650nm的浊度值）所示，从图中可以看出引物组合VanB-12的反应效果最好。
[0066] 因此，本发明的最佳引物组合为VanB-12,包括：引物VanB12-F3(SEQ ID NO :2)和 VanB12-B3(SEQ ID N0:3)，引物VanB12-FIP(SEQ ID N0:4)和VanB12-BIP(SEQ ID N0:5)〇具体内容见实施例1。
[0067] 二、确定用于VanB基因 LAMP检测的最佳反应条件
[0068] 用实施例1获得的用于对VanB基因进行LAMP检测的引物组合VanB-12对携带 VanB基因的粪肠球菌V583 (标准株购于北京生物制品药品检定所）进行LAMP检测，以获得 最佳反应条件，具体方法如下：
[0069] 在不同反应温度下对含VanB基因的粪肠球菌V583基因组DNA进行LAMP检测，以 确定最佳反应条件，具体方法如下：
[0070] 1、以含 VanB 基因的奠肠球菌 V583 基因组 DNA(Promega Wizard? Genomic DNA Purification Kit A1125提取待测样品中的核酸）为模板，在实施例1获得的引物组合 VanB12的引导下进行LAMP扩增，其中，25yL LAMP反应体系包括：含VanB基因的粪肠球 菌基因组 V583DNA 2 μ L(终浓度 >lng/ μ L)，Mixture (主要成分包括：2mM Tris · HCl (pH 8.8)0.7yL，10mM KCl 3.8 μ UlOmM(NH4)2SO4 3.8 μ L，0.1% Tween20 0.4 μ L，0.8M 甜菜 喊（betaine) 0.3 μ L，8mM MgS043 μ L，I. 4mM dNTP each 0.5 μ L，8U Bst DNA polymerase I μ L，ddH20 7. 7 μ L) 21. 2 μ L，LAMP 扩增条件为：置 58-65°C恒温 60min ;
[0071] 2、反应结束后进行结果判定：与步骤一相同。
[0072] 结果如图2所示，在58-65°C恒温60min的LAMP扩增条件下，引物组合VanB-12均 取得了较好的反应效果，65°C与59°C的扩增效率基本一致，但基于温度就高不就低的原则， 65 °C定为最佳温度。
[0073] 最佳的VanB基因的LAMP扩增条件为：置58-65°C恒温40-60min，优选为置65°C 恒温45minD
[0074] 实施例3、本发明VanB基因的LAMP检测方法的特异性、灵敏性检测
[0075] 一、本发明VanB基因的LAMP检测方法的特异性检测
[0076] 分别以鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、霍乱弧菌0139 群、炭疽芽孢杆菌、大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠伤寒沙门菌、 阿伯丁沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌、鲁氏不动杆菌、肠致病性大肠埃希菌、 肺炎克雷伯氏菌、福氏志贺菌（来源于军事医学科学院疾病预防控制所传染病控制中心）、 携带VanA基因的粪肠球菌V309、粪肠球菌-1、粪肠球菌-2、粪肠球菌-3、粪肠球菌-4、屎肠 球菌-1、屎肠球菌-2、屎肠球菌-3、屎肠球菌-4(来源于来源于解放军309医院检验科）、 嗜麦芽寡养假单胞菌（来源于解放军307医院）、百日咳杆菌（CMCC 58003)、铜绿假单胞菌 (CMCC 10104)、白喉杆菌（CMCC 38001)、粪肠球菌V583(来源于北京生物制品药品检定所） 的基因组DNA为模板，以CldH2O为阴性对照、以粪肠球菌V583为阳性对照检测实施例2获 得的最佳的VanB基因的LAMP检测方法的特异性。
[0077] 浊度仪检测结果如图3所示，其中1、携带NDMl基因的鲍曼不 动杆菌（Acinetobacter baumannii) ;2、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ;3、携带 Van A 基因的肠球 菌 V309 (Enterococcus faecalis V309) ;4、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia) ;5、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis) ;6、霍乱弧菌 0139 群（Vibrio cholerae 0139) ;7、炭疽芽抱杆菌（Bacillus anthraci) ;8、大肠埃希菌 (Escherichia coli) ;9、肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli)； 10、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica) ;11、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium) ;12、阿伯丁沙门菌（Aberdeen Salmonella) ;13、单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes) ; 14、副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus) ; 15、鲁氏不动杆 菌（Acinetobacter Iwoffii) ; 16、肠致病性大肠埃希菌（Pathogenic Escherichia coli); 17、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) ;18、类肠球菌-I (E. faecalis) ;19、类肠 球菌 _2(E. faecalis) ;20、类肠球菌 _3 (E. faecalis) ;21、类肠球菌 _4 (E. faecalis) ;22、 屎肠球菌-1(E. faecium) ;23、屎肠球菌 _2(E. faecium) ;24、屎肠球菌 _3(E. faecium); 25、屎肠球菌_4(E. faecium) ;26、福氏志贺菌（Shigella flexneri) ;27、百日咳杆菌 (Bordetella pertussis) ;28、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) ;29、白喉棒状 杆菌（Corynebacterium diphtheriae) ;30、阴性对照（ddH20) ;31、阳性对照（E. faecium V583)，从图中可以看出在50min反应时间内，只有阳性对照（V583,图3中标号31)发生了 LAMP反应，其余菌株均未发生，表明本发明的VanB基因的LAMP检测方法具有较高的特异 性，可以特异性地检测到VanB基因。
[0078] 钙黄绿素指示剂检测结果如图4所示，其中1、携带NDMl基因的鲍 曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii) ;2、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) ;3、携带 Van A 基因的肠球 菌 V309 (Enterococcus faecalis V309) ;4、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia) ;5、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis) ;6、霍乱弧菌 0139 群（Vibrio cholerae 0139) ;7、炭疽芽抱杆菌（Bacillus anthraci) ;8、大肠埃希菌 (Escherichia coli) ;9、肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli)； 10、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica) ;11、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium) ;12、阿伯丁沙门菌（Aberdeen Salmonella) ;13、单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes) ; 14、副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus) ; 15、鲁氏不动杆 菌（Acinetobacter Iwoffii) ; 16、肠致病性大肠埃希菌（Pathogenic Escherichia coli); 17、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) ;18、奠肠球菌-I (E.faecalis) ;19、奠肠 球菌-2(E. faecalis) ;20、奠肠球菌 _3(E. faecalis) ;21、奠肠球菌 _4(E. faecalis) ;22、 屎肠球菌-1(E. faecium) ;23、屎肠球菌 _2(E. faecium) ;24、屎肠球菌 _3(E. faecium); 25、屎肠球菌_4(E. faecium) ;26、福氏志贺菌（Shigella flexneri) ;27、百日咳杆菌 (Bordetella pertussis) ;28、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) ;29、白喉棒状 杆菌（Corynebacterium diphtheriae) ;30、阴性对照（ddH20) ;31、阳性对照（E. faecium V583)，从图中可以看出在50min反应时间内，只有阳性对照（V583)显示为绿色（阳性，标 号31，标记" + "），其余菌株均显示橙色（阴性），进一步表明本发明的VanB基因的LAMP检 测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到VanB基因。
[0079] 二、本发明VanB基因的LAMP检测方法的灵敏度检测
[0080] 比较本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测VanB基因的灵敏度，方法为：提 取携带VanB基因的肠球菌总DNA，然后以10倍梯度（1倍、10倍、IO2倍、10 3倍、10 4倍、10 5倍、IO6倍、107倍）进行稀释，使总DNA的浓度分别为700ng/ μ L、70ng/ μ L、7ng/ μ L、700pg/ μ L、70pg/ μ L、7pg/ μ L、0. 7pg/ μ L、0. 07pg/ μ L，再以经梯度稀释的总DNA为模板，分别用 本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法（引物为VanB12-F3和VanB12-B3)进行灵敏度检 测。