小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的分子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及小菜蛾对阿维菌素祀标抗性的分子检测方法，属于生物技术领域，专 用于小菜蛾对广谱杀虫杀瞒剂阿维菌素（由Avermectin Bla和Avermectin B化混合组 成）祀标抗性的高灵敏度、快速分子检测。 技术背景
[0002] 据统计，近年来我国蔬菜种植面积接近3亿亩/年，已是世界第一大十字花科蔬菜 种植和生产国，因小菜蛾为害造成的蔬菜减产和治理费用极其高昂。小菜蛾属于鱗翅目菜 蛾科，是世界范围内一种重要的十字花科蔬菜害虫，每年造成的经济损失达40~50亿美 元。该物种寄主植物种类达40多种，由于其繁殖周期短、适应能力强、世代重叠严重及田间 混乱用药，使小菜蛾至少已对92种杀虫活性成份产生了不同程度的抗性，几乎涉及目前所 有的防治用药，其中包括多种新型药剂如阿维菌素。小菜蛾抗药性进化问题给十字花科蔬 菜的产量和质量带来严重威胁和巨大挑战，科学有效的防治小菜蛾已成为植保工作者的肩 头重任，开发快速准确的杀虫剂抗性检测技术迫在眉睫。
[0003] 阿维菌素（Avermectin)是日本北里研究所于1975年从±壤中分离的阿维链霉菌 (Str巧tomyces avermitilis)发酵液中分离出来得到的一种大环内醋化合物，1981年由美 国默克公司商品化作为兽药投放市场并获得良好业绩。阿维菌素于20世纪90年代初进入 我国并很快实现了自主生产，该药剂杀虫谱广，具有杀虫杀瞒杀线虫活性，能有效防治鱗翅 目、蜡瞒目、半翅目W及线虫等农林害虫，曾在害虫种群控制方面发挥了积极作用。但是，随 着使用量的增加和使用年限的延长，昆虫自身也对阿维菌素逐渐演化出抗药性，在我国多 个省份呈现逐年加重的趋势。谷氨酸配体口控氯离子通道（GluCl)是阿维菌素的主要作用 革己标，在线虫化enorh油ditiselegans中研究比较广泛而深入，果觸DmGluCla亚基的第二 跨膜区存在P299S点突变，通过外源表达证实该氨基酸替换导致果觸对球抱子酸、伊维菌 素和谷氨酸的敏感性降低了 10倍，为球抱子酸和伊维菌素作用于DmGluCl通道提供了直接 证据化ane等，2000)。在抗阿维菌素的二斑叶瞒Tetranychusudicae品系中研究人员发 现化GluCl存在G323D点突变，送一点突变在回交后代的个体中证实与阿维菌素抗性相关 (Kwon等,2010)。Dermauw等（2012)通过对二斑叶瞒的基因组测序，注释了多个cysLGIC 家族的基因，并进一步利用遗传学方法对GluCl的序列进行分析，发现化GluCll(G314D)和 TuGluC13 (G326巧中存在阿维菌素抗性突变位点，认为化GluCll和化GluC13是阿维菌素对 二斑叶瞒的主要作用祀点。
[0004] 目前，世界多地区的田间小菜蛾已对阿维菌素产生了严重的抗药性，但国内外尚 未建立小菜蛾谷氨酸配体口控氯离子通道（PxGIuCI)突变导致的祀标抗性的分子检测方 法，基于该祀标基因的抗性检测技术局限于英光定量PCR检测方法（专利号CN102154468B， 下简称对比文件）。〔化021544688根据梁延坡在2009提交的01此1(1亚基基因序列 (GQ221939.1)设计了一序列GluCl a亚基基因的特异性引物，并根据特异性引物对小菜 蛾抗性与GluCl a亚基基因表达量之间的关系进行研究，发现GluCl a亚基基因表达量与 小菜蛾对阿维菌素的抗性呈正相关。根据送一结果，将选得的一对特异性引物F16结合英 光实时定量PCR技术及统计学方法提供一种鉴定小菜蛾抗性种群的方法；测定小菜蛾的 GluCl a亚基基因表达量，并与与阴性对照的基因表达量比较是否具有显著差异，有显著差 异说明待测小菜蛾为抗性种群。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中小菜蛾对阿维菌素抗性检测方法灵敏度低、周期 长、材料要求高等问题，根据我们对小菜蛾阿维菌素抗药性分子机理的研究结果，建立小菜 蛾对阿维菌素抗性祀标突变的快速、准确的分子检测方法。
[0006] 本发明的目的可通过W下技术方案实现：
[0007] 根据我们克隆的小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因序列（GenBank登录号 JX014231. 1)设计的特异性引物，W单头小菜蛾的基因组DNA为模板，进行谷氨酸氯离子通 道基因 TM2和TM3区域的PCR扩增，通过对目标片段纯化产物直接测序色谱图的分析，可W 区分小菜蛾个体的基因型（敏感纯合子SS、抗性杂合子RS和抗性纯合子RR)，检测种群样 本的抗性等位基因频率。本发明涉及小菜蛾谷氨酸氯离子通道A309V抗性点突变的检测方 法和专用引物序列。
[0008] -种小菜蛾对阿维菌素祀标抗性的分子检测方法，用SEQ ID NO. 1所示的特异性 正向引物PxGlua-Seq-F和沈Q ID NO. 2所示的特异性反向引物PxGlua-Seq-R对谷氨酸 氯离子通道基因 PxGIuCI进行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序，根据直接测序色谱图鉴 定小菜蛾个体PxGIuCI基因在309位氨基酸是否突变及其具体类型，一次性区分该个体为 对阿维菌素的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。
[0009] 本发明涉及的小菜蛾野生型谷氨酸氯离子通道基因因 PxGluClcDNA序列全长 2074bp(GenBank登录号为JX014231. 1)，我们研究发现；阿维菌素敏感型基因序列第926位 核巧酸由C突变为T (附图1 =Abm-R)，其编码的蛋白质由A突变为V，并发现该突变频率与 种群对阿维菌素的抗药性化Cw值）相关，即该突变导致小菜蛾对阿维菌素的高水平祀标抗 性。所述的根据直接测序色谱图准确鉴定小菜蛾个体谷氨酸氯离子通道在309位氨基酸是 否突变及其具体类型，一次性区分该位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为： 如果识别序列巧'-CATAGACG-3')前一位碱基为C单峰色谱（附图2.A)，则表明该小菜 蛾个体为不携带谷氨酸氯离子通道突变的敏感纯合子；如果识别序列前一位碱基为T/C双 峰色谱（附图2. B)，则表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的杂合子；如果识别序 列前一位碱基为T单峰色谱（附图2. C)，则表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的 纯合子。
[0010] 所述的分子检测方法，优选包含如下H个步骤：
[0011] (1)提取小菜蛾单头幼虫或成虫样本的基因组DNA ;
[001引 似利用沈Q ID NO. 1所示的引物PxGlua-Seq-F和沈Q ID NO. 2所示的引物 PxGluCn-Seq-R，对上一步提取的小菜蛾基因组DNA进行PCR扩增；
[0013] (3)将上一步获得的PCR产物进行1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段纯化回收 后进行直接测序，测序引物为SEQ ID NO. 2所示的引物R，通过检测编码PxGIuCI基因309 位氨基酸的核巧酸测序色谱图，一次性区分在该位点为敏感纯合、抗性杂合和抗性纯合基 因型的个体。
[0014] 其中，PCR 反应体系优选 50ul ;10ul SXPrimeSTAR Buffer，4ul 2. 5mM dNTPs, IOmM的正、反向引物各lul，Iul单头小菜蛾样本的基因组DM, I. 2抓PrimeSTAR服DNA聚 合酶，加双蒸水至反应总体积为50ul。PCR反应程序优选；98°C变性10砂；52°C退火15砂； 72°C延伸30砂；热循环数为30,之后72°C延伸10分钟。
[0015] 用于分子检测小菜蛾对阿维菌素祀标抗性的引物对，正向引物PxGlua-Seq-F如 沈Q ID NO. 1所示，反向引物PxGlua-Seq-R如沈Q ID NO. 2所示。
[0016] 一种用于检测小菜蛾对阿维菌素抗性的试剂盒，包含本发明所述的引物对。
[0017] 本发明所述的引物对在分子检测小菜蛾对阿维菌素祀标抗性中的应用。
[0018] 本发明所述的试剂盒对在分子检测小菜蛾对阿维菌素祀标抗性中的应用。
[0019] 有益效果
[0020] 我们在小菜蛾抗阿维菌素的近等基因系材料中，首次发现PxGIuCI基因的TM2和 TM3之间的Loop结构上存在A309V氨基酸突变，且该突变与小菜蛾对阿维菌素的高水平抗 性密切相关。该基因突变位点的发现可用于监测不同地理种群携带的阿维菌素抗性等位基 因频率，并为小菜蛾抗药性治理提供高效、准确的分子检测方法。
[0021] CN102154468B中所述的检测方法为根据GluCl a亚基表达量的高低判定种群抗 性（实施在基因转录水平，即检测mRNA表达多少，该基因的一级结构未变化，属于量变范 畴），为阿维菌素抗性检测提供了一种参考方法，但其扩增产物不进行核巧酸测序、亦不包 含本发明首次发现的A309V位突变位点。本发明的发明点在于首次发现PxGIuCI基因的 一级结构发生了抗性突变（实施在基因组水平，即检测曲NA的等位基因序列，属于质变范 畴），与CN102154468B中的检测方法有本质差异，涉及PxGIuCI基因核巧酸突变介导的与 阿维菌素结合能力下降或亲和性降低的抗性机制，是对基因的不同等位基因进行核巧酸序 列检测，属于对基因质变的检测手段；且CN102154468B所述方法无法检测本发明发现的 PxGIuCI基因 A309V突变情况。本发明与CN102154468B所述的检测方法所要解决的科学问 题不同，且本发明优选的检测技术可判定不同种群中突变个体的基因型，计算出与抗性有 关的等位基因突变频率（常规生物测定技术和现有专利技术均不可实现）。通过一定数量 的个体的检测，可W确定某个种群中敏感纯合子、杂合子和抗性纯合子的频率，为抗药性早 期预警和害虫综合治理提供了最直接的依据。
[0022] 与传统的抗性监测技术（生物测定）相比，本发明涉及方法无需将田间试虫饲养 至适宜虫龄再进行生物测定W确定抗性水平。若采集不同地理种群调查抗性基因的发生频 率则需要更长时间，对生产实际用药的指导意义滞后、不便于针对性开展化学防控。而本发 明方法不需饲养试虫，节省劳动力和资源，可W快速、准确检测出小菜蛾对阿维菌素抗性的 突变类型和种群携带抗性基因频率。本发明优选的检测方法有益效果表现在；（1)快速准 确：生物测定技术要求试虫标准化，取样误差和虫体之间的差异对结果影响很大，造成结果 的不稳定性；本发明可直接检测田间小菜蛾个体（幼虫或成虫），从取得样本到获得检测结 果在12个小时W内（若送公司测序也仅需2天时间）。（2)材料要求少；生物测定技术中 测定一个标准曲线至少需要200-300头标准试虫，而本发明对一个种群的检测只需要50头 左右。做灵敏度高：生物测定检测技术是一种相对粗略检测抗性水平的方法，不能检测早 期抗性或低频率抗性纯合子或杂合子，本发明利用特异性引物扩增目的片段，根据测序色 谱图可W直接判断个体的基因型。
【附图说明】
[0023] 图1小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因突变区域的核巧酸和氨基酸序列
[0024] 图示小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因跨膜区部分序列，其中ROTH-S序列来自小菜 蛾敏感品系，该基因 CDNA序列第926位核巧酸为C，编码氨基酸为A ;Abm-R序列来自抗阿 维菌素的ROTH-Abm近等基因系，该基因 CDNA序列第926位核巧酸为T，编码氨基酸为V。 [00巧]图2小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因突变区域的直接测序色谱图
[0026] A =PxGIuCI基因第926位碱基为C单峰色谱，表明