专利名称：一种克隆新基因的试剂盒及其应用方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术、基因工程领域，具体地说更具体地说，涉及一种新型基因克隆试剂盒，以及用这种试剂盒克隆新基因的方法。
背景技术：
新基因克隆的传统方法是探针杂交法，通常需要构建基因文库并从文库筛选阳性克隆，是一项耗时繁琐的工作，成功几率很低。这种经典的基因克隆法首先涉及探针的标记，Southern杂交确定合适的限制性内切酶，基因组酶解和连接转化来构建基因文库，接着还需要从成千上万个转化子中筛选出甚至只有一个的阳性克隆，假如没有合适的筛子就只能依赖繁琐的菌落杂交，耗时费力。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)被用于染色体步移是基因克隆技术的一大突破。PCR方法不需要构建基因文库和后续繁琐的筛选工作，省时省力。PCR克隆最成功的应用就是cDNA的克隆，即逆转录PCR(reverse transcriptance PCR，RT-PCR)。PCR技术的关键是要设计和模板基因完全配对的两条寡核苷酸即引物，合成介于两条引物位置之间的基因片段。这个要求极大程度上限制了PCR技术在克隆未知基因中的应用，因为人们甚至没有足够的序列信息来设计引物。RT-PCR的成功最主要的因素是有一条能和mRNA的尾部polyA完全配对的通用引物oligo-T，因此只需要另外设计一条特异性引物，往往可以通过保守序列或仅有的氨基酸序列设计简并引物。
近年来，各种克隆未知基因的PCR技术发展迅速，技术焦点集中于在序列未知的情况下设计一条可靠、高效的通用引物。现有的PCR技术根据原理可分为三大类反相PCR(inversePCR，iPCR)，介于连接反应的PCR(ligation-mediate PCR，LM-PCR)和随机引物PCR(randomprimer PCR，RP-PCR)。
反相PCR反相PCR是历史最早的染色体步移法。操作过程是将基因组DNA先用合适的限制性内切酶彻底酶解，自身环化，然后从已知序列两头设计相向引物，反相扩增，这要求有足够的明确的DNA序列，所以不适用于根据氨基端或保守性氨基酸序列克隆新基因。
介于连接反应的PCR包括载体连接法(single-specific-primer PCR，SSP-PCR)和各种接头法(adaptor ligation PCR)。载体连接法将酶切后的基因组片段和线性载体连接后，利用载体上的引物和基因内部的特异性引物扩增出目标条带。接头法的原理是利用和目标片段连接的一个寡核苷酸接头序列来设计步移引物。寡核苷酸接头主要有双链接头、单链接头、不完全单链接头、气泡接头。
随机引物PCR利用特异性引物和随机引物的直接PCR法。包括targeted gene walking PCR(TGW-PCR)，TAIL-PCR，SiteFinding-PCR等。
前两类PCR技术依赖于限制性内切酶的作用，涉及连接，存在的问题是a)扩增的成败很大程度取决于目标基因在基因组中的丰度，含有目标基因的酶切片段的大小，以及酶切和连接效率。为选择合适的限制性内切酶，通常需要多次尝试，甚至需要先做Southern杂交分析；或用识别4个碱基的限制性内切酶部分酶切，回收大小合适的片段作连接。因此对于复杂的真核生物成功率极低。
b)某些基因组很难被限制性内切酶充分酶解，这种情况下需要改用它法。
随机引物PCR技术在极大程度上改进了前两种依赖于酶切连接的染色体步移法，步骤简单，扩增成功率高。TAIL-PCR是该技术的代表。TAIL-PCR使用三条特异性嵌套引物和一系列较短的随机引物，设计严紧退火和松弛退火交替进行的固定程序来保证特异性和扩增效率。新报道的SiteFinding-PCR利用两条随机引物(SiteFinders)一轮非严谨退火后，通过SiteFinder序列中5’端的部分序列设计的短链引物和上游特异性引物引物扩增，然后用特异性嵌套引物扩增，最后利用随机引物上的NotI位点和另一端的平端进行克隆测序。但是现有随机引物PCR法受其随机性的影响，其选择性都需要嵌套特异性引物来保证。这样就限制了该法在序列信息有限的未知基因克隆中的应用，比如只有一段氨基酸序列或者保守序列，根据这些信息只能设计一条简并引物，无法设计嵌套引物。因此，人们还在继续使用传统的探针杂交法克隆新基因。
总体而言，目前的新基因克隆技术或步骤繁琐，或不具备通用性。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的试剂盒，以及利用该试剂盒克隆新基因的方法。
所说的试剂盒主要包括以下单元PCR魔术缓冲、PCR缓冲、T-载体、Taq酶和多种通用引物。其中，PCR魔术缓冲含随机寡聚核苷酸混合物、Tris缓冲液、dNTP、MgCl2、甲酰铵、二甲基亚砜、甘油、氯化四甲基铵、谷氨酸钾、硫酸铵、离子化除垢剂及非离子化除垢剂；通用引物是能与任意模板上随机分布的通用位点有效退火的人工合成的长度为10-20bp的简并引物，例如ATGCATNNNNNN---，或其它通用引物。
用新试剂盒克隆新基因的方法有两个主要特征(1)PCR魔术缓冲与特异性引物在严紧条件下扩增；(2)通用引物与特异性引物配对在严紧条件下扩增。其主要步骤如下1)根据目标基因的保守序列设计特异性引物，Tm≈44℃；2)以基因组DNA为模板，使用步骤1)中的特异性引物、PCR魔术缓冲及其它PCR反应成分组成PCR反应体系，3)扩增得DNA片段；4)以步骤3)得到的DNA片段为模板，使用步骤1)中的特异性引物、PCR缓冲、一种与特异性引物配对的通用引物及其它PCR反应成分组成PCR反应体系；5)扩增得到一至多条DNA片断。
6)选择特异性最好的条带作为目标条带割胶回收；用T4 DNA连接酶连接目标条带与T-载体，并转化大肠杆菌；培养重组菌。
使用本发明的新型基因克隆试剂盒，特异性引物可以是简并引物，可以在仅有一段氨基酸序列或者保守序列已知的情况下获得完整基因，对于基因组简单的原核生物和复杂的真核生物都适用。该试剂盒适用于根据NH2-端氨基酸序列或保守序列设计引物克隆新基因；克隆分泌型蛋白的信号肽；克隆基因的上游调控序列；研究操纵子或基因簇的结构。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是实施例1的PCR产物琼脂糖凝胶电泳2是实施例2的PCR产物琼脂糖凝胶电泳3是实施例3的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据的附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的乙酸激酶(acetate kinase，ak)的克隆试剂盒的组成为魔术PCR缓冲、PCR缓冲液(含dNTP)、Taq酶、通用引物和T-载体。
使用上述试剂盒克隆海栖热袍菌乙酸激酶的方法如下1)据乙酸激酶保守序列设计合成特异性引物AK5’GCGTTGAATCTTTCC 3’；2)用基因组DNA为模板制备PCR体系
Taq酶 0.5μlPCR魔术缓冲5μl模板DNA0.5-3μg特异性引物 0.02-1μM(视引物简并度而定)灭菌蒸馏水 共50μl3)5℃，5min；(94℃，30s；54℃，30s；72℃，2min)×40；72℃，10min；4℃保温；扩增得新模板；4)用新模板制备PCR体系Taq酶 0.5μlPCR缓冲5μl步骤3产生的新模板 0.5μl特异性引物 0.2-4μM(视引物简并度而定)一种通用引物 5μl灭菌蒸馏水 共50μl5)目标DNA的扩增95℃，5min；(94℃，30s；50℃，30s；72℃，2min)×35；72℃，10min；4℃保温。
6)PCR产物分析和目标条带的回收对步骤5产生的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择特异性最好的条带作为目标条带割胶回收(如图1所示，其中箭头所指条带割胶回收)。
7)目标条带与T-载体的连接10×T4 DNA连接酶缓冲 1μlT-载体(2.3kb) 1μl(0.04pmol)割胶回收产物 和载体的摩尔比为2∶1-10∶1灭菌蒸馏水 共10μl16℃连接，过夜。转化大肠杆菌；培养。
转化子的验证提取转化子中的质粒；用M13引物进行PCR扩增，验证插入片段的大小；用M13引物进行碱基序列测定。测序分析结果和理论序列(NC_000853)一致。
实施例2人类基因组的胆汁激活型酯酶(bile-stimulated lipase，cel)的克隆试剂盒与实施例1相同，克隆方法步骤与实施例1基本相同，不同之处在于特异性引物为CEL5’TCTCTGCCTGTGAAG 3’如图23为DNA分子量标准λ-EcoT14酶切产物。1，2分别为特异性引物和通用引物扩增产物。
转化子验证后，序列测定结果与理论序列(NM 001807)一致。
实施例3芽孢杆菌新型阿拉伯糖苷酶基因(α-L-arabinofuranosidase，abfB)的克隆试剂盒与实施例1相同，克隆方法步骤与实施例1基本相同，不同之处在于根据蛋白NH2-端测序结果MNGTVKV，设计了两条简并引物5’AA(T/C)GGNACNGTNAAAGT 3’(araN1)和5’AA(T/C)GGNACNGTNAAGGT 3’(araN2)。
按使用步骤操作，获得目标DNA(图33为DNA分子量标准D2000。1，为araN2和通用引物扩增产物。3为araN1和通用引物扩增产物)。将箭头所指的条带割胶回收。
测序分析序列，引物araN1的扩增产物为目标条带，该基因的GeneBank登陆号为DQ324528；引物araN2的扩增产物为非特异性条带。
本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。
权利要求
1.一种克隆新基因的试剂盒，主要包括以下单元PCR魔术缓冲、PCR缓冲、T-载体、Taq酶和多种通用引物；其中所述的PCR魔术缓冲含随机寡聚核苷酸混合物、Tris缓冲液、dNTP、MgCl2、甲酰铵、二甲基亚砜、甘油、氯化四甲基铵、谷氨酸钾、硫酸铵、离子化除垢剂及非离子化除垢剂；其中所说的通用引物是能与任意模板上随机分布的通用位点有效退火的人工合成的长度为10-20bp的简并引物。
2.一种利用权利要求1的试剂盒进行新基因克隆的PCR方法1)根据目标基因的保守序列设计特异性引物，Tm≈44℃；2)以基因组DNA为模板，使用步骤1)中的特异性引物、PCR魔术缓冲及其它PCR反应成分组成PCR反应体系，3)扩增得DNA片段；4)以步骤3)得到的DNA片段为新模板，使用步骤1)中的特异性引物、PCR缓冲、通用引物及其它PCR反应成分组成PCR反应体系，所说的通用引物是与特异性引物配对使用的通用引物；5)扩增得到目标DNA。
3.一种利用权利要求1的试剂盒对PCR产物进行克隆的方法，其特征在于，1)根据目标基因的保守序列设计特异性引物，Tm≈44℃；2)以基因组DNA为模板，使用步骤1)中的特异性引物、PCR魔术缓冲及其它PCR反应成分组成PCR反应体系，3)扩增得DNA片段；4)以步骤3)得到的DNA片段为新模板，使用步骤1)中的特异性引物、PCR缓冲、通用引物及其它PCR反应成分组成PCR反应体系，所说的通用引物是与特异性引物配对使用的通用引物；5)扩增得到目标DNA。6)将得到的目标DNA进行琼脂糖凝胶电泳，选择特异性最好的条带作为目标条带割胶回收；用T4 DNA连接酶连接目标条带与T-载体，并转化大肠杆菌；培养重组菌。
全文摘要
一种克隆新基因的试剂盒及其应用方法，涉及一种新型基因克隆试剂盒，以及用这种试剂盒克隆新基因的方法。所说的试剂盒主要包括以下单元PCR魔术缓冲、PCR缓冲、T－载体、Taq酶和多种通用引物。使用本发明的新型基因克隆试剂盒，特异性引物可以是简并引物，可以在仅有一段氨基酸序列或者保守序列已知的情况下获得完整基因，对于基因组简单的原核生物和复杂的真核生物都适用。该试剂盒适用于根据NH
文档编号C12P19/00GK1948501SQ20061009630
公开日2007年4月18日 申请日期2006年9月19日 优先权日2006年9月19日
发明者邵蔚蓝, 蒋宇 申请人:南京师范大学