人egfr基因突变检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种人EGFR基因的多突变 的检测试剂盒及检测方法。另外，本发明还涉及可以用于该检测试剂盒的核酸组合等。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体（EGFR)的突变与一些疾病（如，非小细胞肺癌）或其疗效存在 弱关联，尽管无法用于直接判定相应疾病或其疗效，但是可以作为整个诊断的一小部分，将 相应结果与其他检测结果综合判读，从而最终得出诊断结果。
[0003] EGFR的突变十分多，主要集中于其基因的第18、19、20和21号外显子，尤以 19号外显子和21号外显子突变为主，新的突变也在不断被发现之中（如参见中国专利 200680013839和201010100949等），其中许多与疾病的关联性仍在研究之中。
[0004] 尽管采用基因测序技术来检测这些突变是最直接的，但是出于成本考虑，目前也 有一些基于PCR的检测技术来检测EGFR的突变，例如，中国专利200410103223号公开了检 测表皮生长因子受体基因点突变方法，中国专利200610027918号公开了 EGFR基因突变的 快速检测，中国专利200610035604号公开了检测表皮生长因子受体基因位点突变的荧光 定量PCR试剂盒，中国专利200810027672号公开了引物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂 盒，201010131040号公开了人表皮生长因子受体外显子19及21突变检测试剂盒，中国专利 201010148299号公开了一种扩增人类EGFR基因的多重PCR引物及其设计方法，中国专利 201010504423号公开了检测EGFR基因突变的试剂及其应用，中国专利201110020982号公 开了表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒及方法，中国专利201110054629 号公开了检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变和外显子21点突变的方法，中国 专利2011100705149号公开了用于检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的引物组合 物、试剂盒及方法，中国专利201210291816号公开了检测EGFR基因突变位点的试剂盒，中 国专利201210334208号公开了检测EGFR基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法，中 国专利201310092075号公开了检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的引物探针体系、 方法及试剂盒。
[0005] 然而，本发明人发现，上述基于PCR的检测技术要么检测的EGFR突变的种类不够 多，要么检测的准确性不高，尤其是检测突变的引物也容易把野生型EGFR也扩增并检测出 来，造成假阳性结果。由于在实际的检测工作中野生型EGFR的样品比例占绝大多数，如果 无法避免假阳性结果出现，则该检测技术几乎无实际应用的前景。本发明人长期致力于单 管多重PCR检测的研究工作，但是为了检测足够多的EGFR突变，最终跳出了单管多重PCR 检测的框架（当然同一管中仍然有超过40个引物和探针），采用不对称多重分组技术，在同 一 PCR轮次中判定大量EGFR突变的存在性，在灵敏检测的基础上保证了准确性（特异性）， 尤其是避免了假阳性结果。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题在于提供新的人EGFR基因突变的检测方法，其能在尽 量多重检测的基础上，特异性好，灵敏度高，结果判读方便。另外，本发明还提供可用于上述 方法的检测试剂盒和核酸混合物等。
[0007] 具体而言，在第一方面，本发明提供了一种人EGFR基因突变的检测方法，其包括：
[0008] (1)在8个PCR反应管中分别混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、引物和探针，其 中，每个反应管中包含的引物和探针的核苷酸序列分别如下表所示：
[0011] ，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，并且核苷酸序列如SEQ ID N0s:2、4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、41、44、47、49、51、54、56、58、61和 64所示的引物标记有淬灭基团；
[0012] (2)进行实时PCR，根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样 品中。
[0013] 在这8个PCR管之外，还可以包括其他PCR管，例如作为阴性对照管，其中用水取 代核酸提取液；又如阳性对照管，其中用已知存在突变或野生型EGFR的样品取代核酸提取 液。
[0014] 在本文中，术语"编号"用以区分同类别的多个物体（即用以表示被赋予不同编号 的物体之间是不相同的）并可用于指代和引用，而并非确定性的具体编号。具体编号可以 以 对应的方式用其他编号方式而被重新映射。
[0015] 可以对核酸提取液进行直接检测，但是优选对样品进行处理后获得核酸提取液 后再进行检测。所以，优选核酸提取液是提取样品中的核酸而获得的提取液，如是采用磁 珠提取法提取的。非特异性的磁珠提取法采用表面涂有非特异性核酸吸附类物质的顺磁 性颗粒，在低PH(如，pH值5~7)和高盐浓度的情况下核酸可以吸附到顺磁性颗粒表面， 在进行磁分离和充分洗涤后，在高pH(如，pH值8~9)、低盐浓度的条件下可将核酸洗脱 下来，由此富集了核酸（如靶核酸）的样品可用于PCR试验；另外还可以采用特异性吸附 (如杂交吸附和免疫吸附）的磁珠提取法。这些处理过程对于本领域技术人员来说是熟知 的，也可参见郑秀芬等，模板DNA磁珠提取法.中国法医学杂志，18 (3) :107-108 ;中国专利 200610030229. 5、200710118802· 2 和 201110105181. 0 等。
[0016] 优选采用本发明人进一步优化的磁珠提取法，其对于提取人EGFR中的核酸，更为 可靠，步骤也方便。优选的提取受试品中的核酸的过程是：向样品加入核酸萃取液（优选 核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液（如， Tris-HCl))，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤（优选 洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二 次洗涤所用的洗涤液包含乙醇），并洗脱（优选洗脱所用的洗脱液包含PH缓冲液（如， Tris-HCl))〇
[0017] 因此，优选在本发明的第一方面的方法中，核酸提取液是从样品中提取的，例如， 其中提取是采用磁珠提取法提取的。即优选本发明的第一方面的方法包括提取样品中的核 酸以获得核酸提取液的步骤。
[0018] 在本文中，所检测的"样品"是潜在可能含有靶核酸的离体样品，如食品、血液、血 液制品、尿液、唾液、医疗用品或药品等。本发明的方法优选不是诊断方法，如可用于公共 卫生领域的血液样品检测（如，对群体血液样品检测，其群体百分比数据结果可供公共卫 生机构人力和药物准备之用，也可供医疗保险机构预算之用，而非对患者进行诊断）。本发 明的方法优选仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否。即使对 于利用本发明的检测方法检测人的血液样品中的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与 否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中还是取样时不慎 污染的，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况，尤其是许多EGFR基因的突变与疾病 仅仅存在弱相关性，难以直接表征疾病。在本发明的【具体实施方式】中，样品是市售的标准 品。
[0019] 在实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR 仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此可以用于作为判读结 果的优良指标。在本发明的第一方面的方法中，对于步骤（3)，其中一种靶核酸的荧光检测 结果计算出的Ct值< 45,则这种靶核酸存在于样品中；一种靶核酸的荧光检测结果计算出 的Ct值>45,则这种靶核酸不存在于样品中。这是我们经过长期大量试验摸索出来的经验， 可靠性和重