、芳基、甲硅烷基、-CH2N3 R2 =焼基、 酰基、芳基、甲硅烷基、烷氧基 R3 = 0、N、S、卤素R4 =烧基、horogen、0、N、S [化4] X = 0、N、烷基R4 =烧基、horogen、0、N、S R = H、CH3、CF3 等R4 =烧基、horogen、0、N、S Xl =卤素、H Χ2 = H、CH3
喹唑啉酮骨架R4 =烷基、horogen、0、N、S在本发明中，烷基可以列举例如碳原子数为1 6的烷基，其可以是直链或支链的 任一种，具体来说，可以列举甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或者己基。在本发明中，酰基可以列举碳原子数为1 6的酰基，具体来说，可以列举乙酰基、
丙酰基等。在本发明中，芳基可以列举例如碳原子数为6 10的芳基，具体来说，可以列举苯
基、萘基等。在本发明中，烷氧基可以列举碳原子数为1 6的烷氧基，其可是直链或支链的任 一种，具体来说，可以列举甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基或者己氧基等。在本发明中，卤原子可以列举氟原子、氯原子、溴原子或者碘原子。本发明中使用的第一核酸探针用无荧光性分子标记，该无荧光性分子具有上述骨 架，且分子内具有-O-C(Yl) (Y2)-N3所示的基团(式中，Yl和Y2为氢原子、碳原子数为1 6的烷基、碳原子数为1 6的烷氧基、碳原子数为6 10的芳基或者氰基)。本发明中使用的第二核酸探针用具有还原作用的分子标记。作为可在本发明中 使用的表现还原作用的分子，可以列举硫化合物、三价的磷化合物等。硫化合物可以列举 DTT(二硫苏糖醇)，三价的磷化合物可以列举三苯基膦、烷基膦等。在本发明中，第一核酸探针具有与目标核酸序列的一部分区域相互补的核酸序 列，第二核酸探针具有与目标核酸序列的另一部分区域相互补的核酸序列。这里，第一核 酸探针和第二核酸探针各自识别的目标核酸序列的区域只要满足下述条件，就可以任意地 设定，所述条件是当上述的两探针与目标核酸序列杂交时，第一核酸探针中无荧光性分子 的-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基团可通过第二核酸探针中具有还原作用的分子的作用而被还 原为羟基或者氧代基。为了满足上述条件，第一核酸探针和第二核酸探针各自识别的目标 核酸序列的区域一般优选邻接或靠近。第一核酸探针和第二核酸探针各自识别的目标核酸 序列的区域优选例如隔着1 10个碱基左右的间隔而靠近。利用以下实施例更具体地说明本发明，但本发明不被实施例所限定。实施例实施例1 荧光素的单甲基叠氮衍生物的有机合成(1)单烷基荧光素(图2的化合物1)的合成将荧光素(3. OOg, 9. 03mmol)和碘化钠(271mg，1. 81mmol)在冰浴中溶解于 DMF(50mL)中，并添加溶解在THF (30mL)中的叔丁醇钾(3. 04g，27. Immol)。溶液变得透明 后，缓慢加入溴乙酸甲酯(944 μ L，9. 94mmol)，一边缓缓恢复到室温，一边搅拌2. 5小时。反 应用EtOAc终止，用H2O和盐水(brine)进行分液。将有机层用Na2SO4干燥后，用快速柱色 谱法(硅石，梯度洗脱液30 1 CHCl3/MeOH到20 lCHCl3/Me0H+0. 5 %三乙胺)纯化残
10渣。得到的单烷基荧光素(图2的化合物1)为透明液体(820mg，23% )。[化5] IH 匪R (400MHz，CD3OD) δ 7. 91 (1Η, d, J = 7. 32Hz)，7· 62 (2H，dt, J = 16.40， 15. 10Hz)，7. 10 (1H, d, J = 7.
QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 404. 0896[MH+]C23H1607 405. 0974，检测值:405. 0987(2)单烷基硫甲基荧光素(图2的化合物2)的合成将单烷基荧光素(图2的化合物1) (720mg, 1. 78mmol)在Ar氛围下溶解于脱水 CH3CN(36ml)中。添加氧化银(620mg，2. 67mmol)、氯甲基甲基硫醚(223 μ 1，2. 67mmol)和 5滴吡啶，在40°C搅拌15小时。然后将反应液进行硅藻土过滤，并浓缩后，用快速柱色谱法 (己烷/AcOEt从6 1到2 1(ν/ν)+0. 5%三乙胺)纯化。得到的单烷基硫甲基荧光素 (图2的化合物2)为黄色的结晶(206mg，25% )。[化 6]IH NMR(400MHz, CDC13) δ 8. 01 (1Η, d, J = 7. 08Hz)，7· 64 (2H，dt, J = 16. 10， 15. 10Hz)，7. 15 (1H, d, J = 7. 56Hz)，6. 83 (1H, d, J = 2. 44Hz)，6. 83-6. 62 (5H, m)，5. 15 (2H, s)，4. 66 (2H, s)，3. 80 (3H, s)，2. 24 (3H, s)13C NMR(100MHz, CDC13) δ 168. 94，168. 43，159. 04，152. 64，151. 86，134. 80， 129. 08，128. 87，126. 41,124. 75，123. 78,112. 66，102. 82，101. 65,82. 57,72. 34,65. 12， 52. 27，14. 59QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 464. 0930[MH+]C25H2007S 465. 1008，检测值465. 1004(3)单烷基叠氮甲基荧光素(图2的化合物3)的合成在二氯甲烷(7ml)中溶解单烷基硫甲基荧光素(图2的化合物2)(164mg， 350μπιΟ1)。接着，添加N-氯代琥珀酰亚胺(51.8π^，390μπιΟ1)和三甲基甲基甲硅烷基氯
化物(卜丨J 乂子卟乂子卟〉丨J卟夕口，4 F ) (42. Omg, 390 μ mol)，搅拌1小时，用Na2CO3 水溶液终止反应。用CHCl3进行2次分液，将有机层浓缩后，进行真空干燥。将残渣溶解于 DMF (7ml)中，添加溶解在3. 5ml H2O中的叠氮化钠(34. 4mg，530mmol)，室温下搅拌1小时， 用Na2CO3水溶液终止反应。用AcOEt进行2次分液，将有机层浓缩后，用快速柱色谱法(己 烷/AcOEt从5 1到3 2 (ν/ν)+0.5%三乙胺)纯化。得到的单烷基叠氮甲基荧光素 (图2的化合物3)为黄色的结晶(71. 3mg,44% )。 [化 7] IH NMR(400MHz, CDC13) δ 8. 02 (1Η, d, J = 7. 80Hz) ,7. 65 (2H, dt, J = 15. 2, 14. 9Hz)，7. 16 (1H, d, J = 7. 32Hz)，6. 90 (1H, d, J = 2. 20Hz)，6. 76-6. 63 (5H, m)，5. 18 (2H, s)，4. 66 (2H, s)，3. 82 (3H, s)13C NMR(1 OOMHz, CDC13) δ 169. 02，168. 54，157. 87，152. 64，152. 76，152. 08， 134. 95，129. 70，129. 27，126. 46，124. 95，123. 80, 111. 79，103. 26，101. 80,82. 46,79. 43， 65. 27，52. 42QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI) [MH+]C24H17N307 :460.1145,检 测值:460. 1134(4)单烷基叠氮甲基荧光素的合成将单烷基叠氮甲基荧光素(图2的化合物3) (27. 8mg,60ymol)溶解在甲醇 (605 μ 1)中，并添加 IM NaOHaq. (66. 6 μ 1，66. 6 μ mol)，搅拌 1 小时。用 0. IM HCl 终止反 应，用AcOEt进行2次分液，将有机层浓缩后，用快速柱色谱法(CHCl3/MeOH从30 1到 20 l(v/v)+0.5%三乙胺)进行纯化。得到的单烷基叠氮甲基荧光素(下述化合物)为 黄色的结晶(28. 2mg,105% )0[化 8] IH NMR(400MHz, CDC13) δ 8. 01 (1Η, d, J = 7. 32Hz) ,7. 64(2H, dt, J = 14. 9, 15. 2Hz)，7. 16 (1H, d, J = 7. 56Hz)，6. 88 (1H, d, J = 2. 20Hz)，6. 82 (1H, d, J = 2. 20Hz)， 6. 73-6. 63 (4H, m)，5. 18 (2H, s)，4. 51 (2H, s)13C NMR(1 OOMHz, CDC13) δ 173. 69，169. 17，157. 76，152. 79，152. 30，134. 83， 129. 23，128. 61，126. 62，124. 82，123. 91，112. 30，103. 22，101. 74,82. 50,79. 41,67. 57
QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI) :m/z 445.0910[ΜΗ+]C23H1507N3 446. 0988，检测值468. 0808(5)叠氮甲基荧光素NHS酯(图2的化合物4)将上述(4)得到的单烷基叠氮甲基荧光素(4.60mg，10.3ymol)和N-羟基琥珀酰 亚胺(1.30mg, 11.4ymol)溶解在 DMF (205 μ 1)中，添加 DCC (2. 35mg，11. 4 μ mol)，在室温下 搅拌48小时。将析出的结晶用过滤器过滤后，将残渣直接用于与3’氨基DNA的偶联。[化9] 实施例2 荧光素的双甲基叠氮衍生物的有机合成(1)碘荧光素(图2的化合物5)的合成将荧光素(1. 60g，4. 61mmol)溶解在12N HCl (16. 4ml)和8. 2g的冰中。缓慢添加 亚硝酸钠水溶液(397mg，5. 76mmol,8. 2ml)，搅拌2. 5小时。缓慢添加碘化钾水溶液(15. 3g， 92. 2mmol, 13. 2ml)，使反应液缓慢恢复至室温。反应5小时后，用CHCl3终止反应，用H2O和 盐水分液。将有机层用Na2SO4干燥后，将残渣用快速柱色谱法(硅石，梯度洗脱10 1己 烷/AcOEt到3 1己烷/AC0Et(v/v)+0.5%三乙胺)进行纯化。得到的碘荧光素(图2的 化合物5)为黄色的结晶(lg，47% )。[化 10] IH NMR (400MHz, CD30D) δ 8. 33-8. 31 (1H，m)，8. 08-8. 04 (1H，m)，7. 00-6. 96 (1H， m) ,6. 67-6. 50 (4H, m)13C NMR(100MHz, CD30D) δ 169. 5，161. 3，153. 9，145. 1，134. 7，130. 3，130. 0， 127. 1，113. 6，110. 7，103. 5,95. QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI) :m/z 457. 9651[MH+]C20H11105 458. 9729，检测值458. 9721(2)三甲基荧光素(图2的化合物6)的合成将碘荧光素(图2的化合物5) (lg，2. 18mmol)在Ar氛围下溶解于脱水 CH3CN (36ml)。添加氧化银(1.52g，6. 55mmol)、氯甲基甲基硫醚(550 μ 1，6. 55mmol)和 5 滴 吡啶，在40°C搅拌24小时。然后将反应液进行硅藻土过滤，浓缩后，用快速柱色谱法(己烷 /AcOEt从10 1到3 l(v/v)+0.5%三乙胺)进行纯化。得到的三甲基荧光素(图2的 化合物6)为黄色的结晶(234mg，19% )0[化11] IH NMR (400MHz, CDC13) δ 8. 35 (1Η, s)，7. 96 (1H, d, J = 8. 1Hz)，6· 92 (1Η, d, J = 8. 3Ηζ)，6. 83 (2Η, d, J = 2. 2Ηζ)，6. 73-6. 65 (4Η, m)，5. 16 (4Η, s)，2. 26 (6H, s)13C NMR(1 OOMHz, CDC13) δ 167. 3，158. 6，152. 2，152. 0，143. 6，133. 9，128. 9， 128. 6，125. 6，112. 9，111. 3，103. 0,94. 9,83. 1,72. 5，14. 8QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 577. 9719 [MH+] C24H19I05S2 :578. 9797，检测值:578. 9775(3)叠氮甲基荧光素(图2的化合物7)的合成将三甲基荧光素(图2的化合物6) (200mg,350ymol)溶解在二氯甲烷(7ml)中。 接着，添加N-氯代琥珀酰亚胺(102mg，760ymol)，在室温下搅拌2小时。然后，添加三甲 基氯硅烷(97. 3 μ 1，760 μ mo 1)并搅拌6小时，用Na2CO3水溶液终止反应。用CHCl3进行2 次分液，将有机层浓缩后，进行真空干燥。在DMF(7ml)中溶解残渣，并加入溶解在3. 5mlH20 中的叠氮化钠(67. 5mg, 1. (Mmmol)，在室温下搅拌30小时，用Na2CO3水溶液终止反应。用 AcOEt进行2次分液，将有机层浓缩后，用快速柱色谱法(己烷/AcOEt从10 1到3 1 (ν/ ν)+0.5%三乙胺)进行纯化。得到的叠氮甲基荧光素(图2的化合物7)为黄色的结晶 (41. Omg, 21% )。[化12]IH NMR (400MHz, CDC13) δ 8. 36 (1Η, s)，7. 99-7. 97 (1H, m)，6. 94-6. 90 (3H, m)， 6. 77-6. 70 (4H, m)，5. 19 (4H, s)13C NMR(1 OOMHz, CDC13) δ 167. 3，158. 1,152. 1，152. 0，143. 7，134. 0，129. 2， 128. 5，125. 5，112. 7，112. 3，103. 4,95. 0,82. 6,79. 4QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 567. 9992 [MH+] C22H13IN605 :569. 0070，检测值569. 0065(4)溴乙酰基乙炔连接物的合成在冰浴中将炔丙基胺(116. 28 μ 1，1. 82mmol)和碳酸钾(251mg, 1. 82mmol)溶解于 苯(18. 2ml)，添加溴乙酰基溴(159 μ 1，1. 82mmol)并搅拌20小时。用Ether/H20进行2次
分液，浓缩有机层。残渣(118mg，37. 1% )直接用于下面的反应。[化13] QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 174. 9633[ΜΗ+]C5H6BrN0 175. 9711，检测值:175. 9703(5)叠氮甲基溴乙酰连接荧光素(图2的化合物8)的合成将叠氮甲基荧光素(图2的化合物7) (50mg,88ymol)溶解在THF (1.6ml)中，并添 加四(三苯基膦)合钯(10. 2mg，8. 8μπιο1)、碘化铜(3. 35mg，1. 8 μ mol)、三乙胺(61·9μ 1， 440 μ mol)，最后加入溴乙酰基乙炔连接物(77. Omg，440 μ mol)并搅拌3小时。将析出的化 合物用过滤器过滤除去后，使用快速柱色谱法(己烷/AcOEt从5 1到1 l(v/v)+0.5% 三乙胺)纯化残渣。得到的叠氮甲基溴乙酰连接荧光素(图2的化合物8)为黄色的结晶 (20mg,37% )。[化14] IH NMR (400MHz, CDC13) δ 8. 06 (1Η, s), 7. 70 (1Η, d, J = 8. 04)，7. 27 (2H，s)， 7. 11 (1H, d, J = 8. 1)，6· 91 (2Η, d, J = 2. 2)，6· 77-6. 69 (4Η，m)，5· 19 (4Η, s)，4· 36 (2Η, d, J =5. 6)，3. 94 (1Η, s)，3. 76 (1Η, s)13C NMR(100MHz, CDC13) δ 168. 1,166. 6，158. 0，152. 3，152. 0，138. 2，131. 8， 129. 2，128. 3，123. 9，113. 0，112. 6，112. 5，103. 4,86. 7,82. 5,81. 8,79. 4,30. 9,28. 8QSTAR(Applied Biosystems/MDS SCIEX) (ESI) :m/z 615. 0502 [ΜΗ+] C27H18BrN706 :616. 0580，检测值616. 0578实施例3 荧光强度的测定对实施例1和实施例2中得到的荧光素的单甲基叠氮衍生物(图2的化合物4)和 双甲基叠氮衍生物(图2的化合物8)的荧光特性进行解析。单甲基叠氮衍生物(图2的 化合物4)和双甲基叠氮衍生物(图2的化合物8)为无荧光性的，相对于此，将它们用还原 剂进行处理后(化合物4 用IOOmM的二硫苏糖醇在室温条件下进行2小时的反应，化合物 8 用三羧甲基膦在室温条件下进行1小时的反应)，叠氮基转化为羟基，表现高的荧光性。 与处理前相比，荧光强度增加至约300倍(图2的化合物4)，约2600倍(图2的化合物8) (图 3)。
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实施例4 低聚核苷酸的合成具有图6A中记载的碱基序列(也记载在序列表的SEQ ID NO. 1 3中)的低聚 核苷酸使用0. 2 μ M等级的柱子，根据一般的亚磷酰胺法(* 7 * π 7· S夕-4卜法)，利用 DNA自动合成机(H-8-SE ;Gene World)来合成。碱基的脱保护和从CPG载体上的脱离通 过在氨水中、在55°C孵育4小时来进行。低聚核苷酸的纯化利用反相柱(MicroPure II; BiosearchTechnologies)来进行，通过测定UV吸光度来确定浓度。实施例5 :5’结合了三苯基膦的DNA的合成三苯基膦基的加成通过与5’-氨基修饰低聚物(★ 'J 3 )反应来进行。在5’-氨 基修饰低聚物的合成中，使用5，-amino-modifier 5 (GlenResearch)。反应通过将含有8mM 三苯基膦NHS酯(在DMF中)、50mM四硼酸钠缓冲液、200 μ M 5’ -氨基修饰低聚物溶液的 混合液、在室温下剧烈搅拌3小时来进行(反应液中的DMF浓度为46% )。将反应产物以 乙醇沉淀的形式回收后，利用反相HPLC(梯度条件0-50%乙腈/50mM三乙基乙酸铵)进行 纯化。另外，利用ESI-TOF质谱可以确认得到目的产物。实施例6 :3’结合了叠氮甲基荧光素的DNA的合成叠氮甲基荧光素NHS酯(图2的化合物4)的加成通过与3’ -硫代磷酸DNA反应 来进行。3’ -硫代磷酸低聚物的合成如下进行，即，在3’ -磷酸CPG上偶联起始的单体后， 用sulfrizing reagent (Glen research)进行硫代磷酸酯化。反应通过将含有3mM溴乙酰 胺-RhllO-叠氮化物(在DMF中)、80mM三乙铵双碳酸酯缓冲液、300 μ M 3，-硫代磷酸低 聚物溶液的混合液、在室温下剧烈搅拌5小时来进行(反应液中的DMF浓度为80% )。将 反应产物以乙醇沉淀的形式回收，然后利用反相HPLC(梯度条件0-80%乙腈/50mM三乙基 乙酸铵)进行纯化。另外，通过ESI-TOF质谱确认可以得到目标产物。叠氮甲基溴乙酰连 接荧光素(图2的化合物8)的加成也用同样的方法进行。实施例7 =DNA模板上的反应和荧光测定DNA模板上的反应如下进行，S卩，在缓冲液中(20mM Tris-HCl, IOOmM MgCl2 6H20， 0. 01mg/ml BSA ；pH 7. 2)，分别使50nM的DNA模板、结合了 5，-三苯基膦的探针、结合了 3’ _叠氮甲基荧光素的探针在37°C进行反应。荧光信号使用荧光分光光度计(FP-6500 ； JASC0)来解析。每隔30秒测定一次荧光，激发波长为490nm，荧光波长为520nm。为了确认目标序列特异性信号的产生，测定在不存在目标序列的条件下荧光信号 的经时变化并进行比较。其结果是，本探针在存在目标序列时，可显著增大荧光信号。另一 方面，在不存在目标序列的情况下，几乎观察不到荧光信号的增加(图6B 单甲基叠氮衍生 物(图2的化合物4)，图6C 双甲基叠氮衍生物(图2的化合物8))。因此，可知本探针以 目标核酸序列特异性的方式产生荧光信号。另外，也可以识别单核苷酸变异(SNP)(图6D)。实施例8:转换数的测定转换数的测定如下进行，即，分别在50nM的5’结合了三苯基膦的探针、3’结合了 叠氮甲基荧光素的探针中，添加5nM(相对于探针为0. 1等量)、0. 5nM(相对于探针为0. 01 等量)、0.05nM(相对于探针为0.001等量)的DNA模板，在缓冲液中(20mM Tris-HCl, IOOmM MgCl2 6Η20，0· 01mg/ml BSA ；pH 7. 2)在37°C使其反应。荧光信号使用荧光分光光度 计(FP-6500 JASC0)进行解析。每隔30秒测定一次荧光，激发波长为490nm、荧光波长为 520nm，测定4小时。由4小时后各自的荧光信号，求得向羟基转化的物质量，将其除以模板的物质量，由此求得转换数。测定结果示于图7。实际上，当降低目标序列浓度作为转换条件时，可得到约50左右的转换数，因此 可知，本荧光发生体系在等温条件下可进行50倍左右的信号放大(图7)。实施例9 :HL60 cell细胞内RNA的检测(荧光显微镜，FACS)将在RPMI-1640培养基中培养的HL60细胞用无Mg、Ca的PBS洗涤2次。对于洗 涤的细胞，向各室中加入 300 μ L 的 50U/ml StreptolysinO (SL0 ；Sigma-aldrich)，在室温 下孵育15分钟。此时，SLO使用在IOOmM的DTT中孵育2小时而充分活化的物质。15分 钟的孵育后，加入图8 (SEQ ID NO. 4 7)和图9 (SEQ ID NO. 8 19)所示的各探针使它们 为ΙΟΟηΜ，再孵育5分钟。然后，在各孔中添加300uL含有0. 2g/LCaCl2的MEM培养基，进行 SLO的不活泼化。进而，在4°C孵育lhr。检出的细胞在荧光显微镜(Zeiss)下，使用激发 470/40，荧光525/50的滤色片进行拍摄。同样，进行使用流式细胞仪(《〃々7 >二一> 夕一)的检测。结果示于图8和图9。可以检测细胞内RNA。产业实用性可以提供应用本发明的荧光发生分子体系、用于检测生物体关联物质的标记试 剂。


[图1]图1表示本发明的荧光off/on型感应体系，其以甲基叠氮基的还原为启 动，引起无荧光性分子的结构变化而发出荧光。[图2]图2表示荧光素衍生物的有机合成流程图。[图3]图3表示本发明的荧光素衍生物的荧光测定结果。[图4]图4表示本发明的基因检测的概要。[图5]图5是表示荧光信号的化学放大。[图6]图6是表示DNA模板上的反应和荧光测定的结果。[图7]图7是表示本发明的荧光分子的信号放大。[图8]图8是表示HL60细胞内28SrRNA的检测。使用(A-D)完全匹配的探针(A 和B)和杂乱序列的探针(C和D)时的荧光图像和明视野图像的合并。A和C表示荧光图 像，B和D表示与明视野图像的合并。(E)流式细胞仪的直方图。横轴表示荧光强度，纵轴 表示细胞数。[图9]图9表示HL60细胞内β-肌动蛋白mRNA的检测。使用(A-D)完全匹配 的探针(A和B)和杂乱序列的探针(C和D)时的荧光图像和明视野图像的合并。A和C表 示荧光图像，B和D表示与明视野图像的合并。(E)流式细胞仪的柱状图。横轴表示荧光强 度，纵轴表示细胞数。
权利要求
下式(1)或者(2)表示的化合物，[化1](式中，X表示氢原子、或者羧酸的保护基团，R表示氢原子、卤原子、或者用于与核酸结合的反应基团，Y1、Y2、Y3和Y4分别独立地表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为1～6的烷氧基、碳原子数为6～10的芳基、或者氰基)。FPA00001137470600011.tif
2.标记试剂，其含有权利要求1所述的化合物，并用于检测生物体关联物质。
3.根据权利要求2所述的试剂，其用于核酸的标记。
4.根据权利要求2或3所述的试剂，其与还原剂组合使用。
5.目标核酸序列的检测方法，其含有下述工序使具有与目标核酸序列的一部分区域 相互补的核酸序列的第一核酸探针、和具有与目标核酸序列的另一部分区域相互补的核酸 序列的第二核酸探针与目标核酸序列进行杂交的工序，和检测通过将第一核酸探针中无荧 光性分子的-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基团还原为羟基或者氧代基而生成的荧光的工序，上 述第一核酸探针用无荧光性分子标记，所述无荧光性分子具有选自荧光素骨架、咕吨骨架、 试卤灵骨架、香豆素骨架、吲哚骨架、或者喹唑啉酮骨架中的骨架，且分子内具有-O-C(Yl) (Y2)-N3表示的基团(式中，Yl和Y2表示氢原子、碳原子数为1 6的烷基、碳原子数为 1 6的烷氧基、碳原子数为6 10的芳基、或者氰基)，上述第二核酸探针用具有还原作 用的分子进行了标记。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，上述无荧光性分子使用具有荧光素骨架，且分子 内具有-O-C(Yl) (Y2)-N3(式中，Yl和Y2表示氢原子、碳原子数为1 6的烷基、碳原子数 为1 6的烷氧基、碳原子数为6 10的芳基、或者氰基)表示的基团的无荧光性分子。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，上述无荧光性分子使用权利要求1所述的化 合物。
8.根据权利要求5 7中任一项所述的方法，其中，目标核酸序列为RNA。
9.根据权利要求5 7中任一项所述的方法，其中，检测目标核酸序列的单核苷酸多态性。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，检测细胞内的目标核酸序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，用流式细胞仪检测荧光，挑选发出荧光 的细胞。
全文摘要
本发明的目的在于提供基因解析用的荧光on/off型荧光化合物(荧光发生分子体系)，其稳定性高(即长时间具有活性)、且灵敏度高，能够放大微量的基因信号并进行观察。根据本发明，可以提供无荧光性分子，其具有荧光素骨架等的荧光物质骨架，且分子内具有-O-C(Y1)(Y2)-N3表示的基团(式中，Y1和Y2表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为1～6的烷氧基、碳原子数为6～10的芳基、或者氰基)。
文档编号C12N15/09GK101896491SQ200880115960
公开日2010年11月24日 申请日期2008年8月1日 优先权日2007年9月14日
发明者伊藤嘉浩, 古川和宽, 阿部洋 申请人:独立行政法人理化学研究所