用于检测VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域中基因的分子生物学检测，特别是涉及一种VanB基因 的LAMP试剂盒及其专用引物与其在检测VanB基因中的应用。
【背景技术】
[0002] VanB 基因是耐万古霉素肠球菌（Vancomycin resistant Enterococci，VRE)的耐 药基因型中的一种，主要存在于粪肠球菌及屎肠球菌中。VanB表型耐药基因多位于宿主染 色体上，也可存在于质粒上，可通过共辄机制，由质粒介导将耐药基因在种内或种间水平或 垂直传播，从而传递给其它肠球菌属或其它细菌。
[0003] 20世纪50年代发现的糖肽类抗生素万古霉素被用作治疗多重耐药G+菌株感染的 首选药物，曾被誉为"人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线"。自1988年英国首次分离 并报道耐万古霉素肠球菌（VRE)以来，使这一最后防线面临崩溃，给临床治疗造成极大的 困难，引起了广泛的重视，目前它已逐渐成为医院感染的重要病原菌之一。据报道由VRE引 起的院内尿路感染所占比例为16%，仅次于大肠杆菌。VRE被美国疾病预防控制中心列为 第二大医院感染病原体，在ICU院内感染患者中VRE的分离率也呈上升趋势。据我国医院 感染监控网的统计分析VRE引起的院内感染在G+中排在第4位。VRE不但对万古霉素高度 耐药，而且其耐药因子能转移给其它G+菌株，如致病性很强的金黄色葡萄球菌。因此，对人 类构成严重威胁的不仅是VRE本身，还包括由于其耐药因子的转移可能产生的一些难以治 疗的新耐药菌株。
[0004] 肠球菌通常为条件致病菌。当发生异位寄生时，肠球菌可引起多种感染，如泌尿系 感染、心内膜炎、脑膜炎、败血症、伤口感染、呼吸道感染等，严重的可危及生命。与其它革兰 氏阳性菌相比，肠球菌属具有更强的天然耐药性，且易被抗生素诱导产生新的耐药性。近年 来，由于免疫抑制剂在临床治疗中广泛应用，以及广谱抗生素的过度使用及不合理应用等 因素导致肠球菌属感染和耐药性日益增多，已成为院内感染的主要致病菌。随着耐万古霉 素肠球菌（VRE)的出现，临床治疗耐药菌感染面临着更大的困难。
[0005] 根据VRE的耐药表型及能否发生耐药因子转移等特点，VRE基因型被分为VanA、 VanB、VanC、VanD、VanE和VanG等6种，其中只有VanA和VanB型有重要的临床意义。VanA 和VanB型VRE可呈现高水平万古霉素耐药，且其耐药因子容易发生转移，是引起感染和流 行的主要病原体类型。VanB基因检测可用于判断样品是否对万古霉素耐药，以指导用药。
[0006] LAMP技术介绍：
[0007] 环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal ampl ification，LAMP) 是由 Notomi(Notomi T, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000 ;28(12) :63.)发明的一种新型基因扩增技术。具体方法是针对 靶基因（DNA或者cDNA)的6个区域，设计4-6种特异引物，利用链置换DNA聚合酶，在等温 条件下进行基因扩增反应，结果直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断。具有快 速高效、特异性强、灵敏度高、操作简单、检测直观和设备要求低等特点。
[0008] 自2000年发明以来，LAMP技术已被迅速用于病原微生物检测、遗传病诊断、 食品安全等领域的分子生物检测领域。2011年Nakauchi M等建立的基于LAMP技术的 HlNl 实验室快速诊断方法（Nakauchi M，et al. Evaluation of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assays for rapid diagnosis of pandemic influenza A/HlN12009virus.J Med Virol. 2011Jan;83(l):10-5.)目前，LAMP 已被广 泛用于肺炎支原体（Gotoh K, et al. Assessment of the loop-mediated isothermal amplification assay for rapid diagnosis of Mycoplasma pneumoniae in pediatric community-acquired pneumonia. Jpn J Infect Dis. 2013 ;66 (6):539-42.)、结核杆 菌(Kumar P, et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and sensitive diagnosis of tuberculosis. Pandya D, Singh N, J Infect.2014Sep 9. [Epub ahead of print])、SARS(Poon LL, et al. Rapid detection of the severe acute respiratory syndrome (SARS)coronavirus by a loop-mediated isothermal amplification assay. Clin Chem. 2004Jun ；50 (6):1050-2.)n HIV(Curtis KA, et al.Real-Time Detection of HIV-2by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. J Clin Microbiol. 2014Jul;52(7) :2674-6.)等疾病的检测 中等病原体的诊断。近期爆发于西非的埃博拉病毒的LAMP检测试剂盒已研究成功。目前， 国内未见有用于检测VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了用于对VanB基因进行LAMP检测的引物，以实现VanB基因的批量检 测，提高检测的特异性和灵敏度。
[0010] 本发明所提供的用于检测VanB基因的LAMP引物，是根据VanB基因 Pl基因 (GenBank号：CP002077. 1)的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、患者粪便、 血液等样品中的VanB基因，所述LAMP引物由四条引物组成，包括外引物VanB12-F3和 VanB12-B3、以及内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP的组合；所述VanB基因的特异性保守靶 序列如序列表中SEQ ID NO :1所示。
[0011] 具体来讲，所述用于对VanB基因进行LAMP检测的四条引物的核苷酸序列如序列 表中 SEQ ID NO :2(VanB12-F3)、SEQ ID NO :3(VanB12-B3)、SEQ ID NO :4(VanB12-FIP)和 SEQ ID N0:5(VanB12-BIP)所示。
[0012] 所述的LAMP引物，为外引物VanB12-F3和VanB12-B3、内引物VanB12-FIP和 VanB12-BIP按摩尔比5:40的组合物。
[0013] 本发明的第二个目的是提供一种用于对VanB基因进行LAMP检测的试剂盒。
[0014] 本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对VanB基因进行LAMP检测的引物。
[0015] 具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25yL反应体系（不含模板）的试 剂：Mixture(主要成分包括：2mM Tris.HCl(pH 8.8)0.7yL，10mM KCl 3.8yL， 10禮(順4)25043 . 8 4 1^，0.1%丁￥6611200.4 4 1^0.81甜菜碱〇^七31116)0.3 4 1^811111%5043 μ L, I. 4mM dNTP each 0· 5 μ L，8U Bst DNA polymerase 1 μ L，ddH20 7· 7 μ L) 21. 2 μ L， 引物加入量分别为：①50mM引物VanB12-F30.1 μ L，使终浓度为5pmol ;②50mM引物 VanB12-B3 O.lyL，使终浓度为 5pmol;③ 50mM 引物 VanB12-FIP 0.8yL，使终浓度为 40pmol ;④ 50mM 引物 VanB12-BIP 0· 8 μ L，使终浓度为 40pmol 〇
[0016] 为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为携带 VanB基因的粪肠球菌V583,所述阴性对照为不含DNA的双蒸水。
[0017] 上述LAMP引物或试剂盒在VanB基因 LAMP检测中的应用也属于本发明的保护范 围。
[0018] 本发明的第三个目的是提供一种VanB基因的LAMP检测方法。
[0019] 本发明所提供的检测方法，可包括以下步骤：
[0020] 1)以待测样品基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增，LAMP 反应体系为：待测样品基因组DNA 2yL，Mixture(主要成分包括：2mM Tris，HCl(pH 8· 8) 0.7 μ L，IOmM KCl 3.8 μ UlOmM(NH4)2SO4 3.8 μ L，0.1 % Tween200. 4 yL,0. 8M 甜菜碱（betaine)0.3yL，8mM MgSO4 3yL，1.4mM dNTP each 0.5yL，8U Bst DNA polymerasel yL，ddH20 7. 7 yL)21. 2yL，引物加入量分别为：① 50mM 引物 VanB12-F3 〇· 1 μ L，使终浓度为5pmol ;②50mM引物VanB12-B30. 1 μ L，使终浓度为5pmol ;③50mM弓丨 物 VanB12-FIP 0· 8 μ L，使终浓度为 40pmol ;④ 50mM 引物 VanB12-BIP 0· 8 μ L，使终浓度为 4