专利名称：3d空间中dna的单链空间构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物聚合核酸的三维可寻址阵列和这种阵列的制造方法。这样的阵列可用互补化学反应性探针官能化以提供催化酶。
背景技术：
本申请与以下申请有关，其每一个通过引用并入本文2007年3月15日提交的美国临时申请60/918，144 ；2007年8月30日提交的美国临时申请60/969，154 ；2007年11月 6日提交的美国临时申请60/985，961 ；2007年11月6日提交的美国申请11/936，045 ;2008 年2月28日提交的美国临时申请61/-032，118;2008年3月14日提交的PCT申请PCT/ US08/57013 ；2008年4月10日提交的美国临时申请61/043，981 ；2008年4月23日提交的美国临时申请61/047，201 ；2008年4月29日提交的美国临时申请61/048，599。本文引用的参考文献可帮助理解本发明，其每一个通过引用并入本文。
发明内容
本发明涉及一种生成连接于三维(3D)基质的生物聚合物核酸的可寻址阵列的方法，所述可寻址阵列可用作纳米级制造平台。生物聚合物核酸可包括DNA、PNA、 RNA或LNA。生物聚合物核酸可利用以下而结合于基质蘸水笔纳米平版印刷(dip pen nanolithography)、飞秒激光介导的经由牺牲层的图样形成、激光介导的在表面上预形成的沟槽或凸起上平版印刷、或磁性介导的跨带轮廓的表面的对齐。生物聚合物核酸可连接于金属(如，金)、塑料和/或聚合物基质。诸如氨基酸的不同分子可连接于3D可寻址平台。活化的平台可用作催化剂或酶活性位点模拟物。平台可用于经由组合化学生成新型催化剂。本发明还涉及一种利用触压成型复制连接于3D基质的生物聚合物核酸的可寻址阵列的方法，其中将被复制的阵列转移到扁平模具或滚筒。可选地，复制方法可包括利用压力成型，其中向构造为囊状的弹性物质施加压力，或其中由于环境变化(加入试剂、温度等等)弹性材料延展以与被复制的阵列相互作用。附图简述并入说明书并形成说明书的部分的附图阐述了本发明，并与说明书一起描述本发明。附图中，同样的元件标以同样的数字。图IA是纤维素酶沿纤维素微原纤维前进的示意图。图IB是与ssDNA轴向 排列并与官能化探针杂交的合成的糖苷水解酶(El内切葡萄糖苷酶模拟物)平台示意图。图IB 还显示了用于尺寸比较的纤维素寡聚物。图2是顺从于以纳米级平版印刷制造的示例性酶活性位点样主形状示意图，包括圆筒、尖的(有尖顶的)凹槽、半月形(cleft)/弧坑(crater)和复合螺旋。图3A是以规则2D图样排列的ssDNA示意图。图3B是在3D单变量半径模具顶上平版印刷的ssDNA示意图。显示了用于操纵金模板元件的静电势的电引线。
图4是剥离生产的SSDC特异性变化的示意图。图5是用于基于NIL生产模板和平台的代表性模具的示意图。图5A是半球形模具的滚筒型阵列。图5B是截顶圆锥形模具的扁平模具型阵列。图6是从模板生成3D平台的示意图。图7是利用弹性模板材料从主体生成3D模板的示意图。图8是利用膨胀性模板材料从主体生成3D模板的示意图。图9是示例性ssDC催化剂的示意图。
图10是具有螺旋形和半月形几何学的通用催化平台的组装示意图。图11是示例性ssDC “芯片催化剂(Catalyst-on-a-Chip)，，的示意图。图12A-C是实现赛博化(cybernetization)的技术的示意图。图13是二十种天然产生的氨基酸的示意图，代表生物酶的绝大多数单体成分。图14A-C是外壳内催化作用的示意图。图15是包含以曲线图样在金上平版印刷的永久性ssDNA的示例性主形状示意图。图16是在DPN-布点的接受点上迭代地锚定，并在模板形状上线性拉伸以产生笛卡尔图样的ssDNA的示意图。图17是经由以SA或抗-DIG抗体官能化在牺牲层上的Fsec激光耗竭点上迭代地锚定，并在主形状上线性拉伸的ssDNA的示意图。图18是在2D表面和3D主轮廓上的Fsec激光-耗竭点上迭代地锚定，并在预先平版印刷的沟槽内曲线或线性地拉伸的ssDNA的示意图。图19是经由线性矢量磁场线，拉伸一条ssDNA链从Fsec激光-平版印刷的锚定点进入转变为沟槽或凸起的围隧道的示意图。图20是经由从易于在磁场中移位的胶体外壳解旋和解开，拉伸硫代磷酸酯-修饰的ssDNA链到平版印刷的金上的示意图。实现本发明的方式和工业适用性部分I.单链空间构建单链空间构建(SingleStrand Dimensional Construction)(在本文还称为 "ssDC" ；"Single Strand Dimensional Construction” 和 “ssDC” 二者是 hcitor LLC 的商标)利用单链DNA和纳米级形式来寻址三维(3D)空间中的物理化学官能性并开发和产生要求特别放置离散分子的纳米级3D结构，以提供催化剂和其它产物。组合了多相催化作用、聚合物动力学、多界面有机合成、超分子组装、微阵列和定向进化/组合化学(DE/CC)的各方面，ssDC能够使得大量生产不同产物。实例包括复制和改进几乎任何现有酶的潜能， 和发现催化作用的新模式。ssDC 是基于单链模板制造方法(Single Strand Template Manufacturing process)(在本文还称为 “SSTM”；“SSTM” 和 “Single Strand Template Manufacturing" 二者是hcitor LLC的商标)，该方法可以模板化方式从DNA直接合成模拟肽、生物聚合物和其它分子构建体。以SSTM，DNA地址的高密度阵列被固定于具有几何精度的二维QD)表面，用作制造平台，在其上便于经由杂交和偶合化学进行合成，该合成经由固相上的DNA与在松散、液相中聚合的单体成分之间的稳定界面发生。因为ssDC中的制造平台形状不限于2D(或“平面”)几何，也不要求合成后从模板脱离(de-link)终产物，ssDC还提供了在另外的维度有利的条件下进行以上功能的选择。 所以，3D平台还可用作许多产物和方法的基础，所述产物和方法例如拓扑学促进的多界面合成、具有立体特异性放置的成分的超分子产物的从下到上组装、和在其上进行酶样功能的催化中心。这些实例应用中的第三个，即产生模拟酶或生物激发的多相催化剂的平台的应用，将在本文详细描述。本文描述的技术和方法意为仅是总体技术和其应用的示例 。利用ssDC作为生成催化剂的方法的实例本发明应用的一个实例是开发具有酶激发的几何的生产模板和催化平台，可用于生物燃料工业。大多数纤维素酶和其它糖苷水解酶主要在半月形样活性位点中进行其功能，所述活性位点识别、结合和放置底物，稳定和促进中间产物形成，并产生和释放产物 _ 通常是可发酵的糖(参见 G. J. Davies 和 B. Henrissat,"Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases (糖基水解酶的结构和机制)，” Structure 3,853 (1995))。本发明使得能够成功构建纳米级催化剂，该催化剂能模拟这种几何和官能性，而在其构建中利用更有弹性的材料。图1阐释了上述概念。图IA显示纤维素酶沿纤维素微原纤维的前进(public domain image of the U. S. Dept. of Energy, Oak Ridge National Laboratory, ORNL Review 40(1)，(2007))。图IB显示与ssDNA轴向排列并与官能化探针杂交的合成的糖苷水解酶(El内切葡萄糖苷酶模拟物)平台。在平台上方显示了用于尺寸比较的纤维素寡聚物。利用ssDC生成催化剂的方法可包括以下步骤a)生成具有模拟酶活性和/或结合位点的几何的纳米级尺寸的形状；b)将ssDNA以可重复和可预测方式结合至纳米形状； c)利用大量生产技术任选地复制这些充有ssDNA的纳米形状；并d)通过将结合于不同分子诸如氨基酸的互补ssDNA序列结合到纳米形状上特定位置，而将充有ssDNA的纳米形状官能化。为了本说明书的目的，从步骤a)和b)获得的充有ssDNA的纳米形状称为“主体 (master) ”。这些主体的镜像称为“模板(template) ”。以结合至感兴趣的不同分子的ssDNA 序列官能化的主体的准确复制品称为“平台”。如将变得明显的，如果主体最终被官能化，主体也可以是平台。术语“聚核苷碱基”或“生物聚合物核酸”是指单链DNA、以单聚合(均勻单体)、 混杂单体(即，脱氧核糖核苷酸与核苷碱基氨基酸的共聚物，保持碱基的大约0. 5nm 间隔和堆叠能力)的RNA、PNA或LNA单链或杂合聚合组合。作为本发明的一个实例，符号“ssDNA”在本文用于表示为了永久附着到主体上而修饰的以上生物聚合物核酸的任一种-将用作模板平版印刷的互补生物聚合物。主体的产生产生主体的方法开始于形成凹的或凸的3D纳米形状。这些纳米形状可由大量不同方法生成，所述方法包括但不限于，电子束平版印刷、纳米压印平版印刷、和/或蘸水笔纳米平版印刷。为了该实例的目的，设想了半月形凹陷，该半月形凹陷由3D图样转移纳米压印平版印刷产生(参见Y. S. Kim等人，“Three-dimensional pattern transfer and nanolithography :modified soft molding(三维图样转移和纳米平版印刷改进的软模制)，”AddI. Phys. Lett. 81,1011(2002)),或由可通过选择性去除在硬铸材料上沉积的牺牲层而产生具有正确模具形状、大小和间隔距离(至+/-IOnm)的阵列的光束或电子束平版印刷方法产生(参见S. Y.Chou等人，“Sub 10 nm Imprint Lithography and Applications (亚 IOnm 压印平版印刷和应用)，” T. Vac. Sci. jTechnol. B 15(6), 2897 (1997) )0可没有本文所述的所有步骤而完成该方法(例如，可从官能化主体直接制造催化剂)，例如，可颠倒以从凸的形状而不是凹的形状开始。确定半月形的准确形状和尺寸时，可使用来自酶的活性位点和/或结合位点的测量值，可使用计算机生成的酶的活性位点模型，或形状可仅仅由哪些形状容易获得而确定。为了模拟催化作用，形状的终产物形式可以物理化学基团官能化。然后通过光束或电子束平版印刷和通过其它方法，这些相同形状的阵列可装配到表面诸如Si(IOO)或SiO2 (许多实例的两种)或其它材料上，然后由原子力显微术(AFM)以轻敲模式、扫描电镜或其它纳米级可见度显微术检验质量以证实拓扑学。图2显示顺从于以纳米级平版印刷制造的示例性酶活性位点样主形状，包括圆筒 22、尖的(有尖顶的)凹槽M、半月形/弧坑沈和复合螺旋观。已在单表面上合成相同形状的阵列后，取决于用于官能化末端催化剂的方法， 以下两种方法的任一种可发生1)这些主形状的压制可经由低的固有粘度和小气泡尺寸空间充填聚合物进行(参见G. H. Cross等人，“Refractometric discrimination of void-space filling and swelling during vapour sorption in polymer films (折身寸分析区分聚合物膜中蒸汽吸附期间的孔隙空间填充和溶胀)，，，Analyst 125，2173 (2000))。 铸造后，可通过紫外光或其它方法开始聚合。这些硬铸的、永久的模具可用于反向生产另外的主体，或大量生产终端用户平台；或2)可将ssDNA加至形状的阵列，其中这种形状的阵列称为“主体”。当催化剂的产生要求单独诱导形状(form)、然后加入DNA时，使用第一种方法。无 ssDNA的主体用于引入形状。然后带有ssDNA的主体将DNA加至形状。当形状与DNA在催化剂制造期间同时施加时，使用第二种方法。尽管向主体加入 ssDNA的第二种方法在本说明书的部分III中更充分地描述，加入ssDNA的一些可获得的选项包括(i)蘸水笔平版印刷(dip pen lithography)(其中纳米级笔尖经由静电和界面作用与DNA对齐并拉伸DNA)，(ii)激光介导的图形平版印刷(laser-mediated pattern lithography)到预形成的沟槽或凸起上，这减少了移位不确定性，和/或(iii)利用影响连接于DNA末端的易感物质(susceptible mass)的磁场的线性部分，对拉伸的DNA的磁场图样形成。合成的DNA可被化学修饰以与模板形成共价键，并极接近地(间隔lOnm)加入以在最终产物上形成高密度可寻址阵列图样。产生的图样可以是曲线或笛卡尔的，这便于可预测的寻址并简化物理化学功能和催化作用谱的动态建模。图3显示在参考的出版物中描述的基本图样形成方法上ssDC特异性变化的实例。 图3A显示以规则2D图样排列的ssDNA 31、32、33和34(参见L. M. Demers等人，“Direct Patterning of Modified Oligonucleotides on Metals and Insulators by Dip-Pen Nan0lith0graphy(修饰的寡核苷酸由蘸水笔纳米平版印刷在金属和绝缘体上直接的图样形成).，，Science 296. 1836 (2002) ) 0图显示在3D单变量半径模具(如，钛37上沉积 Au 36)顶上平版印刷的 ssDNA 35 (参见 C. M. Waits 等人，“Microfabrication of 3Dsilicon MEMS structures us ing gray-scale lithography and deep reactive ion etching (利用灰度平版印刷和深度反应性离子蚀刻而微制造3D硅MEMS结构)，，，Sensors and Actuators A 119, 245 (2005))。还显示了可用于操纵金模板元件的静电势的电引线38 和39。 已经构建主体后，可以以下三种方式的一种使用主体1)如果其上没有ssDNA，则可用于复制纳米形状；2)如果其上有ssDNA，则可用于在非-ssDNA活化的主体产生的形状上复制ssDNA的格栅(grid)(以及可能的形状)；或3)如果其上有ssDNA，其可具有与其连接的互补探针以使主体官能化，使其成为“平台”、或官能化的ssDC产物。有多种利用主体来生成模板并最终生成平台的方法，要求是加速生产和降低生产成本。这些方法的实例包括触压成型和压力成型，其每一种在以下详述。这些术语不意为暗示本说明书之外可能存在的、使用这种术语的任何方法。以下部分描述了用于生成模板和平台的“触压成型”和“压力成型”技术。触压成型在触压成型中，可使用两种不同主体。第一种由仅具有形状的主体构成。这种主体被压印在软的聚合物材料上，聚合物由紫外光或其它方法硬化，通过剥离去除模板，以成规模的量生成最初的主形状。图4显示包含在参考的出版物中描述的基本主题上ssDC特异性变化的剥离生产(参见 P. W. Snyder 等人，“Biocatalytic Microcontact Printing (生物催化微触点印刷)” · J. OrR. Chem. 72. 7459 (2007)和 Duke University Office of News and Communications, Sept. 2007)。将具有模制的形状42的模板41与寻址核苷酸43杂交，然后压印到聚合物平台44上，释放压印期间的探针ssDNA 45并保留镜像互补地址。通过利用其上附加有ssDNA的主体，可将ssDNA加入到这些成型的模板。预期形成模板的可寻址阵列的互补DNA或PNA (肽核酸)可与带有ssDNA的主体杂交，为了图样转移将带有ssDNA的主体“上墨(inking)”。与放置在主体上的DNA互补的核苷碱基序列和镜像可作为模板大量生产。在大多数情况下，模板可从滚筒型模板产生或通过由带有ssDNA的主体与空模板重新对齐由压印和剥离(stamp-and-peel)模具而产生。图5显示利用在参考的出版物中描述的基本主题上ssDC特异性变化，可用于基于NIL地生产模板和平台的代表性模具。图5A 显示半球形模具的滚筒型阵列(参见H. Tan等人，“Roller nanoimprint lithography (滚筒纳米压印平板印刷).，，J. Vac. Sci. Technol. B 16(6). 3926(1998))。图5B显示截顶圆锥-形模具的扁平模具型阵列(参见S. Diegoli等人，“Engineering nanostructures at surfaces using nano 1 i tho graphy (利用纳米平版印刷在表面建造纳米结构)，” Pr ο c. Inst. Mech. EnR. G .!. Aerospace EnR. 221 (4). 589 (2007))。为了便于转移模板ssDNA或PNA，并保留主体的可再用性，平版印刷的ssDNA可与主体材料共价键合，如，经由金上的硫代磷酸酯键、或硅氧烷官能化的硬铸Si (100)上的胺 ssDNA骨架。此外，以保留镜像图样和模板的可寻址性(即，“核苷碱基向上”)的方式将聚合物转移到模板上可通过以下来促进温度、主体表面能和电势变化、UV或其它聚合方法、 辊筒还是剥离转模、溶剂化、润滑(摩擦学)、机械和其它因素。平台可以与模板相同的方式制造，但利用带或不带ssDNA的模板而不是带或不带ssDNA的主体。
图6阐释对3D模板和平台二者的ssDNA转移方法。该图显示平版印刷到金模板 64上的带硫代磷酸酯骨架的SSDNA62，在从平台66剥离后，留下互补地址DNA或PNA68。压力成型复制主体为模板和/或平台的另一种示例性方法还使用在某些条件下变成弹性或膨胀性的软聚合物或其它材料。主体可放在限制横向移动的容器中。预期形成模板的可寻址阵列的互补DNA或PNA可与带有ssDNA的主体杂交，为了图样转移将带有ssDNA的主体“上墨(inking)”。然后可将软聚合物或其它弹性或膨胀性材料加入到容器中。如果材料是弹性的， 弹性材料可构造为囊。可准备囊的外表面以永久地结合至ssDNA。可向弹性囊内部施加压力，迫使材料膨胀为容器的尺寸，粘附到主体的形状并获取预先杂交于主体的互补DNA。然后弹性材料可以适于其固有性质的方式诸如UV熟化或其它方法固化。如果材料是膨胀性的，可采取相同步骤，只是不同于应用压力，可向材料引入导致膨胀的条件(如，温度变化、 PH变化等等)，驱使其粘附至主体的形状并获取ssDNA。图7和8证实这些方法。图7显示利用弹性囊从主体生成3D模板。压力迫使模板弹性材料膨胀，呈现主体的形状并连接于此前放置在主体上的互补ssDNA。模板键合至互补ssDNA后，可剥掉模板。图8显示利用膨胀性材料从主体生成3D模板。环境变化迫使模板膨胀性材料膨胀，呈现主体的形状并连接于放置在主体上的互补ssDNA。然后可剥掉模板。平台的制造可以与模板制造相同的方式进行。可使用模板代替主体来构建平台。 可如所需地重复这些方法多次以生成所需的大量平台。活化平台为催化剂 ssDC平台可视为纳米级3D高密度可寻址阵列，其中DNA或PNA形成纳米水平准确的可复制为数十亿的拷贝的图样。平台的形状部分地使得其顺从于转化为酶样催化剂，因为其相似于活性位点的尺寸和形状，可寻址DNA提供了以携带反应性化学基团的互补探针 “活化”这些形状的能力。杂交后，这些基团将位于平台中类似于便于酶中催化作用的活性位点氨基酸垂直侧链的位置，该酶是产生主形状时最初模拟的酶。造成催化过程期间发生的构象变化(由化学基团和与平台地址杂交的探针之间接头提供的功能)、表面能、摩擦学、溶剂化和对催化作用重要的其它因素，现在活化的平台是具有结合净化的纤维素质或藻酸材料、稳定和催化过渡态的形成、并释放解聚合的糖的能力的ssDC产物，正如同天然纤维素酶(糖苷水解酶)和藻酸酶(反式脂酶)。使用最初为微处理器工业开发的纳米压印的聚合物平版印刷提供的另一益处是任选地整合促进酶活性位点移动的电子、磁性、光学和其它系统，如，经由移位、震动和/或改变活化的平台的某些部分的构象的纳米级致动器。催化作用谱中酶活性位点柔性是底物结合、过渡态形成、产物释放和其它活性的关键部分，其不存在阻止有效催化作用并使得活性位点为“静态多相催化剂”(参见E.Z. Eisenmesser等人，“Enzyme Dynamics During Catalysis (催化作用期间的酶动力学)，” Science 295(5559). 1520(2002) ；Μ. Karplus 和 J. Kuriyan,"Molecular dynamics and protein function (酶云力力学禾口蛋白功能)·，Troc· Natl.Acad. Sci. 102(19). 6679(2005) ；A.Kohen 禾口 J. P. Klinman，"Enzyme Catalysis Beyond Classical Paradigms (酶催化作用超越经典范例)，” Acc. Chem. Res. 31，
权利要求
1.一种生成生物聚合物核酸的三维可寻址阵列的方法，该方法包括a.提供具有表面的纳米级三维主形状，并b.以规则图样将多个主生物聚合物核酸结合到所述主形状的表面。
2.根据权利要求1所述的方法，其中结合步骤b)包括利用蘸水笔平版印刷将所述主生物聚合物核酸结合到所述主形状的表面。
3.根据权利要求1所述的方法，其中结合步骤b)包括利用激光介导的图形平版印刷将所述主生物聚合物核酸结合到所述主形状的表面。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述表面包含多个沟槽或凸起，并且其中每个所述主生物聚合物核酸结合至一个沟槽或凸起。
5.根据权利要求1所述的方法，其中易感物质连接于每个主生物聚合物核酸的末端， 且结合步骤b)包括利用磁场图样形成将每个主生物聚合物核酸结合到所述主形状的表
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米级三维主形状包括圆筒、凹槽、半月形或复合螺旋。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述主生物聚合物核酸包括DNA、PNA、RNA或LNA。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括将多个互补模板生物聚合物核酸与所述主形状上的所述多个主生物聚合物核酸杂交。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括将模板形状的表面与所述多个互补模板生物聚合物核酸结合并从所述主形状去除带有结合的互补模板生物聚合物核酸的模板形状。
10.根据权利要求9所述的方法，其中模板结合包括触压成型。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将被复制的模板阵列转移到滚筒或扁平模具。
12.根据权利要求9所述的方法，其中模板结合包括压力成型。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述压力成型包括向构造为囊状的弹性物质施加压力。
14.根据权利要求9所述的方法，还包括将多个互补平台生物聚合物核酸与所述模板形状上的所述多个模板生物聚合物核酸杂交。
15.根据权利要求9所述的方法，还包括将平台形状的表面与所述多个互补平台生物聚合物核酸结合并从所述模板形状去除带有结合的互补平台生物聚合物核酸的平台形状。
16.根据权利要求1或15所述的方法，还包括将所述主生物聚合物核酸或平台生物聚合物核酸与包含反应性化学基团的互补探针杂交。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述反应性化学基团包括氨基酸。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述反应性化学基团模拟酶活性位点。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述反应性化学基团提供催化剂。
20.一种三维(3D)可寻址阵列，所述三维(3D)可寻址阵列包含以规则图样结合至3D 形状表面的多个生物聚合物核酸。
21.根据权利要求20所述的3D可寻址阵列，其中所述表面包括金属、塑料或聚合物。
22.根据权利要求20所述的3D可寻址阵列，其中所述金属包括金。
23.根据权利要求20所述的3D可寻址阵列，还包含与所述多个生物聚合物核酸的每个杂交的互补探针，每个所述互补探针包含反应性化学基团。
24.根据权利要求23所述的3D可寻址阵列，其中所述反应性化学基团包括氨基酸。
25.根据权利要求23所述的3D可寻址阵列，其中所述反应性化学基团模拟酶活性位点。
26.根据权利要求23所述的3D可寻址阵列，其中所述反应性化学基团提供催化剂。
全文摘要
一种生成生物聚合物核酸的三维(3D)可寻址阵列的方法，该方法包括提供具有表面的纳米级三维形状，并以规则图样将多个生物聚合物核酸结合到3D形状的表面。3D生物聚合物核酸可与带有反应性化学基团的互补探针杂交以提供酶活性位点模拟物或人造催化剂。这种模拟物或催化剂可用在生物燃料工业和其它工业中。
文档编号C12Q1/68GK102159724SQ200980131488
公开日2011年8月17日 申请日期2009年6月9日 优先权日2008年6月13日
发明者保罗·本特利, 文森特·苏萨菈, 特洛伊·拉普希斯, 维斯瓦纳特·克里什纳穆尔蒂 申请人:尹斯特有限公司