专利名称：一种通用型原核高效可溶性融合表达载体的构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及构建了一种原核融合表达载体，具体涉及构建了一种适合原核表达系 统的融合载体，该载体能使许多在原核表达系统低表达、低活性的功能蛋白或细胞因子在 大肠杆菌中得到高效，可溶性表达，并具有良好的生物活性。本发明构建的融合表达载体在 利用原核表达系统生产重组蛋白药物、抗原诊断试剂和酶学活性功能蛋白方面具有重要的 应用价值。
背景技术：
大肠杆菌(E. coli)因为具有遗传背景清楚、代时短、易控制等优点，已经成为生 产重组蛋白的主要工程菌。但是并非每一种外源基因都能在其中有效表达。基因自身独特 的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降 解、外源基因和E. coli在密码子利用上的差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等因素影响 外源基因的表达量。同时，原核表达系统缺乏形成二硫键的能力，利用原核表达系统生产的 重组蛋白往往形成包含体，变性复性后产品往往生物活性很低。采用融合表达的方法可以 提高目的蛋白的表达量和可溶性。目前常用的融合伴体有GST、MBP、NusA等，利用这些融合 伴体进行融合表达虽然可以提高目的蛋白的表达量和可溶性，但生成的重组蛋白往往由于 不能形成正确的空间结构而使获得的重组蛋白生物活性非常低，某些蛋白在除去融合伴体 后可能重新形成聚体沉淀。大肠杆菌自身二硫键的形成都是在其具有氧化性环境的周质腔进行的。而在大肠 杆菌细胞质表达的重组蛋白因大肠杆菌细胞质的还原性环境不易形成正确的二硫键和完 整的四级结构。大肠杆菌周质腔内二硫键形成蛋白家族成员是大肠杆菌自身蛋白形成正确 二硫键的关键因素，它们具有二硫键氧化还原酶或异构酶的性质，起辅助二硫键形成的作 用。这些二硫键形成蛋白一级结构中都含有活性位点Cys-X-X-Cys，只是中间的氨基酸组成 不同。其中，二硫键形成蛋白A(Disulfide bond formation protein A，DsbA)直接参与二 硫键的形成，是迄今所发现的硫氧还蛋白家族中氧化性最强的一个，在体内和体外DsbA均 能协助蛋白质折叠。研究发现，将DsbA的功能区域Cys-Pro-His-Cys中的两个Cys定点突 变为Ser，构成Ser-Pro-His-Ser结构，突变后的DsbA蛋白即DsbA_蛋白不再具有氧化还 原酶的功能，但仍然具有促目的蛋白可溶和细胞定位的作用。在原核表达体系中，利用DsbA 作为融合伴体可以辅助目的蛋白正确的二硫键空间配对，得到具有良好生物活性的目的蛋 白-DsbA融合蛋白；利用DsbAmut蛋白作为融合伴体可以大大提高融合蛋白的可溶性和表 达量。本发明是鉴于DsbA和DsbAmut蛋白性质特点，将二者串联起来以DsbA-DsbAmut融 合蛋白作为原核表达系统融合伴体蛋白，构建了一种通用型原核高效可溶性融合表达载体 (pET-dsbA-dsbAmut)。并以此载体实现了多个功能蛋白原核可溶性的融合表达，表达的目的 蛋白具有良好的生物活性。目前尚未见以DsbA-DsbA_串联蛋白作为原核表达融合蛋白的 研究报道。因此，本发明构建的融合表达载体(pET-dsbA-dsbAmut)在原核系统内生产重组
3基因工程药、诊断型试剂的研发、生产功能性酶类蛋白以及研究蛋白质的结构功能方面等 都具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明是构建了一种通用型原核融合表达载体(pET-dsbA-dsbAmut)。利用本载体 可以实现功能蛋白尤其是富含二硫键的功能蛋白在原核系统中的可溶性表达，同时，本载 体生产的重组蛋白在保持目的蛋白生物活性方面具有明显优势。融合表达载体pET-dsbA-dsbAm结构特点1)载体以T7启动子，表达宿主菌为BL21(DE3)系列，通过IPTG进行诱导重组蛋白 的表达。2)翻译起始位点含有Ncol内切酶位点，可以通过Ncol内切酶位点独立表达重组 蛋白。3)在DsbA与DsbAm蛋白以及DsbAm与目的蛋白之间均含有36个氨基酸组成的柔 性linker短肽，有利于DsbA行使其氧化二硫键形成和分子伴侣的功能以及DsbAm蛋白的 促溶和提高表达量的功能。4)在融合蛋白的N端带有组氨酸标签，有利于表达的融合蛋白通过金属鏊合树脂 进行亲和纯化。5)含有的多克隆位点(MCS)包括6个限制性内切酶位点GTCGAC (Sal)、 AAGCTT (Hindlll)、GCGGCCGC (NotI)、GAATTC (EcoRI)、GCTAGC (Nhel)、CTCGAG (Xhol)，使外源 蛋白基因克隆时具有较多的选择性。6)在多克隆位点前有凝血酶识别位点CTGGTGCCGCGCGGCAGC(LVPRGS)，可以通过 凝血酶对表达的融合蛋白酶切作用而纯化出重组靶蛋白。融合表达载体(pET-dsbA-dsbAmut)的优点1)载体以T7为启动子和带有提高表达量的融合伴体DsbAmut蛋白使表达的重组融 合蛋白表达量可占菌体总蛋白的40%以上。2)表达的融合蛋白中含有DsbA，该蛋白可以辅助目的蛋白的正确折叠和二硫键 的形成。3)在表达条件优化的条件下可以获得融合蛋白可溶性表达，这有利于后期的纯化 和保持目的蛋白的生物活性。4)对表达的外源蛋白没有选择性，可以使绝大多数的真核蛋白实现高效可溶性表 达。
图1是融合表达载体pET-dsbA-dsbAmut构建的模式图(a)和质粒图谱(b)；图2是pET-dsbA-dsbAmut原核融合表达霍乱毒素B亚单位(CTB) SDS-PAGE分析 图。利用载体表达的霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B Subunit, CTB)全菌体融合蛋 白、超声破碎和亲和纯化SDS-PAGE分析。其中a:l.诱导的全菌体；2.无诱导全菌体对照； M. protein marker ；b :M. protein marker ；3.；4.；c :1. Hft 一步亲和纯化 DsbA-DsbAmut-CTB ；M. proteinmarker ；
图3是pET-dsbA-dsbAmut原核融合表达前列腺特异性抗原(PSA) SDS-PAGE分析图。 利用载体表达的前列腺特异性抗原(prostate specific antigen, PSA)全菌体融合蛋白、 超声破碎、亲和纯化SDS-PAGE分析以及Western-Blot鉴定。其中a :M :protein marker ；
1.无诱导全菌体对照；2.诱导的全菌体；3.菌体超声上清；4.菌体超声沉淀；b:M :protein marker ； 1.镍柱一步亲和纯化DsbA_DsbAmut-PSA蛋白； 图4是pET-dsbA-dsbAmut原核融合表达人神经生长因子(hNGF) SDS-PAGE分析图。 利用载体表达的人神经生长因子(hNGF)全菌体融合蛋白、超声破碎、亲和纯化SDS-PAGE分 析以及Western-Blot和生物活性鉴定。其中a :M :proteinmarker ；1.无诱导全菌体对照；
2.诱导的全菌体；b3.菌体超声上清；4.菌体超声沉淀；M :protein marker ；c 1.镍柱一 步亲和纯化 DsbA-DsbAmut-hNGF 蛋白；M. protein marker ；
具体实施例方式实施例1、融合表达载体的构建1)首先以载体pET-28a(NOVagen公司)为基本框架，PCR扩增得到的dsbA序列通 过限制性内切酶位点Ndel和BamHI克隆到载体pET_28a中构建载体pET-dsbA。2)采用定点突变的方法将载体上原有的凝血酶识别位点进行突变，使其不在被凝 血酶识别。突变前CCATGGGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATG下划线对应的氨基酸序列为LVPRGS被凝血酶识别突变后CCATGGGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCACTGTTTCTAGCGATAGCCATATG下划线对应的氨基酸序列为TKSSRS不被凝血酶识别3)通过定点突变和重叠PCR获得dsbAmut序列，点突变包括TGC突变为AGC(Cys 突变为Ser)以及同义突变GGA突变为GGT(Gly)。合成108碱基linker序列，然后再 通过重叠PCR获得1 inker-dsbAmut-l inker序列通过限制性内切酶位点BamHI和Xhol 克隆到载体pET-dsbA中，其中在linker-dsbAm-l inker序列的C端带有多克隆位点 (MCS)序列分别是 GTCGAC(Sal)、AAGCTT(Hindlll)、GCGGCCGC(NotI)、GAATTC(EcoRI)、 GCTAGC (Nhel)和CTCGAG (Xhol)。在多克隆位点(MCS)前含有有凝血酶识别位点序列 CTGGTGCCGCGCGGCAGC (LVPRGS)，从而构建完整的融合表达载体pET-dsbA_dsbAmut。构建载体 的模式图和质粒图谱见图1。4)融合蛋白及多克隆位点核酸序列为GCGCAGTATGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCTTTCTTCTGCCCGCACTGCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATGGGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATGGCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTACAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATCAACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGGCGTGGAACAGCTTCGTGGTGAAATCTCT
GGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTGCAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAATCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGGATGTTTTTGTTCAGCAGTATGCTGATACAGTGAAATATCTGTCCGAGAAAAAAGGATCC GGTGATGAAGATGAAGATAGCATGCCC
GATTCTCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGGCCCGGGCTCGAACGGCCGCAATGCATCATG GCGCAGTATGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCTTTCTTC A GCCCGCAC A GCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATGGGTGG rT GACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATGG
CGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTACAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATCAACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGGCGTGGAACAGCTTCGGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTGCAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAATCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGGATGTTTTTGTTCAGCAGTATGCTGATACAGTGAAATATCTGTCCGAGAAAAAA GGTGATGAAGATGAAGATAGCATG
CCCGATTCTCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGGCCCGGGCTCGAACGGCCGCAATGCATCATG CTGGTGCCGCGCGGCAGC \GTCGAC(Sal)AAGCTT(HindIl
l)GCGGCCGC(NotI)GAATTC(EcoRI)GCTAGC(NheI)CTCGAG(XhoI)其中黑体部分为linker序列，黑体下划线为碱基定点突变包括TGC突变为 AGC(Cys突变为Ser)以及同义突变GGA突变为GGT (Gly)，下划线为凝血酶酶切位点序列 CTGGTGCCGCGCGGCAGC(LVPRGS)，框内为多克隆位点，包括有6个限制性内切酶位点[GTCGAC(Sal)AAGCTT(HindiII)GCGGCCGC(Not I)GAATTC(EcoRI)GCTAGC(Nhel) CTCGAG(Xhol)]实施例2、外源基因的表达纯化将PCR扩增得到外源基因⑴序列通过多克隆位点(MCS)克隆到表达载体 PET-dsbA-dsbAmut上。转化表达菌株BL21 (DE3)中，取测序正确的pET-dsbA_dsbAm-X表达 菌株BL21 (DE3)转接卡那LB培养基于37°C进行活化，当菌体生长密度(0D)值约为0. 4时 加入IPTG使其终浓度为0. 3mmol。转入29°C继续诱导诱导7小时左右，收集表达的菌体， 6000转/分，4°C离心5分钟，收集沉淀菌体。取沉淀菌体加入1XPBS缓冲液4°C超声破 菌，分别收集上清液和沉淀，利用融合蛋白N末端的His标签通过M离子螯合树脂对上清 里的融合蛋白进行亲和层析纯化。在纯化所需的缓冲液体系选择上，我们1XPBS系统缓冲 体系，在纯化过程中，以50mmol咪唑的缓冲液洗脱结合的杂蛋白，以150mmol咪唑的缓冲液 洗脱目的蛋白。通过金属螯合柱亲和层析纯化的融合蛋白DsbA-DsbAm-X经过SDS-PAGE检 测，纯度基本都能达到> 90%。纯化的融合蛋白水透析后真空冰干后_20°C冰箱保存。
实施例3、利用载体pET-dsbA-dsbAmut原核表达霍乱毒素B亚单位(CTB)霍乱毒素是引起霍乱腹泻的主要作用物质，由A、B2个亚单位组成，其B亚单位没 有毒性，由5条相同的多肽链以非共价键形式连成一个五聚体环状结构。霍乱毒素B亚单 位(Cholera toxin B Subunit, CTB)是一种理想的制备抗病疫苗的载体和口服免疫佐剂， 目前利用原核系统表达的CTB蛋白都是以包含体的形式存在，未见有可溶性表达的报告。首先通过PCR扩增CTB产物，以限制性内切酶SaLI、NotI双酶切PCR产物，然后 在T4DNA连接酶的作用下于同样双酶切的质粒质粒pET-dsbA-dsbAm相连接，转化大肠杆菌 BL21(DE3)。其次将转化的pET-dsbA-dsbAm_CTB表达菌株BL21 (DE3)转接卡那LB培养基于 37°C进行活化，当菌体生长密度(0D)值约为0.4时加入IPTG使其终浓度为0. 3mmol，转 入29°C诱导诱导7小时左右。收集菌体加入1 XPBS缓冲液4°C超声破菌，分别收集上清 液和沉淀，进行12% SDS-PAGE电泳，电泳结果显示经原核表达系统表达后，重组融合蛋白 DsbA-DsbAm-CTB获得较高的表达，融合蛋白可占菌体蛋白20%以上。经过超声破菌后发现， 融合蛋白DsbA-DsbAm-CTB绝大部分都是以可溶性形式存在超声上清中(分子量为60kDa) 并占上清总蛋白的50%以上。利用融合蛋白N末端的His标签通过M离子螯合树脂对上清中融合蛋白 DsbA-DsbAm-CTB进行亲和层析纯化。以50mmol咪唑+1 XPBS的缓冲液洗脱结合的杂蛋白， 以150mmol咪唑+1 XPBS的缓冲液洗脱目的蛋白。通过金属螯合柱亲和层析纯化的融合蛋 白DsbA-DsbAm-CTB，经过SDS-PAGE检测，纯度达到> 90%。纯化的融合蛋白水透析后真空 冰干后_20°C冰箱保存，冰干后的融合蛋白水溶性达到100%。以上实验结果见图2。 实施例4、利用载体pET-dsbA-dsbAmut原核表达前列腺特异性抗原(PSA)前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)是诊断前列腺癌的肿瘤标 志物，其在前列腺癌筛选、诊断和术后监测中发挥了巨大作用，同时PSA有抑制血管生成作 用，降低肿瘤形成，抑制肿瘤转移和侵袭。目前应用于临床诊断和治疗的PSA都是从精液中 提取，这种方法材料集取繁琐，无法大批量生产，原核表达末有可溶性表达的报道。PCR扩增PSA核酸序列，以Not I和Sal I双酶切与同样双酶切的融合表达载体 PET-dsbA-dsbAmut连接酶进行连接，将其转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)。取表达菌株按比例接菌到新鲜LB培养基中，在0D_为0. 4 0. 6时，加入诱 导物IPTG至终浓度为0. 3mmol/L，29°C诱导7h。收集菌体加入1XPBS缓冲液4°C超声破 菌，分别收集上清液和沉淀，进行12% SDS-PAGE电泳，电泳结果显示经原核表达系统表达 后，重组融合蛋白DsbA-DsbAm-PSA获得较高的表达，融合蛋白可占菌体蛋白40%以上。经 过超声破菌后发现，融合蛋白DsbA-DsbAm-PSA部分是以可溶性形式存在超声上清中(分子 量为74kDa)，并占上清总蛋白的50%以上。利用融合蛋白N末端的His标签通过M离子螯合树脂对上清中融合蛋白 DsbA-DsbAm-PSA进行亲和层析纯化。以50mmol咪唑+1 XPBS的缓冲液洗脱结合的杂蛋白， 以150mmol咪唑+1 XPBS的缓冲液洗脱目的蛋白。通过金属螯合柱亲和层析纯化的融合蛋 白DsbA-DsbAm-PSA，经过SDS-PAGE检测，纯度达到> 95%。纯化的融合蛋白水透析后真空 冰干后_20°C冰箱保存，冰干后的融合蛋白水溶性达到100%。
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取纯化的DsbA-DsbAm_PSA 融合蛋白 12% SDS-PAGE。以兔抗人 PSA 为一抗 Western 印迹分析DsbA-DsbAm-PSA融合蛋白免疫原性，Western-Blot结果显示原核表达的融合 蛋白DsbA-DsbAm-PSA能特异的结合人源PSA抗体，说明原核系统表达和纯化的融合蛋 白DsbA-DsbAm-PSA具有特异的免疫原性。利用载体pET-dsbA-dsbAmut表达的融合蛋白 DsbA-DsbAm-PSA可以结合人源PSA产生的抗体，为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供 关键材料。以上实验结果见图3。实施例5、利用载体pET-dsbA-dsbAmut原核表达人神经生长因子(hNGF)NGF(nerve growth factor)有利于中枢和周围神经元的存活和分化，对老年痴呆 病、周围神经病变和脊髓损伤有治疗作用。完整的NGF由a，3，Y3种肽链以的y2 的形式通过非共价键结合而成，其中3亚基具有神经生长因子完全的生物学功能。3亚基 即为我们通常所说的NGF，它由2个120氨基酸通过非共价键结合而成的二聚体，每个单位 内有3组二硫键。原核表达NGF表达量低，生物活性差，目前末有原核细胞质可溶性表达的 报道。PCR扩增hNGF核酸序列，以Sal I和Not I双酶切与同样双酶切的融合表达载体 PET-dsbA-dsbAmut连接酶进行连接，将其转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)。取表达菌株按1 %比例接菌到新鲜LB培养基中，在0D_为0. 3时，加入诱导物 IPTG至终浓度为0. 3mmol/L，29°C诱导7h。收集菌体加入1XPBS缓冲液4°C超声破菌，分 别收集上清液和沉淀，进行12% SDS-PAGE电泳，电泳结果显示经原核表达系统表达后，重 组融合蛋白DsbA-DsbAmut-hNGF获得较高的表达，融合蛋白可占菌体蛋白60%以上。经过超 声破菌后发现，融合蛋白DsbA-DsbAmut-hNGF大部分是以可溶性形式存在超声上清中(分子 量为64kDa)，并占上清总蛋白的50 %以上。利用融合蛋白N末端的His标签通过M离子螯合树脂对上清中融合蛋白 DsbA-DsbAmut-hNGF进行亲和层析纯化。以50mmol咪唑+1 XPBS的缓冲液洗脱结合的杂蛋 白，以150mmol咪唑+1 XPBS的缓冲液洗脱目的蛋白。通过金属螯合柱亲和层析纯化的融 合蛋白DsbA-DsbAmut-hNGF，经过SDS-PAGE检测，纯度达到> 98 %。纯化的融合蛋白脱盐或 水透析后真空冰干后-20°C冰箱保存，冰干后的融合蛋白水溶性达到100%。取纯化的DsbA-DsbA_-hNGF融合蛋白12 % SDS-PAGE。以兔抗人NGF为一抗 Western印迹分析DsbA_DsbAmut-hNGF免疫原性，Western-Blot结果显示原核表达的融 合蛋白DsbA-DsbAmut-NGF能特异的结合人NGF抗体，说明原核系统表达和纯化的融合蛋白 DsbA-DsbAmut-PSA具有特异的免疫原性。以提取的小鼠NGF为阳性对照，无菌PBS为阴性对照，利用鸡胚背根神经节培养实 验鉴定融合蛋白DsbA-DsbAmut-NGF生物活性。在倒置显微镜(X400倍)下观察鸡胚背根 神经节神经突起生长情况，结果证实融合蛋白DsbA-DsbAmut-NGF能促鸡胚背根神经节神经 突起生长，具有良好的生物活性。以上实验结果见图4。
权利要求
一种原核高效可溶性融合表达载体pET dsbA dsbAmut，其特征在于利用大肠杆菌二硫键形成蛋白(Disulfide bond)家族中DsbA与DsbA突变体DsbAmut蛋白串联后(DsbA L DsbAmut)作为目的蛋白表达的融合伴体。
2.据权利要求1中所述方法，串联融合蛋白可以是DsbA-L-DsbAmut或DsbAmut-L-DsbA 方式。
3.据权利要求1中所述方法，串联蛋白中L(Iinker)序列中碱基数可以是3的任意整数倍。
4.据权利要求1中所述方法，DsbA-L-DsbAmut或DsbAmut-L-DsbA融合蛋白与外源蛋白 在原核表达系统中表达方式可以是融合表达或共表达形式。
5.据权利要求1中所述方法，DsbA-L-DsbAmut或DsbAmut-L-DsbA融合蛋白包括自身氨 基酸序列或其它形式的氨基酸改变如氨基酸缺失、增加或置换等。
6.权利要求1所述的表达载体在医药研究领域中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及利用大肠杆菌二硫键形成蛋白(Disulfide bond)家族中DsbA与DsbA突变体DsbAmut蛋白串联后(DsbA-L-DsbAmut)作为原核表达目的蛋白的融合伴体构建一种通用型原核融合表达载体pET-dsbA-dsbAmut。DsbA-L-DsbAmut融合蛋白具有二硫键氧化还原酶的动能也具有分子伴侣的作用，因此构建的融合表达载体pET-dsbA-dsbAmut可以实现多肽或蛋白分子尤其是富含有二硫键的外源蛋白以高效、可溶的方式进行表达。利用此载体在生产基因工程产品、抗原诊断试剂、酶学活性功能蛋白和研究蛋白质的结构功能方面都具有非常广泛应用前景。
文档编号C12N15/70GK101955969SQ200910089018
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月20日 优先权日2009年7月20日
发明者丁红梅, 刘农乐, 孙卫国, 李少华, 沈倍奋, 邵宁生, 陈留存 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所