用于哺乳动物干细胞生长和分化的生物相容性材料的制作方法

专利名称：用于哺乳动物干细胞生长和分化的生物相容性材料的制作方法
技术领域：
本发明提供具有影响细胞功能和胚胎干细胞生长的表面结构和组成成分的生物相容性材料。第一个方面，本发明提供具有用作促进未分化的多能干细胞生长或用作促进干细胞均一分化性生长的组成成分和表面结构的生物相容性材料。第二方面，本发明提供体内和离体影响细胞功能，特别是与基因诱导、细胞分化和骨组织形成有关的细胞功能的表面结构和组成成分的生物相容性材料。
背景技术：
关于本发明的第一个方面，在许多应用中，例如未分化的哺乳动物胚胎干细胞的产生和/或其均一分化性生长，提高选定的细胞功能是一项重要任务。特别是哺乳动物胚胎干[ES]细胞的治疗性应用引起了人们极大的关注，越来越需要制备未分化的哺乳动物 ES细胞以及引导并控制其分化的方法。因此，需要有助于/促进这些过程的合适微环境。 因此需要ES细胞可在其表面附着、生长和/或分化和/或进一步执行各种生物功能的生物相容性材料以满足各种治疗目的。其治疗可受益于这类材料的病症包括退变性疾病、癌症和肌肉骨骼器官创伤，都为公共卫生方面带来了越来越多的问题。对ES细胞培养方案有3个主要的要求。第一，在ES细胞培养期间，细胞必须接受来自培养基的可溶性因子和来自生长支持体的适当刺激以维持多能性。第二，应当保持染色体完整性。第三，为了利于哺乳动物ES细胞用于医学目的，细胞绝不能与来源于其他物种的生物材料接触，因为异种污染物在移植到患者体内时很可能引起免疫原性问题。现有的培养方案一般依赖于使用动物来源的生物材料，其中ES细胞在一层饲养细胞和血清上生长。已经披露了用于鼠ES细胞的无饲养细胞和无血清的培养条件，例如使用涂布明胶的培养皿结合补充了白血病抑制因子(LIF)的培养基，但是这些培养系统费用昂贵，而且并不总能产生适于所有治疗形式的ES细胞。此外，未来的医学治疗的目标在于应用分化的ES细胞移植入患者体内。为此目的必须确保所有ES细胞的均一分化，因为植入物中存在的未分化细胞可能在患者体外引起畸胎瘤，对于现有分化方案这仍然是个问题。综上所述，非常需要开发无异种物的ES细胞培养条件，即其中细胞保持多能性和染色体完整性的条件以及其中细胞以均一的、受控方式进行分化的条件。关于本发明的第二个方面，在各种应用中，提高选定的细胞功能(例如开发合适的植入物)是一项重要的任务。需要活细胞可在其上面附着、生长和/或分化和/或进一步执行各种生物功能的生物相容性材料用于各自治疗目的。退变性疾病、癌症和肌肉骨骼器官创伤为公共卫生方面带来越来越多的问题。仅脊柱病症就累及成年人口的30%，65岁以上人群中40%有骨关节炎症状。全球每年进行 130万例以上的关节异质成形术以治疗衰弱性末期关节炎。由于没有可接受的防止骨关节炎的疗法，因此预计在接下来的几十年内，由于西方人口老龄化而进行的关节成形术的数目将急剧上升。目前在欧洲和美国，全部卫生保健费用的25%以上都与肌肉骨骼病症有关， 在美国治疗这类病症的预算(2540亿美元)是例如用于研究和教育的资源总额的两倍。
这些疾病的主要外科治疗依靠使用金属医疗植入物结合骨或骨替代物。为了获得良好的临床效果，必须将植入物成功地整合到骨组织中。在过去几十年间，在这个领域已经取得了重大进展和结果，但是植入物随时间松脱仍是成功长期关节置换的一个重大问题。 仅现有的植入物表面不能够桥接较大的骨缺损和保持长期稳定性。使用从患者自身取出的骨移植物来解决这些问题继发15-30%的高供区病损。多达20%进行髋关节置换的患者在最初手术的10-15年内在修复区周围发生骨损失，在脊柱融合术中，20-30%的患者的融合不佳。此外，因为在不久的将来患者群将包括大量较年青的患者，预计有关长期无菌植入物松脱的问题会急剧增加。因此，就生命质量和经济性两者而言，改进骨组织中的植入物性能将具有深远的影响。WHO已经认识到了这一点，并把2000-2010年定为“骨与关节十年行动(Bone and Joint Decade) ” (http: //www. bone jointdecade. org/)，这一倡议也得到了丹麦卫生部的认可。体内植入物的生物相容性/生物整合极其复杂，包括传统上属于医学科学、表面科学、材料科学和分子生物技术的方法。当把植入物置入组织中时，便立即开始了对表面的竞争。在植入物嵌入机体后几毫秒内，便在植入物表面上形成由来自生理液体中的水、蛋白质和其它生物分子组成的生物层。随后，由于生物层中的细胞因子和生长因子的刺激，组织周围的细胞迁移到植入物附近区域。从而通过这个生物层介导了植入物表面与细胞之间的相互作用。植入物表面的性质对此层性质的影响非常强，需要了解并控制这种影响以优化生物相容性。同样重要的是细胞的性质，例如其通过信号分子遍及胞外基质的沟通能力。在骨愈合期间，许多生物活性信号分子控制骨生成，而且发现一些蛋白质能够刺激骨向植入物的修复。无论植入物是否以足够的机械强度成功地锚定在患者骨内，或者不论针对植入物的炎性反应是否发生，所有这些机制都引起组织对植入物的反应和影响，这最终将导致无菌性松脱和手术失败。需要骨组织细胞可在其上面附着和/或生长以及进一步执行各种生物功能的生物相容性材料用于治疗目的，特别是在包括引入植入物(例如假体和骨替代物)的外科治疗。这类治疗要获得成功的结果面临着巨大的挑战，因为植入物必须使组织在植入物部位再生，同时避免成为机体自身强大排斥机制的目标。植入物的临床成功取决于植入物与宿主组织之间的紧邻界面上的细胞行为。因此该领域发展的关键要素取决于在制备这些植入物中生物相容性材料的鉴定和用途。骨组织包括骨祖细胞在内的多种细胞类型。骨髓基质细胞(MSC)是产生骨祖细胞和其它细胞类型这两者的多能干细胞。骨祖细胞可分化并形成成骨细胞，特别在响应骨再生时。由骨髓基质细胞产生的骨成形蛋白(BMP和其它生长激素)用于募集骨祖细胞并刺激它们成熟成为成骨细胞。成骨细胞分泌例如TGF-β BMP、其它激素和生长因子等，其既可用作骨祖细胞的趋化引诱物，又可刺激成骨细胞的成熟并诱导骨基质的形成。成骨细胞合成并分泌有机骨基质(像胶原纤维、蛋白聚糖、骨钙蛋白、骨粘连蛋白和骨桥蛋白)，因此成骨细胞在矿化骨基质的沉积中发挥关键作用。在骨矿化期间，成骨细胞表达碱性磷酸酶以及多种细胞因子和生长激素。在正在进行的开发改进的生物相容性材料中，需要鉴定其结构与移植手术相容并诱导骨再生的材料。
此外，在最近几年，胚胎干细胞的治疗性应用引起了人们极大的关注，越来越需要引导并控制胚胎干细胞的分化。因此，需要有助于/促进这些过程的合适的微环境。发明概述本发明的第一个方面基于这样的认识，在机体或细胞培养物中各干细胞在微米和纳米结构水平上接触其周围组织或组织培养物表面构造，其中通过提供具有微米级特征的界定表面形貌的生物相容性材料或结构来满足上述需要，所述材料或结构可用于构建细胞或组织培养物表面和/或装置以用于手术性治疗/治疗性治疗。这类干细胞的实例是胚胎干细胞。术语干细胞是指能够使未分化细胞生长以产生多能干细胞以及使分化细胞生长的任何细胞种类。术语多能干细胞包括哺乳动物源的干细胞，例如啮齿动物或人干细胞。本发明特别提供多能哺乳动物胚胎干细胞，包括种系传递的多能胚胎干细胞。制备具有所需表面形貌的结构(其可以完全是人工的或可以模拟实际观察到的表面构造)需要能够界定微米级或纳米级尺寸的特征的技术。本发明利用微米及纳米技术中目前开发的工具和技术，使得可以设计和构建其表面构造具有微米或纳米级的横向特征大小(a lateral feature size)的结构。可以通过例如通过铁蛋白的胶体蚀刻法 (colloidal lithography)，随后除去离子点之后留下的有机相，来获得这种特征尺寸。特别是应用电子束蚀刻法和光刻法可制备界线十分清晰以及可在相关应用中精确重现的表面形貌。特别是研究发现，由表面伸出来、间隔开的突出物的规则形式对促进未分化干细胞的生长以及其均一分化性生长特别有效。发现突出物的尺寸和突出物之间间隙的尺寸是相关联的参数。因此，一方面，本发明涉及使用细胞或组织培养容器促进一种或多种未分化多能哺乳动物胚胎干细胞生长，所述一种或多种细胞能够种系传递，所述容器具有在使用期间暴露于培养物的表面，其中至少部分表面为生物相容性材料，其中至少部分生物相容性材料的暴露表面具有纳米和/或微米级形貌结构，所述形貌结构包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物，其特征在于突出物的横截面积等于或小于所述结构总面积的25%，所述面积以所述结构暴露表面平面测得，其中突出物的密度等于或大于1个突出物/65 μ m2， 且其中所述形貌结构的每个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 6 μ m，又或者等于或大于3. 0 μ m ；优选介于2. 0 μ m-3. 0 μ m之间，更优选2. 4 μ m。突出物可具有横截面，最小横截面径介于0. 1 μ m和4. 0 μ m之间，或介于0. 5 μ m 和1.5μπι之间，且其中任何突出物与其最近邻突出物之间的间隙的水平尺寸(d;Y)可介于约0. 5 μ m-8. 0 μ m之间，或介于约1 μ m_6 μ m之间，或介于约2 μ m_6 μ m之间，或介于约 1 μ m-4 μ m之间。沿至少一维的相邻格点之间的最小距离一般小于8. 0 μ m，或介于0. 5 μ m 禾口 6· Ομπι之间。突出物可具有相同的横截面几何形状或至少两种不同的横截面几何形状，其可具有不同的横截面积。突出物的横向截面可具有由周缘定义的形状和/或选自以下的几何形状环形、凹形、凸形、圆形、星形、正方形、长方形、六边形和多边形或其组合。在一个实施方案中，不同横截面几何形状的突出物以交替方式排列在规则二维网格上。至少部分的容器表面可涂覆选自钽、钛、钼或其氧化物的材料。所述表面的至少一部分可包含选自以下的聚合物聚苯乙烯、聚己酸内酯聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、 脱乙酰壳多糖或其组合。表面还可含有选自以下的化合物多肽、碳水化合物、脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物，其中化合物可吸附在容器的暴露表面或以化学方式与容器的暴露表面连接。合适的生长激素包括 BMP、EGF 样、TGF- β、IGF 禾口 LIF。细胞或组织培养容器还可进一步通过例如纳米晶金刚石、等离子体聚合、氧等离子体或氮等离子体进行化学官能化。本发明还提供用于制备本发明的细胞或组织培养容器的印模(stamp)或掩模 (mask)，容器至少部分由生物相容性材料制备，而印模适于将形貌表面结构压印入或提供给生物相容性材料的表面。本发明还提供用于促进未分化多能哺乳动物胚胎干细胞生长的具有上述特征的细胞或组织培养容器，其中所述形貌结构的每个突出物的垂直高度/深度尺寸约为 2. 4 μ m0另一方面，本发明提供促进一种或多种未分化多能哺乳动物胚胎干细胞生长的方法，所述一种或多种能够种系传递，所述方法包括使细胞与具有暴露于干细胞的表面的细胞或组织培养容器接触，其中至少部分表面为生物相容性材料，其中至少部分生物相容性材料的暴露表面具有纳米和/或微米级形貌结构，所述形貌结构包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物，其中选择所述结构以促进未分化哺乳动物胚胎干细胞的生长，其特征在于突出物的横截面积等于或小于所述结构总面积的25%，所述面积以所述结构暴露表面平面测量，其中突出物的密度等于或大于1个突出物/65 μ m2，且其中所述形貌结构的每个突出物的垂直高度/深度尺寸为等于或大于1. 6 μ m，等于或大于3. 0 μ m，或介于 2. 0μ -3. Ομ 之间，或约 2. 4μπ 。按照本发明的这个方面，突出物可具有横截面，且最小横截面径介于0. 1 μ m和 4.0 μ m之间，或介于0. 5 μ m和1. 5 μ m之间；任何突出物与其最近邻突出物之间的间隙的水平尺寸(d;Y)可介于约0. 5μ -8. Ομ 之间或介于约1μ -4μπ 之间。沿至少一维的相邻格点之间的最小距离可小于8. 0 μ m，或者介于0. 5 μ m禾Π 6. 0 μ m之间。此外，所述结构可包括至少两种不同的由周缘定义的形状和/或选自以下几何形状的突出物环形、圆形、星形、正方形、长方形、六边形和多边形或其组合，所述形状具有不同的横截面积。不同横截面几何形状的突出物可以交替方式排列在规则二维网格上。此外，所述表面的至少一部分可以是涂钽和/或涂钛的表面，且所述表面的至少一部分可由聚合物组成，聚合物包括聚苯乙烯、聚己酸内酯聚乳酸或脱乙酰壳多糖。表面上的其它化合物可包括以下的一种或多种多肽、碳水化合物、脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物，其中所述化合物吸附在容器的表面层上或者与容器的表面层化学连接、固定化或络合。合适的生长激素包括BMP、EGF 样、TGF- β、IGF和白血病抑制因子或其组合。此外，细胞或组织培养容器可通过例如纳米晶金刚石、等离子体聚合、氧等离子体或氮等离子体进行化学官能化。另一方面，本发明涉及促进哺乳动物胚胎干细胞的均一分化性生长从而有利于产生分化细胞群的细胞或组织培养容器的用途，分化细胞群中未分化细胞的数目显著降低，使得当与现有分化方案相比时，在治疗中使用分化细胞(例如植入物)使得未分化细胞可能给患者带来畸胎瘤的风险降低。因此，本发明提供一种容器，所述容器具有在使用期间暴露于培养物的表面，其中至少部分表面为生物相容性材料，其中至少部分生物相容性材料的暴露表面具有纳米和/或微米级形貌结构，所述结构包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物，其特征在于突出物具有横截面和介于1. 0 μ m-8. 0 μ m之间的横截面径，其中任何突出物与其最近邻突出物之间的最大间隙的水平尺寸(d;Y)介于1.0μπι-2.0μπι之间，且其中所述形貌结构的每个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或小于1. 0 μ m，优选介于0. 6 μ m-1. 0 μ m之间，更优选约0. 6 μ m。本发明中，使用细胞或组织培养容器可供产生其中未分化细胞的数目显著降低的分化细胞群，当与现有细胞分化方案相比时，在植入物中使用如此产生的细胞使得移植细胞可能给患者带来畸胎瘤的风险降低。此外，一个或多个突出部分的横向截面可具有由周缘定义的形状和/或选自以下的几何形状环形、凹形、凸形、圆形、星形、正方形、长方形、六边形或多边形。此外，表面可包括具有正方形横向截面的突出部分和具有长方形横向截面的突出部分，其中突出部分的第一横截面径为1.0 μ m，突出部分的第二横截面径介于 Ι.Ομ m-8. Oym之间，或介于1. 0 μ m-6. Oym之间，且其中突出部分的垂直高度/深度尺寸等于或小于1. 0 μ m，优选介于0. 6 μ m-1. Oym之间，更优选约0. 6 μ m。此外，所述表面的至少一部分可以是涂钽和/或涂钛的表面，且所述表面的至少一部分可包含选自以下的聚合物聚苯乙烯、聚己酸内酯聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、脱乙酰壳多糖或其组合。表面还可含有选自以下的化合物多肽、碳水化合物、脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物，其中所述化合物吸附在容器的暴露表面上。另一方面，本发明涉及促进哺乳动物胚胎细胞均一分化性生长的方法，所述方法包括使细胞与具有暴露于干细胞的表面的细胞或组织培养容器接触，其中至少部分表面为生物相容性材料，其中至少部分生物相容性材料的暴露表面具有纳米和/或微米级形貌结构，所述结构包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物，其特征在于突出物具有横截面和介于1.0 μ m-8. 0 μ m之间的横截面径，其中任何突出物与其最近邻突出物之间的最大间隙的水平尺寸(d;Y)介于Ι.Ομ m-2.0 μ m之间，且其中每个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或小于1. 0 μ m，优选介于0. 6 μ m-1. Oym之间，更优选约0. 6 μ m。按照这个方面，一个或多个突出部分的横向截面可具有由周缘定义的形状和/或选自以下的几何形状环形、圆形、正方形和长方形。此外，表面可包括具有正方形横向截面的突出部分和具有长方形横向截面的突出部分，其中突出部分的第一横截面径为1.0 μ m，突出部分的第二横截面径介于 Ι.Ομ m-8. Oym之间，或介于Ι.Ομ m-6. Oym之间，且其中突出部分的垂直高度/深度尺寸等于或小于1. 0 μ m，优选介于0. 6 μ m-1. Oym之间，更优选约0. 6 μ m。此外，所述表面的至少一部分可以是涂钽和/或涂钛的表面，且所述表面的至少一部分可包含选自以下的聚合物聚苯乙烯、聚己酸内酯聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、脱乙酰壳多糖或其组合。表面还可含有选自以下的化合物多肽、碳水化合物、脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物，其中所述化合物吸附在容器的暴露表面上。
本发明的第二个方面基于这样的认识，即在机体或细胞培养物中各个细胞在微米和纳米结构水平上接触其周围组织或组织培养物表面构造，这样的需要通过提供具有微米级特征的界定表面形貌的生物相容性材料或结构来满足，所述材料或结构可用于构建细胞或组织培养物表面和/或植入物和装置以用于手术性治疗/治疗性治疗。这类细胞的实例是成骨细胞。术语成骨细胞是指能够形成骨的任何种类的细胞， 包括天然细胞类型和/或修饰细胞类型，例如通过遗传技术修饰。其它实例包括胚胎干细胞和神经元。制备具有所需表面形貌的结构(其可以完全是人工的或可以模拟实际观察到的表面构造)需要能够界定具有微米级或纳米级尺寸的特征的技术。具体来说，已经证明当这类生物相容性材料表面的至少一部分的特征在于微米级形貌结构时，各种不同细胞类型中的至少一种的多种细胞功能得到显著改进。特别是发现由表面延伸出来的间隔开的突出物的规则形式对于促进上述细胞功能特别有效。本发明提供用于骨组织植入的医学植入物，医学植入物包含表面，其中至少部分表面为生物相容性材料，其中生物相容性材料的表面的至少一部分的特征在于包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物的纳米和/或微米级形貌结构，其中所述结构能够通过在成骨细胞中表达骨桥蛋白和骨钙蛋白而促进骨生成，其中突出物具有最小横截面径为 Ι.Ομ m-2. Oym的横截面，其中沿至少一维的相邻格点之间的距离介于2. 0 μ m和9. 0 μ m 之间，其中形貌结构的各个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m，优选约 2. 4 μ m0在医学植入物的又一个方面，任何突出物与其最近邻突出物之间的最大间隙的水平尺寸(d;Y)可介于约1.0μπι-6.0μπι之间。此外，横截面的横截面径可约为1 μ m，任何突出物与其最近邻突出物之间的最小间隙的水平尺寸(d;Y)可约为Ι.Ομπι。在医学植入物的又一个方面，所述结构可包括具有至少两种不同的横截面几何形状的突出物，例如环形、凹形、凸形、圆形、正方形和长方形或其组合；其可具有不同的横截面积，其中不同横截面几何形状的突出物可以交替方式排列在规则二维网格上。在医学植入物的又一个方面，突出物可位于二维规则网格的格点上，使得只有子集部分格点被突出物覆盖。此外，突出物可以平行排列，其中相邻突出物之间中心至中心的距离在相邻排中不同。此外，所述周期性形貌结构的特征中心可置于网格常数为a和b的二维长方形网格的格点上，其中网格为正方形网格，每个方向的网格常数(a = b)的间距介于2_8μπι之间，或者网格为长方形，第一方向的网格常数(a)的间距介于2_8μπι之间， 第二方向的网格常数(b)的间距介于1_4μπι之间。在医学植入物的又一个方面，所述表面的至少一部分是涂钽和/或涂钛的表面或其任何氧化物的表面；和/或所述表面的至少一部分由生物可降解聚合物(像聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物)组成。此外，所述表面还包含选自以下的吸附的化合物多肽、碳水化合物、脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物。合适的生长激素包括BMP、EGF样、TGF-β和IGF。本发明的医学植入物可以为手术植入物，例如用于治疗患有疾病(例如牙科疾病、矫形病症或肺心病)的人或动物的牙科植入物、矫形植入物、支架、心脏瓣膜。在又一个方面，本发明提供用于生产医疗装置的印模或掩模，医疗装置至少部分由生物相容性材料制备，印模适于将形貌表面结构印压入或提供给所述生物相容性材料的表面。本发明的又一个方面涉及在细胞培养期间促进分化细胞的基因表达的细胞或组织培养容器的用途，容器具有在使用期间暴露于细胞培养物的表面，其中至少部分表面为生物相容性材料，其中生物相容性材料的表面的至少一部分的特征在于纳米和/或微米级形貌结构，该结构包含大量突出物排列在规则二维网格的格点上，其中突出物具有最小横截面径为1. 0 μ m-2. 0 μ m的横截面，其中沿至少一维的相邻格点之间的距离介于2. 0 μ m和 9. 0 μ m之间，其中形貌结构的各个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m,优选约 2. 4 μ m。在又一个方面，本发明提供用于制备医学植入物的生物相容性涂层材料，其中生物相容性涂层材料包含上述生物相容性材料。在又一个方面，本发明提供通过在成骨细胞中表达骨桥蛋白和骨钙蛋白而促进骨生成的方法，所述方法包括使细胞与生物相容性材料接触，其中生物相容性材料的表面的至少一部分的特征在于纳米和/或微米级形貌结构，其包含大量突出物排列在规则二维网格的格点上，其中突出物具有最小横截面径为1.0μπι-2.0μπι的横截面，其中沿至少一维的相邻格点之间的距离介于2. 0 μ m和8. 0 μ m之间，其中形貌结构的各个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m,优选约2. 4 μ m。附图简述下面将结合实施方案并参照附图对本发明进行更全面地说明，其中

图1图示一种筛选工具的实例-所谓的BioSurface Structure Array(BSSA)圆片(wafer)的顶视图，用于鉴定促进/提高细胞功能(例如成骨细胞的矿化或胚胎干细胞、 成人干细胞、脐带血干细胞等干细胞的生长/分化或神经元的生长)的形貌结构。图2图示图1筛选工具沿A-B线的剖视图。图3图示形貌结构的顶视图(图3a)和剖视图(图北)，显示交替形式的槽宽 Χ(μπ )和脊宽 Υ(μ )。图4图示形貌结构的顶视图(图4a)和剖视图(图4b)，包括正方形孔和预定间距。图5图示形貌结构的顶视图(图5a)和剖视图(图5b、图5c)，包括X ( μ m) χ Y(ym)的长方形孔，间隔脊宽为X μπι。图6图示包含预定尺寸和预定间距的柱(pillar)的形貌结构的顶视图(图6a) 和剖视图(图6b)。图7图示包含交替的正方形孔和柱的形貌结构的顶视图。图8图示形貌结构的顶视示意图，其中每个突出部分(柱)的中心位于二维网格 (例如具有预定网格常数的六边形、长方形或正方形网格)的格点上，这些结构用来测定未分化或分化模式的胚胎干细胞的生长。图9图示具有微米级结构的暴露表面的组织培养皿的剖视图。图10图示在饲养细胞中(左图)或在不存在饲养细胞但补充了明胶的培养基中 (右图)生长两天的KH2ES细胞的集落形态和分化状态。标出了未分化的和分化的ES细胞集落的实例。DICjIOx0
图11图示接种在包含一式三份结构高度各为0.6 μ m、l. 6 μ m和2. 4μπι的钽形貌结构库的BSSA圆片上的CJ7 (下排)或ΚΗ2 (上排)ES细胞。图12图示在Fl. 2、F4. 1和K8各结构的BSSA圆片上培养3天后被固定和AP活性染色的CJ7 (左图)和KH2 (右图)ES细胞。NS 非结构化正方形，其中圆片上结构的高度/ 深度为0. 6 μ m、1. 6 μ m或2. 4 μ m。不同的背景色彩是由于钽结构上的光反射而引起的。直线比例尺:160μπι，5χ。图13图示对自动集落计数的评价。对具有三种不同结构高度(0.6μπι、1.6μπι和 2.4ym)的选定结构进行未分化KH2ES细胞集落的自动(Auto)和手工(Man)计数。值为一式三份的平均值。根据集落大小进行自动计数。根据集落形态和AP染色强度进行手工计数。图14图示在BSSA圆片上培养3天后通过自动计数(3个值的平均值)检出的未分化CJ7和KH2ES细胞集落的数目。A-J结构的数据按结构尺寸X和Y排序。K结构用按T 值排序的独立表格表示。不同的色度用于不同的结构高度0. 6 μ m、1.6 μ m和2.4 μ m。NS
非结构化。图15图示ES细胞集落数与ES细胞在其上面生长的结构的尺寸。对于三种结构高度/深度(0. 6 μ m、1. 6 μ m和2. 4 μ m)每一种，合并各个ES细胞系CJ7和KH2从具有相同X和Y尺寸的结构A-J得到的数据。每条曲线代表一个固定的X值，水平轴为Y值。垂直轴给出平均集落数。图16图示ES细胞集落数与ES细胞在其上面生长的圆片结构的高度/深度尺寸。 水平轴给出BSSA圆片上结构的高度/深度(μ m)，垂直轴给出圆片上检出的ES细胞总集落数。显示了两个细胞系CJ7和KH2—式三份的实验平均值。图17图示通过在以下任一个中连续传代而生长的CJ7和KH2ES细胞的微分干涉相差(DIC)图像生物相容性钽表面结构F1.2、F4. 1，高度/深度为2.4μπι;包含饲养细胞的培养基；涂覆明胶的培养皿(仅CJ7细胞)；或非结构化(NS)钽(仅ΚΗ2细胞)。CJ7细胞在6次传代期间扩增，ΚΗ2细胞在10次传代期间扩增(图示第7传代)。对CJ7细胞的 0ct4(使用抗0ct4抗体)和Nanog(使用抗Nanog抗体)的表达以及对核(DAPI)进行染色。对KH2细胞的0ct4表达和核(DAPI)进行染色。10x。图18图示在移植术或种系传递中使用ES细胞的示意图。从胚泡的内细胞团分离出ES细胞。培养中这些细胞可以无限扩增并且是多能的它们具有分化成全部三种胚层的各种细胞类型的能力。因此对其在再生医学中的应用有着很高的期望。ES细胞的另一个重要用途是用于在胚泡期重新导入哺乳动物胚胎(例如鼠胚胎)中。当把含有ES细胞的胚泡植入假孕小鼠中时，多能ES细胞可在该小鼠的第一代子代的不同组织中发育。然后高品质ES细胞有利于种系，因此可以产生完全由ES细胞传递而来的第二代小鼠。图19表格表示在以下之一中连续传代后CJ7细胞的种系潜力生物相容性表面结构Fl. 2或F4. 1 ；涂覆明胶的平板；或包含饲养细胞的培养基。图20图示基于在BSSA圆片上培养3天后的自动测量值(3个值的平均值)的CJ7 和KH2ES细胞集落的分化指数(分化指数=DAPI总面积-ES细胞集落总面积)。A-J结构的数据按结构尺寸X和Y排序。K结构用按T值排序的独立表格表示。由不同结构高度 (0.6μπ 、1.6μπ^Π 2. 4μπ )得到的值均用不同的量表表示。
图21图示ES细胞集落数与分化指数。给出从图14和图20所示数据推导的一式三份CJ7和KH2ES细胞的平均值。不同的结构高度(0.6μπι、1.6μπ^Π2.4μπι)用不同的色度表示。水平轴给出分化指数，垂直轴给出ES细胞集落数。图22图示包括在BSSA圆片中的形貌结构的顶视示意图，其中每个突出部分的中心(柱)位于例如带有预定网格常数的六边形、长方形或正方形网格的二维网格的格点上。图23图示用于矿化分析的圆片设计A 系列A-J ；正方形和柱的不同重复。各系列含有结构的水平尺寸⑴(Pm)及结构之间的间隙(Υ)(μπι)的16种不同组合。系列K; “鲨鱼皮”结构水平尺寸的8种不同重复，各结构间的间隙相同(iym)。B:左上图圆片上系列A-K的位置。圆片中间的白色区是未结构化的对照区。右上图和中间两张图在A中所述的BSSA圆片结构上的3种不同垂直高度尺寸(Z = 0. 6 μ m、 Z = 1.6μπι和Z = 2. 4μπι)上诱导矿化。下面两张图重复两种不同高度(Ζ = 1.6μπι和Z = 2.4ym)的上述实验。注意各系列，结构2和结构3总是位于结构15和16之上，且小面积的非结构化对照表面将各个结构分隔开来。将MC3T3细胞接种在BSSA圆片上，诱导矿化达3周，随后用茜素红染色以检测矿化(钙)。C :Β中最后两张图选定区域的放大图。上面三行(Z= 1.6 μ m)；选定区域包括覆盖结构2、3、15和16和分隔各个结构(系列A-J)的未结构化的对照表面(交叉)。第4行 (Z= 1.6 μ m);上面为1(1，1(2、1(3，1(4、1(5，1(6和1(7，1(8，下面为8554圆片边缘的未结构化表面。第5-8行(Ζ = 2. 4μπι)为与Z= 1. 6 μ m相同的区域。注意由系列A、C、E和I组成的上排(每个第2行的结构特征都直接位于第1行的每个第二结构的下方)；第2行由系列B、D、G和J组成(每个第2行的结构特征向左移位0. 5X(间隙+特征尺寸)；第3行由系列F和H组成(每个结构特征都直接位于彼此下方)。D 用两片圆片(Z= 1.6 μ m和Z = 2.4 μ m)的实验定量测定的相对矿化度。合并系列A-J具有相同尺寸和间隙的全部结构。合并系列K的所有尺寸(T = 1-8)。图M图示接种在BSSA圆片上的MC3T3细胞的增殖，所述圆片具有如图23中定义的不同高度/深度的表面结构突出部分左图对于接种后所有时间点及圆片上的所有结构，突出部分的高度/深度尺寸Z =1.6μπι(深色)和Z = 2.411111(浅色)表示细胞数(Ζ轴)。右图对于Ζ = 2.4μπι(浅色)，接种后96小时的细胞数(Ζ轴)是尺寸(X轴)和间隙(Y轴)的函数。合并系列A-J具有相同X值和Y值的全部数据。两张图中的对照数据相当于细胞生长在具有平整表面的圆片的区域上。图25图示接种在垂直距离为Z = 2. 4 μ m的系列A、K或对照表面结构的BSSA圆片(如图23中定义)上的MC3T3细胞的细胞大小、矿化及OPN和OC的表达。垂直图第1列图示通过肌动蛋白和黏着斑蛋白重叠染色检测的圆片上的细胞 (IOX)。垂直图第2-5列图示接种在BSSA圆片上后的MC3T3细胞；生长两周；随后固定并进行骨桥蛋白(0ΡΝ，绿色)、骨钙蛋白(0C，红色)和DAPI (蓝色)染色。在0PN、0C和DAPI 染色的荧光显微术检测后，将圆片用茜素红染色(垂直图第2列)。水平图第1-4行具有X =Iym且间隙⑴分别为1^111、211111、411111禾口611111的特征尺寸。水平图第5-8行具有X=2 μ m且间隙(Y)分别为1 μ m、2 μ m、4 μ m禾口 6 μ m的特征尺寸。水平图第9_12行具有X =4μπι且间隙⑴分另丨」为1口111、2口111、4口111禾口6口111的特征尺寸。水平图第13-16行具有X =6μπι且间隙(Y)分别为1口111、2口111、4口111禾口6口111的特征尺寸。水平图第17和18行分别具有鲨鱼皮结构Kl (Τ = 1 μ m)和非结构化表面。图2-5 所有图像包括分隔不同结构的 BSSA圆片的未结构化部分(各图的左1/5部分)。图26图示在BSSA圆片上诱导2周后MC3T3细胞的矿化、0ΡΝ, OC的表达和DAPI 染色，其中圆片具有表面结构系列A-J、K和对照，其中结构高度尺寸为Z = 2. 4 μ m(如图23 中定义)。图像是包含结构间相交区域的放大图(系列A-J的2、3、15和16)和(K 1-8的 1-8和对照区)。荧光显微图像表示接种在BSSA圆片上的MC3T3细胞；生长两周；随后固定及对0ΡΝ(绿色)、OC(红色)和DAPI (蓝色)染色，随后用茜草红(Alizianred)染色。水平行1-10:其中(X，Y) = 1，2、1，4、6，4和6，6的结构的图像，具有从系列A(顶端行)开始至J(底端行)的各结构相交的未结构化表面。水平行11-14:从BSSA圆片边缘的未结构化表面上方的Κ1，Κ2开始到未结构化表面(末行)上方的Κ7，Κ8结束的K结构以及未结构化表面的图像。DAPI信道第9行的黑色区是由于显微镜的自动照片采集程序在改变滤光镜时出现机械故障所致。图27图示附着在BSSA圆片(如图23中定义)上的MC3T3细胞的面积。在附着后一天定量MC3T3细胞的平均细胞面积，定量方法是用被肌动蛋白/黏着斑蛋白重叠覆盖的面积除以细胞数(DAPI染色)。合并系列A-J结构之间具有相同尺寸⑴和间隙⑴的所有结构。实心柱和交叉影线柱两次独立的实验。图28图示在具有垂直距离Z = 2. 4μ m的系列A表面结构的BSSA圆片(如图23 中定义)上诱导3周后MC3T3细胞的矿化、0ΡΝ, OC的表达和DAPI染色。荧光显微图像显示接种在BSSA圆片上后；生长3周；然后固定和进行骨桥蛋白 (0ΡΝ，绿色)、骨钙蛋白(0C，红色)和DAPI (蓝色)染色；随后用茜素红染色(垂直图第1 列)的MC3T3。水平图第1-4行具有X = 1 μ m和间隙⑴分别为1μπι、2μπι、4μπ^Π6μπι 的特征尺寸。水平图第5-8行具有X = 2μπ 禾口间隙(Y)分别为1μπ 、2μπ 、4μπ^Π6μπ 的特征尺寸。水平图第9-12行具有X = 4 μ m和间隙(Y)分别为1 μ m、2 μ m、4 μ m禾口 6 μ m 的特征尺寸。水平图第13-16行具有X = 6μπι和间隙⑴分另1」为1口111、2口111、4口111禾口6口111 的特征尺寸。图四图示用于绵羊成骨试验中的样品架。图30显示具有高度/深度为2. 4μ m的特征的生物相容性表面F(l，4)上人胚胎干细胞(hESC)集落随时间的生长。使细胞在第0天传代，每天拍照达5天。图30a图示表面上所有集落的概观(0. 8x)。图30b图示一个选定的hESC集落的形态改变时程(8x)。图31图示具有高度/深度为2.4μπι的特征的表面F(l，2)上人胚胎干细胞集落随时间的生长。使细胞在第0天传代，每天拍照达5天。图31a图示表面上所有集落的概观(0. 8x)。图31b图示一个选定的hESC集落的形态改变时程(8x)。图32图示生长在纳米表面上的人胚胎干细胞集落与生长在GeltrexTM基质 (Invitrogen)上的相同细胞的比较，GeltrexTM基质是还原生长因子(reduced growth factor, RGF)基底膜提取物的可溶形式。图33图示生长在具有高度/深度为2. 4 μ m的特征的表面F(l，4)上的细胞的免疫荧光、DAPI和相位图像。图34图示生长在具有高度/深度为2. 4 μ m的特征的表面F(l，2)上的细胞的免疫荧光、DAPI和相位图像。发明详述本发明的第一方面这个方面涉及使大量多能哺乳动物胚胎干细胞以未分化状态生长随后诱导胚胎干细胞分化成所需要的细胞类型的需要。一旦分化成某一特定的细胞类型，这些特定的细胞类型便可用于许多不同的应用，例如药物筛选、细胞替代疗法、糖尿病、软骨损伤等。本发明基于这样的认识，即方向性生长和/或分化的细胞功能受细胞微环境的强烈影响。因此，一般认为未分化胚胎干细胞的生长及其随后的分化可取决于细胞可附着的合适结构的提供。具体地讲，本发明认识到，细胞微环境表面的二维和三维结构或形貌是上述过程的决定性因素。有无数不同的可能的微环境。因此，一方面，本发明涉及提供其表面形貌产生促进多能哺乳动物胚胎干细胞以未分化状态生长的特定微环境的生物相容性材料。本发明的第二个方面提供其表面形貌促进细胞生长和/或分化的生物相容性材料。由于蛋白质和细胞的尺寸由纳米到微米不等，因此这些是提供与生物相容性材料的问题有关的长度尺度。I.测试和选择适于ES细胞生长和促进分化的生物相容性材料的方法。采用提供不同候选形貌结构的筛选工具/测定法可以筛选具有不同表面形貌的材料来鉴定本发明的生物相容性材料或结构。适于筛选形貌结构的筛选工具的实例包括所谓的BioSurface Structure Array (BSSA)圆片。图1图示这类BioSurface Structure Array圆片的实例的顶视图。 BSSA圆片1包含60个测试区。多个测试区2留作“空白”，即它们不被加工以具有结构化表面。因此，测试区2的表面基本上是平整的。因此在用BSS筛选工具的每个平行筛选试验中都固定包括了对照实验。规定为Si，S2. . .，S54的其余测试区包含如本文所述的各个结构化表面。测试区为正方形，尺寸IOmm χ 10mm。用作鉴定诱导/提高细胞功能(例如生长和分化)的结构的筛选工具的圆片可通过多种生产技术制备。其制备方法的实例包括一种或多种本领域已知的下列技术·光刻方法光刻法是一种将几何形状/图案形式从光掩模转印至需要结构化的表面(例如圆片表面)上的已知方法。已知具有约1微米至IOOnm以下的最小横向特征尺寸的光刻设备。光刻法参见例如S. M. Semiconductor Devices, Physics and Technology，第■^片反，John Wiley & Sons 2002，第 12 章Lithography and Etching;以及载于 Plummer, Deal, Griffin :Silicon VLSI Technology, Fundamentals, Practice, and Modeling, Prentice Hall 2000,第 5 章Lithography。·电子束蚀刻法基本上，可采用电子束蚀刻法以与光用于光刻法中完全一样的方式来暴露光致抗蚀剂。电子束蚀刻法具有高达约5nm的特别高的分辨率。·热压印热压印使用主印模将微米和纳米级结构压印在聚合物基底上。该方法使用各种聚合物材料可供主印模产生许多完全图案化的基底。热压印提供低成本、多用途的制备方法，非常适于从研究与开发应用到大量生产用途的BSSA的制备。可获得高长宽比与极高均勻度的大型圆片(例如8英寸或12英寸圆片)上的微米和纳米级结构。20nm以下的特征尺寸是可能的。可以通过例如电子束蚀刻技术来制备主印模。 可能涉及生产生物相容性材料或结构的生产步骤或工艺的其它实例包括纳米压印蚀刻法、激光消融、化学浸蚀、等离子喷涂、磨料喷射、雕刻、刮擦、微细加工等。图2图示图1圆片的剖视图。图加图示标为A-B直线的完整圆片宽度的横截面。 图2b图示一个测试区一部分表面的放大图。圆片1具有包括图案化衬底层21 (例如硅层) 和表面层23的多层结构。圆片的表面是图案化的(例如通过光刻法)，以在各个测试区Si， S2，...，SM表面上提供不同的图案。结构具有深度/高度H。在光刻法中，高度H是可通过蚀刻过程控制的。图案化表面被一层薄的二氧化硅层22和/或以下不同生物相容性材料的表面层23覆盖例如钽或任何其它金属、金属氧化物、金属氮化物、金属碳化物、金刚石、 类金刚石碳、半导体、半导体氧化物/氮化物、绝缘体、聚合物、共聚物。测试区之间有无结构的“空白”边区，即边区未被加工成具有结构化表面。在这种情况下，空白边区宽为0. 3mm。 空白边有助于结构的直观排列和鉴定。空白边还用作紧邻各测试正方形的小的对照表面。注意图2是示意图，并未按比例绘制。尤其是垂直尺寸可放大以提高可读性。II.本发明的生物相容性材料的化学组成生物相容性材料或结构的实施方案可为各种形式，例如-医学植入物或用于制备医学植入物的生物相容性涂层材料，-具有暴露于细胞培养物的表面的组织培养皿/培养瓶，其中暴露表面具有支持所需细胞功能(例如未分化或分化状态的胚胎干细胞的生长)的结构，-组织培养物表面或例如改进以在表面上呈现这些结构或这些结构蓝图 (blueprint)的组织培养塑料制品。在这方面，组织培养塑料制品是指可用于制备体外细胞培养的细胞生长表面的任何聚合物。生物相容性材料或结构的实施方案可包含衬底层和任选表面层。用于制备生物相容性材料或结构的合适原材料包括任何半导体(掺杂或未掺杂)、单一金属、金属氧化物、金属氮化物、合金、陶瓷、聚合物、共聚物、复合材料、递药系统、 具有生物活性分子的聚合物、其它生物活性化合物或其任何组合。在本发明的实施方案中，表面层包含对于ES细胞体外和/或植入患者后的生长有足够生物相容性的材料。表面层的实例包括金属表面沉积物，例如钽、钛、Ti-Al-V合金、 金、铬、金属氧化物、半导体氧化物、金属氮化物、半导体氮化物、聚合物、生物聚合物或其它合金。植入物的优选的表面组成成分包括钽、钛、钼或其氧化物。在本发明的一个实施方案中，至少部分表面层包含选自以下的聚合物聚苯乙烯、 聚己酸内酯聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、脱乙酰壳多糖或其组合。在本发明的一个实施方案中，细胞或组织培养容器通过例如纳米晶金刚石、等离子体聚合、氧等离子体或氮等离子体进行化学官能化。在一些实施方案中，生物相容性材料或结构包含其它组分，例如一种或多种可沉积或吸附在所述材料或结构的暴露表面或表面层上的生物活性化合物。例如所述化合物可选自抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、生长激素、有机化合物和无机化合物。优选选自以下的一种或多种生长激素吸附于容器的表面层或与容器的表面层化学连接、固定化或络合骨形态发生蛋白[BMP]、表皮生长因子[EGF]、转化生长因子-β [TGF- β ]、胰岛素样生长因子IGF和白血病抑制因子[LIF]。
III.本发明的生物相容性材料的结构性质生物相容性材料或结构的全部或部分表面(其可为上述的各种形式)包含在由该材料或结构的表面界定的平面内一维或多维的微米级特征。本文使用的术语微米级和微米大小是指在约Iym和约1000 μ m范围内的长度尺度。本文使用的术语纳米级是指在约Inm 和约lOOOnm、特别是在约Inm和约IOOnm范围内的长度尺度。在本发明的实施方案中，所述特征是结构/形貌特征，例如由生物相容性材料的表面延伸出来的突出物。微米级特征可在至少一个横向方向上具有水平尺寸，其中所述尺寸选自以下一种间距介于约Ιμπι和约20 μ m之间、介于约1-10 μ m之间、介于约10-20 μ m之间、介于约 1 μ m-2 μ m之间、介于约2 μ m_4 μ m之间、介于约4 μ m_6 μ m之间、介于约6 μ m_8 μ m之间、 介于约8μπι-10μπι之间、介于约10-12 μ m之间、介于约12-14 μ m之间、介于约14-16 μ m 之间、介于约16-18μπι之间、介于约18-20μπι之间。在本发明的一个实施方案中，优选至少一个水平尺寸介于0. 1μπι-4μπι之间。因此，从某一特征的横截面区域内的任一指定点到该横截面区域边缘的最短距离等于或小于4 μ m。水平尺寸在与表面基本平行或至少与表面基本正切的方向上测量。任何微米级特征与其最近邻之间的最大距离或间隙可在至少一个横向方向上具有水平尺寸，其中所述尺寸选自以下的间距之一介于约0.5口!11-1口111之间、介于约 1μ -2μπ 之间、介于约2μ -4μπ 之间、介于约4μ -6μπ 之间、介于约6μ -8μπ 之间、介于约8μ -10μπ 之间、介于约10μ -12μπ 之间、介于约12 μ m_14 μ m之间、介于约14μπι-16μπι之间。在本发明的实施方案中，优选水平尺寸介于0.5 μ m-8 μ m之间。生物相容性材料表面上微米级特征的分布优选是沿一个或多个横向方向呈周期性，可通过具有选自以下一种间隔的横向间距尺寸的周期函数来描述介于约1 μ m-2 μ m之间、介于约 2口111-4口111之间、介于约4口111-6口111之间、介于约6口111-胸111之间、介于约10μπι-16μπι之间、介于约16μπι-20μπι之间、介于约20μπι-Μμπι之间。在本发明的一个实施方案中，间距尺寸小于8. 0 μ m，更优选介于0. 5 μ m-6. 0 μ m之间。微米级特征的周期函数可具有沿一个方向较小的周期或具有在不同方向上的例如2、3、10或以上的因素的较大周期。生物相容性材料的表面上的任意一个微米级特征可定义为周期性的周期结构。因此，周期结构某一特征的水平尺寸可定义为周期形状/函数的周期，即所述结构沿其重复其形状的最短间距的长度。微米级特征的深度/高度，即其在从生物相容性材料的表面突出出来的方向上的线性尺寸可为纳米或微米大小，即结构可具有Inm-IO μ m或选自以下间距范围的高度/深度介于约0. 07μπι-0. 6μπι之间、介于0. 6μπι-1. 6μπι之间、介于约1. 6_3. Ομπι之间、介于约3μπ -10μπ 之间。在本发明的一个实施方案中，所述结构(例如突出物)具有为以下的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 6 μ m、等于或大于3. 0 μ m、优选介于2. 0 μ m-3. 0 μ m 之间或约2.4 μ m。这个实施方案特别适于促进多能干细胞的无分化生长。在另一个实施方案中，所有特征(突出物)的垂直高度/深度尺寸都等于或小于ι. ο μ m、优选介于 0. 6 μ m-1. 0 μ m之间、更优选约0. 6 μ m。这个实施方案特别适于促进干细胞的分化。任意一种微米大小特征的横向横截面优选为几何形状的，例如正方形、长方形、六边形、多边形或星形。特征的顶面和/或侧面优选基本上是平整的。然而，微米大小特征的表面还可包括纳米级特征以在微米和纳米两种尺度上获得形貌协同效应。这可以通过例如下列方法获得化学浸蚀(例如通过NaOH或柠檬酸)、离子蚀刻、胶体蚀刻(例如通过聚苯乙烯珠、巴克球(bucky ball)或蛋白质)、掠入射物理气相沉积涂层、CVD涂层或等离子喷涂。生物相容性材料的表面上的特征可具有相同或不同的形状。优选生物相容性材料的表面上的特征为几何形状(例如正方形、长方形、六边形、星形或多边形)。一般来说，二维周期结构的定义可包括格子单位(unit cell)和位于格子单位中的重复单元，所述格子单位在所述表面的平面上具有预定形状(例如正方形、长方形、六边形等)；所述重复单元定义在格子单位中的详细结构(基础)，例如孔或突出物，例如正方形柱、多边形柱、环形柱等。格子单位限定的位置定义了重复单元距离，而重复单元界定预定的形状和尺寸。这些格子单位位置可由相应的二维向量界定。因此，网格结构由格子单位沿表面界定的二维方向平移而形成，特别是相应的多个格子单位尺寸。在一个实施方案中， 每个特征的中间位置可定义为向量ν = nlVl+n2V2，其中V1和V2在表面上是线性独立向量， H1和n2都为整数。在一些实施方案中，每个特征的中心位于二维网格(例如具有预定网格常数的六边形、长方形或正方形网格)的格点上(图8A、图8B)。在一些实施方案中，全部特征覆盖这类网格的全部格点，而在其它实施方案中，不是网格上的全部格点都被特征覆盖。例如，在一些实施方案中，在每隔一行的格点中，每隔一个格点可被特征覆盖。在其它实施方案中，在每第二、第三、第四或更高次行中，每第二、 第三、第四或更高次的格点留为空白。在一些实施方案中，形貌结构可包括大量不同的特征，例如规则排列/图案的多种不同的特征，例如周期性排列，例如交替呈行的2个、3个或更多个不同特征。这类图案的实例包括包含以交替行排列的具有正方形横截面的特征和具有圆形横截面的特征的结构。在一些实施方案中，特征排成行和/或排。在一些实施方案中，每行中的特征具有相同的间距，而在其它实施方案中，间距可在整个行中有所不同和/或在行与行间有所不同。同样，行与行间的距离可以是所有行均相同，或者行与行间有所不同。在一些实施方案中，某一行中的一些或所有结构可相对于同一行中相应的近邻结构旋转。在一些实施方案中，某一行中的一些或所有结构可相对于其相邻行中相应的近邻结构旋转。在一些实施方案中，在所有横向方向上的特征的水平尺寸都介于Iym和约10 μ m 之间。这类特征的实例包括具有大致为正方形或圆形横截面的突出物。在其它实施方案中， 一个方向的特征的水平尺寸介于Iym和约IOym之间，而另一个方向的水平尺寸较大。生物相容性材料的实例是具有微结构的生物相容性材料，所述微结构具有以下形貌特征的表面正方形柱的二维周期结构，尺寸为2μπι χ 2 μ m，间距为6 μ m(图6)。图8A-K图示形貌结构实例的顶视图，形貌结构具有大致呈圆形、正方形或长方形横截面的突出物/柱的形式的特征。每个特征在至少一个方向上具有水平径X，相邻行和列中特征之间的间隙距离表示为Y。在图8A、C、E、F和I中，Y等于任何特征与其最邻近特征之间的间隙尺寸，相当于间距X+Y。在图8B、D、G、H和J中，与最邻近特征的间隙距离对于不同特征是不同的，以图8B的特征1201、1202和1203为例说明。特征1201以特征1202 为其最近邻；因此间隙尺寸为Y。然而，特征1203以特征1201和1202为其最近邻特征，具有稍稍不同的间隙尺寸d。因此，在图8B、D、G、H和J中，行与行之间的间距不同。在包括特征1201的行中，间距为X+Y，而在包括特征1203的行中的间距为2(X+Y)。虽然其它高度是可行的，但用于以下实例中的结构具有0. 6 μ m、1. 6 μ m或2. 4 μ m之一的特征高度。在图8的实例中，每个特征的中心位于网格常数为a和b的二维长方形网格相应的格点上，见图8A和B。然而，在图8A-E、H-I中，不是所有格点实际上都被特征覆盖，而在图8F和K中，所有格点都被特征覆盖。在图8A、C、E、F和I中，网格是网格常数为a = b =(X+Y)的正方形网格。在图8B、D、G、H和J中，网格为长方形，网格常数为a = X+Y，b = (X+Y)/2。在图81(中，网格常数为3 = 2乂^ = 3.5乂。对于选定的X值和Y值，按照图8A-H 制备了圆片，其中(X，Y) (μπι)选自(X，Y) = (1，1)、(1,2), (1,4), (1,6), (2，1)、(2,2), (2，4)、(2，6)、(4，1)、(4，2)、(4，4)、(4，6)、(6，1)、(6，2)、(6，4)、(6，6)。对于选定的 X 值和Y值，按照图8Κ制备了圆片，其中Χ(μπι)选自X= 1、2、3、4、5、6、7、8。因此，对于图8Α、 C、E、F和I的正方形网格，网格上的网格常数a和b为a = b = 2-12 μ m。对于图8B、D、G、 H和J的长方形网格，方向a的网格常数的间距介于2-12μπι之间，方向b的网格常数的间距介于1-6 μ m之间。对于图8K的网格，网格常数b保持间距在3. 5-28 μ m之间，网格常数 a保持间距在2-16 μ m之间。为了鉴定上述结构X和Y各自不同的值，将本说明书图8A所示结构称为AX. Y，其中X和Y是指上述X和Y的尺寸。因此，结构AX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中每隔一行的相邻突出物间的间隙尺寸为Y μπι，而其余行中突出物间的间隙尺寸为OY+X)ym。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μ m0相邻行中的突出物彼此排成一线。同样，图8Β中所示结构称为BX. Y。因此，结构BX. Y包括具有直径为X ym的圆形横截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中每隔一行的相邻突出物间的间隙尺寸为 Y μ m，而其余行中突出物间的间隙尺寸为(2Y+X) μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μπι。间隙尺寸为ΟΥ+Χ) μ m的行中的突出物与其相邻行的突出物之间的间隙中心排成一线。图8C所示结构称为CX. Y。因此，结构CX. Y包括具有线性尺寸为X μ m的正方形横截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中正方形的各边与行/列的方向一致，且其中每隔一行的相邻突出物间的间隙尺寸为Y μπι，而其余行中突出物间的间隙尺寸为(2Υ+Χ) μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μm0相邻行中的突出物彼此排成一线。图8D所示结构称为DX. Y。因此，结构DX. Y包括具有线性尺寸为X μ m的正方形横截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中正方形的各边与行/列的方向一致，且其中每隔一行的相邻突出物间的间隙尺寸为Y ym，而其余行中突出物间的间隙尺寸为(2Y+X) μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μ Hi0间隙尺寸为(2Υ+Χ) μπι的行中的突出物与其相应的相邻行突出物间的间隙中心排成一线。图8Ε所示结构称为EX. Y。因此，结构EX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。圆形突出物行中相邻突出物间的间隙尺寸为Yym，而其余行中的正方形突出物间的间隙尺寸为(2Υ+Χ)μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y ym。相邻行中的突出物彼此排成一线。所示结构图8F称为FX. Y。因此，结构FX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为Χμ m的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。各行内突出物之间的间隙尺寸和相邻行间的间隙尺寸为γ μ m0相邻行中的突出物彼此排成一线。图8G所示结构称为GX. Y。因此，结构GX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行为圆形突出物，其余行为正方形突出物。圆形突出物行中相邻突出物间的间隙尺寸为Υμπι，而其余行中的正方形突出物间的间隙尺寸为(2Υ+Χ)μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y U m0间隙尺寸为(2Υ+Χ) μ m的正方形行中的突出物与其相应的相邻行中的圆形突出物间之间的间隙中心排成一线。图8H所示结构称为HX. Y。因此，结构HX. Y包括具有直径为Χμ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。各行内突出物之间的间隙尺寸和相邻行间的间隙尺寸为Yym。相邻行中的突出物彼此排成一线。正方形突出物与其相应的相邻行的圆形突出物之间的间隙中心排成一线。图81所示结构称为IX. Y。因此，结构IX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。正方形突出物行中相邻突出物之间的间隙尺寸为Yym，而其余行中的圆形突出物之间的间隙尺寸为(2Υ+Χ)μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μ m。相邻行中的突出物彼此排成一线。图8J所示结构称为JX. Y。因此，结构JX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。正方形突出物行中相邻突出物之间的间隙尺寸为Y ym，而其余行中的圆形突出物之间的间隙尺寸为(2Y+X) μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Yum。间隙尺寸为ΟΥ+Χ) μ m的行中的圆形突出物与其相应的相邻行的正方形突出物之间的间隙中心排成一线。因此，在上述实例中，最近邻特征之间的最小间隙尺寸为Y ym，最近邻特征之间最小中心-中心之间的距离为Χ+Υμ m。图8K所示结构称为KX。结构KX包含多组长方形横截面的长形突出物(脊)。脊具有不同的长度，并彼此平行排列。每组的脊排列形成长方形形状，使得每组都包括最长脊作为中脊。中脊的每侧排列了随距中脊的距离增加而逐渐变得更短的一系列脊。因此长方形形状KX包括一连串的长度为X μπι、2Χμπι、3Χμπι、4Χ μ 、3Χ μ m、2X μ m、X μ m的脊。脊宽为X μ m0脊之间的距离为Xym。脊组以预定方式排列，使得脊沿行放置，其中每行包括两个长度交替的脊行的第一种类型包括长度为Χμ m和4Χμ m的交替脊。行的第二种类型包括长度为2Χμπι和3X ym的交替脊。脊的整体图案类似于鲨鱼皮结构。下面将结合实例描述其它优选的结构。IV.在成形的3D表面上合成本发明的生物相容性形貌改进表面的方法。可通过多种生产技术制备对ES细胞有生物相容性的容器的表面，例如一种或多种下列技术-印模压印(Dieimprinting)通过使用硬质模(例如SiC或SiN模)可在其它硬质材料上直接产生图案，像通过压印的植入金属。作为原版的印模，通常通过结合电子束蚀刻法和反应性离子蚀刻法来制备。已经证明，可将宽低至40nm的大批纳米结构印制在像铝一样的软金属上(S. W. Pang, Τ. Tamamura, Μ. Nakao, Α. Ozawa, H. Masuda, J. Vac. Sci. Technology B 16 (3) (1998) 1145)。更准确地讲，当在像Al、Ti、钛合金、不锈钢、Ta等一样的其它硬质基底上压印时，需要在像SiC或SiN —样非常硬的材料上制成印模图案，否则印模将受损，甚至遭破坏。印模压印当然还可用于像聚合物一样较软的材料。因为像SiC 或SiN 一样的材料难以干蚀刻，因此需要制备包含例如Cr而不仅仅是光致抗蚀剂的蚀刻掩模。掩模可按以下方式制备在耐蚀膜上经电子束蚀刻然后显影(通常在乙酸盐等有机溶剂中)来产生横向图案。这使得耐蚀膜图案留在表面上。耐蚀膜图案用约IOOnm Cr层的 PVD沉积物覆盖，并使用标准耐蚀膜脱膜剂溶解耐蚀膜而最终揭开。硬质印模材料的干蚀刻可以在反应性离子蚀刻系统中进行。结构的厚度受离子蚀刻时间控制。Cr掩模最终可在硝酸铈水溶液中去除。此时硬质印模已准备好在合成生物相容性形貌改进表面的表面上压印。印模可通过液压压制在表面的选定区域上，从而将微米图案和纳米图案印在生物材料的选定区域上。施加的压力通常可为几公吨持续10-30秒钟。可通过使印模大小的区域连续图案化来使若干区域图案化。印模大小通常为10x10mm2直到40x40mm2。这种微米印刷和纳米印刷方法非常适于在例如Ti、钛合金、钽或不锈钢产生的成形3D植入物上的选定区域图案化。当然它还可用于不太硬的材料，如聚合材料/涂料。-通过滚动印模压印。该方法基本上与印模压印相同，然而，这里的印模不是扁平的而通常是一个圆筒。这种印模滚筒是通过上述印模压印中所述的光刻法或电子束蚀刻法 /反应性离子蚀刻法进行微米结构化和纳米结构化的。考虑弧形表面，需要修改设置。此时可将滚筒印模通过液压压制在植入物的表面，而将印模滚筒压在生物材料的选定区域并在上面滚动，从而压印出微米和/或纳米结构。植入物材料在此同样像Ti、Ti-合金、钽或不锈钢一样可以是硬质的，但是并非必需如此，因此该方法也适于例如聚合物。-通过胶体蚀刻法图案化在此，通过使胶体微粒(例如聚苯乙烯或铁蛋白)沉积而使表面纳米图案化是可行的，这类似于近程有序图案。这些微粒可以用作例如制备柱的蚀刻掩模、在表面上制备突出物的形貌模板或例如纳米金属簇的沉积(例如通过铁蛋白的金属中心)。-通过超短激光脉冲的激光图案化该项技术可用于高精密图案化。特别是烧蚀工艺强的非线性导致材料切除有界线清晰的阈值，且这已被用来证实甚至衍射极限以下的 g 丰勾的？ (P. P. Pronko, S. K. Dutta, J. Squier, J. V. Rudd, D. Du, G. Mourou =Optical Communication 114, (1995)106)。-通过超短激光脉冲的激光图案化还可与石英球的预沉积联用(K.Vestentoft， J. A. Olesen,B. H. Christensen,P. Balling =Appl. Phys A80, (2005)493)来制备大阵列的纳米大小的孔。更准确地讲，将石英球层沉积在表面上通常但并非一定产生密集的阵列。通过超短脉冲的未聚焦激光束扫描具有石英球的表面，有可能产生大面积的平行结构，因为石英球用作聚焦激光束的独立透镜。-激光扫描束干涉蚀刻法(InterferenceLithography)这种低成本方法可用于在大的表面面积上制备周期和准周期及空间相干图案。该方法利用两个或更多个相干平面波阵面之间的干涉(S. Kuiper7H. van Wolferen7G. van Ri jn, Journal of Micromechanicsand Microengineeringll(1), (2001)33)。V.用于培养组织或细胞的包括具有微米级表面结构的暴露表面的装置图9图示具有微米级结构暴露表面的组织培养皿的剖视示意图。培养皿301包括具有底部303和侧壁302的向上开口的容器。在使用时，上表面304暴露于细胞培养物或组织，从而为培养物提供微环境。在本发明的实施方案中，暴露表面304具有选定用以促进本文所述的预定细胞功能的微米级形貌结构。可用以下化合物例如通过热压印或通过注射成型，或者通过本领域已知的和/或本文所述的任何其它合适的方法由合适的印模或蓝图产生大量的这类表面例如聚合物，如聚苯乙烯、不同类型的聚己酸内酯、聚甲基丙烯酸甲酯、 硅酮包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)、聚乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯醇、透明质酸型聚合物、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸丁二醇酯、甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、mr-I T85、mr-I 7030、聚(双(三氟乙氧基)磷腈 (poly (bis (trifluoroethoxy)phosphazenes)、天然聚合物包括修饰多糖(例如淀粉、纤维素和脱乙酰壳多糖)及上述化合物的混合物和共聚物。表面304可以是底部303的上表面或位于培养皿的底部303上方的独立组件(例如圆盘)的上表面。例如，这类组织培养皿 /培养瓶或具有被选用来支持未分化状态的胚胎干细胞生长的结构的任何表面可用来使大量胚胎干细胞生长，其在稍后的发育中可被诱导分化成所需要的细胞类型。一旦分化成特定的细胞类型，则这些特定的细胞类型可用于药物筛选和/或细胞替代疗法。表面304还可以单独的组织培养塑料制品的形式提供，其经过改进以在表面上显示特定的结构或这些结构蓝图。例如，单独的组织培养塑料制品可以是可移动地插入培养皿301中。在这方面，术语组织培养塑料制品是指包括可以用来制备可用于细胞培养中细胞的体外生长的表面的任何聚合物/金属涂料/材料。
实施例实施例1包含测试区的13x3钽阵列的BSSA圆片的制备厚度为525士25 μ m的单面抛光硅片提供了用于生物相容性材料制备的底层。圆片为η型圆片，电阻系数为l-20ohm cm。按照下列方案，在SF6/02放电下，通过标准光刻法和反应性离子蚀刻法将微米型图案印制在硅片的抛光面上1.圆片用氢氟酸缓冲液(BHF，BHF是浓HF (49% )、水和缓冲盐、NH4F的溶液，比率约1 6 4)预蚀刻30秒钟，然后在氮气流下干燥，和2.圆片然后用 1. 5μπι厚的光致抗蚀剂AZ5214(Hoechst Celanese Corporation, NJ，US，化学组成可参见由Hoechst Celanese Corporation提供的材料安全数据表 (MATERIAL SAFETY DATA SHEET, MSDS))层旋涂。于约 90°C预烘干 120 秒钟，和3.在AL6-2型EVC整直器中，将涂覆光致抗蚀剂的圆片通过合适的掩模暴露于紫外线5秒钟，使之显影50-60秒钟，然后于120°C后烘1分钟，和4.然后将涂覆光致抗蚀剂的圆片图案化用BHF短暂蚀刻约30秒钟，然后以约 0. 30 μ m/分钟的速度进行反应性离子蚀刻(RIE)，用丙酮脱去耐蚀膜接着进行RCA清洗。 RCA清洗过程相继采用的三个主要步骤用5 1 IH2O H2O2 NH4OH溶液(SCl)除去不溶性有机污染物。使用稀的50 IH2O HF溶液，除去由于(I)所致而可能蓄积金属污染物的薄的二氧化硅层。使用6 1 1 H2O H2O2 HCl的溶液(SC2)除去离子和重金属原子污染物。5.图案化圆片然后与热生长于1000°C 15分钟的20nm SiO2层一起通过干氧化而钝化。6.通过溅射沉积将250nm钽层沉积于图案化圆片的表面。制备包括168结构化正方形的圆片，且一个对照非结构化正方形作为测试区，其中各区都具有一个特定的横向形貌，按照实施例1制备指定结构A_K[图8A-K]。结构图案 A-J中的每一个用圆片上的16个正方形表示，但具有用(X，Y)规定的不同尺寸。对结构图案A的原理进行了说明。K结构用不同尺寸的8个正方形表示，所述尺寸以参数T限定。X、 Y和T的单位为μπι。按照这些规定参数制备圆片，其中横向形貌的深度规定为0.6μπι、 1· 6μπι禾口 2· 4μπι。· “ΑΧ/Υ”图3所示的行结构。该结构包括宽X(ym)的槽41和宽Υ(μπι)的脊 42。因此，图3的行结构只沿一维具有微米大小特征。在实施例1中，区域Α(2，2)包括槽宽 2 μ m和脊宽2 μ m的行结构，区域A (4，4)包括槽宽4 μ m和脊宽4 μ m的行结构，区域A (4， 2)包括槽宽4 μ m和脊宽2 μ m的行结构。ZBXzT':图4所示的正方形-孔结构，所述结构包括尺寸为Χ( μπι) χ X(ym)的正方形孔/凹穴51，其间距为X+Y，即脊网52宽为Y。因此，图4结构在测试区表面的平面中具有二维数的微米大小特征。在实施例1中，区域B (4，4)包括尺寸4μπιΧ4μπι和间距8μπι 的正方形孔。· “ΚΧ/Υ” 图5所示的包含被脊分隔开的长方形孔/凹穴的结构。该结构包括长方形孔61，尺寸X(μ m)χγ(μ m)，被宽为X(ym)的脊62分隔开。ZDXzT':包含图6所示的突出物/柱的结构。该结构包含具有正方形横截面的突出物/柱71，尺寸为乂&111)1乂&111)，间距为乂+￥。因此区域0(2，4)包括柱尺寸为2 μ mx2 μ m 和间距为6 μ m的正方形-柱结构。*“CX”:图7所示的正方形-孔/柱结构。该结构具有棋盘外观，孔81和突出物/ 柱82，两者都具有尺寸为X ( μ m) Χχ ( μ m)的正方形的形状。要了解的是，上述制备方法还可适用于具有其它形式和测试区尺寸以及其它结构类型的圆片。同一制备方法可用于许多不同的圆片，其中测试区和特定表面结构的布局由圆片所暴露的掩模决定。实施例2用于促进多能小鼠胚胎干(EQ细胞生长的生物相容性表面的鉴定使未分化的鼠ES细胞在界线清晰的致密集落中生长(图10)。当集落变平并展开时，ES细胞非常可能已开始分化。因此，集落形态是明显的，且是普遍认可的多能性标志物。非常确定的胞内多能性标志物的实例是转录因子0ct4和Nanog以及碱性磷酸酶(AP)。以1.3-5xl06个细胞/plO培养皿的密度将ES细胞(KH2细胞和CJ7细胞)接种在按实施例1制备的钽BSSA圆片上(图11)。将细胞在5% C02、90%空气湿度和37°C的条件下培养3天。使细胞在补充了 15(% 03、21111谷氨酰胺、5(^/1111青霉素、50 μ g/ml链霉素、 非必需氨基酸、ΙΟΟμΜ β-巯基乙醇和核苷但不存在饲养细胞层的DMEM中生长。此外，ES 细胞生长培养基补充了白血病抑制生长因子(LIF) 1000U/ml,以助于维持ES细胞的未分化表型。培养3天后，对细胞进行碱性磷酸酶(AP)活性染色(蓝色)，这为未分化鼠ES细胞提供阳性标志物。对于两个细胞系，不同结构之间的集落形态存在明显的差异(图12)。总的来讲， 在所述结构上，CJ7细胞比KH2细胞容易分化，但却有着相关的共同特征在2. 4μ m结构高度的Fl. 2上形成的集落形成界线清晰的具有AP活性的圆形集落。在相同的结构高度上， F4. 1上的集落易变平并损失AP染色强度。生长在K8结构上的集落是长形的，并且AP染色强度减弱。尤其对于CJ7细胞，这种效应随结构高度降低而增强。对于其它结构，当结构高度降低时集落数减少。结构高度降低还趋于增加集落大小和减少AP染色。两个细胞系对 NS正方形的反应不同CJ7集落开始分化，而KH2集落与其在结构化正方形上的生长形态相比，范围小、界线清晰且数目减少。由于分析了大量的生物相容性结构，因此使用集落数自动计数对ES细胞生长模式进行了量化。根据集落形态和AP染色强度，对该方法与手工计数进行了比较。未分化KH2ES集落的手工和自动计数的比较(图13)表明，自动计数一向过高估计集落数。然而，(自动计数数目)/(手工计数数目)之比相对稳定1. 5 士 0.3。显然自动计数检测在各个结构上发育的集落数的特征与用手工计数检测的那些特征一致。对于CJ7 细胞，手工计数和自动计数之间有同样良好的关联性。这就证实了自动计数方法适于鉴定产生例如高集落数的生物相容性结构。此外，计算输出还估算了被未分化ES细胞集落覆盖的总面积(ES细胞集落总面积)和被细胞覆盖的总面积(DAPI总面积)。为此，将ES细胞用4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]染色，DAPI是一种与DNA牢固结合并且能跨过完整细胞膜的荧光染料，因此用于对活细胞和固定细胞进行染色。被DAPI染色的细胞用紫外线激活后通过荧光显微镜检测。当DAPI与双链DNA结合时，其最大吸收位于358nm，其最大发射位于461nm，看上去为蓝/青色。然后使用自动计数对从图11描述的实验中获得的结果进行量化。由于在不同结构高度上集落数的变化颇大，因此对于图14的不同高度，有必要应用不同的色度，其中色度越暗，集落数就越大。集落数一般随X尺寸的减小而增加。在其中尺寸为Υ = 2μπι或 4μπι且X=Iym或2μπι的结构上，获得最大集落数，而当Y=I且Χ = 2μπι、4μπι或6μπι 时获得最小的集落数。所有K结构上观察到低水平的集落数。不同的受测生物相容性表面结构的作用还可参见图15。具有小的最小横截面径 (小X)的突出物的表面结构产生最大的ES细胞集落数，而较大X值的突出物产生较少的集落数。此外，该图表明，其中尺寸Y = 2 μ m或4 μ m的结构产生最多的集落数，这取决于X 的值。因此就Y值(结构中柱间的距离)而言，我们鉴定出集落形成的局部最优值。据推断，在X尺寸小于1 μ m的结构集落数将进一步增加。观察图15发现，对未分化ES细胞增殖的不利条件与少于1个突出物/65 μ m2的表面结构和其中突出物的面积超过表面总面积25%的表面结构有关。因此得出结论，未分化ES细胞的最佳增殖与满足这两个条件的表面结构有关。图16图示结构高度与CJ7和ΚΗ2细胞系的ES细胞集落数之间的关系。垂直轴上给出的是整片圆片的ES细胞集落总数。集落数随结构高度明显增加，这种效应可见于这两个细胞系。全部数据分析显示，X = 1、Y = 2或4和结构高度2. 4 μ m的结构产生最大集落数。
实施例3在生物相容性表面上进行连续传代期间保持小鼠胚胎干(EQ细胞的多能性和生长形态之前的实施例证实，具有不同的表面结构的生物相容性表面可用于促进高的ES 集落数(例如结构F1. 2)或促进低的ES集落数(例如结构F4. 1)。在CJ7和KH2ES细胞的连续传代中研究了这些结构对ES细胞生长的持续作用。在每次传代后，将ES细胞固定， 并使用0ct4和Nanog的特异性抗体分析0ct4和Nanog表达。ES细胞CJ7和KH2分别在 Fl. 2 (F1. 2的尺寸为X = 1 ;Y = 2)或F4. 1 (F4. 1的尺寸为X = 4 ;Y = 1)上传代6次和10 次后，仍表达多能性标志物。在最后一次传代中，CJ7和ΚΗ2细胞还表达碱性磷酸酶。在传代期间，在Fl. 2结构上产生的ES集落保持致密和界线清晰的形态，在F4. 1形成的集落也保持其形态。总之，这些结果表明所述结构对ES细胞集落形成的作用在传代期间得到保持。实施例4通过在生物相容性表面上连续传代获得的小鼠胚胎干(EQ细胞的种系潜力表示用于ES细胞种系传递方案的步骤的示意图见图18。在体外连续传代后，采用图18描绘的胚泡注射方案测定了 CJ7ES细胞的种系潜力。使CJ7细胞在以下之一中进行传代生物相容性表面结构Fl. 2、F4. 1 ；涂覆明胶的培养板；或补充了饲养细胞的培养基 (按照实施例幻。然后将得自传代后收获的各个细胞群的CJ7细胞注射入胚泡中，将胚泡植入代孕母体中。在其子代嵌合雄性幼仔中进行选择用于育种。在Fl. 2或在包含饲养细胞的培养基上传代的CJ7细胞保持种系潜力，而在F4. 1或涂覆明胶的培养板上传代的细胞未观察到种系潜力，这表明至少在F 1. 2结构上传代的细胞保持种系能力。实施例5用于促进小鼠胚胎干(EQ细胞均一分化性生长的生物相容性表面的鉴定观察到体外生长的ES集落变平和展开，这就表示ES细胞分化(图10)。因此，集落形态是明显的，且是普遍认可的多能性和分化的标志物。基于DAPI总覆盖面积减去属于 ES集落的面积的分化指数，提供由给定生物相容性结构诱导的ES细胞分化程度的测量值。因此，分化指数被用来测定按照实施例2生长在BSSA圆片上的ES细胞。图20 给出测定的分化指数，其中较暗的色度相当于较高的分化指数。对于受测试的所有类型的表面结构，尺寸X值的增加导致分化指数增加(X = 6 > X = 4 > X = 2 > X = 1)。同样， Y = 1的结构和K结构具有相对高的分化指数，分化指数大致上随结构高度的降低而增加 (0. 6 μ m > 1. 6 μ m > 2. 4 μ m)。进一步观察到，产生高集落数的表面结构具有低分化指数， 且低集落数的结构具有高分化指数(图21)。生长在高度为0. 6 μ m的结构上的细胞获得最低集落数和最大分化指数。实施例6在生物相容性表面上培养人胚胎干细胞的研究引言人胚胎干(hEQ细胞是多能细胞，来源于人胚泡的内细胞团，一般在小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)饲养层上培养。使用细长的巴氏吸管通过手工显微切割hES集落，随后接种在新鲜的mEF饲养层上而常规实现未分化细胞的传代。这种方法非常费力而且耗时，并
27不适于大规模的细胞培养。开发其中hES细胞可以在动物饲养层不存在时也能扩增的培养技术是在人细胞疗法和高通量药物开发中使用hES细胞的先决条件。为了满足这些需要，将hES细胞培养在形貌结构化表面上，以确定这些表面是否可支持hES生长，培养在这些表面上的hES细胞是否维持其多能性，以及在后续传代后当培养在生物相容性表面上时hES细胞是否继续生长并维持多能性。方法根据之前通过BioSurface Structure Array (BSSA)圆片对不同表面的筛选(参见图1)，对于mES培养，选择4种表面培养hES细胞，即F (1，2)、F (1，4)、F (4，1)、G (4，1)， 其中各微结构化表面特征(突出部分)的高度/深度为2.4μπι。初步实验已经表明，hES 细胞(King' s College London细胞系)在表面F(1，4)和F(l，2)上生长得更好，因此集中研究这两个表面。使未分化的hES细胞(KCL-OO》培养物在含有10% ES级FBS的培养基中于小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)饲养层上维持。从mEF饲养层手工切割未分化的集落， 将约5-6片接种至每个生物相容性表面上。结果细胞附着首先，检查细胞确定它们是否可附着在表面上。为此，将未分化的hES细胞层手工切成小片，并接种在相应的表面上。结果发现细胞次日能够很好地定居在表面F(l，4)和 F(l, 2)两者上。两种表面的附着能力的比较表明，与表面F(l，2)相比，表面F(l，4)上附着较多的细胞集落。此外，还在KnockOut血清替代品(KOSR)而不是血清中对细胞集落进行了测试。为此，将hES细胞集落在KOSR的mEF饲养层上培养4次传代，然后转移至F(1，2) 和F(l，4)表面上。结果发现，次日细胞集落无法有效地在表面F(l，4)或F(Id)上定居。 然而，与表面F(Id)相比，相对较大量的集落附着在表面F(l，4)上。这就表明，表面F(l， 4)的细胞附着比表面F(l，2)的相对更有效，但是当培养在血清中时，细胞附着在表面上的情况比在KOSR中要好得多。细胞生长为了确定hES细胞是否可在表面上增殖，将细胞集落接种在表面上，并在2ml含有 10%胎牛血清(FBQ的hES培养基中培养。每隔一天更换培养基，并且在此期间补充lml。 结果发现，在FBS血清存在下，细胞集落在两个表面F(l，4)和F(Id)上都生长得很好。如图30和图31所示，hES集落能够在表面上扩增。各集落的大小一般每天增加 30-40%。生长在表面的hES细胞集落的形态与生长在Geltrex (Invitrogen)上的细胞集落十分相似(图32)。hES细胞多能性的维持为了确定hES细胞是否能够在表面上维持其多能性，使细胞生长1周，然后在4% PFA中固定，并用抗0ct4(0Ctamer-4)抗体染色。图像见图33和图34。所有的细胞核用DAPI染色。0ct4是位于未分化hES细胞核上的转录因子。图33 和图34显示50-70%的细胞在表面上培养1周后对0ct4呈免疫阳性。这就表明，大多数细胞能够维持其在表面上的多能性。小结综上所述，hES细胞在特征高度/深度为2. 4μπι的微表面F (1，4)和F (1，2)可以
28生长得非常好，并维持其多能性，正如0ct4表达所证实的一样。细胞可通过胶原酶IV消化而传代，然而这会妨碍细胞生长。本发明的第二方面。这个方面涉及需要成功整合到骨组织以获得良好临床效果的植入物。在过去的几十年间这方面已取得了重大的进展和结果，但是植入物随时间松脱仍是长期关节置换是否成功的重大问题。具有可促进成骨细胞中骨桥蛋白和骨钙蛋白表达的表面的植入物或装置可根据其应用而改进治疗结果。因此，本发明提供生物相容性材料或结构，其通过骨形成细胞(包括成骨细胞)的骨桥蛋白和骨钙蛋白表达而支持骨生成。矫形植入物具有有限的寿命，当植入物和骨组织之间的附着不良时可导致植入物脱位。因此，本发明还提供植入物表面，其支持成骨细胞表达骨桥蛋白和骨钙蛋白，从而改进植入物的生物相容性。本发明基于这样的认识，即指导基因表达、生长和/或分化的细胞功能在很大程度上受细胞微环境的影响。因此，一般认为体内和体外骨细胞的基因表达可取决于细胞可附着的合适结构的提供。具体来说，本发明认识到，细胞微环境的表面二维和三维构造或形貌是上述过程的决定性因素。有无数不同的可能的微环境。因此，一方面，本发明涉及生物相容性材料的提供，生物相容性材料的表面形貌产生可促进成骨细胞表达骨桥蛋白和骨钙蛋白并导致植入物更好地整合至其余骨的特定微环境。可受表面形貌影响的其它细胞功能包括细胞生长、扩增、分离、迁移、分化、去分化、胞内外组构等。由于蛋白质和细胞的尺寸范围为纳米或微米，因此这些是与提供生物相容性材料的问题有关的长度尺度。I.证实生物相容性性质和本发明的生物相容性材料促进细胞功能(例如促进矿化)的方法。可采用提供不同候选形貌结构的筛选工具/测定法，通过具有不同的表面形貌筛选材料来鉴定本发明的生物相容性材料或结构。具体地讲，应用例如茜素红染色(实施例2)、von Kossa染色(von Kossa, J(1901) “ Ueber die im Organismus kuenstlich erzeugbaren Verkalkungen. “ Beitr Pathol Anat AIIg Pathol四163-202)、异位成骨(实施例3)和体内骨生成/骨长入(实施例4)等矿化测定法，提供了表明本发明的生物相容性材料的性质和用于选择促进矿化的合适形貌结构的工具。 适于筛选形貌结构的筛选工具的实例包括所谓的BioSurface Structure Array (BSSA)圆片。图1是图示这类BioSurface Structure Array圆片的实例的顶视图。 BSSA圆片1包含60个测试区。多个测试区2留作“空白”，即不被加工成具有结构化表面。 因此，测试区2的表面基本上是平整的。因此在具有BSSA筛选工具的每个平行筛选试验中都固定包括了对照实验。规定为Si，S2. . .，S54的其余测试区包含如本文所述的各个结构化表面。测试区是正方形，尺寸lOmmxlOmm。用作鉴定诱导/提高细胞功能(例如矿化、生长和基因表达)的结构的筛选工具的圆片可通过多种生产技术制备。其制备方法的实例包括一种或多种本领域已知的下列技术·光刻方法光刻法是其中将几何形状/图案从光掩模转印至待结构化的表面 (例如圆片的表面)上的已知方法。已知具有范围为约1微米至IOOnm以下的最小横向
29特征尺寸的光刻设备。光刻法参见例如S. M. Semiconductor Devices, Physics and Technology，第■^片反，John Wiley & Sons 2002，第 12 M Lithography and Etching;以及载于 Plummer, Deal, Griffin :Silicon VLSI Technology, Fundamentals, Practice, and Modeling, Prentice Hall 2000,第 5 章Lithography。·电子束蚀刻法基本上，可采用电子束蚀刻法以与光用于光刻法中完全一样的方式来暴露光致抗蚀剂。电子束蚀刻法具有高达约5nm的特别高的分辨率。·热压印热压印使用主印模将微米和纳米级结构压印在聚合物基底上。该方法使用各种聚合物材料可供主印模产生许多完全图案化的基底。热压印提供低成本、多用途的制备方法，非常适于从研究与开发应用到大量生产用途的BSSA的制备。可获得高长宽比与极高均勻度的大型圆片(例如8英寸或12英寸圆片)上的微米和纳米级结构。20nm以下的特征尺寸是可能的。可以通过例如电子束蚀刻技术来制备主印模。 可能涉及生产生物相容性材料或结构的生产步骤或工艺的其它实例包括纳米压印蚀刻法、激光消融、化学浸蚀、等离子喷涂、磨料喷射、雕刻、刮擦、微细加工等。图2图示图1圆片的剖视图。图加图示标为A-B直线的完整圆片宽度的横截面。 图2b图示一个测试区一部分表面的放大图。圆片1具有包括图案化衬底层21 (例如硅层) 和表面层23的多层结构。圆片的表面是图案化的(例如通过光刻法)，以在各个测试区Si， S2，...，SM表面上提供不同的图案。结构具有深度/高度H。在光刻法中，高度H是可通过蚀刻过程控制的。图案化表面被一层薄的二氧化硅层22和/或以下不同生物相容性材料的表面层23覆盖例如钽或任何其它金属、金属氧化物、金属氮化物、金属碳化物、金刚石、类金刚石碳、半导体、半导体氧化物/氮化物、绝缘体、聚合物、共聚物。测试区之间有无结构的“空白”边区，即边区未被加工成具有结构化表面。在这种情况下，空白边区宽为 0.3mm。空白边行有助于结构的直观排列和鉴定。空白边还用作紧邻各测试正方形的小的对照表面。注意图2是示意图，并未按比例绘制。尤其是垂直尺寸可放大以提高可读性。II.本发明的生物相容性材料的化学组成生物相容性材料或结构的实施方案可呈多种形式，例如-医学植入物或用于制备医学植入物的生物相容性涂层材料，-具有暴露于细胞培养物的表面的组织培养皿/培养瓶，其中暴露表面具有支持所需细胞功能(例如未分化状态的神经元或胚胎干细胞的生长或分化)的结构，-组织培养物表面或例如已被改进以呈现这些结构或表面上这些结构的蓝图的组织培养塑料制品。在这方面，组织培养塑料制品是指可用于制备细胞培养体外细胞的生长表面的任何聚合物。生物相容性材料或结构的实施方案可包含衬底层和任选表面层。用于制备生物相容性材料或结构的合适原材料包括任何半导体(掺杂或未掺杂)、单一金属、金属氧化物、金属氮化物、合金、陶瓷、聚合物、共聚物、复合材料、递药系统、 具有生物活性分子的聚合物、其它生物活性化合物或其任何组合。在本发明的实施方案中，表面层包含有足够的生物相容性以提高成骨细胞矿化的材料。表面层的实例包括金属表面沉积物，例如钽、钛、Ti-Al-V合金、金、铬、金属氧化物、 半导体氧化物、金属氮化物、半导体氮化物、聚合物、生物聚合物或其它合金。植入物的优选
30的表面组成成分包括钽或钛。在一些实施方案中，生物相容性材料或结构包含其它组分，例如一种或多种可沉积或吸附在所述材料或结构的暴露表面或表面层上的生物活性化合物。例如所述化合物可选自抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、生长激素、有机化合物和无机化合物。优选选自81^丄6 样36 -0的生长激素吸附于生物相容性材料的表面或与生物相容性材料的表面结合。III.本发明的生物相容性材料的结构性质生物相容性材料或结构的全部或部分表面(其可呈上述的多种形式)包含在由该材料或结构的表面界定的平面内一维或多维的微米级特征。本文使用的术语微米级和微米大小是指在约Iym和约1000 μ m范围内的长度尺度。本文使用的术语纳米级是指在约Inm 和约lOOOnm、特别是在约Inm和约IOOnm范围内的长度尺度。在本发明的实施方案中，特征是结构/形貌特征，例如由生物相容性材料的表面延伸出来的突出物。生物相容性材料的表面可包括在至少一个横向方向上具有水平尺寸的微米级特征，该水平尺寸基本上在与表面平行或至少基本上与表面正切的方向上测量。该水平尺寸选自以下的间距介于约Ιμπι和约20 μ m之间、介于约1_10μπι之间、介于约10-20 μ m 之间、介于约1μπι-2μπι之间、介于约2μπι-4μπι之间、介于约4μπι-6μπι之间、介于约 6口111-8“111之间、介于约8“111-1(^111之间、介于约10-12 μ m之间、介于约12-14 μ m之间、介于约14-16 μ m之间、介于约16-18 μ m之间、介于约18-20 μ m之间。在本发明的一个优选的实施方案中，突出物具有最小横截面径为1. 0 μ m-2. 0 μ m 的横截面。生物相容性材料的表面上微米级特征的分布优选是沿一个或多个横向方向呈周期性的，可通过具有选自以下一种间隔的横向间距尺寸的周期函数来描述介于约 1 μ m-2 μ m之间、介于约2 μ m_4 μ m之间、介于约4 μ m_6 μ m之间、介于约6 μ m_10 μ m之间、 介于约10μ -16μπ 之间、介于约16μ -20μπ 之间、介于约20μ -24μπ 之间。在本发明的一个优选的实施方案中，在沿至少一维的相邻格点之间的距离介于 2· Ομ 禾P 9· Ομ 之间。任何微米级特征与其最近邻特征之间的最大距离或间隙在至少一个横向方向上具有水平尺寸，其中所述尺寸选自以下的间距介于约0.5口!11-1口111之间，介于约 1μ -2μπ 之间，介于约2μ -4μπ 之间，介于约4μ -6μπ 之间，介于约6μ -8μπ 之间，介于约8μ -10μπ 之间，介于约10μ -12μπ 之间，介于约12 μ m_14 μ m之间，介于约 14 μ m-16 μ m til]。在本发明的一个优选的实施方案中，任何突出物与其最近邻突出物之间的最大间隙的水平尺寸(d ；Y)介于约1. 0 μ m-6. 0 μ m之间。更优选横截面的横截面径约为1 μ m，且任何突出物与其最近邻突出物之间的最小间隙的水平尺寸(d ；Y)约为Ι.Ομπι。微米级特征的周期函数可具有沿一个方向的较小周期或具有在不同方向上的2、 3、10或以上因素的较大周期。生物相容性材料的表面上的任意一个微米级特征可定义为周期性周期结构。因此，周期结构某一特征的水平尺寸可定义为周期形状/函数的周期，即所述结构沿其重复其形状的最短间距的长度。
微米级特征的深度/高度，即其在从生物相容性材料的表面突出出来的方向上的线性尺寸可为纳米或微米级，即结构可具有范围为Inm-IO μ m的高度/深度。在本发明的一个优选的实施方案中，形貌结构的各个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m,优选约2. 4 μ m。任意一种微米级特征的横向横截面优选为几何形状的，例如正方形、长方形、六边形、多边形或星形。特征的顶面或侧面优选基本上是平整的。然而，微米级特征的表面还可包括纳米级特征以在微米和纳米两种尺度上获得形貌协同效应。这可以通过例如化学浸蚀(例如通过NaOH或柠檬酸)、离子蚀刻、胶体蚀刻(例如通过聚苯乙烯珠、巴克球或蛋白质)、掠入射物理气相沉积涂层、CVD涂层或等离子喷涂获得。生物相容性材料的表面上的特征可具有相同或不同的形状。优选生物相容性材料的表面上的特征为几何形状(例如正方形、长方形、六边形、星形或多边形)。在一些实施方案中，特征的横截面形状可从正方形、圆形等简单的几何形状得到， 通过例如修改正方形各个角。这类修改的实例包括切掉和/或弄圆各个角。因此，这类形状一般是正方形、圆形等，但是它们稍稍偏离绝对的正方形或圆形形状，从而引入另外的角和/或改变各边在每个角相交的角度。一般来说，二维周期结构的定义可包括格子单位和位于格子单位中的重复单元， 所述格子单位在所述表面的平面上具有预定形状(例如正方形、长方形、六边形等)；所述重复单元定义在格子单位中的详细结构(基础)，例如孔或突出物，例如正方形柱、多边形柱、环形柱、棱锥体等。格子单位限定的位置定义了重复单元距离，而重复单元定义了预定的形状和尺寸。这些格子单位位置可由相应的二维向量界定。因此，网格结构由格子单位沿表面界定的二维方向平移而形成，特别是相应的多个格子单位尺寸。在一个实施方案中， 每个特征的中间位置可定义为向量v = nlVl+n2V2界定，其中V1和V2在表面上是线性独立向量，H1和n2都为整数。在一些实施方案中，每个特征的中心位于二维网格(例如具有预定网格常数的六边形、长方形或正方形网格)的格点上。在一些实施方案中，全部特征覆盖这类网格的全部格点，而在其它实施方案中，不是网格的全部格点都被覆盖。例如，在一些实施方案中，在每隔一行的格点中，每隔一个格点可被特征覆盖。在其它实施方案中，在每第二、第三、第四或更高次行中，每第二、第三、第四或更高次的格点留为空白。在一些实施方案中，形貌结构可包括大量不同的特征，例如规则排列的多种不同的特征，例如周期性图案，例如交替行排列的2个、3个或更多个不同特征。这类图案的实例包括包含以交替行排列的具有正方形横截面的特征和具有圆形横截面的特征的结构。在一些实施方案中，特征排成行和/或排。在一些实施方案中，每行中的特征具有相同的间距，而在其它实施方案中，间距可在整个行中和/或在行与行间有所不同。同样， 所有行的行与行间的距离可以相同，或行与行间有所不同。在一些实施方案中，某一行中的一些或所有结构可相对于同一行中相应的近邻行结构旋转。在一些实施方案中，某一行中的一些或所有结构可相对于其相邻行中相应的近邻结构旋转。在一些实施方案中，在所有横向方向上的特征的水平尺寸都介于Iym和约10 μ m 之间。这类特征的实例包括具有大致为正方形或圆形横截面的突出物。在其它实施方案中，
32在一个方向上的特征的水平尺寸介于Iym和约IOym之间，而在另一方向上的水平尺寸较大。这类特征的实例包括长形的脊、棱或孔。脊的侧面基本上可以是平滑的，或者它们可包括其它的特征，例如规则顺序排列的突出物和/或凹穴。因此，在一些实施方案中，这类脊可具有类似于一排正方形、圆形等的外观，其与其相应的邻居会合/互相连接形成连续的脊。在一些实施方案中，形貌结构特别包含在所有横向方向上具有介于Iym和约 10 μ m的水平尺寸的特征和在仅一个方向上具有介于1 μ m和约10 μ m之间的水平尺寸的特征。这类结构的实例包括大致为正方形和/或圆形特征的行，其中各行被长形脊分隔开来。示形貌结构实例的顶视图，形貌结构具有大致呈圆形、正方形或长方形横截面的突出物/柱的形式的特征。每个特征在至少一个方向上具有水平径X，相邻行和列中特征之间的间隙距离表示为Y。在图8a、c、e、f和i中，Y等于任何特征与其最邻近特征之间的间隙尺寸，相当于间距X+Y。在图^5b、d、g、h和j中，与最邻近特征的间隙距离对于不同特征是不同的，以图26b的特征1201、1202和1203为例说明。特征1201以特征1202 为其最近邻特征；因此间隙尺寸为Y。然而，特征1203以特征1201和1202为其最近邻特征，具有稍稍不同的间隙尺寸d。因此，在图8b、d、g、h和j中，行与行间的间距不同。在包括特征1201的行中，间距为X+Y，而在包括特征1203的行中的间距为2(X+Y)。在图8的实例中，每个特征的中心位于网格常数为a和b的二维长方形网格相应的格点上，见图8a和b。然而，在图8a-e、h-i中，不是所有格点实际上都被特征覆盖，而在图8f和k中，所有格点都被特征覆盖。在图8a、c、e、f和i中，网格是网格常数为a = b =(X+Y)的正方形网格。在图8b、d、g、h和j中，网格为长方形，网格常数为a = X+Y，b = (X+Y)/2。在图池中，网格常数为3 = 2乂^ = 3.5乂。对于选定的X值和Y值，按照图8a-h 制备了圆片，其中(X，Y) (μπι)选自(X，Y) = (1，1)、(1,2), (1,4), (1,6), (2，1)、(2,2), (2，4)、(2，6)、(4，1)、(4，2)、(4，4)、(4，6)、(6，1)、(6，2)、(6，4)、(6，6)。对于选定的 X 值和Y值，按照图池制备了圆片，其中X(ym)选自X= 1、2、3、4、5、6、7、8。因此，对于图8a、 c、e、f和i的正方形网格，网格上的网格常数a禾Pb为a = b = 2-12 μ m。对于图8b、d、g、 h和j的长方形网格，方向a的网格常数的间距介于2-12 μπι之间，方向b的网格常数的间距介于1-6 μ m之间。对于图8K的网格，网格常数b保持间距在3. 5- μπι之间，且网格常数a保持间距在2-16 μπι之间。为了鉴定上述结构X和Y各自不同的值，将本说明书图8a所示结构称为AX. Y，其中X和Y是指上述X和Y的尺寸。因此，结构AX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中每隔一行的相邻突出物间的间隙尺寸为Y μπι，而其余行中突出物间的间隙尺寸为ΟΥ+Χ) μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μ m0相邻行中的突出物彼此排成一线。同样，图8b所示结构称为BX. Y。因此，结构BX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中每隔一行的相邻突出物间的间隙尺寸为Y μπι, 而其余行中突出物间的间隙尺寸为(2Υ+Χ) μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μ m0间隙尺寸为ΟΥ+Χ) Pm的行中的突出物与其相应的相邻行突出物间的间隙中心排成一线。图8c所示结构称为CX. Y。因此，结构CX. Y包括具有线性尺寸为X μ m的正方形
33横截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中正方形的各边与行/列的方向一致，且其中每隔一行的相邻突出物间的间隙尺寸为Y Pm,而其余行中突出物间的间隙尺寸为(2Y+X) μ m0相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μ m0相邻行中的突出物彼此排成一线。图8d所示结构称为DX. Y。因此，结构DX. Y包括具有线性尺寸为X μ m的正方形横截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中正方形的各边与行/列的方向一致，且其中每隔一行的相邻突出物间的间隙尺寸为Y ym，而其余行中突出物间的间隙尺寸为(2Υ+Χ)μπι。 相邻行突出物之间的间隙尺寸为γ μ m0间隙尺寸为ΟΥ+Χ) ym的行中的突出物与其相应的相邻行突出物间的间隙中心排成一线。图8e所示结构称为EX. Y。因此，结构EX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。圆形突出物行中相邻突出物间的间隙尺寸为Υμπι，而其余行中的正方形突出物间的间隙尺寸为(2Υ+Χ)μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μ m0相邻行中的突出物彼此排成一线。图8f所示结构称为FX. Y。因此，结构FX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。各行内突出物之间的间隙尺寸和相邻行间的间隙尺寸为Y μ m0相邻行中的突出物彼此排成一线。图8g所示结构称为GX. Y。因此，结构GX. Y包括具有直径为Χμ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。圆形突出物行中相邻突出物间的间隙尺寸为Yym，而其余行中的正方形突出物间的间隙尺寸为(2Υ+Χ)μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μ Hi0间隙尺寸为ΟΥ+Χ) μ m的行中的正方形突出物与其相应的相邻行中的圆形突出物间的间隙中心排成一线。图他所示结构称为HX. Y。因此，结构HX. Y包括具有直径为Χμ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。各行内突出物之间和相邻行间的间隙尺寸为Yym。相邻行中的突出物彼此排成一线。正方形突出物与其相应的相邻行的圆形突出物之间的间隙中心排成一线。图8i所示结构称为IX. Y。因此，结构IX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。正方形突出物行中相邻突出物之间的间隙尺寸为Yym，而其余行中的圆形突出物之间的间隙尺寸为(2Υ+Χ)μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为γ μ m0相邻行中的突出物彼此排成一线。图8j所示结构称为JX. Y。因此，结构JX. Y包括具有直径为X μ m的圆形横截面的突出物/柱以及具有线性尺寸为X μm的正方形横截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行为圆形突出物，正方形突出物位于其余行中。正方形突出物行中相邻突出物之间的间隙尺寸为Y ym，而其余行中的圆形突出物之间的间隙尺寸为(2Y+X) μπι。相邻行突出物之间的间隙尺寸为Y μ Hi0间隙尺寸为(2Υ+Χ) μπι的行中的圆形突出物与其相应的相邻行的正方形突出物之间的间隙中心排成一线。
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因此，在上述实例中，最近邻特征之间的最小间隙尺寸为Y ym，最近邻特征之间最小中心-中心之间的距离为Χ+Υμ m。图池所示结构称为KX。结构KX包含多组长方形横截面的长形突出物/脊。脊具有不同的长度，并彼此平行排列。每组的脊排列形成长方形形状，使得每组都包括最长脊作为中脊。中脊的每侧排列了随距中脊的距离增加而逐渐变得更短的一系列脊。因此长方形形状的KX包括一连串的长度为X μπκ2Χ μπκ3Χ μπκ4Χ μπκ3Χ μ 、2Χμπ 、Χ μ 的脊。脊宽为Χμπι。脊之间的距离为X ym。脊组以预定方式排列，使得脊沿行放置，其中每行包括两个长度交替的脊行的第一种类型包括长度为Xym和4X ym的交替脊。行的第二种类型包括长度为2X ym和3Χμπι的交替脊。脊的整体图案类似于鲨鱼皮结构。本发明最优选的生物相容性表面的结构的特征在于包含大量突出物排列在规则二维网格的格点上的纳米和/或微米级形貌结构，其中突出物具有最小横截面径为 Ι.Ομ m-2. Oym的横截面，其中沿至少一维的相邻格点之间的距离介于2. 0 μ m和9. 0 μ m 之间，其中形貌结构的各个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m，优选约 2. 4 μ m0IV.包含本发明的生物相容性材料的植入物按照一个方面，本发明提供用于骨组织植入等的医学植入物，其中植入物表面的至少一部分的特征在于本发明的生物相容性材料，其表面的特征在于对成骨细胞有生物相容性的有界线的周期性微米级形貌结构，在上面第II节和实施例中描述了其形貌结构。本发明的医学植入物包括牙科植入物、矫形假体/植入物、脊柱植入物、骨替代物，其预期可用于治疗骨折、退变性疾病、创伤和癌症。在一个优选的实施方案中，植入物的整个暴露表面或用于制备植入物的生物相容性涂层材料由具有提高成骨细胞表达骨桥蛋白和骨钙蛋白的形貌结构的本发明的生物相容性材料组成。在一个备选的实施方案中，所述暴露表面的一个或多个部分由具有提高成骨细胞表达骨桥蛋白和骨钙蛋白的形貌结构的本发明的生物相容性材料组成。因此，它可通过选择性地提供具有合适表面结构的装置而受控制，所述表面的组成部分应以某种方式起作用(例如矿化)。在植入物将与交错型组织接触的情况下，植入物的其它部分可由其它类型的、可提高例如软骨细胞(chrondrocytes)、上皮细胞的生物相容性的结构制成。还可包括排斥细菌生长的表面。例如牙科植入物应予以考虑。这种植入物由5个不同的表面组成以满足环境变化的需要1.成骨细胞中骨桥蛋白和骨钙蛋白表达最佳，2.结缔组织(成纤维细胞)的最佳生物相容性，3.上皮(上皮细胞)的最佳生物相容性，4.排斥细菌的表面，最后，5.植入人工牙的最佳表面。V.在成形的植入物3D表面上合成本发明的生物相容性形貌改进表面的方法。可通过多种生产技术制备对成骨细胞有生物相容性并提高成骨细胞表达骨桥蛋白和骨钙蛋白的植入物表面，例如以下一种或多种下列技术-印模压印(Dieimprinting)通过使用硬质模(例如SiC或SiN模)可在其它硬质材料上直接产生图案，像通过压印的植入金属。作为原版的印模，通常通过结合电子束蚀刻法和反应性离子蚀刻法来制备。研究显示，可将宽低至40nm的大批纳米结构印制在像铝一样的软金属上(S. W. Pang, Τ. Tamamura, Μ. Nakao, Α. Ozawa, H. Masuda, J. Vac. Sci. Technology B 16 (3) (1998) 1145)。更准确地讲，当在像Al、Ti、钛合金、不锈钢、Ta等一样的其它硬质基底上压印时，需要在像SiC或SiN —样非常硬的材料上制成印模图案，否则印模将受损，甚至遭破坏。印模压印当然还可用于像聚合物一样较软的材料。因为像SiC 或SiN—样的材料难以干蚀刻，因此需要制备包含例如Cr而不仅仅是光致抗蚀剂的蚀刻掩模。掩模可按以下方式制备在耐蚀膜上经电子束蚀刻然后显影(通常在乙酸盐等有机溶剂中)来产生横向图案。这使得耐蚀膜图案留在表面上。耐蚀膜图案用约IOOnm Cr层的 PVD沉积物覆盖，并使用标准耐蚀膜脱膜剂溶解耐蚀膜而最终揭开。硬质印模材料的干蚀刻可以在反应性离子蚀刻系统中进行。结构的厚度受离子蚀刻时间控制。Cr掩模最终可在硝酸铈水溶液中去除。此时硬质印模已准备好在用于合成生物相容性形貌改进表面的表面上压印。印模可通过液压压制在表面的选定区域上，从而将微米图案和纳米图案印在生物材料的选定区域上。施加的压力通常可为几公吨持续10-30秒钟。可通过使印模大小的区域连续图案化来使若干区域图案化。印模大小通常为10x10mm2直到40x40mm2。这种微米印刷和纳米印刷方法非常适于在使用例如Ti、钛合金、钽或不锈钢产生的成形3D植入物上的选定区域图案化。当然它还可用于不太硬的材料，如聚合材料/涂料。-通过滚动印模压印。该方法基本上与印模压印相同，然而，这里的印模不是扁平的而通常是一个圆筒。这种印模滚筒是通过以上印模压印中所述的光刻法或电子束蚀刻法 /反应性离子蚀刻法进行微米结构化和纳米结构化的。考虑弧形表面，需要修改设置。此时可将滚筒印模通过液压压制在植入物的表面，而将印模滚筒压在生物材料的选定区域并在上面滚动，从而压印出微米和/或纳米结构。植入物材料在此同样像Ti、Ti-合金、钽或不锈钢一样可以是硬质的，但是并非必需如此，因此该方法也适于例如聚合物。-通过胶体蚀刻法图案化在这里通过胶体微粒(例如聚苯乙烯或蛋白质的铁蛋白)沉积使表面纳米图案化是可行的，这类似于近程有序图案。这些微粒可以用作例如制备柱的蚀刻掩模、在表面上制备突出物的形貌模板或例如纳米金属簇的沉积(例如通过铁蛋白的金属中心)。-通过超短激光脉冲的激光图案化该项技术可用于高精密图案化。特别是烧蚀工艺强的非线性导致材料切除有界线清晰的阈值，并且这可用来证实甚至衍射极限以下的 g 丰勾的？ (P. P. Pronko, S. K. Dutta, J. Squier, J. V. Rudd, D. Du, G. Mourou =Optical Communicationl14, (1995)106)。-通过超短激光脉冲的激光图案化还可与石英球的预沉积联用(K.Vestentoft， J. A. Olesen,B. H. Christensen,P. Balling =Appl. Phys A80, (2005)493)来制备大阵列的纳米孔。更准确地讲，将石英球层沉积在表面上通常但并非一定产生密集的阵列。通过超短脉冲的未聚焦激光束扫描具有石英球的表面，有可能产生大面积的平行结构，因为石英球用作聚焦激光束的独立透镜。-激光扫描束干涉蚀刻法(InterferenceLithography)这种低成本方法可用于在大的表面面积上制备周期和准周期及空间相干图案。该方法利用两个或更多个相干平面波阵面之间的干涉(S. Kuiper7H. van Wolferen7G. van Ri jn, Journal of Micromechanics and Microengineeringll(1), (2001)33)。VI.用于培养组织或细胞的包括具有微米级表面结构的暴露表面的装置图9图示具有微米级结构暴露表面的组织培养皿的剖视示意图。培养皿301包括具有底部303和侧壁302的向上开口的容器。在使用时，上表面304暴露于细胞培养物或组织，从而为培养物提供微环境。在本发明的实施方案中，暴露表面304具有选定用以促进本文所述的预定细胞功能的微米级形貌结构。可用以下化合物例如通过热压印或通过注射成型，或者通过本领域已知的和/或本文所述的任何其它合适的方法由合适的印模或蓝图产生大量的这类表面例如聚合物，如聚苯乙烯、不同类型的聚己酸内酯、聚甲基丙烯酸甲酯、 硅酮包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)、聚乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯醇、透明质酸型聚合物、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸丁二醇酯、甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、mr-I T85、mr-I 7030、聚(双(三氟乙氧基)磷腈、 天然聚合物包括修饰多糖(例如淀粉、纤维素和脱乙酰壳多糖)及上述化合物的混合物和共聚物。表面304可以是底部303的上表面或位于培养皿底部303上方的独立组件(例如圆盘)的上表面。表面304还可以单独的组织培养塑料制品的形式提供，其经过改进以在表面上显示特定的结构或这些结构的设计图。例如，单独的组织培养塑料制品可以是可移动地插入培养皿301中。在这方面，术语组织培养塑料制品是指包括可以用来制备可用于细胞培养中的细胞的体外生长的表面的任何聚合物/金属涂料/材料。实施例1. 2包含169个测试区的13xl3BSSA圆片的制备厚度为525士25 μ m的单面抛光硅片G英寸)提供了用于生物相容性材料制备的底层。圆片为η型圆片，电阻系数为l-20ohm cm。按照下列方案，在SF6/02放电下，通过标准光刻法和反应性离子蚀刻法将微米型图案印制在硅片的抛光面上7.将圆片用氢氟酸缓冲液(BHF，BHF是浓HF (49% )、水和缓冲盐、NH4F的溶液，比率约1 6 4)预蚀刻30秒钟，然后在氮气流下干燥，和8.圆片然后用 1. 5μπι厚的光致抗蚀剂AZ5214(Hoechst Celanese Corporation, NJ，US，化学组成可参见由Hoechst Celanese Corporation提供的材料安全数据表(MSDS)) 层旋涂。于约90°C预烘干120秒钟，和9.在AL6-2型EVC整直器中，将涂覆光致抗蚀剂的圆片通过合适的掩模暴露于紫外线5秒钟，使之显影50-60秒钟，然后于120°C后烘1分钟，和10.然后将涂覆光致抗蚀剂的圆片图案化通过用BHF短暂蚀刻约30秒钟，然后以约0. 30 μ m/分钟的速度进行反应性离子蚀刻(RIE)，用丙酮脱去耐蚀膜接着进行RCA清洗。RCA清洗过程相继采用的三个主要步骤用5 1 IH2O H2O2 NH4OH溶液(SCl) 除去不溶性有机污染物。使用稀的50 IH2O HF溶液，除去由于(I)所致而可能蓄积的金属污染物的薄的二氧化硅层。使用6 1 IH2O H2O2 HCl的溶液(SC2)除去离子和重金属原子污染物。11.图案化圆片然后与热生长于1000°C 15分钟的20nm SiO2层一起通过干氧化而钝化。12.通过溅射沉积将250nm钽层沉积于图案化圆片的表面。图23B图示一片制成圆片的顶视图。按照实施例1. 2制备的圆片具有169个测试区，其中每个测试区具有11个不同的横向形貌A-K之一，包含不同重复的突出部分，突出部分具有圆形、正方形或长方形的横截面形状，如图23A所示。圆片上形貌A-J的每一个用一系列的16个区域、具有不同尺寸组合的系列的各个成员表示(X)是每个突出部分的最小横向横截面尺寸，单位为ym;(Y)是突出部分之间的间隙，单位为ym。形貌K用8种不同重复的“鲨鱼皮”结构的水平尺寸表示，其中各个结构之间的间隙为常数(Ιμπι)。形貌A-K 系列在圆片上的位置见图23Β。圆片的中心区(图23Β中的空白正方形)无结构，提供对照区。按照这些规定参数制备一系列的圆片，其中横向形貌的深度规定为0.60 μ m、l. 60 μ m 或 2· 40 μ m0 图2 中，标记每个测试区以表明其形貌表面结构，对于形貌A，系列A-J的16个成员的尺寸说明如下 “Al”形貌A，其中X =1 μ m, Y =1 μ m0
“A2”形貌A，其中X =1 μ m, Y =2 μ m0
“A3”形貌A，其中X =1 μ m, Y =4 μ m0
“A4”形貌A，其中X =1 μ m, Y =6 μ m0
“A5”形貌A，其中X =2ym, Y =1 μ m0
“A6”形貌A，其中X =2ym, Y =2 μ m0
“A7”形貌A，其中X =2μπι, Y =4 μ m0
“A8”形貌A，其中X =2μπι, Y =6 μ m0
“A9”形貌A，其中X =4μ m, Y =1 μ m0
“A10，’形貌A，其中X ==4μ m, Y ==2 μ m0
“All，’形貌A，其中X ==4μ m, Y ==4 μ m0
“A12，’形貌A，其中X ==4μ m, Y ==6 μ m0
“A13，’形貌A，其中X ==6 μ m, Y ==1 μ m。
“A14，’形貌A，其中X ==6 μ m, Y ==2 μ m0
“A15，’形貌A，其中X ==6 μ m, Y ==4 μ m0
“A16，’形貌A，其中X ==6 μ m, Y ==6 μ m0 系列K (鲨鱼皮)的8个成员的T尺寸如下 “ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =1 μ m
“Κ2”形貌K，其中X =1μm,T =2 μ m
“ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =3 μ m
“ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =4 μ m
“ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =5 μ m
“ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =6 μ m
“ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =7 μ m
“ΚΓ，形貌K，其中X =1μm,T =8 μ m要了解的是，上述制备方法还可适用于具有其它形式和测试区尺寸以及其它结构类型的圆片(参见图3-7)。同一制备方法可用于许多不同的圆片，其中测试区和特定表面结构的布局由圆片所暴露的掩模决定。实施例2. 2筛选鉴定通过成骨细胞中骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达而促进骨生成的生物相容性材料的BSSA圆片按照图23中的设置，将鼠成骨细胞(MC3T3-E1)接种在具有表面形貌库的硅片上， 从其上鉴定出能够通过成骨细胞表达骨桥蛋白和骨钙蛋白而促进骨生成的表面。
方法BSSA圆片结合实施例1. 2中所述，使用标准光刻法制备，并用钽涂覆。成骨细胞细胞系、培养和接种方案在95%大气和5% CO2的潮湿环境，将鼠成骨细胞(MC3T3-E1) (RIKEN 细胞库；Tokio, Japan ；Sudo, H 等，1983，J Cell Biol96(l) 191-98)在无抗坏血酸但补充10%胎牛血清(Gibco)、100 μ /ml青霉素和100 μ g/ml链霉素(Gibco)的MemAlpha培养基(由Gibco hvitrogen提供)中于37°C维持，采用标准技术每4天传代。在细胞接种前，将圆片放入plO培养皿(Nunc)中，浸泡在70%乙醇中15分钟灭菌，用无菌水漂洗两次后，在无菌通风橱中干燥。MC3T3-E1细胞用胰蛋白酶消化，收获，对于细胞生长测定以1000个细胞/cm2的密度接种在装有圆片的培养皿中，对于细胞面积测定以6000个细胞/cm2或对于生骨刺激以40，000个细胞/cm2接种在上述相同的培养基中。对于细胞生长测定，将细胞固定并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]染色或在4小时、24小时、48小时和96小时后进行免疫测定。DAPI是与DNA牢固结合的荧光染料，其可通过完整的细胞膜，因此可用来使活细胞和固定细胞染色。被DAPI染色的细胞用紫外线激活后通过荧光显微镜检测。当DAPI与双链DNA结合时，其最大吸收位于358nm，其最大发射位于461nm，看上去为蓝/青色。对于细胞面积测定，将细胞固定，24小时后进行免疫测定。对于成骨刺激，3天后更换培养基为成骨培养基上述常用培养基补充了 50 μ g/ml抗坏血酸(Sigma)和IOmM β -甘油磷酸盐(Sigma)。一周两次更换成骨培养基直到在14天或21天固定和染色为止。免疫测定方案将细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBQ轻轻漂洗后，在4%低聚甲醛/PBS 中固定 15 分钟。在 0. Triton X 100/PBS(T-PBS)中透化 10 分钟后与 2% BSA/T-PBS 温育2小时，使细胞与第一抗体反应2小时。然后将细胞在T-PBS中洗涤3次，随后加入第二抗体达1小时。同时加入DAPI (4,6- 二脒基-2-苯基吲哚)(Sigma)用于核染色和罗丹明标记的鬼笔毒环肽(pl951Sigma)用于肌动蛋白纤维染色。在T-PBS中洗涤3次后，将圆片用自动荧光显微镜分析。用来检测蛋白质表达的第一抗体包括二者以1 400于T-PBS稀释的抗骨桥蛋白(AKM 2A1，鼠单克隆 IgG，Santa Cruz Biotechnology)、抗骨钙蛋白(FL-95，兔多克隆 IgG,Santa Cruz Biotechnology)和以1 800于T-PBS稀释的单克隆抗黏着斑蛋白(克隆hVIN-Ι鼠腹水液，Sigma)。第二抗体Alexa Flour 488-羊抗小鼠 IgG (1 400 于 T-PBS 中) (Molecular Probes, Invitrogen)和罗丹明(TRITC)缀合的驴抗兔(1 200) (Jackson ImmunoResearch)。体外矿化检测方案在收获细胞后或在免疫测定步骤后立即通过茜素红染色定量圆片上的矿化/钙沉积(以确保免疫染色的细胞与钙沉积之间的精确相关)。当细胞立即用茜素红染色后，细胞用冰冷的70%乙醇固定1小时，用ddH20洗涤两次后加入40mM茜素红溶液(Sigma A3757) 10分钟。在ddH20中洗涤几次后，将细胞在PBS 中温育15分钟，并在通风橱中风干。分析染色区域，应用Leica Qwin软件，使用自动荧光显微镜定量。当在免疫测定后用茜素红染色后，免疫染色的细胞用ddH20洗涤两次后，加入茜素红溶液。其它步骤同上。
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结果A.通过成骨细胞促进矿化的生物相容性表面形貌结构的性质将Mc3T3细胞接种在实施例1. 2和图23定义的BSSA圆片上，并按上述设置生长。 从图23B-D可以观察到，结构的垂直尺寸(突出部分)对矿化具有作用，其中具有最高高度的结构促进最大程度的矿化Ζ = 2.4μπι>Ζ=1.6μπι>Ζ = 0.6μπι。在各个系列(A-J) 中没有太大的差异，这就强调了结构的形式和结构之间是否有小的系统间隙在促进矿化方面不太重要。合并具有相同X值和Y值的所有系列，可以从图23D中观察到具有较小X值和Y值的结构促进较多的矿化，因此对于所测试结构的所有尺寸，1μπι>2μπι>4μπι> 6 μ m >>未结构化表面。所有的鲨鱼皮结构具有1 μ m的间隙尺寸和不同T值的结构尺寸， 其中一个横截面径的长度总是为1 μ m，其它横截面径的长度是可变的。所有鲨鱼皮结构以及系列A-J的最佳结构都促进矿化。注意，由系列A-J鉴定出来的尺寸中，1 μ m的间隙⑴ 和Iym结构(X)的尺寸为矿化最佳尺寸。B.促进成骨细胞增殖的生物相容性表面形貌的结构性质将Mc3T3细胞接种在实施例1. 2和图23定义的BSSA圆片上，并按照上述设置生长。在接种后4小时、M小时、48小时和96小时，通过计算DAPI染色的细胞的数目，计算出成骨细胞在BSSA圆片上的增殖。如图M所示，细胞增殖随突出部分高度而降低Z = 2. 4 μ m <z = 1.6 μ m，而突出部分的高度并不影响细胞与BSSA圆片表面附着的能力G小时的数据)。对于X和Y尺寸，介于Iym和4μπι之间的间隙尺寸(Y)与X= Iym的结构尺寸的组合导致增殖率最明显的降低。因此，增加表面形貌高度(Z)对细胞增殖的负面作用与对矿化的积极作用负相关(图23)。相比之下，鲨鱼皮结构高度的增加不会引起细胞增殖率降低。C.通过成骨细胞表达骨桥蛋白和骨钙蛋白促进骨生成的生物相容性表面形貌的结构性质将Mc3T3细胞接种在实施例1. 2定义的BSSA圆片上，垂直尺寸Z = 2. 4 μ m，诱导矿化2或3周。随后将细胞固定，并对OPN(绿色)、OC(红色)和DAPI (蓝色)染色。在 OPN、OC和DAPI的荧光显微术检测后，圆片用茜草红染色。在细胞接种后M小时，测定了平均细胞面积(图25和图27)。在成骨诱导2周(图25和图26)或3周(图28)后测定了矿化。OPN和OC的诱导与矿化正相关，而矿化与细胞大小负相关(对于小的χ值X= 1 和X = 2)因此，BSSA圆片上的突出部分的X值和Y值越小，OPN和OC的诱导越大，矿化度越大，且细胞尺寸越小；因此对于矿化、OPN, 0C:lym> 2μπι> 4μπι> 6μπι>>未结构化表面。对于较大的X值，观察到随Y值增加，细胞大小再次减小(例如6，6)。对于大的X 值和Y值，这种细胞大小的减小与矿化、OC和OPN无关联。所有系列K鲨鱼皮结构均诱导矿化、OPN和OC的表达以及细胞大小至系列A-J的最佳结构相同的程度。小结实施例对包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物的BSSA结构表面库对成骨细胞性质的影响提供了系统分析，所述二维网格包含突出物(X)的最小横截面径、最相邻突出物(Y)之间的间隙和突出物高度(Z)的不同组合。数据表明，在诱导矿化方面，高度 2. 4μπι> 1.6μπι> 0. 6“111>平整未结构化表面是较好的。这与增殖相关，其中2. 4 μ m < 1.6μπι<平整未结构化表面。至于X值和Y值Χ值和Y值越小，OPN和OC的诱导越好，
40矿化越好，细胞越少和细胞尺寸越小；Ιμπ > 2μ > 4μ > 6μ >>未结构化表面。所有鲨鱼皮结构均具有Iym的间隙尺寸(Y)和一侧尺寸总为1 μ m，而另一侧是可变的结构尺寸(X)。矿化、OPN和OC的诱导、细胞数和细胞大小与系列A-J的最佳结构相似。综合数据为以下发现提供了基础，即特征在于包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物的形貌结构的生物相容性材料通过成骨细胞表达骨桥蛋白和骨钙蛋白而特别促进骨生成，其中突出物具有最小横截面径为ι. ο μ m-2. 0 μ m的横截面，其中沿至少一维的相邻格点之间的距离介于2. ομπι和8.0 μ m之间，其中形貌结构的各个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m,优选约2. 4 μ m。实施例3. 2 异位成骨异位成骨可如下进行分析将500，000个MC3T3-E1细胞/cm2在包含了添加的50 微克/ml抗坏血酸和IOmM β -甘油磷酸盐的简单培养基中、在6mm χ 6mm生物相容性材料结构(例如K系列1-8中的任一种)上培养。培养一周后，将生物相容性材料结构转移到小鼠模型皮下用于异位成骨。在小鼠背侧制备两个皮下袋状皮摺。手术期间，将动物用异氟烷麻醉，将一个结构放入一个袋状皮摺中，用外科缝线缝合。小鼠留置8周后，通过颈椎脱位法处死。取出结构，塑料包埋在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中，切片，染色用于骨检测(例如碱性复红/亮绿或茜素红S)。实施例4. 2.绵羊成骨试验下述体内绵羊模型可用来测定生物相容性材料诱导骨生成/骨长入的能力在6mm χ 6mm硅片正方形的基底上制备相关生物相容性材料的样品和对照，例如平整的钽。样品分别称为“活性物”和“对照”，并成对使用以减小由动物变化引起的结果变动。用生物相容性胶水(例如Loctite 431)将样品粘合在样品架上，制成植入物。用于绵羊成骨试验的样品架见图四。具体地讲，图^a图示样品架的底视图，图 28b图示样品架的侧视图，图^c图示样品架的顶视图，图^d图示样品架的透视图，图^e 图示样品架的剖视图。样品架包含正方形凹穴1501，适于接受将要暴露其生物相容性表面的样品。正方形凹穴位于圆柱状部分1502的底面。在顶面上，样品架包括螺纹孔1503，有利于在骨中/从骨中放置和取出样品架。手术前，给予绵羊2.5ml Rompun vet和2ml阿托品。20分钟后，用15ml异丙酚使动物麻醉。在每个内股骨髁中钻一个深度6mm，直径Ilmm的孔。这在生物相容性表面和骨之间留下0. 5mm间隙用于研究骨长入。将植入物压配合至孔中，切口用外科缝合线缝合。 绵羊留置4周后处死。取出植入物，包埋在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中。最初用μ CT扫描检查骨长入程度，随后切割，对朝向植入物的骨容积和骨长入进行标准组织学检查。
4权利要求
1.一种细胞或组织培养容器用于促进未分化多能哺乳动物胚胎干细胞生长的用途，所述容器具有在使用期间暴露于培养物的表面，其中至少部分所述表面为生物相容性材料， 其中至少部分所述生物相容性材料的暴露表面具有纳米和/或微米级形貌结构，所述结构包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物，其特征在于所述突出物的横截面积等于或小于该结构总面积的25%，所述结构面积以所述结构暴露表面的平面测得，且其中突出物的密度等于或大于1个突出物/65 μ m2，且其中所述形貌结构的每个突出物的垂直高度/深度等于或大于1. 6 μ m或3. 0 μ m，优选介于2. 0 μ m-3. Oym之间，更优选2. 4 μ m。
2.权利要求1的用途，其中所述突出物具有横截面，且最小横截面径介于0.1 μ m和 4.0μπι之间，且其中任何突出物与其最近邻突出物之间的间隙的水平尺寸(d ；Y)介于约 0. 5 μ m-8. Ομπι 之间。
3.权利要求2的用途，其中所述横截面径介于0.5 μ m和1. 5 μ m之间，且任何突出物与其最近邻突出物之间的最大间隙的水平尺寸(d ；Y)介于约1μπ -4μπ 之间。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中沿至少一维的相邻格点之间的最小距离小于 8. 0 μ m，优选介于0. 5 μ m和6. 0 μ m之间。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述结构包括具有相同的横截面几何形状或至少两种不同的横截面几何形状的突出物。
6.权利要求5的用途，其中所述不同横截面几何形状的突出物以交替方式排列在规则二维网格上。
7.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述结构包括不同横截面积的突出物。
8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述突出物的横向截面具有由周缘定义的形状和/或选自以下的几何形状环形、凹形、凸形、圆形、星形、正方形、长方形、六边形和多边形或其组合。
9.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述表面的至少一部分用选自钽、钛、钼或其氧化物的物质涂覆。
10.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述表面的至少一部分包含选自以下的聚合物聚苯乙烯、聚己酸内酯聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、脱乙酰壳多糖或其组合。
11.权利要求1-10中任一项的用途，其还包括选自以下的化合物多肽、碳水化合物、 脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物，其中所述化合物吸附在容器的暴露表面上或以化学方式与容器的暴露表面连接。
12.权利要求11的用途，其中所述生长激素选自BMP、EGF样、TGF-β、IGF和LIF。
13.权利要求1-12的用途，其中所述细胞或组织培养容器通过例如纳米晶金刚石、等离子体聚合、氧等离子体或氮等离子体进行化学官能化。
14.一种用于制备细胞或组织培养容器的印模或掩模，所述容器至少部分由生物相容性材料制备，所述印模或掩模适于将按照权利要求1-13中任一项限定的形貌表面结构印压入或提供给所述生物相容性材料的表面。
15.一种用于促进未分化的多能哺乳动物胚胎干细胞生长的细胞或组织培养容器，所述容器具有在使用期间暴露于培养物的表面，其中至少部分所述表面为生物相容性材料， 其中至少部分生物相容性材料的暴露表面具有纳米和/或微米级形貌结构，所述结构包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物，其特征在于所述突出物的横截面积等于或小于该结构总面积的25%，所述面积以该结构暴露表面的平面测量，且其中所述突出物的密度等于或大于1个突出物/65 μ m2，且其中所述形貌结构的每个突出物的垂直高度/深度尺寸约为 2. 4μπι。
16.一种促进未分化的多能胚胎干细胞生长的方法，所述方法包括使细胞与具有暴露于干细胞的表面的细胞或组织培养容器接触，其中至少部分所述表面为生物相容性材料， 其中至少部分所述生物相容性材料的暴露表面具有纳米和/或微米级形貌结构，所述结构包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物，其中选择所述结构以促进未分化的哺乳动物胚胎干细胞的生长，其特征在于所述突出物的横截面积等于或小于该结构总面积的25%，所述面积以该结构暴露表面的平面测量，且其中所述突出物的密度等于或大于1 个突出物/65 μ m2，且其中所述形貌结构的每个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于 1. 6μπι或 3. Ομ ，优选介于 2. 0μπι-3. Ομ 之间，更优选 2. 4 μ m。
17.权利要求16的方法，其中所述突出物具有横截面，且最小横截面径介于0.1 μ m和 4.0μπι之间，且其中任何突出物与其最近邻突出物之间的间隙的水平尺寸(d;Y)介于约 0. 5 μ m-8. 0 μ m 之间。
18.权利要求17的方法，其中所述横截面径介于0.5 μ m和1. 5 μ m之间，且任何突出物与其最近邻突出物之间的最大间隙的水平尺寸(d ；Y)介于约1μπι-4μπι之间。
19.权利要求16-18中任一项的方法，其中沿至少一维的相邻格点之间的最小距离小于8. 0 μ m，优选介于0. 5 μ m和6. 0 μ m之间。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述结构包括至少两种不同的横截面几何形状的突出物。
21.权利要求20的方法，其中所述不同横截面几何形状的突出物以交替方式排列在规则二维网格上。
22.权利要求16-21中任一项的方法，其中所述结构包括不同横截面积的突出物。
23.权利要求16-22中任一项的方法，其中一种或多种特征的横向截面具有由周缘定义的形状和/或选自以下的几何形状环形、圆形、星形、正方形、长方形、六边形和多边形或其组合。
24.权利要求16-23中任一项的方法，其中所述表面的至少一部分是涂钽的和/或涂钛的表面。
25.权利要求16-23中任一项的方法，其中所述表面的至少一部分由聚合物组成，所述聚合物包括聚苯乙烯、聚己酸内酯聚乳酸或脱乙酰壳多糖。
26.权利要求16-25中任一项的方法，其还包括选自以下的化合物多肽、碳水化合物、 脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物，其中所述化合物吸附在容器的表面层上或者与容器的表面层化学连接、固定化或络合。
27.权利要求沈的方法，其中所述生长激素选自BMP、EGF样、TGF-β、IGF和白血病抑制因子或其组合。
28.权利要求14-27的方法，其中所述细胞或组织培养容器通过例如纳米晶金刚石、等离子体聚合、氧等离子体或氮等离子体进行化学官能化。
29.权利要求16的方法，其中所述细胞表达选自0ct4、NanOg、SSEA3/4和S0X2的多能性标志物。
30.一种细胞或组织培养容器用于促进哺乳动物干细胞均一分化性生长的用途，所述容器具有在使用期间暴露于培养物的表面，其中至少部分所述表面为生物相容性材料，其中至少部分所述生物相容性材料的暴露表面具有纳米和/或微米级形貌结构，所述结构包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物，其特征在于所述突出物具有横截面，且横截面径介于1.0 μ m-8.0 μ m之间，且其中任何突出物与其最近邻突出物之间的最大间隙的水平尺寸(d;Y)介于1.0μπι-2.0μπι之间，且其中所述形貌结构的每个突出物的垂直高度/ 深度尺寸等于或小于1. O μ m，优选介于0. 6 μ m-1. Oym之间，更优选约0. 6 μ m。
31.权利要求30的用途，其中所述一个或多个突出部分的横向截面具有由周缘定义的形状和/或选自以下的几何形状环形、圆形、星形、正方形、长方形、六边形和多边形或其组合。
32.权利要求31的用途，其中所述结构包括具有正方形横向截面的突出部分和具有长方形横向截面的突出部分，其中所述突出部分的第一横截面径为Ι.Ομπ ，所述突出部分的第二横截面径介于ι. ο μ m-8. 0 μ m之间，优选介于1. 0 μ m-6. 0 μ m之间，且其中所述突出部分的垂直高度/深度尺寸等于或小于ι. ο μ m，优选介于0. 6 μ m-1. 0 μ m之间，更优选约0.6 μ m0
33.权利要求30-32中任一项的用途，其中所述表面的至少一部分是涂钽的和/或涂钛的表面。
34.权利要求30-33中任一项的用途，其中所述表面的至少一部分由聚合物组成，所述聚合物包括聚苯乙烯、聚己酸内酯聚乳酸或脱乙酰壳多糖。
35.权利要求30-34中任一项的用途，其还包括选自以下的化合物多肽、碳水化合物、 脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物，其中所述化合物吸附在容器的暴露表面上。
36.一种促进哺乳动物细胞均一分化性生长的方法，所述方法包括使细胞与具有暴露于干细胞的表面的细胞或组织培养容器接触，其中至少部分所述表面为生物相容性材料， 其中至少部分所述生物相容性材料的暴露表面具有纳米和/或微米级形貌结构，所述结构包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物，其特征在于所述突出物具有横截面和介于1.0 μ m-8. 0 μ m之间的横截面径，且其中任何突出物与其最近邻突出物之间的最大间隙的水平尺寸(d ；Y)介于1.0 μ m-2.0 μ m之间，且其中每个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或小于1. 0 μ m，优选介于0. 6 μ m-1. Oym之间，更优选约0. 6 μ m。
37.权利要求36的方法，其中一个或多个突出部分的横向截面具有由周缘定义的形状和/或选自以下的几何形状环形、圆形、星形、正方形、长方形、六边形和多边形或其组合。
38.权利要求37的方法，其中所述结构包括具有正方形横向截面的突出部分和具有长方形横向截面的突出部分，其中所述突出部分的第一横截面径为Ι.Ομπι，而所述突出部分的第二横截面径介于ι. ο μ m-8. 0 μ m之间，优选介于1. 0 μ m-6. 0 μ m之间，且其中所述突出部分的垂直高度/深度尺寸等于或小于ι. ο μ m，优选介于0. 6 μ m-1. 0 μ m之间，更优选约 0. 6 μ m0
39.权利要求36-38中任一项的方法，其中所述表面的至少一部分是涂钽和/或涂钛的表面。
40.权利要求36-39中任一项的方法，其中所述表面的至少一部分由聚合物组成，所述聚合物包括聚苯乙烯、聚己酸内酯聚乳酸或脱乙酰壳多糖。
41.权利要求36-40中任一项的方法，其还包括选自以下的化合物多肽、碳水化合物、 脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物，其中所述化合物吸附在容器的暴露表面上。
42.权利要求30-41中任一项的用途或方法，其中所述干细胞选自胚胎干细胞、间充质干细胞和中枢神经系统干细胞。
43.一种用于骨组织植入的医学植入物，所述医学植入物包含表面，其中至少部分所述表面为生物相容性材料，其中所述生物相容性材料的表面的至少一部分的特征在于包含排列在规则二维网格格点上的大量突出物的纳米和/或微米级形貌结构，其中所述结构能够通过在成骨细胞中表达骨桥蛋白和骨钙蛋白而促进骨生成，其中所述突出物具有最小横截面径为1. 0 μ m-2. 0 μ m的横截面，其中沿至少一维的相邻格点之间的距离介于2. 0 μ m和 9. 0 μ m之间，其中所述形貌结构的各个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m, 优选约2. 4 μ m。
44.权利要求43的医学植入物，其中任何突出物与其最近邻突出物之间的最大间隙的水平尺寸(d ；Y)介于约1. 0μπι-6. Oym之间。
45.权利要求43或44的医学植入物，其中所述横截面的横截面径约为1μ m,且任何突出物与其最近邻突出物之间的最小间隙的水平尺寸(d ；Y)约为Ι.Ομπι。
46.权利要求43-45中任一项的医学植入物，其中所述结构包括至少两种不同的横截面几何形状的突出物。
47.权利要求46的医学植入物，其中不同横截面几何形状的突出物以交替方式排列在规则的二维网格上。
48.权利要求43-47中任一项的医学植入物，其中所述结构包括不同横截面积的突出物。
49.权利要求43-48中任一项的医学植入物，其中所述突出物位于二维规则网格的格点上使得只有子集部分格点上覆盖有突出物。
50.权利要求43-49中任一项的医学植入物，其中所述突出物平行排列，其中在相邻排中，相邻突出物之间中心至中心的距离不同。
51.权利要求43-50中任一项的医学植入物，其中一种或多种突出物的横向截面具有由周缘定义的形状和/或选自以下的几何形状环形、凹形、凸形、圆形、正方形和长方形或其组合。
52.权利要求43-51中任一项的医学植入物，其中所述周期性形貌结构的特征中心位于网格常数为a和b的二维长方形网格的格点上，且其中a.网格为正方形网格，其中每个方向的网格常数(a= b)的间距介于2_8μπι之间，或b.网格为长方形，其中第一方向的网格常数(a)的间距介于2_8μπι之间，第二方向的网格常数(b)的间距介于1_4μπι之间。
53.权利要求43-52中任一项的医学植入物，其中所述表面的至少一部分是涂钽和/或涂钛或其任何氧化物的表面。
54.权利要求43-52中任一项的医学植入物，其中所述表面的至少一部分由像聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物一样的生物可降解聚合物组成。
55.权利要求43-54中任一项的医学植入物，其还包含选自以下的吸附的化合物多肽、碳水化合物、脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物。
56.权利要求55的医学植入物，其中所述生长激素选自BMP、EGF样、TGF-β、IGF。
57.权利要求43-56中任一项的医学植入物，其中所述植入物是牙科植入物。
58.权利要求43-56中任一项的医学植入物，其中所述植入物是矫形植入物。
59.权利要求43-58中任一项的医学植入物，其用于人或动物的外科治疗。
60.权利要求56的医学植入物，其用于治疗人或动物的牙科疾病。
61.一种用于制备医疗装置的印模或掩模，所述医疗装置至少部分由生物相容性材料制备，所述印模或掩模适于将权利要求43-60中任一项限定的形貌表面结构印压入或提供给所述生物相容性材料的表面。
62.权利要求43-60中任一项的医学植入物的用途，其用于治疗人或动物的矫形病症。
63.一种细胞或组织培养容器用于促进分化细胞在细胞培养期间的基因表达的用途， 所述容器具有在使用期间暴露于细胞培养物的表面，其中至少部分所述表面为生物相容性材料，其中所述生物相容性材料包含权利要求43-60中任一项的生物相容性材料。
64.一种用于制备医学植入物的生物相容性涂层材料，其中所述生物相容性涂层材料包含权利要求43-60中任一项的生物相容性材料。
65.权利要求64的生物相容性涂层材料，其中所述医学植入物与成骨细胞具有生物相容性。
66.一种通过在成骨细胞中表达骨桥蛋白和骨钙蛋白而促进骨生成的方法，所述方法包括使细胞与生物相容性材料接触，其中所述生物相容性材料的表面的至少一部分的特征在于纳米和/或微米级形貌结构，所述结构包含排列在规则二维网格的格点上的大量突出物，其中所述突出物具有最小横截面径为ι. ο μ m-2. 0 μ m的横截面，其中沿至少一维的相邻格点之间的距离介于2. 0 μ m和8. 0 μ m之间，其中所述形貌结构的各个突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m,优选约2. 4 μ m。
全文摘要
本发明提供一种生物相容性材料，其中生物相容性材料表面的至少一部分的特征在于包含大量特征的微米或纳米级形貌结构，其中选择所述结构来促进未分化的多能干细胞生长或用来促进干细胞的均一分化性生长。此外，提供具有影响细胞功能，特别是与体内和离体基因诱导、细胞分化和骨组织形成有关的细胞功能的表面结构和组成成分的生物相容性材料。
文档编号C12N5/00GK102232109SQ200980130625
公开日2011年11月2日 申请日期2009年5月27日 优先权日2008年5月27日
发明者A·C·富希特鲍尔, E·M·富希特鲍尔, F·S·佩德森, F·贝森巴切尔, J·洛夫曼德, L·马克特, M·R·杜克, M·福斯 申请人:奥尔胡斯大学