[0081] 检测结果如图5-7所示，图5显示本发明VanB基因的LAMP检测方法可检测到 70pg/ μ L ;图6和图7中标号1-8代表模板中总DNA的浓度分别为700ng/ μ L、70ng/ μ L、 7ng/ μ L、700pg/ μ L、70pg/ μ L、7pg/ μ L、0. 7pg/ μ L、0. 07pg/ μ L，图 6 钙黄绿素指示剂染 色方法检测结果（" + "表示结果阳性（绿色表示结果阴性（橙色））和浊度仪检测 方法的结果一致，最低可检测到70pg/ μ L(标号5);而图7普通PCR方法最低只能检测到 7ng/ μ L(标号3)，表明本发明VanB基因的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高 100 倍。
[0082] 实施例4、VanB基因 LAMP检测试剂盒
[0083] 本发明提供的试剂盒包括：用于对VanB基因进行LAMP检测的VanB12引物：引物 VanB12-F3(SEQ ID NO :2)和VanB12-B3(SEQ ID NO :3)，引物VanB12-FIP(SEQ ID NO :4)和 VanB12-BIP(SEQ ID NO ：5)〇
[0084] 具体的，所述试剂盒包括以下用于25 yL反应体系（不含模板）的试剂： Mixture (主要成分包括：2mM Tris .HCl (pH 8. 8) 0.7 μ L，IOmM KCl 3. 8 μ UlOmM(NH4)2SO43· 8 μ L，0· I % Tween20 0· 4 μ L，0· 8Μ 甜菜碱（betaine) 0· 3 μ L，8mM MgSO4 3 μ L，I. 4mM dNTP each 0.5 μ L，8U Bst DNA polymerase I μ L，ddH20 7.7 μ L) 21.2 μ L，引物加入量分 别为：① 50mM 引物 VanB12-F3 (λ I yL，使终浓度为 5pmol ;② 50mM 引物 VanB12-B3 (λ I yL， 使终浓度为5pmol ;③50mM引物VanB12-FIP 0· 8 μ L，使终浓度为40pmol ;④50mM引物 VanB12-BIP 0· 8 μ L，使终浓度为 40pmol 〇
[0085] 试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为携带VanB基因粪肠球 菌V583,所述阴性对照为不含DNA的双蒸水。
[0086] 该VanB基因的LAMP检测试剂盒可参考实施例2的方法使用。具体可包括以下步 骤：
[0087] 1)以待测样品基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增，LAMP 反应体系为：待测样品基因组DNA 2yL，Mixture(主要成分包括：2mM Tris，HCl(pH 8. 8)0. 7 μ L, IOmM KCl 3. 8 μ L, IOmM (NH4) 2S04 3. 8 μ L, 0.1 % Tween20 0. 4 yL,0. 8M 甜菜碱（betaine)0.3yL，8mM MgSO4 3yL，1.4mM dNTP each 0.5yL，8U Bst DNA polymerasel yL，ddH20 7. 7 yL)21. 2yL，引物加入量分别为：① 50mM 引物 VanB12-F3 〇· 1 μ L，使终浓度为5pmol ;②50mM引物VanB12-B3 0· 1 μ L，使终浓度为5pmol ;③50mM弓丨 物 VanB12-FIP 0· 8 μ L，使终浓度为 40pmol ;④ 50mM 引物 VanB12-BIP 0· 8 μ L，使终浓度为 40pmol ;LAMP 扩增条件为：置 58-65°C 恒温 40-50min ;
[0088] 2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜 色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在VanB基因（结果阳性），橙色表示待测样品中不 存在VanB基因（结果阴性）；妈黄绿素指示剂的添加量可为1 μ L(终反应体系为26 μ L)， 含有0. 5mM钙黄绿素和IOmM氯化锰。
[0089] 或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判 断结果，浊度（比浊度多〇. 1)上升表示待测样品中存在VanB基因（结果阳性），浊度无变 化表示待测样品中不存在VanB基因（结果阴性）。
【主权项】
1?用于检测VanB基因的LAMP引物，是根据VanB基因Pl基因（GenBank号：CP002077. 1)的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、患者粪便、血液等样品中的 VanB基因，所述LAMP引物由四条引物组成，包括外引物VanB12-F3和VanB12-B3、以及内引 物VanB12-FIP和VanB12-BIP的组合；所述VanB基因的特异性保守靶序列如序列表中SEQ IDNO:1 所示。2. 根据权利要求1所述的用于检测VanB基因的LAMP引物，其特征在于：所述用于对 VanB基因进行LAMP检测的四条引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2 (VanB12-F3)、 SEQIDN0:3(VanB12-B3)、SEQIDN0:4(VanB12-FIP)和SEQIDN0:5(VanB12-BIP)所示。3. 根据权利要求1和2所述的用于检测VanB基因的LAMP引物，其特征在于：所述的 LAMP引物，为外引物VanB12-F3和VanB12-B3、内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP按摩尔比 5:40的组合物。4. 一种用于对VanB基因进行LAMP检测的试剂盒，包括权利要求1或2或3所述用于 对VanB基因进行LAMP检测的引物。5.根据权利要求4所述的用于对VanB基因进行LAMP检测的试剂盒，其特征在于：所 述试剂盒包括以下用于25 yL反应体系（不含模板）的试剂=Mixture(主要成分包括： 2mM Tris*HCl(pH 8. 8) 0. 7 y L, IOmM KCl 3. 8 y L, 10mM(NH4)2S043 . 8 y L,0.1 % Tween20 0.41^，0.81甜菜碱〇^七&11^)0.31^，811111%5043 1^，1.41111(1犯136&。11〇.51^，81]88七 DNA polymerase Iy L，ddH20 7.7 yL) 21.2 yL，引物加入量分别为：①50mM引物VanB12-F3 〇? I y L，使终浓度为5pmol ;②50mM引物VanB12-B30.1 y L，使终浓度为5pmol ;③50mM弓丨 物VanB12-FIP 0? 8 y L，使终浓度为40pmol;④50mM引物VanB12-BIP 0? 8 y L，使终浓度为 40pmol〇6. 根据权利要求4或5所述的用于对VanB基因进行LAMP检测的试剂盒，其特征在 于：所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为携带VanB基因粪肠球菌 V583,所述阴性对照为不含DNA的双蒸水。7. 权利要求1或2或3所述的LAMP引物或权利要求4或5或6所述的试剂盒在VanB基因的LAMP检测中的应用。8. 根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述VanB基因的LAMP检测，包括以下步 骤： 1) 以待测样品基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增，LAMP反 应体系为：待测样品基因组DNA2yL，Mixture(主要成分包括：2mMTris?HCl(pH 8. 8)0. 7yL，IOmMKCl3. 8yL，IOmM(NH4)2SO4 3. 8yL，0.I%Tween20 0. 4yL,0. 8M 甜菜碱（betaine) 0.3yL，8mMMgSO4 3yL，I. 4mMdNTPeach0.5yL，8UBstDNA polymeraselyL，ddH20 7. 7yL)21. 2yL，引物加入量分别为：① 50mM引物VanB12-F3 〇?IyL，使终浓度为5pmol;②50mM引物VanB12-B3 0?IyL，使终浓度为5pmol;③50mM弓丨 物VanB12-FIP0? 8yL，使终浓度为 40pmol;④ 50mM引物VanB12-BIP0? 8yL，使终浓度为 40pmol;LAMP扩增条件为：置 58-65°C恒温 40-50min; 2) 反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变 化判断结果，绿色表示待测样品中存在VanB基因（结果阳性），橙色表示待测样品中不存在 VanB基因（结果阴性）；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的 浊度变化来判断结果，浊度（比浊度多0. 1)上升表示待测样品中存在VanB基因（结果阳 性），浊度无变化表示待测样品中不存在VanB基因（结果阴性）。9. 根据权利要求8所述应用，其特征在于：所述步骤1)中的LAMP反应体系中还设有 阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为VanB基因，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体 系，如双蒸水；所述LAMP扩增条件优选为：置65 °C恒温45min。10. 根据权利要求8所述应用，其特征在于：所述步骤2)中钙黄绿素指示剂的添加量 可为IyL(终反应体系为26yL)，含有0.5mM钙黄绿素和IOmM氯化锰。
【专利摘要】本发明公开了一种VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物。用于检测VanB基因的LAMP引物，是根据VanB基因的特异性保守靶序列设计的，所述LAMP引物由四条引物组成，包括外引物VanB12-F3和VanB12-B3、内引物VanB12-FIP和VanB12-BIP。利用本发明可在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地定性检出纯菌、患者粪便、血液等样品中的VanB基因，无需复杂仪器，为VanB基因的检测提供了新的技术平台。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105177157
【申请号】
【发明人】袁静, 李环, 赵向娜, 王雪松, 魏晓, 林维石
【申请人】中国人民解放军疾病预防控制所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月14日