专利名称：儿茶酚－o－甲基转移酶调节分子筛选模型及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种儿茶酚-O-甲基转移酶调节分子筛选模型及其用途。
背景技术：
儿茶酚-O-甲基转移酶(Cathchol-O-methyltransferase，COMT)是人体内一个非常重要的酶，涉及到人体中多种神经递质及一些激素的代谢，如多巴胺(dopamine，DA)、雌激素(estrogen)等。DA与帕金森疾病(Pakinson’s Disease，PD)及其他精神性疾病的关系非常紧密。该酶的缺失或者活性的改变都会导致体内DA代谢异常，而过量DA在体内是具有毒性，所以最终会导致一系列疾病，包括帕金森疾病、精神分裂症等等。人体内是通过COMT等多种酶共同作用来代谢雌激素从而解除它的毒性，COMT功能异常可能会导致乳腺癌。此外，由于COMT位点多态性造成活性的异常还会导致强迫症、抑郁症等。因此可以说COMT在人体内的正常与否，是与很多疾病息息相关的，甚至是癌症。通过BLAST发现在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe，以下简称S.pombe)中存在同源基因，S.pombe常用于作为研究真核生物的生长周期以及一些疾病的模式生物，因为它与一些高等真核细胞有很多相同分子生物学的特征。鉴于COMT在人体内具有如此重要的作用，建立基于S.pombe这个模式生物的COMT调节分子筛选模型具有产业价值。
发明内容
本发明的目的在于提供，1.一种过量表达儿茶酚-O-甲基转移酶的工程菌；2.利用工程菌筛选儿茶酚-O-甲基转移酶调节分子的方法；3.利用从文库中筛选的基因作为药物靶标研发新的药物的模型。
本发明的技术方案如下S.pombe的COMT存在于二号染色体中，有两个基因，分别是SPBC119.03和SPBPB21E7.04c，通过序列比对，二者序列并不完全相同，但存在这一些保守序列，因此，本文首先选用SPBC119.03作为研究对象，克隆表达粟酒裂殖酵母COMT基因，研究其性质，构建COMT的药物筛选模型。SPB119.03序列全长为801个bp，编码266个氨基酸。
本文以pQE30作为克隆表达的载体，转化到宿主菌E.coli JM109中进行表达。据pQE30操作手册低温诱导有利于可溶蛋白的表达，故采用低温进行诱导。将目的蛋白进行超声波破碎，得到蛋白粗品，并用KTAprime蛋白纯化仪分离得到重组蛋白。COMT纯品用于活性研究，构建筛药模型。
实现上述目的的基本技术路线为总体技术方案是克隆包括提取扩增COMT所需的基因组，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构建转化载体，将基因克隆到合适的大肠杆菌或粟酒裂殖酵母宿主细胞。
1.基因模板提取将待克隆菌株在LB培养基或YE培养基等能够生长的培养基中，培养到合适的菌体浓度，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取菌体DNA。
2.表达载体的构建按照分子克隆标准方法从菌中提取质粒载体，将载体和PCR产物经酶切回收后连接，构建COMT的表达载体。
3.阳性克隆的筛选与鉴定宿主感受态细胞按照分子克隆的方法进行制备。转化方法采用分子克隆的CaCl2法。将连接产物转化感受态细胞，挑取转化子，挑取实验组平板上长出的转化子，接种到3ml含100ug/ml Amp的液体LB，待菌体生长到浑浊，取100ul菌体在水浴中煮沸5min，13000rpm离心1min，上清用做菌落PCR进行鉴定。并抽提转化子质粒用酶切和PCR确证。
4.利用含有功能COMT基因的重组菌或者纯化的酶，进行酶抑制剂或激活剂的筛选。
发明效果利用本技术方案涉及的方法，构建了COMT重组菌，得到了过量表达的COMT，进行了调节分子的筛选，获得了具有活性的分子。
图1.重组产物和PCR产物的酶切分析。1PCR产物；2PCR阴性对照；3分子量标记DL2000(2000，1000，750，500，250，100)；4重组质粒酶切图谱；5pQE30酶切图谱。
图2.重组蛋白的诱导表达。1-15分别为阳性未诱导，空载体为诱导，阳性诱导2h(2个样)，空载体诱导2h(2个样)，阳性诱导4h(2个样)，空载体诱导4h(2个样)，阳性诱导6h(2个样)，空载体诱导6h(2个样)。
具体实施例方式
1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与质粒质粒pQE30来源菌株为E.coli XHc-7，宿主菌为E.coliJM109，Schizosaccharomyces pombe均由本实验室保存。Streptomyces griseus ATCC13273由IOWAUniversity Rosazza教授赠送。
1.1.2工具酶与试剂Pfu、DNA Marker购自天根生化科技(北京)有限公司，Taq酶购自北京鼎国生物技术有限责任公司，限制酶PstI和SacI、碱性磷酸酶(CIAP)购自大连宝生物工程公司。LB培养基主要成分酵母膏和蛋白胨购自北京鼎国生物技术有限责任公司。Esculetin(6，7-dihydroxycoumarin)购买自Fluka公司。SAM(S-adenosyl-methionine fulphate)及其他活性测定所需试剂均购自国内试剂公司，均为分析纯。Ni-Sepharose购买自Amersham公司。
1.2方法1.2.1PCR引物以野生型S.pombe基因组为模板，通过PCR扩增COMT SPBC119.03基因，扩增中所用的PCR扩增引物由上海博亚生物公司合成，序列为P15‘-ATAGAGCTCATGCCTCATATGGAAGAC-3’SacIP23‘-TCCATGGTTTCCGTAAGACGTCAAT-5’PstIPCR反应条件为95℃预变性5min，95℃45s，60.8℃45s，72℃1min，35个循环，72℃10min。
1.2.2酵母基因组的提取酵母基因组提取方法是以分子克隆(第三版)[4]所介绍方法作为参考，并进行部分改进。
1.2.3表达载体的构建按照分子克隆[3]标准方法从XHc-7菌中提取质粒pQE30，将pQE30和PCR产物经PstI和SacI两步单酶切回收后连接8-12小时，构建COMT的表达载体pQE30-COMT。
1.2.3阳性克隆的筛选与鉴定宿主JM109感受态细胞按照分子克隆[4]的方法进行制备。转化方法采用分子克隆[4]的CaCl2法稍做改进。将连接产物转化JM109感受态细胞，挑取转化子，挑取实验组平板上长出的转化子，接种到3ml含100ug/ml Amp的液体LB，待菌体生长到浑浊，取100ul菌体在水浴中煮沸5min，13000rpm离心1min，上清用做菌落PCR进行鉴定。并抽提转化子质粒用PstI和SacI进行酶切和PCR确证。
1.2.4阳性克隆插入片断的序列测定将构建的重组菌株送往上海博亚生物公司进行测序。
1.2.4重组蛋白的表达挑取阳性克隆平板的单菌落接种到含5ml含100ug/ml的液体LB培养基中，37℃220rpm振摇过夜培养。取过夜培养液按1％接种量接种到10ml含100ug/ml液体LB培养基中，37220rpm振摇至OD0.6，根据pQE30操作手册建议的IPTG诱导浓度，加入IPTG至终浓度为1mM，在30℃低温诱导6h收获菌体。
1.2.5重组蛋白的鉴定诱导的蛋白利用SDS-PAGE来进行初步鉴定，同时将推测的目的条带从SDS-PAGE胶上切下保存在7％乙酸溶液中，并送往复旦大学蛋白质中心进行质谱鉴定。
1.2.6可溶蛋白的获取与分离纯化主要根据Qiangen公司提供的pQE操作手册建议的细胞破碎方法，采用超声波破碎后，离心上清用于蛋白后续分析。
根据载体pQE带有6个His标签的特点，用Ni sepharose亲和层析柱进行纯化。
lysis buffer50mMNaH2PO450mM，NaCl 300mM，Imidazole 10mM，PH8.0Washing buffer50mMNaH2PO450mM，NaCl 300mM，Imidazole 20mM，PH8.0Elution buffer50mMNaH2PO450mM，NaCl 300mM，Imidazole 500mM，PH8.0。
首先用Lysis buffer重悬诱导后细胞，超声波破碎细胞后，离心收集上清液准备上样，上样结束后用Washing buffer洗涤柱子约10杯柱体积，用15倍柱体积的Elutin buffer和washingbuffer进行梯度洗脱，收集洗脱的蛋白通过SDS-PAGE进行检测，以确证目的蛋白所处位置。将含有目的蛋白的溶液进行透析过夜除盐后，进行冷冻干燥。将动干粉溶解于storing buffer中供后续研究。
Storing buffer[3]50mMTris-cl(pH7.5)，2mM PMSF，10mMgCl2，0.1mM SAM，10％甘油。
1.2.8 COMT的性质研究虽然不同的COMT具有底物专一性，但都是具有儿茶酚结构的化合物，所以针对S.pombe中的COMT蛋白的活性研究，尽量选择更多的底物去测定是否有活性。COMT底物中，有用L-多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等作为活性研究的底物。尤其在Streptomyces griseus的COMT研究中Esculetin是其最合适的底物[3]。所以选择用Esculetin作为COMT活性测定底物，以SAM作为甲基供体，研究COMT的转甲基活性。
标准曲线的测定将SAM配成16mM的母液，-20℃保存，同时配制MgCl2、DTT、TrisClpH7.5、Esculetin母液，浓度分别为100mM、100mM、1M和10mM。标准曲线体系比例见表1。
Table 1 the mixture volume of standard curve
35℃水浴30min，后依次加入等体积的显色液(0.5M的HCl，NaNO2-Na2MoO4混合液、1NNaOH，ddH2O)后在407nm下测定吸光度。
用Streptomyces griseus AT13273的培养液按照Rosazza[3]的方案得到COMT蛋白作为活性测定过程的阳性对照。以pQE质粒转化菌的蛋白作为阴性对照，按照底物浓度0.4mM来进行测定。
2结果与分析2.1重组质粒鉴定通过抽提重组菌株的质粒，对质粒进行酶切和PCR鉴定(图1)。
从图上可以清楚的看到重组质粒的PCR片断和双酶切后的目的片段的位置大小在marker750bp稍偏上，因此可以断定这重组质粒阳性克隆，命名为IMB0301。
2.2序列测定由上海博亚生物公司测序后，经Vector软件同模式菌株进行序列比对分析，与NCBI中提交的标准株792h-的SPBC119.03相比，发现有三个碱基的突变，分别是181位的C突变成T，255位的G突变为A，282位的T突变成C，相应造成的氨基酸甘氨酸→精氨酸，异亮氨酸→苏氨酸，丙氨酸→苏氨酸。
2.3重组蛋白的诱导表达经初步的诱导表达，诱导条件为OD0.6，30℃，取样时间分别为2h、4h、6h。以15％蛋白胶分离所获得的菌体(图2)。同时将空载体转化的菌一起诱导做对照。
由图上看出，阳性在30KD左右有非常明显的条带，与预期蛋白大小相当。
2.4目的蛋白纯化用Amersham的AKTAprime蛋白纯化仪进行蛋白的纯化。梯度洗脱中Elution buffer比例在42％时开始出现目的蛋白的洗脱峰，开始收集蛋白。将收集的蛋白溶液进行SDS-PAGE鉴定，确定目的蛋白存在于洗脱峰中。将目的蛋白透析动干后溶解于storing buffer中，4℃保存。
2.5质谱鉴定将纯化蛋白的SDS-PAGE上的目的条带切下，送往复旦蛋白质中心进行质谱鉴定。结果如表2。
Table 2 Mass-spectrum result of recombinant proteinProtein Name
SPBC119.03[Schizosaccharomycespombe]Accession No.Protein MWProteinPep.ProteinTotallonBestlonProteinMSlon Intensity Bestlon TotallonPI Count Score Score Score C.I.％ Intensity Matched C.I.％C.I.％gil2959364 30247.6 5.48 9 270107 62 1002305.4389.662 99.969100Peptide InformationObsrv.±da±StartEndSequenceIonC.I.％ModificationMass ppmSeq. Seq. Score849.4464849.4672 0.0208 24240 246EFEGVIR990.5255990.5432 0.0177 18166 173DLYVPDLR1124.5041124.5267 0.0227 20203 211YVNMSPEER1138.5638 1138.5745 0.0107 9 220 229NVNGFDFIGR1308.6793 1308.687 0.0077 6 236 246TETKEFEGVIR1584.7175 1584.7137 -0.0038 -240 53 EIDEFTYPDGSGVR 1501584.7175 1584.7137 -0.0038 -240 53 EIDEFTYPDGSGVR1892.9977 1892.9774 -0.0203 -11 12 26 EQLFLQHIQNLPQER1892.9977 1892.9774 -0.0203 -11 12 26 EQLFLQHIQNLPQER1601956.9966 1956.9658 -0.0308 -16 220 235NVNGFDFIGRWDLIYK1956.9966 1956.9658 -0.0308 -16 220 235NVNGFDFIGRWDLIYK 1402458.2249 2458.1548 -0.0701 -29 32 53GHPELVLKEIDEFTYPDGSGVR2458.2249 2458.1548 -0.0701 -29 32 53GHPELVLKEIDEFTYPDG 6299.969SGVR质谱结果确证了该蛋白为S.pombe中SPBC119.03，COMT蛋白。
2.5蛋白的纯化及活性检测按照底物浓度分别为0.01nM，0.05mM，0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM，0.5mM，0.6mM，0.7mM，0.8mM，绘制保准曲线，曲线R2＝0.9973，可以用于活性测定中的计算。
酶活的定义[5]在标准反应条件下，单位时间内催化1uM的Escultin甲基化所需要的酶量。
权利要求
1.一种基于粟酒裂殖酵母和大肠杆菌的儿茶酚-O-甲基转移酶调节分子筛选模型，其特征是将酵母或者人的儿茶酚-O-甲基转移酶编码基因在粟酒裂殖酵母或者大肠杆菌异源表达，然后利用工程菌或者纯化的儿茶酚-O-甲基转移酶筛选酶的调节分子。
2.根据权利要求1所述的筛选模型，其特征是儿茶酚-O-甲基转移酶来自粟酒裂殖酵母。
3.权利要求1所述的的筛选模型，其特征是儿茶酚-O-甲基转移酶来自人。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种儿茶酚－O－甲基转移酶调节分子筛选模型及其用途。特别是异源表达粟酒裂殖酵母的儿茶酚－O－甲基转移酶的大肠杆菌工程菌及其在筛选儿茶酚－O－甲基转移酶调节分子中的用途。
文档编号C12N15/70GK1995377SQ20061009534
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月25日 优先权日2006年12月25日
发明者谢建平, 黄宇琪, 胡昌华 申请人:西南大学