专利名称：基于微阵列芯片的核酸测序方法
技术领域：
本发明涉及一种基于微阵列芯片的核酸测序方法，尤其是一种进行特定物种的基因组测序、基因转录和表达谱的检测、以及各种基因组DNA(脱氧核糖核苷酸)修饰谱(如DNA甲基化谱)的检测，属于生物医学核酸阵列芯片应用的技术领域。
背景技术：
人类基因组(测序)计划已经完成，后基因组计划已步入实施。特别是人类基因组计划完成以后，有关核酸序列数据呈指数增长，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，为比较基因组学的研究提供了丰富的信息资源。如何对大量的生物分子信息进行分析和比较，寻找共同的分子机制，发现新的生物学原理，使生物学由实验上升到理论，另一方面，随着人们更深入地从分子层次上认识生命现象，医学临床实践将产生革命性的变化。在分子层次上进行疾病的预测、诊断和治疗，将根本地认识疾病产生的根源，并将有希望根本认识和治疗包括癌症在内的重大疾病。这些生物学、医学的变革，一个根本的前提是要对大量的个体的基因组信息进行检测，以及对大量未知基因序列的快速测定和鉴定。高效快速地进行大量基因组测列的测定，将加速人类对于基因组信息的基因组应用，从而推动生物学、医学的进一步发展。
虽然在大规模DNA测序方面人类已经取得了巨大的进步。然而，大规模个体全基因组DNA的测序，即对大量的人类个体的基因组DNA(包含有30亿碱基)进行测序，其成本仍太高。这严重地限制了功能基因组的研究进展，影响到人类基因组计划研究成果的应用。我们知道，功能基因组研究的目的是要认识基因组中每个核酸的生物学含义，发现疾病易感基因。功能基因组的研究途径是比较基因组学，即通过比较和分析不同表型个体之间基因组序列差异，解码基因组中每个核酸的生物学意义，发现功能基因，识别与疾病相关的分子遗传信息。进一步地，根据个体基因组信息，实现疾病的预测、预防和个体化治疗。随着功能基因组研究的发展以及人们对提高医疗健康水平的不懈追求，“个体化医疗”已开始进入人们的生活。为了真正实现“个体化医疗”这一目标，首先要对每个人的基因组进行测序，找出不同个体在DNA序列上的差异与不同疾病、发育等的相关性。而对于目前的基因组测序成本而言，“个体化医疗”仍然是人类的一个遥远的梦想。因此，如何快速、经济地对大量个体全基因组进行测序将是一个巨大的挑战，同时也蕴藏着巨大的商机。人们急需发展出一些快速、廉价的个体化基因信息检测技术来缩短这个距离。
目前人们正在研究的高通量低成本DNA测序技术大体上可以分为两类一类是延续毛细管分离DNA自动化测序仪的技术方案，以化学降解法或双脱氧链终止法为基础，通过提高电泳分离和荧光检测并行度，进行高通量DNA序列分析。例如，阵列毛细管凝胶电泳技术、微流控毛细管电泳芯片技术等方法。但是，基于毛细管分离的测序技术，其提高测序通量的空间已十分有限，在测序速度和降低成本方面已经不能满足未来个体全因组DNA测序的要求。
另一类则为非凝胶电泳分离测序方法，主要有杂交测序法、焦磷酸测序法、质谱法、核苷酸直接阅读技术等。DNA杂交测序(Sequencing by hybridization)是八十年代末提出来的，其原理主要是应用一组已知序列的寡核苷酸探针与未知的荧光标记的DNA杂交，通过杂交信息来识别未知DNA序列。这种方法类似于碱基连接法，利用的是DNA链与互补序列而非错配序列进行结合或杂交的趋势。这一测序系统由美国生物科技公司——艾菲矩阵公司(Affymetrix)、佩尔金科学公司(Perlegen Sciences)和Illumina公司开发，已经在商业上广为使用，最初应用于查找已知基因序列的变化。测序时，首先需要合成有可能与目的DNA分子相匹配的DNA短链，然后把它们排列在大的载玻片上。当未知的目的DNA分子的多个拷贝分子与这种载玻片共浴时，目的DNA分子就能与载玻片上跟自身互补的DNA序列相结合。如果完全匹配，就会产生强烈的荧光信号。但由于其芯片制备的复杂性以及杂交的非特异性等因素，该方法要达到长片段的测序尚有一段距离。
目前很多研究小组模仿DNA分子复制的过程，发明了合成测序方法(Sequencing by Synthesis)。当碱基在聚合酶的作用下，加入到一条新互补链的起始端(引物)上，或者当连接酶将它作为匹配物加以识别时，模板链的序列就得以揭示出来。如果将荧光分子连接到加入的碱基上，光学显微镜就可以检测到它发出的颜色信号。然而该方法却面临着碱基的掺入效率和荧光分子间的淬灭作用而导致测序的长度比较短。桑格(Sanger)测序法发明数十年来，一直具有准确可靠的优点，但所用材料昂贵、检测费时。因此要提高测序速度、降低测序成本，必须要做到缩小化学反应体积，以减少化学制品用量，同时以大规模平行反应来同步读取数百万个DNA片断的序列。
发明内容
技术问题本发明针对目前核酸测序成本高、速度慢等问题，提出了一种将传统的桑格(Sanger)测序法和核酸微阵列芯片技术相结合的DNA测序方法，即基于微阵列芯片的核酸测序方法，该方法具有测序通量高、制备成本低、方法简单，可用于目标核酸的直接测序检测，具有十分重要的应用前景和使用价值。
技术方案本发明的基于微阵列芯片的核酸测序方法，是将不同待测序的核酸片段分别固定到一块固体基片上，形成核酸微阵列，并使不同的核酸片段都含有一段多个碱基长度的相同的公共序列作为测序引物的互补序列；将公共测序引物与芯片杂交后，利用桑格(Sanger)末端终止法，将某一种核苷酸混合溶液一定比例标记的ddNTP(双脱氧核糖核苷)和对应的未标记的dNTP(脱氧核糖核苷)注入到上述的DNA片段微阵列芯片上进行在片碱基终止反应，每延伸终止一次后立即扫描一次延伸信号，得到芯片上不同样品点碱基延伸信息，通过信号叠加得出每个样品点上固定的核酸片段完整的序列信息。
核酸微阵列是指用机械方法将多种DNA片断(如聚合酶联反应(PCR)产物等)定点固定(包括化学键合或者物理吸附固定)在固体在片上，使基片上每个阵列点为单一相同的核酸片段。或将多种含有多个相同核酸片断单分子长链核酸(如RCA产物)随机定点固定(包括化学键合或者物理吸附固定)在固体在片上，使基片上每个阵列点为单一分子核酸。
核苷酸混合溶液是指由一定比例的标记的ddNTP和dNTP，该比例为1∶1～1000∶1。其中ddNTP分子标记物是可以通过光、电、磁检测到信号的分子。延伸反应是指用一条通用测序引物与基片上固定的核酸片段中一段相同序列杂交后，用4种dNTP和其对应标记的ddNTP混合物分别进行在片碱基延伸。其中基片上与标记的ddNTP发生延伸反应的核酸片段通过信号检测被记录下来。
基片上不同样品点碱基延伸信息的叠加是指将每次延伸的信息与所加入的具体的核苷酸混合物对应起来，然后将基片上所有样品点的每次发生延伸反应的碱基信息叠加起来，得出基片上所有的核酸片段的完整序列。
本发明涉及的是基于核酸芯片的一种测序方法，这里的核酸是指所有提取的DNA、RNA(Ribonucleic Acid核糖核酸)或它们的核酸序列扩增(PCR(聚合酶链反应)、RCA(滚环反应)等)产物、克隆产物。本发明的采取以下方案实现的通过PCR、RCA或克隆等方法将制备的含有共同序列的核算片段固定到固相载体上制备微阵列。取四个分别标记有A、T、C、G的PCR反应小管，每个管中的反应体系为dNTP/荧光标记的ddNTP混合物(如标记A的小管中为dATP(腺嘌呤核苷)/CY3(羰花青类荧光染料)标记的ddATP(双脱氧腺嘌呤核苷))、DNA聚合酶延伸体系。测序时，分别在芯片点样区依次加入dATP/Cy3-ddATP(腺嘌呤核苷/荧光标记的双脱氧腺嘌呤核苷)、dGTP/Cy3-ddGTP(鸟嘌呤核苷/荧光标记的双脱氧鸟嘌呤核苷)、dCTP/Cy3-ddCTP(胞嘧啶核苷/荧光标记的双脱氧胞嘧啶核苷)、dTTP/Cy3-ddTTP(胸腺嘧啶核苷/荧光标记的双脱氧胸腺嘧啶核苷)混合物，充分反应后，利用芯片扫描仪或荧光显微镜检测各个样品点的荧光信号。依次循环往复进行不同碱基的延伸反应，最后将每张扫描图进行信号分析，得出个样品点的序列信息。
其具体原理为I当加入dTTP/ddTTP混合物时，有少部分片段的第一个碱基掺入了荧光标记的ddTTP而被终止，其它片段掺入了dTTP后可以继续延伸下一个碱基，检测荧光信号，得出第一个掺入碱基为T(胸腺嘧啶)；II当加入dATP/ddATP混合物时，有少部分片段的第二个碱基掺入了荧光标记的ddATP而被终止，其它片段掺入了dATP后可以继续延伸下一个碱基，检测荧光信号，得出第二个掺入碱基为A(腺嘌呤)；III当加入dGTP/ddGTP混合物时，有少部分片段的第三个碱基掺入了荧光标记的ddGTP而被终止，其它片段掺入了dGTP后可以继续延伸下一个碱基，检测荧光信号，得出第三个掺入碱基为G(鸟嘌呤)；IV当加入dCTP/ddCTP混合物时，有少部分片段的第四个碱基掺入了荧光标记的ddCTP而被终止，其它片段掺入了dCTP后可以继续延伸下一个碱基，检测荧光信号，得出第四个掺入碱基为C(胞嘧啶)。然后将各扫描图进行信号处理，得出待测核酸片段的序列信息。
该方法可以用于功能基因组研究，进行特定物种的全基因组测序、基因转录和表达效率的检测、以及各种基因组DNA修饰谱(如DNA甲基化谱)的检测。对人们在生命过程的分子机制研究、基因组DNA信息的解码、个体化医学、疾病的预测和预防、药物的开发和个体化等方面将具有重大的应用价值。
有益效果本发明与以往的方法相比较具有以下优点1、本发明结合了传统的桑格(Sanger)测序法，技术成熟，实施简单；2、本发明结合了核酸微阵列芯片技术，可以同时对数以万计的核酸片段进行再测序，通量高、速度快、成本低；3、本发明利用了荧光标记的ddNTP(双脱氧核糖核苷酸)作为测序指示剂，避免了以往在同一条链上进行多个荧光标记的dNTP(脱氧核糖核苷酸)掺入，导致荧光分子间的淬灭作用而使测序信号不准确。
图1是用于杂交的DNA芯片示意图，其中有a固体基片；b待测序的DNA分子阵列；c核酸分子单元；d待测序的核酸片段；e通用核酸片段。
图2是固定的PCR产物进行测序原理图。
图3是固定的滚环扩增产物进行测序原理图。
图4是在片延伸测序流程图。
图5是芯片荧光信号分析与DNA测序实例图。
图6是基因组DNA的片断化示意图，其中①用超声仪随机打断基因组DNA；②用绿豆核酸酶消化使DNA片段平末端化；③用Lambada核酸酶适度消化使DNA片段带有5’突出的粘性末端；④用Taq DNA聚合酶延伸DNA片段，使之形成3’端变为只有一个碱基A突出的粘性末端。
图7是基因组DNA的片段的环化及滚环扩增(RCA)示意图，其中甲、乙、丙分别为化学合成的寡核苷酸片段，丁为基因组片段；甲、丙分别与乙的3’和5’段互补，复性后形成一条5’端只有一个碱基T突出的粘性末端，片断甲、乙的3’端分别标记一个磷酸基团，片断丙的5’端标记一个氨基连接集团。
具体实施例方式
以下将结合附图对本发明作进一步说明(实例中所有的酶均来自纽英伦生物技术(北京)有限公司)。
图1其中(I)用于杂交的DNA芯片示意图；II固定的PCR产物或克隆产物；III固定的滚环扩增产物。其中a固体基片；b待测序的DNA分子阵列；c核酸分子单元；d待测序的核酸片段；e通用核酸片段。
图2固定的PCR产物进行测序原理图。I当加入dTTP/ddTTP混合物时，有少部分片段的第一个碱基掺入了荧光标记的ddTTP而被终止，其它片段掺入了dTTP后可以继续延伸下一个碱基，检测荧光信号，得出第一个掺入碱基为T；II当加入dATP/ddATP混合物时，有少部分片段的第二个碱基掺入了荧光标记的ddATP而被终止，其它片段掺入了dATP后可以继续延伸下一个碱基，检测荧光信号，得出第二个掺入碱基为A；III当加入dGTP/ddGTP混合物时，有少部分片段的第三个碱基掺入了荧光标记的ddGTP而被终止，其它片段掺入了dGTP后可以继续延伸下一个碱基，检测荧光信号，得出第三个掺入碱基为G；IV当加入dCTP/ddCTP混合物时，有少部分片段的第四个碱基掺入了荧光标记的ddCTP而被终止，其它片段掺入了dCTP后可以继续延伸下一个碱基，检测荧光信号，得出第四个掺入碱基为T。
图3固定的滚环扩增产物进行测序原理图(图解同图2)。不同的是滚环产物为同一DNA片段的重复序列组成，可以在同一条链上进行多次末端终止反应。
图4在片延伸测序流程图。I将待测序的核酸片段固定制备微阵列；II加入A混合物(dATP和荧光标记的ddATP混合物)，经DNA聚合酶延伸后进行荧光扫描；III加入T混合物(dTTP和荧光标记的ddTTP混合物)，经DNA聚合酶延伸后进行荧光扫描；IV加入C混合物(dCTP和荧光标记的ddCTP混合物)，经DNA聚合酶延伸后进行荧光扫描；V加入G混合物(dGTP和荧光标记的ddGTP混合物)，经DNA聚合酶延伸后进行荧光扫描。各图中X轴表示延伸的荧光信号值，Y轴表示测序结果。
图5芯片荧光信号分析与DNA测序实例图。I两条不同的固定化PCR产物分别加入A、T、C、G、C的dNTP/ddNTP混合物后荧光扫描图；II不同碱基掺入与芯片的荧光信号变化。当加入A混合物时，PCR产物1有荧光信号，PCR产物2的点没有荧光信号，说明PCR产物2的第一个碱基为A；当加入T混合物时，PCR产物1和2的点都有荧光信号的增加，说明PCR产物1的第一个碱基和PCR产物2的第二个碱基都为T；当加入C混合物时，PCR产物1有荧光信号增加，PCR产物2的点却没有荧光信号增加，说明PCR产物1的第二个碱基为C；当加入G混合物时，PCR产物1没有荧光信号增加，而PCR产物2有荧光信号增加，说明PCR产物2的第三个碱基为G；当再次加入C混合物时，PCR产物1和2的都有荧光信号增加，说明PCR产物1的第三个碱基和PCR产物2的第四个碱基为C；测序结果表明PCR产物1的前3个碱基为TCC，而PCR产物2的前4个碱基为ATGC。
图6基因组DNA的片断化。其中①用超声仪随机打断基因组DNA；②用绿豆核酸酶消化使DNA片段平末端化；③用Lambada核酸酶适度消化使DNA片段带有5’突出的粘性末端；④用Taq DNA聚合酶延伸DNA片段，使之形成3’端变为只有一个碱基A突出的粘性末端。
图7基因组DNA的片段的环化及滚环扩增(RCA)。其中甲、乙、丙分别为化学合成的寡核苷酸片段，丁为基因组片段。(I)片断甲、丙分别与乙的3’和5’段互补，复性后形成一条5’端只有一个碱基T突出的粘性末端，其中片断甲、乙的3’端分别标记一个磷酸基团，片断丙的5’端标记一个氨基连接集团；(II)利用T/A互补，在DNA连接酶的作用下，将基因组DNA片段环化；(III)然后在Φ29DNA聚合酶反应体系中以片段甲为引物按照箭头的方向进行DNA滚环扩增反应(Rolling Cycle Amplification，RCA)，得到单链DNA(其结构如图1-III)。
实施例1.固定的PCR产物制备的核酸微阵列芯片进行测序1、通用引物PCR产物的制备以扩增为例，欲测出乙肝病毒DNA片段78-257的核酸序列，具体方法为5’...GGCATGGACATTGATCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCCTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCGTCGGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTATATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAACATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAAGCAAGCAATT...3’，设计一对特异扩增引物，P15’...NH2-TTTTTTTTTTCCGTACCTGTAACTAG...3’，
P23’...CTCAAGCAAGCAATTGCATGGCCACGGGCGGAC...5’.斜体部分为特异性引物序列，黑体部分为通用序列，即所有PCR下游引物的5，端都带有此片段。利用这对引物在常规PCR扩增体系中将乙肝病毒78-257片段扩增出来。
2、基因芯片的制备将上步的PCR产物分离纯化，然后溶入碳酸盐缓冲液中，利用点样的方法将PCR产物固定到氨基硅烷化处理的玻片上，37℃水化2小时。
3、固定化PCR产物的在片延伸测序将制备好的微阵列在10M氢氧化钠溶液中浸泡10分钟，对双链产物进行变性，使固定的PCR产物变成单链DNA分子。然后将化学合成的与固定PCR产物通用序列互补的DNA片段(3’...GTCCGCCCGTGGCCATGC...5’)以500nM的浓度溶于杂交缓冲液(10×SSC、50％去离子甲酰胺、0.2％SDS、100ug/μl剪切的的鲑鱼精DNA)中，在37℃下与芯片杂交1小时。杂交结束后分别用2×SSC、0.2×SSC/0.5％SDS及去离子蒸馏水各洗涤5分钟，用氮气流吹干玻片后用于后边的在片延伸反应。
取四个分别标记有A、T、C、G的PCR反应小管，每个管中的反应体系为100nM dNTP/CY3-ddNTP混合物(如标记A的小管中为dATP/CY3-ddATP)、TherminatorTMDNA聚合酶0.U/μl、20mM Tris-HCl(pH 8.8@25℃)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1％.Triton X-100。由于目前大部分都是DNA序列的再测序，可以根据已知的DNA序列，如图2所示，分别将含有不同单体混合物的反应液加到芯片上，50℃反应20分钟。然后分别用2×SSC、0.2×SSC/0.5％SDS及去离子蒸馏水各洗涤5分钟，用氮气流吹干玻片后用于后边的在片延伸反应。如图4及图5，每次延伸后扫描并分析芯片上各个点的荧光信号的变化，得出每步延伸的碱基信息，达到测序的目的。
实施例2.固定的滚环扩增技术制备的核酸微阵列芯片进行测序1、应用滚环扩增技术制备全基因组的单分子多拷贝DNA片段微阵列芯片(如图1-III)。
基因组DNA的片断化如图6所示，①将提取的基因组DNA，用超声仪在一定的强度下将基因组DNA打碎为100～500bp的片段，取1μl的产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测基因组DNA超声片断化效果；②取一定量的超声产物，加入适量的绿豆核酸酶体系，30℃反应30～60分钟，由于该酶具有去除单链3′或5′突出端的特性，将所有的DNA片段平末端化，然后80℃15分钟失活绿豆核酸酶；③在反应产物中加入适量的Lambada DNA核酸酶体系，30℃反应30～60分钟，由于该酶可以作用于双链DNA，沿5′→3′方向渐进性催化去除5′单核苷酸，将所有的DNA片段消化成5’突出的粘性末端，80℃15分钟失活Lambada DNA核酸酶；④然后在上步的反应产物中加入适量的TaqDNA聚合酶反应体系，72℃反应5～10分钟，由于该酶的延伸产物的3’末端通常为单个碱基A。
基片的表面氨基硅烷化修饰(A)选择大小合适的低荧光背景的全反射玻片，在80℃的piranha洗液(浓硫酸与30％的H2O2按体积比7∶3混合)超声洗涤2小时，然后用洗涤剂彻底清洗；用去离子蒸馏水再次彻底清洗、烘干备用；(B)硅烷化处理在上步洗涤干净的载玻片置于含有2％APTES(3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5～10分钟，用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗各两次，氮气吹干，180℃烘烤1～2小时。(C)氨基化处理将硅烷化处理的玻片置于含5％的戊二醛(50％水溶液，Amresco)磷酸缓冲液(0.1M批H7.4)中浸泡2小时，用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗各3次，氮气吹干，4℃保存备用。(D)每处理一张玻片后都必须在高灵敏度光学显微镜上进行荧光背景检测，以防处理效果不好所导致的荧光背景对后继单荧光分子检测的干扰。
基因组DNA片段的环化及滚环扩增(RCA)基因组DNA片断的环化及RCA扩增如图7所示甲、乙、丙分别为化学合成的寡核苷酸片段，丁为基因组片段。(I)片断甲、丙分别与乙的3’和5’段互补，复性后形成一条5’端只有一个碱基T突出的粘性末端，其中片断甲、乙的3’端分别标记一个磷酸基团，片断丙的5’端标记一个氨基连接集团；(II)利用T/A互补，在DNA连接酶的作用下，将基因组DNA片段环化；(III)然后在Φ29DNA聚合酶反应体系中以片段甲为引物按照箭头的方向进行DNA滚环扩增反应(Rolling Cycle Amplification，RCA)，得到单链DNA(其结构如图1-III)。
单分子多拷贝基因组DNA片段微阵列芯片的制备(A)用DNA纯化试剂盒纯化RCA反应产物，然后溶入碳酸盐缓冲液(pH 9.0)，用紫外分光光度计确定每个稀释梯度的DNA分子浓度；(B)将溶入RCA产物的碳酸盐缓冲液均匀平铺到处理过的全反射玻片中间1cm×1cm的表面上，自然晾干后37℃水化过夜；最后将玻片用2×SSC/0.1％SDS及去离子蒸馏水分别彻底清洗2遍，便制备成单分子多拷贝基因组DNA片段微阵列芯片。
2、在片延伸测序(如图3)具体的反应条件同案例一，其过程如下(A)在TherminatorTMDNA聚合酶体系中依次加入5ul由一种荧光标记核苷ddNTP和该核苷的dNTP溶液组成的延伸体系；(B)将固定有DNA片段的全反射玻片置于检测平台上，通过计算机控制平台软件，预设好荧光标记的核苷单体(A、T、C、G)混合物的加样顺序，按照预设程序，通过微流体装置，每掺入一个荧光单体后，将残留的延伸体系清洗掉，在高灵敏度荧光显微镜下检测各区域点上的表面荧光信号强度变化情况，根据荧光信号的强度差异确定DNA序列上的核苷酸信息。测序循环结束后，将检测到的荧光图片用图像处理软件进行分析，便可以同时得到所有固定的单分子DNA序列信息，然后通过生物信息学的方法，拼接为全长序列。
权利要求
1.一种基于微阵列芯片的核酸测序方法，其特征在于将不同待测序的核酸片段分别固定到一块固体基片上，形成核酸微阵列，并使不同的核酸片段都含有一段多个碱基长度的相同的公共序列作为测序引物的互补序列；公共测序引物与芯片杂交后，将某一种核苷酸混合溶液注入到上述的核酸片段微阵列芯片上进行在片碱基延伸终止反应，每延伸终止一次后立即扫描一次延伸信号，得到芯片上不同样品点碱基延伸信号，通过对每个样品点碱基延伸信号叠加得出对应样品点上固定的核酸片段完整的序列信息。
2.根据权利要求1所述的基于微阵列芯片的核酸测序方法，其特征在于核酸微阵列是指用机械方法将多种DNA片段定点固定在固体在片上，使基片上每个阵列点为单一相同的核酸片段。
3.根据权利要求1所述的基于微阵列芯片的核酸测序方法，其特征在于固定的待测序的核酸片段为单链核酸片段。
4.根据权利要求1所述的基于微阵列芯片的核酸测序方法，其特征在于固定的待测序的核酸片段为双链DNA，其中只有一条单链与基片上的活性基团连接，未连接的核酸单链可以通过变性从基片表面除去。
5.根据权利要求1所述的基于微阵列芯片的核酸测序方法，其特征在于核酸微阵列是指将多种含有多个相同核酸片段单分子长链核酸随机定点固定在固体在片上，使基片上每个阵列点为单一分子核酸。
6.根据权利要求1所述的基于微阵列芯片的核酸测序方法，其特征在于核苷酸混合溶液是指由一定比例的标记的ddNTP和dNTP，该比例为1∶1～1000∶1；其中ddNTP分子标记物是可以通过光、电、磁检测到信号的分子。
7.根据权利要求1所述的基于微阵列芯片的核酸测序方法，其特征在于延伸终止反应是指用一条通用测序引物与基片上固定的核酸片段中一段相同序列杂交后用4种dNTP和其对应标记的ddNTP混合物分别进行在片碱基延伸；其中基片上与标记的ddNTP发生延伸反应的核酸片段通过信号检测被记录下来。
8.根据权利要求1所述的基于微阵列芯片的核酸测序方法，其特征在于样品点碱基延伸信号叠加是指将每次延伸的信息与所加入的具体的核苷酸混合物对应起来，然后将基片上所有样品点的每次发生延伸反应的碱基信息叠加起来，得出基片上所有的核酸片段的完整序列。
全文摘要
基于核酸微阵列芯片的核酸测序方法是一种进行特定物种的基因组测序、基因转录和表达谱的检测、以及各种基因组DNA修饰谱的检测，将不同待测序的DNA片段分别固定到一块固体基片上，形成核酸微阵列，并使每个DNA片段都含有相同的公共序列作为测序引物的互补序列。将公共测序引物与芯片杂交后，利用Sanger末端终止法，通过微流控装置将某一种核苷酸混合溶液按一定比例的荧光标记ddNTP和dNTP，注入到上述的DNA片段微阵列芯片上进行在片碱基终止反应，每延伸终止一次后立即扫描一次荧光信号，得到芯片上不同样品点碱基延伸信息。最后利用图像处理软件将每张测序图进行叠加，得出每个样品点上固定的核酸片段完整的序列信息。
文档编号C12Q1/68GK1932033SQ20061009637
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月22日 优先权日2006年9月22日
发明者白云飞, 肖鹏峰, 涂景, 吕华, 陆祖宏 申请人:东南大学