专利名称：一种高效融合表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种高效融合表达载体，其含有编码EspA伴体蛋白的核苷酸序列，在常用宿主菌如大肠杆菌(E.coli)中表达时，能够促进原核表达系统高效表达外源目的蛋白，使本身不表达或表达量低的目的蛋白得到高效表达。
背景技术：
在生命科学研究和生物制药、生物制品的生产中，利用表达载体制备重组蛋白是重要而关键的环节。获得足够量的重组蛋白是进行后续研究和生产的必要条件。构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求，同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。现有的表达载体分为非融合型表达载体、融合型表达载体、共表达载体等，可根据不同的试验设计来选择载体，然而仍有许多外源基因不能利用现有的表达载体获得高效表达的目的蛋白，需要尝试多种不同的表达载体，造成不必要的损失，给后续研究和生产带来困难。影响外源基因表达的因素有很多，首先稀有密码子的出现会给目的蛋白的合成造成影响，如果一个基因中含有成串或多个E.coli稀有密码子，外源蛋白的表达将非常低，目的基因中含有过多的稀有密码子被认为是低表达水平和产生不完全产物的一个原因(Sorensen et al.，1989；Zhang et al.，1991)；其次毒性基因及质粒稳定性也影响外源蛋白的表达，带有毒性基因的质粒在DE3溶原菌中过夜培养时可能不稳定，这是由于cAMP对于T7 RNA聚合酶的刺激作用(Grossman etal.，1998)；此外N-端原则、二级翻译起始位点、意外终止密码子、转录终止子及不稳定目的mRNA都会影响外源蛋白的表达。因此解决外源蛋白的表达问题成为关键。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够促进外源蛋白高效表达的高效融合表达载体。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案。
本发明提供了一种高效融合表达载体，此载体含有一种特定的核苷酸片段，该核苷酸片段由启动子、选自下列a)或b)的核苷酸序列、连接区核苷酸序列串连构成，a)SEQ ID NO1所示的编码EspA蛋白的核苷酸序列；b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列。
其中，上述启动子较佳为T7启动子。
其中，上述连接区核苷酸序列包括编码如SEQ ID NO2所示的Linker柔韧区氨基酸序列的核苷酸序列，该Linker柔韧区在融合伴体和外源蛋白之间提供一个过渡，减少二者在空间结构上的相互干扰以及可能出现的一些刚性结构，经DNAstar软件分析Linker正好处于一个柔韧性良好的区域，分析结果如图2所示。较佳地，编码Linker的核苷酸序列为如SEQ ID NO3所示的序列。
其中，上述连接区核苷酸序列还可以包括编码如SEQ ID NO4所示的6个组氨酸序列的核苷酸序列，组氨酸能够提供配位电子和一些金属离子如Ni2+螯合位点，6个His标签可以使融合蛋白吸附于含Ni2+的层析填料上，利用这种亲和层析来纯化融合蛋白，从而简化了蛋白的纯化工作。较佳地，编码如SEQ IDNO4所示的6个组氨酸序列的核苷酸序列为如SEQ ID NO5所示的序列。
其中，上述连接区核苷酸序列还可以包括编码如SEQ ID NO6所示的氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)能被肠激酶特异识别，切割位点在Lys的羧基端，相对于其他切割酶，肠激酶具有识别特异性强、切割效率更高、反应条件更温和等优点，由于肠激酶的切割位点在识别位点的羧基末端，因而切下来的外源蛋白氨基端无额外的氨基酸，从而使氨基酸序列保持不变。较佳地，此编码如SEQ ID NO6所示的氨基酸序列的核苷酸序列为如SEQ ID NO7所示的序列。
其中，上述连接区核苷酸序列还包括如SEQ ID NO8所示的多克隆位点。
EspA(Esp为E.coli secreted protein缩写)是肠出血性大肠杆菌O157:H7的III型分泌系统(type III secretion system，TTSS)相关蛋白，编码EspA的espA基因共578bp，表达的蛋白约为25Kda。利用基因重组技术构建表达的重组蛋白EspA具有很高的表达量(参考文献王庆旭，毛旭虎，邹全明等，肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7espA基因的克隆与表达．中华微生物学和免疫学杂志，2006，26(6)535-538；进一步构建的融合蛋白EspA-Stx2B(志贺毒素2B亚单位)、EspA-IntiminC300(肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密粘附素C-端免疫保护性片段)、EspA-S1(百日咳毒素S1亚单位)也都得到高效表达。这些大量研究表明，EspA可作为一种新型的原核表达融合伴体。
还有研究表明EspA在肠出血性大肠杆菌O157:H7与宿主细胞的粘附过程中起到关键作用，重组蛋白EspA免疫家兔能够产生强烈的免疫应答(参考文献Sarah A.Kühne，William S.Hawes，Roberto M.La Ragione，et al.Isolation ofRecombinant Antibodies against EspA and Intimin of Escherichia coliO157:H7[J].Clin Microbiol.2004，42(7)2966-2976)，所以EspA具有潜在粘膜佐剂功能，其更有利于融合蛋白诱导机体产生强的免疫应答。
因此，利用EspA能够促进外源蛋白高效表达的特点，通过基因重组技术将其或其中的功能性肽段构建至表达载体上，同时加入肠激酶位点以获得目的蛋白，从而获得一种新型高效原核表达载体，达到促进外源蛋白高效表达的目的，并且EspA能够为目的免疫蛋白提供潜在的粘膜佐剂功能。
本发明在连接区的6个组氨酸纯化标签之后还设计了肠激酶切割位点。肠激酶是一种特异性蛋白酶，它能特异识别肽链中天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)五个氨基酸残基，切割位点在Lys的羧基端。以有效的切除伴体蛋白获得目的蛋白相对于其他切割酶，肠激酶具有识别特异性强、切割效率更高、反应条件更温和等优点。
综上所述，本发明的高效融合表达载体利用了EspA作为融合伴体可以促进融合蛋白表达，使本身不表达或表达量低的蛋白获得高效表达，利用EspA单抗可用于融合蛋白表达鉴定，并可以利用EspA单抗制作亲和纯化层析柱进行融合蛋白的高效纯化；Linker柔韧区在融合伴体和外源蛋白之间提供了一个过渡，减少了二者在空间结构上的相互干扰以及可能出现的一些刚性结构；6个His标签可以使融合蛋白吸附于含Ni2+的层析填料上，利用这种亲和层析来纯化融合蛋白，简化了蛋白的纯化工作；提供了肠激酶的特异识别位点，可以在温和的反应条件下，高效率地在识别位点的羧基末端完成切割，切下来的外源蛋白的氨基端无额外的氨基酸，序列保持不变。
本发明构建的融合表达载体pEspA可应用于各种外源蛋白的高效表达，经发酵可用于重组蛋白的大规模生产。
图1是本发明的载体从启动子至肠激酶位点的序列。
图2是DNAstar软件对Linker柔韧性分析图。
图3是EspA基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1是天为时代100bp Marker，2是扩增产物。
图4是含EspA基因的克隆载体pMD18-T-EspA的构建示意图。
图5是含连接区基因序列的克隆载体pMD18-T-Linker的构建示意图。
图6是融合表达载体pEspA的构建示意图。
图7是利用pEspA表达融和蛋白EspA-Stx2B及纯化的SDS-PAGE示意图，其中1为重组菌诱导4小时全菌蛋白，2为Takara蛋白标准Marker，3、4、5为用Ni2+亲和层析洗脱的融和蛋白EspA-Stx2B。
图8是利用pEspA表达融和蛋白EspA-IntiminC300及纯化的SDS-PAGE示意图，其中1为重组菌诱导4h全菌蛋白，2为Takara蛋白标准Marker，3、4、5为用Ni2+亲和层析洗脱的融和蛋白EspA-IntiminC300。
图9是利用pEspA表达融和蛋白EspA-S1的SDS-PAGE示意图，其中1为Takara蛋白标准Marker，2、3为空质粒诱导前后对照，4、5、6、7分别为诱导1h、2h、4h、6h全菌蛋白，箭头所示为表达的融和蛋白EspA-S1。
图10是融合表达载体pEspA的图谱。
具体实施例方式
以下结合附图及实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1融合表达载体pEspA的构建1.EspA基因的扩增1)引物设计合成(下划线示酶切位点)根据GenBank公布的国际标准株EHEC O157:H7 EDL933的espA基因核苷酸序列(AE005174)，依照酶切位点检索和引物设计原则，设计一对引物，上游引物(SEQ ID NO9)5’端引入NcoI酶切位点，将Linker(YAPQDP)序列(SEQID NO2)设计在下游引物(SEQ ID NO10)5’端，并引入BamH I位点，以BamH I酶切的粘性末端即可进行两条序列间的正确连接。
上游引物P1(SEQ ID NO9)5’CCATGGATACATCAAATGCAAC-3’(NcoI)
下游引物P2(SEQ ID NO10)5’GGATCCTGCGGCGCGTATTTACCAAGGGATATT-3’(BamHI)引物用Primer Premier 5.0软件设计，oligo 6.7分析评价，并由上海英骏生物技术有限公司合成，PAGE纯化。
2)目的基因EspA的PCR扩增以肠出血性大肠杆菌O157:H7基因组DNA(煮沸破菌上清)为模板，以P1和P2为引物扩增EspA基因，采用如下PCR体系和程序模板DNA3μlP1(25pmol/μl) 2μlP2(25pmol/μl) 2μldNTPs(2.5mmol/L each) 8μl10×PCR buffer 10μlMgCl2(25mmol/L)10μlEx-Taq DNA polymerase 1μlddH2O 63μltotal volume 100μl将反应体系振荡混匀，离心处理后，加入40μl石蜡油。94℃预变性10min，94℃变性60s，58℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后取3μl反应产物，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果，结果如图3所示。
2.含EspA基因的克隆载体pMD18-T-EspA的构建采用TA克隆方法克隆PCR产物，质粒构建过程如图4所示。
3.含连接区基因序列的克隆载体pMD18-T-Linker的构建
1)根据连接区设计序列合成互补的两条寡核苷酸片段L1(SEQ ID NO11)5’-GGATCCTCACCACCACCACCACCACGGTACCGACGACGACGACAAAGAA-3’(BamHI)L2(SEQ ID NO12)5’-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTTGTCGTCGTCGTCGGTA-3’(Xho I)由上海英骏生物技术有限公司合成，并进行PAGE纯化。两条寡核苷酸片段在PCR仪上经变性、退火、延伸得连接区序列6His Tag-EK site-MCS。
2)采用TA克隆方法构建pMD18-T-Linker载体，质粒构建过程如图5所示。
4.融合表达载体pEspA的构建1)经NcoI和BamHI双酶切从pMD18-T-EspA载体上切下EspA序列，插入到pET-28a(+)的NcoI和BamHI双酶切窗口，构建成pET-28a(+)-EspA载体。
2)经BamHI和Xho I双酶切从pMD18-T-Linker载体上切下连接区序列，插入到pET-28a(+)-EspA的BamHI和Xho I双酶切窗口，构建成融合表达载体pEspA，质粒构建过程如图6所示，构建出的融合表达载体pEspA如图10所示。EspA序列和连接区序列(包括柔韧区、6组氨酸纯化位点、肠激酶切割位点和多克隆位点)如图1所示。
实施例2融合表达载体pEspA表达融合蛋白EspA-Stx2B1.stx2B基因PCR扩增1)通过GenBank得到EHEC O157:H7stx2B基因，用Primer Premier 5.0软件设计引物序列，上游引物(SEQ ID NO13)5′-GAATTCAAAGAAGATGTTTATGGCGGT-3′，5′端加入EcoR I酶切位点，下游引物(SEQ ID NO14)5′-CTCGAGGTCATTATTAAACTGCACTT-C-3′，5′端加入Xho I酶切位点，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
2)取培养过夜的EHEC O157:H7菌液10ml，离心去上清，加入2ml高压灭菌的双蒸水混悬，煮沸10分钟，12000g离心取上清作为PCR模板。取1μl作为模板，94℃预变性10分钟，按94℃60s，55℃60s，72℃60s温度循环模式反应30个循环，最后72℃延伸10分钟，扩增stx2B基因片段。
3)将获得的stx2B基因片段TA克隆至pMD18-T载体上，转化E.coli DH5α，氨苄抗性筛选阳性重组子，抽提质粒。
2.融合基因表达载体pEspA-Stx2B的构建将EcoR I和XhoI双酶切切下的stx2B片段连接至pEspA载体的EcoR I和XhoI窗口上，经双酶切鉴定融合片段，大小正确后，转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)。
3.融合蛋白EspA-Stx2B的诱导表达重组工程菌在LB液体培养基培养，至菌液OD600约0.6时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导不同时间收集菌液。融合蛋白EspA-Stx2B的表达率达40％。
4.融合蛋白EspA-Stx2B的纯化重组菌的发酵，采用德国B.Braun 10L发酵罐，按照常规的工程菌发酵工艺进行。发酵结束收集菌液，4℃、8000g离心15min。吸弃上清，收集细菌，称重后冻存备用。用pH值7.4的TE缓冲液重悬细菌，经高压匀浆仪进行破菌，然后高速离心(12000G，4℃，30min)，收集沉淀，分别用含1％Triton×100的TE缓冲液和含1M、2M尿素TE缓冲液洗涤包涵体，用8M尿素溶解包涵体，透析后利用蛋白所带的6个His标签，采用亲和层析的方法进行蛋白纯化。重组工程菌沉淀经高压匀浆机4次破菌后，差速离心收集包涵体，经洗涤后用亲和层析柱进行纯化，纯度可达90％。融和蛋白EspA-Stx2B表达纯化效果如图7所示。
实施例3融合表达载体pEspA表达融合蛋白EspA-IntiminC3001.IntiminC300基因PCR扩增1)根据从GenBank查到的O157:H7(Sakai标准株)IntiminC300基因，利用软件Primer Premier5.0进行引物的设计和分析。上游引物P1(SEQ IDNO15)5′-GAATTCTACTTCAGCACTTA-3′，下游引物P2(SEQ ID NO16)5′-CTCGAGTTCTACACAAACCGCATA-3′，P1的5′端引入EcoR I酶切位点，P2的5′引入Xho I酶切位点。引物由上海英骏公司合成。
2)取模板2μl，引物P1、P2或P3、P4各1μl，dNTPs 4μl，缓冲液5μl，ExTaq酶0.25μl，双蒸水32.75μl，按以下循环在PCR仪上反应94℃预变性5min，按照94℃30s→55℃30s→72℃1min进行30个循环，最后72℃延伸10min，分别扩增IntiminC300基因片段。
3)将获得的IntiminC300基因片段TA克隆至pMD18-T载体上，转化E.coliDH5α，氨苄抗性筛选阳性重组子，抽提质粒。
2.融合基因表达载体pEspA-IntiminC300的构建将EcoR I和XhoI双酶切切下的IntiminC300片段连接至pEspA载体的EcoR I和XhoI窗口上，经双酶切鉴定融合片段，大小正确后，转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)。
3.融合蛋白EspA-IntiminC300的诱导表达重组工程菌在LB液体培养基培养，至菌液OD600约0.6时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导不同时间收集菌液。融合蛋白EspA-IntiminC300的表达率达40％。
4.融合蛋白EspA-IntiminC300的纯化
重组菌的发酵，采用德国B.Braun 10L发酵罐，按照常规的工程菌发酵工艺进行。发酵结束收集菌液，4℃、8000g离心15min。吸弃上清，收集细菌，称重后冻存备用。用pH值8.0的TE缓冲液重悬细菌，经高压匀浆仪进行破菌，然后高速离心(12000G，4℃，30min)，收集沉淀，分别用含1％Triton×100的TE缓冲液和含1M、2M尿素TE缓冲液洗涤包涵体，用8M尿素溶解包涵体，透析后利用蛋白所带的6个His标签，采用亲和层析的方法进行蛋白纯化。重组工程菌沉淀经高压匀浆机4次破菌后，差速离心收集包涵体，经洗涤后用亲和层析柱进行纯化，纯度可达85％。融和蛋白EspA-IntiminC300表达纯化结果如图8所示。
实施例4融合表达载体pEspA表达融合蛋白EspA-S11.目的基因的PCR扩增1)根据从GenBank查到的编码S1亚单位基因序列设计引物如下上游引物P1(SEQ ID NO17)5′-GTAGAATTCGACGATCCTCCC-3′，下游引物P2(SEQ ID NO18)5′-CTCGAGCTAGAACGAATACGCGATG-3′，P1的5′端引入EcoR I酶切位点，P2的5′引入Xho I酶切位点。引物由上海英骏公司合成。
2)以PT-PGEM转化至DH5α菌液(菌液为百日咳杆菌CS菌株PT(3114bp)全基因与PGEM-T Easy克隆载体连接转化至大肠杆菌DH5a)抽提的质粒为模板，进行S1亚单位基因的扩增，PCR反应条件为94℃变性0.5分钟，60℃退火0.5分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环。扩增前先在94℃预变性3分钟，扩增完毕后在72℃延伸10分钟。
3)将获得的目的基因片段TA克隆至pMD18-T载体上，转化E.coli DH5α，氨苄抗性筛选阳性重组子，抽提质粒。
2.融合基因表达载体pEspA-S1的构建
将EcoR I和XhoI双酶切切下的S1片段连接至pEspA载体的EcoR I和XhoI窗口上，经双酶切鉴定融合片段，大小正确后，转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)。
3.融合蛋白EspA-S1的诱导表达重组工程菌在LB液体培养基培养，至菌液OD600约0.6时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导不同时间收集菌液。融合蛋白EspA-S1的表达率达15％。融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE结果如图9所示。
大量研究证实百日咳毒素(PT)S1亚单位在诱导表达的过程中因其毒性基因对质粒稳定性有影响，从而导致不表达，而采用融合表达载体pEspA可以高效表达，融和蛋白表达量为15％。
以上实施例可以清楚的说明了本发明的融合表达载体pEspA的构建过程及其结构信息，并证明了其表达量高，纯化简单，适用于重组蛋白的大量生产的优点。但是以上实施例并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>一种高效原核表达载体<130>6P99020-CN<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>576<212>DNA<213>人工合成的编码EspA蛋白的核苷酸序列<400>1atggatacat caaatgcaac atccgttgtt aatgtgagtg cgagttcttc gacatcgacg60atctatgact taggtaatat gtcgaaggat gaggtggtta agctatttga ggaactcggt120gtttttcagg ctgcgattct catgttttct tatatgtatc aggcacaaag taatctgtcg180attgcaaagt ttgctgatat gaatgaggca tctaaagcgt caaccacggc acaaaagatg240gctaatcttg tggatgccaa aattgctgat gttcagagta gcactgataa gaatgcgaaa300gccaaacttc ctcaagacgt gattgactat ataaacgatc cacgtaatga cataagtgta360actggtattc gtgatcttag tggtgattta agcgctggtg atctgcaaac agtgaaggcg420gctatttcag ctaaagcgaa taacctgaca acggtagtga ataatagcca gctcgaaatt480cagcaaatgt cgaatacatt aaatctctta acgagtgcac gttctgatgt gcaatctcta540caatatagaa ctatttcagc aatatccctt ggtaaa 576<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<400>2Tyr Ala Pro Gln Asp Pro1 5<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>3acgcgccgca ggatcct17
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<210>17<211>21<212>DNA<213>基于编码S1亚单位基因序列设计并人工合成的上游引物<400>17gtagaattcg acgatcctcc c 21<210>18<211>25<212>DNA<213>基于编码S1亚单位基因序列设计并人工合成的下游引物<400>18ctcgagctag aacgaatacg cgatg 2权利要求
1.一种高效融合表达载体，其包括启动子、连接区核苷酸序列和选自下列a)或b)的核苷酸序列a)SEQ ID NO1所示的编码EspA蛋白的核苷酸序列；b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的高效融合表达载体，所述启动子为T7启动子。
3.根据权利要求1所述的高效融合表达载体，所述连接区核苷酸序列包括编码如SEQ ID NO2所示的Linker柔韧区氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的原核融合表达载体，所述编码Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
5.根据权利要求1所述的高效融合表达载体，所述连接区核苷酸序列包括编码如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的高效融合表达载体，所述编码如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。
7.根据权利要求1所述的高效融合表达载体，所述连接区核苷酸序列还包括编码如SEQ ID NO6所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的高效融合表达载体，所述编码如SEQ ID NO6所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO7所示。
9.根据权利要求1所述的高效融合表达载体，所述连接区核苷酸序列包括如SEQ ID NO8所示的多克隆位点。
全文摘要
本发明利用EspA(肠出血性大肠杆菌O157:H7III型分泌蛋白A)作为融合伴体，构建一种高效原核融合表达载体。此载体含有T7强启动子、编码EspA伴体蛋白的核苷酸序列、连接区(包括柔韧区、6组氨酸纯化位点、肠激酶切割位点和多克隆位点)。该载体能以融合蛋白的形式高效表达外源基因，表达量高，纯化简单，适用于重组蛋白的大量生产。
文档编号C12N15/62GK1924020SQ200610095019
公开日2007年3月7日 申请日期2006年8月9日 优先权日2006年8月9日
发明者毛旭虎, 邹全明, 刘艳青, 王庆旭, 余抒, 顾江, 杨琴, 易勇, 杨珺, 张卫军, 程建平, 马颖, 童文德 申请人:中国人民解放军第三军医大学