0pmol ;LAMP 扩增条件为：置 58-65°C 恒温 40-50min ;
[0021] 2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜 色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在VanB基因（结果阳性），橙色表示待测样品中不 存在VanB基因（结果阴性）；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应 液的浊度变化来判断结果，浊度（比浊度多0. 1)上升表示待测样品中存在VanB基因（结 果阳性），浊度无变化表示待测样品中不存在VanB基因（结果阴性）。
[0022] 在上述检测方法中，所述步骤1)中的LAMP反应体系中还设有阳性对照和阴性对 照，所述阳性对照为VanB基因，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水；所述 LAMP扩增条件优选为：置65°C恒温45min。
[0023] 所述步骤2)中钙黄绿素指示剂的添加量可为lyL(终反应体系为26yL)，含有 0. 5mM妈黄绿素和IOmM氯化猛。
[0024] 本发明提供了一种VanB基因的LAMP检测方法及其专用引物。本发明检测VanB 基因的原理是采用LAMP技术对VanB基因的特异性保守靶序列进行检测。
[0025] 本发明具有以下优点：
[0026] 1、操作简单，设备要求低。本发明只需将检测样品和检测反应液放入58-65Γ恒 温（水浴锅，恒温金属浴或浊度仪等）装置中孵育40-50分钟后即可判断结果。检测结果 可通过肉眼观察（钙黄绿素显色）或浊度仪判断，无需复杂仪器。
[0027] 2、特异性好，灵敏度高。本发明设计的四条引物对VanB基因靶序列特异区域的识 别保证了 LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅1个核苷酸的基因标本中找出相应 的靶序列进行扩增；灵敏度可比普通PCR高10-100倍；
[0028] 3、检测时间短、扩增效率高。整个LAMP扩增反应可在一小时内完成，目的基因产 率可达到0. 7mg/mL。
[0029] 综上所述，本发明可实现在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检出 VanB基因，无需复杂仪器，为VanB基因的检测提供了新的技术平台。本发明可用于畜牧业 生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测VanB基因，具有广阔的市 场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
[0030] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0031] 图1为四套引物组合的LAMP反应曲线；
[0032] 图2为用于确定VanB基因最佳反应条件的LAMP反应曲线；
[0033] 图3为VanB基因 LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果；
[0034] 图4为VanB基因 LAMP检测方法特异性的钙黄绿素指示剂检测结果；
[0035] 图5为VanB基因 LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果；
[0036] 图6为VanB基因 LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂检测结果；
[0037] 图7为VanB基因普通PCR检测方法灵敏度的检测结果。
【具体实施方式】
[0038] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： ((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook,J. ,Russell,David ff. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)〇
[0039] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量（W/W，单位g/lOOg)百分比浓度、 质量/体积（W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积（V/V，单位mL/100mL)百分比浓 度。
[0040] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提 示替换使用。
[0041] 所用引物由生工生物工程股份有限公司合成。
[0042] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0043] 实施例1、设计用于对VanB基因进行LAMP检测的引物
[0044] 从 NCBI 的核酸数据库 GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)检索获得 VanB 基因序列（GenBank号：KC489784. 1)，通过BLAST软件进行同源性分析，获得VanB基因的 特异性保守靶序列（序列表中SEQ ID NO :1)，再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对VanB基因进行LAMP检测的引物，设计出四套引物（代号分别为 VanB-1、VanB-6、VanB-9、VanB-12)，经过实验对比，最终选取了引物组合VanB12,引物序列 如下。
[0045] 表1用于对VanB进行LAMP检测的引物组合VanB-12
[0046] CN 105177157 A 说明书 5/9 页
[0048] 实施例2、VanB基因的LAMP检测
[0049] -、确定用于VanB基因 LAMP检测的最佳引物组合
[0050] 用实施例1设计的四套引物组合（代号为VanB-1、VanB-6、VanB-9、VanB-12)对 VanB基因进行LAMP检测，以获得最佳引物组合，具体方法如下：
[0051] 1)提取肠球菌V583的基因组DNA
[0052] 用 Promega Hzardfe. Genomic DNA Purification Kit Al 125 提取奠肠球菌 V583 的基因组DNA，具体提取方法包括以下步骤：
[0053] 1.吸取 560 μ L 准备好的 buffer AVL(含有 carrier RNA)到 I. 5mL 离心管中。 (根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA)
[0054] 2.将140yL血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有 buffer AVL-carrier RNA的离心管中。幹旋15秒，混勾。
[0055] 3.室温放置 IOmin。
[0056] 4.瞬时尚心，将盖子上的液滴甩回管底。
[0057] 5.样品中加入560 μ L无水乙醇（96% -100% )，斡旋15s充分混匀。然后瞬时离 心，将盖子上的液滴甩回管底。
[0058] 6.吸取630 μ L上步中的溶液小心的加入column(已装入到2mL离心管中）中， 注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000Xg(8000rpm)离心lmin。将column放入新的 2mL离心管中，弃去旧的收集管。
[0059] 7.小心的打开column的盖子，重复第6步。
[0060] 8.小心的打开column盖子，加入500 μ L buffer AWl。盖上盖子，8000rpm离心， Imin。将column放入新的2mL收集管（Kit提供）中，弃去旧的收集管。
[0061] 9.小心的打开column盖子，加入500 μ L buffer AW2。盖上盖子，全速离心 (14000rpm),3min〇
[0062] 10.将column放在I. 5mL离心管（kit中未提供）中。弃去旧的收集管。小心的打 开(3〇11111111，加入60以1^室温的131^€614\^。盖上盖子，室温放置1111；[11。8000印1]1离心1111；[11。
[0063] 2)分别在上述四套引物组合的引导下进行LAMP扩增，25yL LAMP反应体系 包括：含VanB基因的粪肠球菌基因组V583DNA 2 μ L (终浓度>lng/ μ L)，Mixture (主 要成分包括：2mM Tris · HCl (pH 8. 8) 0.7 μ L，IOmM KCl 3. 8 μ UlOmM(NH4)2SO4 3.8 μ L， 0· 1 % Tween20 0· 4 μ L，0· 8Μ 甜菜碱（betaine) 0· 3 μ L，8mM MgSO4 3 μ L，I. 4mM dNTP each 0· 5 μ L，8U Bst DNA polymerase I μ L，ddH20 7.7 μ L) 21.2 μ L，引物加入量分别为：① 50mM 引物F30. 1 μ L，使终浓度为5pmol ;②50mM引物B3 0· 1 μ L，使终浓度为5pmol ;③50mM引 物FIP 0· 8 μ L，使终浓度为40pmol ;④50mM引物BIP 0· 8 μ L，使终浓度为40pmol ;反应条 件为65°C恒温50min。
[0064] 3)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加1 μ L(终反应体系为26 μ L)含有 0. 5mM钙黄绿素和IOmM氯化锰的钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果（原理： 钙黄绿素是金属离子指示剂，能指示反应液中Mg2+的变化），绿色表示待测样品中存在VanB 基因（阳性），橙色表示待测样品中不存在VanB基因（阴性）；或者不添加钙黄绿素指示剂 直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果（原理：LAMP反应的过程中会产 生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应），浊 度上升表示待测样品中存在VanB基因（阳性），浊度无变化表示待测样品中不存在VanB基 因（阴性）。
[0065] 在荣研化学株式会社公司的LA230型号的环介导等温核酸扩增仪器上进行等温 扩增反应并记录结果，四套引物组合的LAMP反应曲线如图1 (横坐标为反应时间，纵坐标为 反应产物在