专利名称：用于代谢工程和其它应用的微流体微滴的制作方法
技术领域：
本发明一般性地涉及微滴在培养和/或测定细胞或其它物质中的用途。在某些情况下，可以根据培养和/或测定的结果分选细胞或其它物质。
背景技术：
代谢工程对工业和其它应用之遗传品系的改进有显著贡献。例如，可以采用多种代谢工程技术对用于生成产物的基因或其它所谓的远距离基因进行操作以影响产物的生成，例如，基于动力学或调控作用。在某些情况下，可以通过建立文库的组合方法识别这些基因，所述文库含一个或更多个基因和/或这些基因的随机变体，基因敲除的随机组合、过度表达等。可以从这些文库中选择具有优良特性的细胞，并用例如反向代谢工程的方法识别该特定遗传改变。这些方法经常借助于高通量筛选方法的使用以从这些文库中选择所需的克隆。对于许多文库，可用的选择标准包括分泌代谢物的生成或培养基组分的消耗。每个克隆在隔离环境中生长可用作分隔克隆的策略，这可允许测量克隆特异的代谢浓缩物等。在多种分隔策略中可采用传统方法，即利用诸如微孔板的工具进行培养和测定。 然而，这些方法不能提供足够的高通量，因此，还需要改进的组成和方法。发明概述本发明一般性地涉及微滴在培养和/或测定细胞或其它物质中的用途。在某些情况下，可以根据培养和/或测定的结果分选细胞或其它物质。在某些情况下，本发明的主题涉及相关的产物、对特定问题的替代解决方案和/或一个或更多个系统和/或制品的多个不同用途。在一个方面，所述方法为一种生成富集的细胞群的方法。在一组实施方案中，该方法包括以下步骤，即提供包含在微流体装置中的第一微滴群，至少一些微滴包封有一个或更多个细胞，至少一些微滴包括第一细胞类型并且至少一些微滴包括第二细胞类型；对于至少一些微滴，测定对应微滴中一个或更多个细胞与糖类反应的能力，其中第一细胞类型能够比第二细胞类型更大程度地进行糖代谢；以及基于该测定，相对于第二细胞类型生成第一细胞类型的细胞微滴的富集群。在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤，即提供包含在微流体装置中的微滴群，至少一些微滴包封有一个或更多个细胞，至少一些微滴群的微滴包括第一细胞类型并且至少一些微滴包括第二细胞类型；对于至少一些微滴，测定微滴中一个或更多个细胞与试剂反应的能力，其中第一细胞类型能够比第二细胞类型更大程度地与试剂反应；以及基于该测定，相对于第二细胞类型生成第一细胞类型的细胞微滴的富集群。根据另一个方面，所述方法一般性地涉及一种生成富集的物质群的方法。在一组实施方案中，该方法包括以下步骤，即提供包含在微流体装置中的微滴群，至少一些微滴包封有第一物质并且微滴群中的至少一些微滴包括第二物质；对于至少一些微滴，测定微滴中一种或更多种物质与试剂反应的能力，其中第一物质能够比第二物质更大程度地与试剂反应；以及基于该测定，相对于含第二物质的微滴生成含第一物质的微滴的富集群。在又一个方面，所述方法包括以下步骤，即提供包含在微流体装置中的微滴群，至少一些微滴包封有一个或更多个细胞并且至少一些微滴含糖；将至少一些微滴暴露于能够与糖反应的酶；并确定酶与糖的反应程度。根据又一个方面，所述方法包括以下步骤，即将包含在微流体装置中的其中至少一些微滴包封有一个或更多个细胞的微滴群暴露于糖，暴露时间至少足以使糖进入至少一些微滴；将至少一些微滴暴露于能够与糖反应的酶；并测定酶与糖的反应程度。当结合附图考虑时，通过以下对多个本发明非限制性实施方案的详细描述，将明确本发明的其它优点和新特征。当本说明书与通过引用并入的文件包含相冲突和/或不一致的公开内容时，以本说明书为准。如果通过引用并入的两个或更多个文件包含彼此相冲突和/或不一致的公开内容时，以具有较近生效日期的文件为准。
将参考附图通过实施例描述本发明的非限制性实施方案，所述附图为示意性的且并非按比例绘制的。在附图中，各个相同或近似相同的组件通常用相同的附图标记表示。为了清楚，并未在每个附图中标注每个组件，并且当不影响本领域普通技术人员理解本发明时，并未图示本发明每个实施方案的每个组件。在附图中图1为一个实施方案的装置的示意图；图2为另一个实施方案的装置的示意图；图3A为又一个实施方案的微流体高通量筛选平台的示意图；图;3B为又一个实施方案的微滴生成装置的示意图；图4为根据一个实施方案在培养前包封在微滴中的单个细胞的光学图像；图5为根据另一个实施方案在培养后包封在微滴中的多个细胞的光学图像；图6为又一个实施方案的用于在微滴中进行测定反应的装置的示意图；图7为另一个实施方案的包括微滴聚结部分的整合装置的示意图；图8为根据另一个实施方案在培养2天后H131株的荧光检测数据曲线图；图9为根据又一个实施方案在培养2天后H131株和TALl株荧光检测数据曲线图；图10为根据又一个实施方案在培养2天后H131株和TALl株在给定荧光范围内细胞百分数曲线图；图11为根据又一个实施方案在培养3天后H131株和TALl株在给定荧光范围内细胞百分数曲线图12为根据另一个实施方案在培养3天后H131株和TALl株在给定荧光范围内细胞百分数曲线图；图13为又一个实施方案的包括聚结、检测和分选部分的装置的示意图；图14为根据一组实施方案的基因组DNA文库构建的示意图；图15包括根据一组实施方案的在H131-A31中构建XYLA基因的示意图；图16为说明在不同荧光范围内微滴百分数的示例性曲线图；图17为说明在不同荧光范围内微滴百分数的示例性曲线图；图18包括根据一组实施方案的丰富和最低培养基中的木糖消耗曲线图。图19A至19D包括根据一组实施方案的多个突变木糖消耗的曲线图。发明详述本发明一般性地涉及微滴在培养和/或测定细胞或其它物质中的用途。在某些情况下，可以根据培养和/或测定的结果分选细胞或其它物质。在某些实施方案中，可将细胞或其它物质包封在微滴中，并使其暴露于一种或更多种试剂(如糖、指示染料等)。例如，在某些情况下，将细胞暴露于试剂可以导致代谢物或其它化合物(例如氨基酸、蛋白质、有机酸等)的生成，所述代谢物或其它化合物可以被例如测定或以其它方式确定。在某些实施方案中，微滴中细胞和/或其它物质与试剂的反应可以揭示细胞或其它物质的特性(如糖消耗、生长速率、承受试剂暴露的能力等)。例如，可通过分选技术将生成所需代谢物或显示某些特性的细胞与其它细胞分离。本发明的其它方面涉及实施该分选的装置或试剂盒以及推广该技术的方法等。本发明的一个方面一般性地涉及分选细胞的系统和方法，例如，生成富集的细胞群。在某些情况下，细胞群包含在多个微滴中，并且分选微滴以生成富集的细胞群。如下所述，在某些情况下，可以根据细胞与递送到含细胞的微滴中的试剂的反应来分选细胞。在某些实施方案中，本文所述方法和装置可以用于生成富集的细胞群或其它物质群。例如，可以分选包括第一细胞类型和第二细胞类型的细胞群以相对于第二细胞类型生成第一细胞类型富集的细胞群，即分选后与分选前相比，第一细胞类型的细胞的百分比 (表示为占细胞总数的百分数)提高。随后可以将这些细胞(或其它物质)用于多种应用。 例如，可以从微滴中收集产物，可以将微滴与其它微滴组合，可以进一步纯化物质，可以培养细胞等。作为一个具体的实例，在某些实施方案中，例如为了确定所需或非所需基因的存在和/或特性，可以对富集细胞群的DNA进行测序。本领域普通技术人员已知细胞DNA测序的多种方法，例如，PCR(聚合酶链式反应)技术。在多个实施方案中，在某些情况下，分选后细胞或其它物质的富集量的倍数可以为至少约3、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约100、 至少约1000，或至少约10，000或更多。在一组实施方案中，可以对富集一种细胞类型的细胞(或其它物质)群实施一个或更多个额外的筛选环节，例如，如本文所述，这可使得与群中的其它细胞类型相比，细胞类型的富集程度更高。本发明的某些实施方案一般性地涉及一个或更多个细胞在微滴中的包封。如本文所用，“细胞”为在生物学中所用的一般含义。细胞可以为任何细胞或细胞类型。例如，细胞可以为细菌或其它单细胞生物、植物细胞或动物细胞。如果细胞为单细胞生物，则细胞可以为例如原生动物、锥体虫、变形虫、酵母细胞、藻类等。如果细胞为动物细胞，则细胞可以为例如无脊椎动物细胞(例如，果蝇细胞)、鱼细胞(例如，斑马鱼细胞)、两栖动物细胞(如， 青蛙细胞)、爬行动物细胞、鸟细胞或哺乳动物细胞(如灵长类动物细胞、牛细胞、马细胞、 猪细胞、山羊细胞、狗细胞、猫细胞或啮齿动物细胞，如大鼠或小鼠)。如果细胞源自多细胞生物，则细胞可以来自生物的任何部分。例如，如果细胞来自动物，则细胞可以为心细胞、成纤维细胞、角质化细胞、肝细胞、软骨细胞、神经细胞、骨细胞、肌肉细胞、血细胞、内皮细胞、 免疫细胞(如T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、嗜伊红粒细胞)、 肝细胞等。在某些情况下，细胞可以为遗传工程细胞。在某些实施方案中，细胞可以为中国仓鼠卵巢(“CH0”)细胞或3T3细胞。然而，应该理解的是，本发明不限于仅培养和/或分选包含在微滴中的细胞，也适用于分选其它可包含在微滴中的物质，例如，生物化学物质如核酸(如siRNA、RNAi和DNA)、 蛋白质、多肽或酶。可以引入微滴的另外的物质，包括但不限于纳米颗粒、量子点、片段、蛋白质、指示剂、染料、荧光物质、化学物等。例如，可以基于本文所述的例如荧光方法分选含第一类型的量子点和第二类型的量子点的微滴群。因此，本文只是以举例的方式讨论微滴中所含细胞的用途。在某些实施方案中，根据细胞或其它物质与试剂(例如，包含在微滴中)反应的能力对其进行分选。可以采用任何适合的技术将试剂递送到微滴中的细胞或其它物质中，例如，通过从载体溶液中扩散、通过将含细胞的微滴与含试剂的另一微滴聚结等。在美国专利申请序列号 11/360，845(于 2006年 2 月 23 日提交，题为“Electronic Control of Fluidic Species，”，在2007年1月4日以美国专利申请发布号2007/000342公开)或美国专利申请序列号 11/698，298(于 2007 年 1 月 24 日提交，题为“Fluidic DropletCoalescence,，，) 中描述了用于聚结微滴的系统和方法，其均通过引入并入本文。例如，在某些情况下，载体相可以包含一种或更多种能够与细胞反应的试剂。在某些情况下，微滴群暴露于试剂(例如，糖)的时间为至少足以使试剂进入至少一些微滴中。在某些情况下，可将多于一种试剂引入微滴中。例如，可以将第一试剂引入微滴中并使其与细胞或其它物质反应，然后将第二试剂引入微滴中以测定第一试剂，例如，在反应后微滴中存在的第一试剂的浓度或量。作为具体的实例，该试剂可以包括能与细胞、细胞生成的产物和/或在之前引入细胞和/或含细胞的微滴中的其它物质进行反应的化学物。作为另一个实例，第二试剂可以包括能与糖(例如，木糖)反应的酶(例如，氧化酶)，所述糖例如在微滴形成过程中被引入到微滴中。在某些实施方案中，第二试剂可以包括能够与细胞暴露于初始试剂之前和/或之后所生成的实体反应的化学物。在某些例子中，第二试剂可以包括只在细胞与在微滴形成时期引入的起始试剂反应和/或不反应之后才与细胞反应的化学物。在某些实施方案中，所述试剂包括能够至少一些被细胞代谢的物质，例如以从细胞生成一种或更多种代谢物。例如，试剂可以包含糖(如，木糖、脱氧核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、半乳糖等)或其它适合的碳水化合物。作为另一个例子，在某些实施方案中，该试剂可以包含氨基酸(例如，天冬氨酸、赖氨酸等)。在某些情况下，所述试剂也可以包含核酸如尺離、8丨1 離、1 離丨、0嫩、？嫩等和/或其它物质，如蛋白质、多肽、酶等。在一组实施方案中，所述微滴可以包含糖和能够氧化该糖的氧化酶。例如，该氧化酶可以为碳水化合物氧化酶或寡糖氧化酶，如吡喃糖氧化酶、半乳糖氧化酶、葡萄糖氧化酶等。在某些情况下，该试剂还可以包含其它酶，如辣根过氧化物酶。在某些情况下，该试剂也可以包含指示染料，如 Amplex UltraRed (Molecular Probes)、Amplex Red (Molecular ftObes)、二氢荧光素、二氢若丹明等。例如，在某些情况下，糖暴露于酶可以导致过氧化氢的生成。在某些情况下，可以随后分析该过氧化氢以测定该糖。例如，过氧化氢可以与非荧光化合物(如Amplex UltraRed(MolecularProbes))反应生成荧光化合物(如 Resorufin)。以下参照图1讨论本发明系统的一个非限制说明性实例。如在该实例中所示，装置100包括一个输入通道110以及两个输出通道112和114。在某些情况下，装置100为微流体装置，如之后更详细描述的，该装置的通道可具有任意的深度、宽度和/或高度，每个通道可以限定任意路径(如直的、弯的等)。在某些情况下(包括图1所示的)，第一类型的细胞(或其它物质)116包封在微滴118中。此外，第二类型的细胞117也可如图所示包封在微滴中，例如，在任选的腔130中。在其它情况下，微滴可以包含多于一个细胞，或可以不包含任何细胞。在某些实施方案中，每个微滴可以包含恰好一种细胞类型，而在其它实施方案中，在单个微滴中可以包含多于一种细胞类型。在图1所示的实例中，在通道110中的点120和122之间将试剂引入微滴118中。 可以采用任何适合的技术将试剂引入微滴中，如，通过扩散、通过将微滴118与含该试剂的其它微滴聚结等。在某些情况下，细胞可以与该试剂反应，而在其它情况下，细胞可以不反应。例如，细胞暴露于试剂可能导致细胞死亡。或者，细胞可以暴露于试剂并存活，在某些情况下，细胞能够代谢该试剂或者以其它方式利用该试剂。例如，在某些情况下，细胞暴露于试剂可以导致细胞生长速率的变化、一个或更多个代谢物生成的变化或细胞的其它特性的变化(例如，荧光、颜色、形态、大小、有丝分裂能力等)。在某些实例中，除细胞和/或没有细胞外，试剂可以与微滴中的其它物质反应(例如，核酸如RNA或DNA，蛋白质或多肽、酶、 抗体等)。在某些情况下，试剂与细胞和/或其它物质的反应可能导致微滴和/或其内含物特性的可测定变化(如，荧光的变化、颜色的变化等)。可以确定试剂和/或其它物质之间的反应程度，如在微流体系统中特定位点处。 例如，在图1所示的实例中，测定步骤可在位点122处进行。本领域普通技术人员可以确定能在本发明中采用且在微滴内特征可测定的例子，其包括但不限于荧光、光谱(例如，可见光、红外、紫外等)、放射活性、质量、体积、密度、温度、粘度、PH、物质如生物物质(如蛋白质、核酸等)的浓度、微滴中一个或更多个细胞的活性等。本领域普通技术人员将了解确定这些特征的恰当方法，如，市售UV检测仪、荧光检测仪、热电偶等。在本文所述的任何实施方案中，至少一些基于如以上所述的微滴测定，可以基于例如分选或筛选的目的将微滴导入装置的特定区域。例如，可以通过某种方式(例如以上所述的方式(如，荧光))确定流体微滴的特征，并且作为应答，可以施加或去除电场以将微滴导入本发明装置中的特定区域(如输出通道)，如图1中所示的通道132或134。该电场可以基于电场吸引、电场排斥、介电泳等使微滴移动到特定的通道或区域。作为另一个实例，微滴中的试剂和细胞和/或其它物质的相互作用可以导致微滴上电荷的聚集，其随后可用电场进行引导。如美国专利申请序列号11/360，845(于2006年2月23日提交，题为 "Electronic Control of FluidicSpecies”，在2007年1月4日以美国专利申请
发明者凯瑟琳·J·汉弗莱, 大卫·A·韦茨, 格里戈里·斯特凡诺普洛斯, 王汝诚 申请人:哈佛大学, 麻省理工学院