用于pcr分析的检测算法的制作方法

专利名称：用于pcr分析的检测算法的制作方法
技术领域：
本申请案大体来说涉及使用聚合酶链反应(PCR)来检测核酸的领域。本申请案提 供通过以下方式来增加使用PCR检测靶核酸的特异性、和(由此)灵敏性的方法计算温度 对于经标记探针与靶的杂交的影响，并且计算随标记强度(随时间变化)变化的探针与靶 的杂交速率。
背景技术：
核酸扩增已成为检测试样中的特异性核酸的非常重要的工具。如例如美国专利 第4，683，202号中所述，在包括靶核酸、与所述靶核酸互补的DNA聚合引物、以及必需的核 苷和缓冲剂的反应中，使用PCR并利用热稳定DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)的热循环来 扩增核酸。已研发出用于特定需求的PCR的许多变化形式，可参见(例如)最新分子生物 学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology) (2008 年 4 月，印刷 ISSN 1934-3639 ；在线ISSN 1934-3647)。PCR是出于各种目的用于检测DNA和RNA靶的存在的 广泛使用的技术，包含(例如)离体和来自环境试样的病原体检测、活体外诊断、遗传分析、 取证、食品和农业测试、和血统测试。PCR已从仅在受控实验室条件下实施的技术发展成用于现场测试的技术。手持式 PCR装置的出现使得此发展变得可行。所述装置可尤其适用于检测病原体、法医取样、或甚 至快速诊断医学病状而无需昂贵、耗时并费力的实验室处理。在现场使用PCR对于抵抗生 物恐怖攻击来说尤为重要，因为快速并准确的鉴别生物武器是关键。尽管缺少受控的实验室环境，但现场应用仍需要稳定且准确的分析。尽管现场分 析与实验室分析在检测靶DNA方面大致不相上下，但通过比较PCR分析与用于诊断来自组 织试样的细菌感染的常规培养技术表明，PCR方法的敏感性小于72小时实验室培养(伊曼 纽尔(Emanuel)等人，临床微生物学期刊(J. Clin. Microbiol). (2002)41 :689_693)。因此， 改进PCR灵敏性是研发快速检测方法的目标。信号特异性仍然是任一 PCR分析的灵敏性的主要限制，尤其在使用荧光报导子分 子测量反应动力学和反应中扩增靶的量时。尽管通常使用在阴性对照反应中减去背景荧光 来计及非特异性杂交，但此方法最多仍不过是粗略的方法，此限制了为检测必需存在的靶 核酸的阈值量。

发明内容
本文提供检测经标记核酸探针与其互补核酸靶的杂交的方法，其包括(a)使怀疑 含有靶核酸的试样与可与所述靶核酸杂交的经标记核酸探针接触；(b)在第一温度和第二温度下测量标记强度，其中所述第一温度低于所述第二温度；(C)计算(i)所述第一温度下的标记强度与(ii)所述第二温度下的标记强度的比率，其中至少0.8的比率表明存在所述 靶核酸。在另一实施例中，步骤(b)和(c)重复至少两次。在另一实施例中，步骤(b)和 (c)是在相同的第一和第二温度下重复。第一温度的测量可在第二温度的测量之前进行或 相反。在另一实施例中，所述方法是用作PCR后的检测技术。在另一实施例中，所述方法进 一步包括在单一温度下在试样达到所述温度后在3个或更多个时间点(例如15、30、和45 秒)测量标记强度。在另一实施例中，所述方法进一步包括在不同温度下在3个或更多个 时间点(例如15、30、和45秒)测量标记强度。在一个实施例中，至少0. 9的比率表明存在所述靶核酸。在另一实施例中，第一温度低于经标记核酸探针的Tm且第二温度高于经标记核 酸探针的Tm。在另一实施例中，第一温度为约400C、约410C、约42 °C、约43 °C、约44°C、 约 45"C、约 46"C、约 47°C、约 48"C、约 49"C、约 50°C、约 51°C、约 52°C、约 53"C、约 54"C、 约 55°C、约 56°C、约 57°C、约 58°C、约 59"C、约 60°C、约 61°C、约 62°C、约 63°C、约 64°C、约 65°C、约 66°C、约 67°C、约 68°C、约 69°C、约 70°C、约 71°C或约 72°C。 在另一实施例中，第二温度为约85°C、约86 V、约87 V、约88 V、约89 V、约90 V、 约 91°C、约 92°C、约 93°C、约 94°C、或约 95°C。在另一实施例中，第二温度为约85°C、约86 V、约87 V、约88 V、约89 V、约90 V、 约 91°C、约 92°C、约 93°C、约 94°C、或约 95°C。在另一实施例中，第一温度为约50°C且第二温度为约95°C。在另一实施例中，经标记核酸探针包括荧光标记。在另一实施例中，核酸探针进一 步包括吸收荧光标记的发射的猝灭剂分子，从而在所述猝灭剂分子与荧光标记相对来说紧 密靠近时，所述荧光标记的荧光发射不可检测或至少可检测性小于所述猝灭剂分子与荧光 标记并不紧密靠近时。在另一实施例中，核酸探针为分子信标或线性探针。在一个实施例中，靶核酸为DNA或RNA。在一个实施例中，根据重复测量来计算平均比率。在另一实施例中，在PCR反应后进行测量。在另一实施例中，PCR反应包括i)使怀疑含有靶核酸的试样与经标记核酸探针在 包括适宜引物、酶和底物的溶液中接触以形成反应混合物；和ii)使所述反应混合物在适 于靶核酸扩增的变性、退火和延伸温度下循环。本文进一步提供检测经标记核酸探针与其靶核酸的杂交的方法，其包括(a)使怀 疑含有靶核酸的试样与可与所述靶核酸杂交的经标记核酸探针接触；(b)在至少两个不同 时间点测量标记强度；和(c)计算所述标记强度随时间变化的斜率。可在等温条件或在不 同温度下如步骤(b)中所述在不同时间点进行测量。在另一实施例中，与并未与靶核酸结合时经标记核酸探针所产生的信号强度相 比，当与靶核酸结合时经标记核酸探针所产生的信号强度随时间有所增加时，正斜率表明 存在所述靶核酸。在另一实施例中，负或零斜率表明不存在靶核酸。在另一实施例中，核酸探针为分子信标或线性探针。在一个实施例中，靶核酸为DNA或RNA。在一个实施例中，在等温条件期间进行测量。在另一实施例中，在PCR反应后进行测量。在另一实施例中，测量是在完成PCR反应后约1分钟至约10分钟的时间内完成。在 另一实施例中，在至少5个不同时间点进行测量。在另一实施例中，在完成PCR后15、30、和 45秒时进行测量。在另一实施例中，PCR反应包括(i)使怀疑含有靶核酸的试样与经标记核酸探针 在包括适宜引物、酶、底物和缓冲剂的溶液中接触以形成反应混合物；和(ii)使所述反应 混合物在适于靶核酸扩增的变性、退火和延伸温度下循环。在另一实施例中，退火和延伸温 度相同。在一个实施例中，斜率是通过获得标记强度随时间变化的一阶导数来进行计算。 在另一实施例中，通过最小二乘法拟合随时间变化的标记强度测量值来计算随时间变化的 标记强度。在另一实施例中，通过将随时间变化的标记强度数据拟合成下列方程y = mx+b 来计算斜率，其中y为标记强度，χ为时间，且m为斜率。在另一实施例中，根据标记强度斜率来计算经标记核酸探针与靶核酸随时间变化 的杂交动力学。


图1是展示低于信标Tm的荧光值除以高于信标Tm的荧光值的比率的图形。发现 正比率(+)仅针对含有芽孢杆菌属(bacillus globigii) (BG)模板(用于研究生物武器的 替代有机体)的试样，且发现负比率(_)是针对缺乏BG模板的对照试样。因此，图1显示， 可使用比率值来正性检测甚至少量的靶试样同时将假阳性降至最低。图2展示6份试样中的荧光值在3-10分钟内的斜率的测量结果。仅含有BG模板 (靶序列)的试样会显示正斜率。图3展示为确定在两个温度及两个不同时间下的标记强度是否可用于精确检测 靶核酸(炭疽热的特异性核酸)的存在同时将假阳性降至最低所实施的PCR反应的结果。 结果显示能可靠检测炭疽热。图4展示为确定在两个温度及两个不同时间下的标记强度是否可用于精确检测 靶核酸(兔热病的特异性核酸)的存在同时将假阳性降至最低所实施的PCR反应的结果。 结果显示能可靠检测兔热病。
具体实施例方式
“核酸探针”意指如下寡核苷酸其为与靶序列互补且由此与所述靶序列特异性杂 交的RNA或DNA。探针可具有任一适宜长度，且在一些实施例中，探针长20至1000个碱基。 任选地，将探针标记并(例如)连接至至少一个可检测报导子分子上。可使用荧光报导子分 子作为报导子分子。荧光报导子可附接至寡核苷酸的一端且荧光猝灭剂分子附接至所述寡 核苷酸的相对端，从而在报导子与猝灭剂紧密靠近时，来自报导子的荧光发射至少部分地 由猝灭剂吸收，由此降低报导子的可检测信号。这些分子还可附接至寡核苷酸的内部部分。 此猝灭机制称作荧光共振能量传递(FRET)且使得探针在与靶结合时的标记强度高于探针 未与靶结合时。标记探针的其它方法包含连接的放射性同位素、单一荧光团、DNA嵌入染料 (例如SYBR绿(SYBR Green))、化学发光分子、亲和标记物、和诸如此类。可使用业内已知 的方法和方程来计算探针与靶的杂交，(例如)那些阐述于托斯卡司(Tsourkas)等人，核酸研究(Nuc. Acids Res). (2003)31 1319-1330中者，其全部内容以引用方式并入本文中。“分子信标”意指在探针中部具有与靶互补的序列且在5'和3'端具有异源性序 列的探针，所述探针在并未与靶结合且在低于茎结构的有效Tm的温度下时会形成茎_环结 构。分子探针的互补序列可至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、或至少 99%地与靶互补。茎-环使5'和3'端紧密靠近，从而使报导子和猝 灭剂分子发生相互作 用而引起标记强度减小。在与靶结合时，报导子和猝灭剂分子变得相距较远，从而使标记强 度增加。因此，游离分子信标产生较少信号或不产生信号，而与靶序列结合的分子信标在接 近或低于信标_靶杂合体的有效Tm的温度下具有远大得多的标记强度。分子信标探针在 业内已众所周知且阐述于(例如)马拉什(Maras)等人，临床化学学报(Clinica Chemica Acta) (2006)363 48-60 中。“线性探针”意指不具有特定二级结构的探针。探针可100%地与靶互补或仅部分 地与靶互补。举例来说，探针可至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、或至 少99%地与靶互补。除非另有所述，否则“探针”大体来说涉及核酸探针、分子信标、和线性探针。换句 话说，除非另有所述，否则本文所用的“探针”涵盖核酸探针、分子信标、和线性探针。“靶核酸”意指试样中欲使用互补PCR引物和探针检测的核酸。靶可为DNA，例如基 因组DNA、细菌DNA、病毒DNA、附加型DNA、或合成DNA。靶可为RNA，例如mRNA、rRNA、tRNA、 病毒RNA、细菌RNA、或合成RNA。含有靶核酸的试样可来自任一来源。所述试样包含(例 如)生物试样、环境试样、临床试样、活体外试样、和组织试样。举例来说，试样可来自怀疑 经生物战剂污染的材料。靶核酸的具体实例包含但不限于编码炭疽热、兔热病、瘟疫、和通 用型正痘病毒(pan orthopox)基因组中的至少一部分的核酸。自用于PCR反应的所述试 样提取核酸的方法在业内已众所周知且可使用所述方法。探针和引物可多路复用以检测单一反应中的一个以上的靶。通常，不同引物组扩 增不同靶核酸，并且检测靶的探针可具有不同标记(例如不同荧光团)，从而两个靶可在相 同反应中区分开来。所述方法在业内已众所周知，(例如)那些阐述于贝朗格(Belanger) 等人，临床微生物学期刊(2002)40:1436-1440中者。在另一实施例中，不同引物组扩增不 同靶核酸，并且检测靶的探针可具有相同标记(例如相同荧光团)。探针可在不同温度下杂 交，从而使得每一探针尽管具有相同标记但可在相同反应中区分开来。此可称作在温度空 间中多路复用。此外，可使用多个反应来筛选多个靶，例如筛选试样中的致病有机体或疾病基因。 可以多孔模式(例如96-孔板)实施所述反应。“标记强度”意指自探针所检测信号的振幅。所检测的特定信号取决于探针。举 例来说，检测经荧光探针标记的探针的荧光。在使用FRET基探针标记时，标记强度与结合 靶的探针量成正比，且由此与试样中的靶量成正比。同样，在使用DNA嵌入报导子分子(例 如SYBR绿)时，荧光随着更多报导子纳入新合成的双链DNA中而增加。因此，可使用标记 强度作为确定试样中是否存在靶核酸、和(任选地)试样中存在的靶量的方式。举例来说， 可将标记强度与使用已知量靶产生的标准曲线进行比较，从而内插结果并测定试样中的靶 量。所述方法在业内已众所周知。在一些实施例中，使用代替单位来记录或表示标记强度。举例来说，装置可将来自荧光探针的荧光检测或记录为特定电压。此代替单位-电压在此具体实例中可视为标记强度。 “杂交”意指两个单链聚核苷酸组合形成一条双链聚核苷酸链。核酸可为DNA或 RNA,并且可形成DNA-DNA、RNA-RNA、或DNA-RNA双链聚核苷酸或三链杂合体。杂交具有序 列特异性，并且可使用二阶方程来计算杂交动力学，如(例如)托斯卡司等人，核酸研究 (2003)31 :1319-1330所述，其以引用方式并入本文中。还可通过测量在分子信标与同源序 列杂交期间其随时间的荧光增加来计算杂交动力学。分子信标在一端经荧光分子标记且在 另一端经猝灭剂分子标记。随着分子信标与其互补序列发生杂交，报导子荧光素以物理方 式与猝灭剂分子分离且荧光有所增加。然后可使用标记强度斜率以荧光增加比率形式来测 量杂交动力学。“Tm”或“熔融温度”意指50%的探针分子与靶核酸发生杂交而50%的探针分子在 溶液中保持游离状态时的温度。Tm可(例如)使用式Tm= 2[A+T]+4[G+C]来进行计算，或 通过出于此目的特定生成的软件程序来确定。Tm的计算在业内已众所周知。“标记强度随时间变化的斜率”意指标记强度或标记强度变化随时间变化的图线 的直线斜率。随着探针与其特异性互补模板发生杂交，标记强度有所增加。在给定时间内， 较多探针与模板发生杂交，从而使得荧光(标记强度)随时间增加。因此，斜率可测量为随 时间的强度或随时间的强度变化。所述斜率可通过诸如以下方式来计算获得标记强度随 时间变化的一阶导数，通过最小二乘法拟合随时间变化的标记强度测量值来计算，或将随 时间变化的标记强度数据拟合成下列方程y = mx+b，其中y为标记强度，χ为时间，且m为 斜率。可使用业内已知的任一适宜方法来测定斜率。另外，可根据标记强度随时间变化的 斜率以此方式来计算经标记核酸探针和靶核酸的杂交动力学。可使用下式来测定由点(Xl，Y1)和(x2，y2)定义的直线斜率
y2 -yt■“r-
xI-xI其中m为直线斜率且X1 Φ χ2。所属领域技术人员可以任一数量的方式来使用此 方程。举例来说，可将直线拟合成数据且然后可应用方程以测定斜率m。另一选择为，可计 算许多不同点的斜率m并计算平均值以测定斜率。在一些实施例中，使用连续时间点的数 据来重复计算斜率。“约”意指所示值加或减所述值的5%的值。“PCR”意指基于连续循环反应温度的重复性靶核酸扩增反应，所述反应包括靶 (可来自试样)；DNA聚合酶(例如Taq聚合酶或其它热稳定聚合酶)；至少一与靶互补的引 物；与靶的扩增部分互补的探针；脱氧核苷三磷酸；和缓冲溶液(包括二价阳离子)。各组 份的适宜浓度在业内已众所周知且可根据已知优化参数进行调节。每一循环通常包含3个 步骤在85-10(TC下变性，在37-60°C下退火，和在40-75°C下延伸。每一步骤可长10-300 秒，优选地为30-120秒。各步骤的确切温度可根据靶序列以及熟知参数而有所变化。举例 来说，退火温度可为低于引物Tm(可如上所述进行计算)约5°C的温度。存在许多可用于 计算PCR步骤的最佳温度的软件程序。每一循环均可包括两个步骤第一步骤为变性，且第 二步骤为将退火和延伸步骤合并至一起。“热起动”聚合酶可包含任选的初始变性步骤。另 夕卜，还可包含最终延伸步骤以确保任一剩余单链DNA分子均完全延伸。实施PCR的具体方案在业内已众所周知且可参见(例如)最新分子生物学实验方法汇编(2008年4月，印刷 ISSN 1934-3639 ；在线 ISSN 1934-3647)。可将PCR反应循环描述为早期、晚期和最终阶段。在早期阶段，随着靶序列发生接 近100%效率的倍增，发生指数式扩增。随着试剂消耗，反应进入晚期阶段且效率下降。此 阶段有 时称作线性阶段，但反应实际上在此阶段具有高度可变性，此取决于试剂可用性和 聚合酶性能。最终阶段是由于试剂和酶耗尽而不再进一步有靶序列发生累积的时期。“实时PCR”(也称作定量或Q-PCR且最初阐述为5 ‘核酸酶PCR分析)涉及在PCR 反应期间测量由双重标记探针的酶解离所产生的信号(标记强度)。由与靶序列结合的探 针的解离所产生的信号与反应中的靶序列量成正比。通过将所述信号与已知标准相比较， 可确定试样中存在的靶量。“端点PCR”通常涉及测量反应中晚期或最终阶段的标记强度。无需完全耗尽试剂。 尽管试样中的靶在使用此方法时量化的准确度可能小于实时PCR，但靶已最大程度地扩增 从而由于靶在PCR反应的最终阶段中具有较大丰度而能稳定地检测其存在。“不对称PCR”涉及用于相比靶核酸中的一条链优先扩增另一条链的PCR技术。通 常，通过使用大量用于优选核酸的引物来优先扩增靶核酸。特异性不对称PCT方案在业内 已众所周知。扩增靶的特异性检测仍然是所有PCR反应的限制性特性，不管标记强度的类型或 测量时间如何。可以任一适宜热循环器和模式(例如96或384孔板)来实施PCR。另一选择为， PCR反应可在现场适用装置中实施，例如购自史密斯检测公司(Smiths Detection)的比奥 斯球(BIOSEEQ) PLUS 装置。可使用(例如)计算机软件或硬件来自动计算标记强度随时间变化的斜率。在一 些实施例中，检测标记强度，并且将此检测的输出结果传输至用于数据操纵的处理器。处理 器实施必需的计算并将数据以数字、图形或其它可解释的输出结果返回至使用者。在其它 实施例中，使用者获得信号强度数据并人工操纵数据。可使用标准数学方法或计算机程序 (例如微软(Microsoft)的EXCEL程序，包含2007版)来人工操纵数据。在一个实施例中，通过测量至少两个不同温度下的标记强度来检测经标记核酸探 针与其靶核酸的杂交。在一个实施例中，所述方法包括使怀疑含有靶核酸的试样与可与所 述靶核酸杂交的经标记核酸探针接触，且在第一温度和第二温度下测量标记强度，其中所 述第一温度小于所述第二温度或相反。计算较低温度下的标记强度除以较高温度下的标记强度的比率。因此，所得数值 越高，则反应中所含靶的浓度越高。比率数值的具体值取决于许多因素，包含所用仪器的标 记强度标度。大于1的比率可表明存在靶。在一些实施例中，约0.9、1.0、1. 1、1.2、1.5、2、
5、10、20、或50的比率表明存在靶核酸。还可使用所述比率来计算存在靶的量。可通过(例 如)比较所述比率与标准来进行此测定。测定表明存在靶核酸的比率的另一方面是测定不 含靶核酸(可称作分析噪音)的反应的基线比率。确定存在靶核酸的比率可(例如)为高 于噪音5或更多个标准偏差。在一些实施例中，表明存在靶核酸的比率可为高于噪音2、4、
6、8、10、或15或更多个标准偏差。根据所用探针，还可直接自比率来计算所述量而无需与 标准进行比较。
测量标记强度的温度可根据特定应用而有所变化，并且适宜温度可易于由所属领 域技术人员来进行计算。温度的选择取决于探针的Tm和序列。具体来说，较高温度大于探 针的Tm，并且较低温度小于探针的Tm。在一些实施例中，较高温度为至少约90°C且较低温 度为约50°C或更低。举例来说，较高温度可为至少951、1001、1051、或110°C，并且较低 温度可为 51、101、151、201、251、301、351、401、或451。在一些实施例中，在 两个以上的温度下测量强度。举例来说，可在第一、第二、和第 三温度下测量强度，其中第一、第二、和第三温度各不相同。所有温度下的相似值表明特异 性结合。相似值可意指相差至多20%、至多15%、至多10%、至多5%、至多3%、或至多 的值。通过增加所用温度的数量，可增加结果的置信度。可在一或若干个时间点计算比率。举例来说，可在PCR反应后测量标记强度以确 定存在为PCR反应的标的物的靶核酸。还可在实施PCR反应之前测量标记强度。表明存在 靶核酸的比率可由此避免不必要的PCR。可根据较高和较低温度中每一者下的单一读数来计算比率。或者，可在较低或较 高温度下获得多个读数并取其平均值。可使用此平均法来防止由不正确读数所引起的误差。在一个实施例中，可通过测量标记强度随时间变化的斜率来检测经标记核酸探针 与其靶核酸的杂交。由于含有靶的试样中的靶量因PCR而随时间增加，所以更多探针随时 间与靶进行杂交。因此，可使用随时间变化的标记强度来确定在试样中存在靶。另外，可使 用随时间变化的标记强度来确定探针/靶的相互作用的杂交动力学。在一个实施例中，所述方法包括使怀疑含有靶核酸的试样与可与所述靶核酸杂交 的经标记核酸探针接触并在不同时间点测量标记强度。标记强度随时间变化的斜率表明存 在靶核酸和探针与靶核酸的杂交动力学。具体来说，在探针与靶杂交而标记强度增加时，正 斜率表明存在靶核酸，并且在不含与探针杂交的靶而探针标记强度降低时，负或零斜率表 明不存在靶核酸。类似地，还可使用斜率并利用熟知的动力学方程来确定杂交动力学。可以所属领域技术人员易于知晓的任一数量的方式来计算标记强度随时间变化 的斜率。举例来说，可使用已知数值方法将标记强度数据拟合成直线。这些方法包含最小 二乘法拟合(线性和非线性)、线性回归(y = mx+b)、最佳拟合指数曲线、二次回归、三次回 归、和多项式回归。可通过获得对数据的线拟合的一阶导数以分析方式或数字方式来计算 标记强度的斜率。所属领域技术人员已熟知所述数学计算。可在等温条件或不同温度下测量标记强度。在一个实施例中，所有标记强度测量 均是在单一温度下进行。在另一实施例中，标记强度测量可在不同温度下进行。此情形可出 现于冷却或加热PCR反应混合物期间。在又一实例中，标记强度可在不同温度下测量。根 据此数据，可计算不同斜率。举例来说，可在第一温度Tl下获得多个数据点，随后在第二温 度T2下获得多个数据点。根据此数据，可计算两个不同斜率，一个对应于Tl数据且一个对 应于T2数据。通过改变测量标记强度时的温度，可研究杂交动力学。可在任一时间测量强度。可在PCR后或PCR期间进行测量。在一些实施例中，在 PCR后10分钟时进行测量。还可在PCR后5、4、3、2或1分钟时进行测量。在一个实施例 中，在约15sec、30sec、和45sec时进行测量。测量间的时间可有所变化。举例来说，测量可相隔至少约lOsec、约15sec、或约20sec。还可在一定时间内快速连续地进行测量。强度测量次数还可有所变化。通常，增加数据点数量可增加直线斜率的置信度。然而，可使用少至两个的数据点来测定斜率。在一些实施例中，使用2个、3个或4个数据点来 测定斜率。实例实例1 通过在两个温度下测量标记强度来降低假阳件。实施PCR反应来确定两个温度下的标记强度是否可用于精确检测靶核酸的存在 同时将假阳性降至最低。PCR反应(各25 μ L)阐述于下表1中，并且所用引物序列阐述于 表2中。
权利要求
1.一种用于检测经标记核酸探针至其靶核酸的杂交的方法，其包括(a)使怀疑含有靶核酸的试样与可与所述靶核酸杂交的经标记核酸探针接触；(b)在第一温度和第二温度下测量标记强度，其中所述第一温度小于所述第二温度；(c)计算(i)所述第一温度下的所述标记强度与(ii)所述第二温度下的所述标记强度 的比率，其中至少0. 8的比率表明存在所述靶核酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中至少0.9的比率表明存在所述靶核酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一温度低于所述经标记核酸探针的Tm且所述 第二温度高于所述经标记核酸探针的所述Tm。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第二温度为约85°C、约86°C、约87°C、约88°C、 约 89°C、约 90°C、约 91°C、约 92°C、约 93°C、约 94°C、或约 95°C。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述第一温度为约40°C、约41°C、约42°C、约43°C、 约 44"C、约 45"C、约 46"C、约 47°C、约 48"C、约 49"C、约 50°C、约 51°C、约 52°C、约 53"C、 约 54°C、约 55°C、约 56"C、约 57°C、约 58°C、约 59°C、约 60°C、约 61°C、约 62°C、约 63°C、约 64°C、约 65°C、约 66°C、约 67°C、约 68°C、约 69°C、约 70°C、约 71°C、或约 72°C。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述第一温度为约50°C且所述第二温度为约95°C。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述经标记核酸探针包括荧光标记。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述核酸探针进一步包括吸收所述荧光标记的发射 的猝灭剂分子，以便当所述猝灭剂分子与所述荧光标记紧密靠近时，所述荧光标记的荧光 发射不可检测或至少小于所述猝灭剂分子与所述荧光标记并不紧密靠近时的荧光发射。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸探针为分子信标或线性探针。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸为DNA。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸为RNA。
12.如权利要求1所述的方法，其中(b)和(c)重复至少两次。
13.如权利要求12所述的方法，其中根据重复测量值来计算平均比率。
14.如权利要求1所述的方法，其中(b)和(c)是在相同的第一和第二温度下重复。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述测量是在PCR反应之后进行。
16.如权利要求13或14所述的方法，其中所述PCR反应包括i)使怀疑含有所述靶核酸的试样与所述经标记核酸探针在包括适宜引物、酶和底物的 溶液中接触以形成反应混合物；和 )使所述反应混合物在适于所述靶核酸扩增的变性、退火和延伸温度下循环。
17.一种用于检测经标记核酸探针至其靶核酸的杂交的方法，其包括(a)使怀疑含有靶核酸的试样与可与所述靶核酸杂交的经标记核酸探针接触；(b)在至少两个不同时间点下测量标记强度；和(c)计算所述标记强度随时间变化的斜率。
18.如权利要求17所述的方法，其中当与未结合所述靶核酸时所述经标记核酸探针所 产生的信号强度相比，结合所述靶核酸时所述经标记核酸探针所产生的信号强度较大时， 正斜率表明存在所述靶核酸。
19.如权利要求17所述的方法，其中负或零斜率表明不存在所述靶核酸。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述靶核酸为DNA。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述靶核酸为RNA。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述经标记核酸探针为荧光标记的核酸探针。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述核酸探针为分子信标或线性探针。
24.如权利要求17所述的方法，其中所述测量是在等温条件期间进行。
25.如权利要求17所述的方法，其中所述测量是在PCR反应之后进行。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述测量是在所述PCR反应完成后约1分钟至约 10分钟的时期内完成。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述测量是在至少5个不同时间点下进行。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述PCR反应包括(i)使怀疑含有所述靶核酸的试样与所述经标记核酸探针在包括适宜引物、酶、底物和 缓冲剂的溶液中接触以形成反应混合物；和( )使所述反应混合物在适于所述靶核酸扩增的变性、退火和延伸温度下循环。
29.如权利要求17所述的方法，其中通过获得所述标记强度随时间变化的一阶导数来 计算所述斜率。
30.如权利要求29所述的方法，其中通过最小二乘法拟合随时间变化的标记强度测量 值来计算随时间变化的所述标记强度。
31.如权利要求17所述的方法，其中通过将随时间变化的所述标记强度数据拟合至下 列方程来计算所述斜率y = mx+b，其中y为标记强度，χ为时间，且m为所述斜率。
32.如权利要求17所述的方法，其中使用下式来计算线的所述斜率其中m为所述线的所述斜率，(Xl，Yl)和(x2，y2)为所述至少两个不同时间点，且X1 / X 2 ο
33.如权利要求17所述的方法，其进一步包括根据标记强度随时间变化的所述斜率来 计算所述经标记核酸探针与靶核酸的杂交动力学。
34.如权利要求17所述的方法，其中有至少两个各自与不同靶核酸杂交的经标记核酸 探针，且其中每一探针在不同温度下发生杂交。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述经标记核酸探针各具有相同标记。
全文摘要
本发明提供用于改进经标记核酸探针(例如那些用于PCR反应中者)的结合的检测准确度的方法。一种所述方法包括在较高温度和较低温度两个不同温度下测量标记强度(例如荧光)，且然后计算所述较低温度下的所述标记强度与所述较高温度下的所述标记强度的比率。另一方法包括测量PCR后的至少两个时间点下的标记强度并计算所述标记强度随时间变化的斜率。测量所述探针结合至靶核酸的杂交动力学允许计算比率斜率，此使得此方法具有良好的检测特异性。
文档编号C12Q1/68GK102112632SQ200980130801
公开日2011年6月29日 申请日期2009年8月10日 优先权日2008年8月8日
发明者巴里·爱德华·博伊斯, 约翰·罗伯特·林克 申请人:史密斯探测公司