可溶的“只有重链的”抗体的制作方法

专利名称：可溶的“只有重链的”抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于自转基因非人哺乳动物分离功能性可溶的只有重链的抗体和源自它们的可溶的VH结构域的多样化库的改良方法，所述可溶的VH结构域在结构上与源自包含重链和轻链的抗体的VH结构域不同。优选只有重链的抗体和可溶的VH结构域源自长寿命的浆细胞或记忆B细胞。
背景技术：
单克隆抗体或其变体将代表21世纪投产新药的主要部分。单克隆抗体疗法业已被接受为用于治疗类风湿性关节炎和克罗恩病的优选途径，并在治疗癌症方面有令人印象深刻的进展。亦在将基于抗体的产品开发用于心血管病和传染病的治疗中。最有市场的单克隆抗体产品识别并结合靶配体(例如TNF α)上的单一的明确表位。抗体结构在本领域众所周知。大部分天然抗体为四聚体，包含两条重链和两条轻链。重链经由位于沿各重链的大约一半处的铰链结构域之间的二硫键彼此连接在一起。轻链在铰链结构域的N-末端侧与各重链缔合。每条轻链通常通过靠近铰链结构域的二硫键与其各自的重链结合。当抗体分子正确折叠时，每条链折叠为由更线性的多肽序列连接的一些独特的球状结构域。例如，轻链折叠为可变(VL)结构域和恒定(CL)结构域。重链具有毗连轻链可变结构域(VL)的单个可变结构域(VH)、第一恒定结构域(CHl)、铰链结构域和两个或三个另外的恒定结构域。重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的相互作用导致形成抗原结合区(Fv)。重链和轻链之间的相互作用由重链的第一恒定结构域(CHl)和轻链恒定结构域 (CL)介导。然而，在重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)之间亦存在参与重链和轻链之间的相互作用的界面(interface)。因为可变区具有可变氨基酸序列，所以设计了用于为这些结构域的氨基酸残基编号的系统。该编号系统参见Kabat等((1991)US Public Health Services, NIH publication 91-3242)，并用于本说明书中。在重链可变结构域中，框架1 (FRl)包含残基1-30，框架2(FR2)包含残基36-49，框架3 (FR3)包含残基66-94，框架4 (FR4)包含残基103-113。同样在重链可变结构域中，互补性决定区(OTR)包含残基30-35(⑶Rl)、残基 50-65(CDR2)和 95-102(CDR3)。正常人B细胞含有染色体14上的单个重链基因座，通过重排从所述染色体上产生编码重链的基因。在小鼠中，重链基因座位于染色体12上。正常重链基因座包含多个V基因区段、一些D基因区段和一些J基因区段。大部分VH结构域由V基因区段编码，但各VH 结构域的C末端由D基因区段和J基因区段编码。B细胞中VDJ重排接着亲和力成熟，为各VH结构域提供其抗原结合特异性。正常四聚体抗体的序列分析证明，多样性结果主要来自VDJ重排和体细胞高变的组合(Xu和Davies, (2000) Immunity, 13，37-45)。超过50个人V基因区段存在于人基因组中，其中仅39个是功能性的。在正常的二倍体产抗体B细胞中，各细胞自单套重链和轻链抗体基因座产生四聚体抗体。使用其它套基因座，但因称作等位基因排斥的过程而是非生产性的(参见Singh等，Q003) J. Exp. Med.，197，743-750 禾口 Immunology 第 5 版，R. Goldsby, T. Kindt, B. Osborne, J. Kuby (2003)W. H. Freeman and Company NY, NY及其中参考文献)。“记忆”遇到的病原体的能力是高等脊椎动物免疫系统的特色。B细胞对“记忆”的贡献似乎是两种独特的B细胞群，长寿命的浆细胞和记忆B细胞的作用(综述参见Tangye 和 Tarlinton Q009) Eur. J. Immunol.，(2009) 39，2065-2075)。它们由于幼稚 B 细胞最初的初次免疫应答(抗原攻击)产生。一种群体由长寿命的浆细胞代表，其为在抗原被清除后长时间(几个月)继续分泌高水平中和抗体的B细胞。浆细胞为终末分化的，包含编码高亲和力的抗原特异性抗体的重排亲和力成熟免疫球蛋白基因座。它们与仅几天寿命的短寿命浆细胞形成对照，短寿命浆细胞因大量产生抗原特异性抗体引起的应激而死亡(参见 Radbruch 等 Q006)Nature Reviews Immunology，6，741-750)。与此相反，第二群抗原特异性记忆B细胞代表亦包含编码高亲和力的抗原特异性抗体的重排亲和力成熟免疫球蛋白基因座的B细胞群，但其不高水平分泌抗体。记忆B细胞具有在再次发生暴露于初次免疫的抗原后迅速分裂并分化为分泌抗体的浆细胞的能力。这导致快速富集响应特定抗原攻击可用的抗原特异性免疫球蛋白库。天花接种的工作证明，记忆B细胞在免疫的个体中在50 年时间期间都有应答(Crotty 等 Q003)J. Immunology，171，4969-4973)。在人中，记忆B细胞在周围淋巴器官中存活，包含重排的体细胞突变的免疫球蛋白基因，并在再次攻击时介导再次免疫应答(参见Bernasconi等^00 kience，四8， 2199-220 。人脾脏尤其是记忆细胞的主要位点(综述参见Tangye和TarlintonQ009) Eur.J. Immunol.，(2009)39，2065-2075)。长寿命的分泌抗体的浆细胞在周围淋巴器官和骨髓中存活几个月。例如，抗原选择的分泌免疫球蛋白的细胞保持在人脾脏和骨髓中(Ellyard等Q004)Blood，103， 3805-3812)。在其它哺乳动物例如小鼠中，初次长期抗体应答似乎是长寿命浆细胞的功能。因而，在小鼠中，存在于骨髓和脾脏中的终末分化的长寿命浆细胞幸存并继续分泌抗体超过一年的长期时间(参见 Slifka 等(1998) Immunity，8，363-372 ；Maruyama 等 Q000) Nature， 407,636-641)。虽然在不同哺乳动物中记忆细胞和终末分化的长寿命的浆细胞之间的准确关系有待得到确定地证实，但是两类长寿命的B细胞存在于哺乳动物中，每种都包含编码高亲和力的抗原特异性抗体的重排亲和力成熟的免疫球蛋白基因座。一种具有快速分裂的能力。另一种不分裂但保留长期分泌抗体的能力。患者产生的抗原特异性人四聚体抗体提供临床及市售相关抗原特异性抗体的潜在来源。它们亦可直接源自EBV-转化的人B细胞，优选源自EBV转化的人记忆B细胞，任选在多克隆B细胞激活剂存在下转化(PCT/IB04/01071)。到现在为止，尚未将记忆细胞和长寿命的浆细胞用作转基因编码的高亲和力抗体的来源，高亲和力抗体尤其是人抗体或包含人VH和VL结构域的杂合抗体。VH结构域工程和只有重链的抗体在20世纪60年代确定了缺失轻链只有重链的抗体结合抗原的能力(参见Jaton 等(1968) Biochemistry，7，4185-4195)。物理上与轻链分开的重链免疫球蛋白相对于四聚体抗体保留80%的抗原结合活性。此外，结合活性与重链氨基末端片段(Fd)有关。虽然这些实验使用明确表征的抗原特异性的兔多克隆抗体，但它们代表包含哺乳动物(包括人) 来源的四聚体抗体的任何多克隆群。重链二聚体保留CHl轻链结合结构域。在20世纪80年代，一些出版物阐述了体外操作重链基因以构建新型抗体。该项工作的大部分基于重排小鼠抗体μ基因(IgM)，其编码针对明确表征的抗原产生的抗体。该抗体的特征是已经知道其抗原结合特异性位于VH结构域中，因为与不相关轻链装配和分泌显示保留抗原结合(参见Neuberger 和 WiIliams (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond.，A317， 425-432)。使用该系统，显示可将小鼠抗原特异性VH结合结构域用于获得新型抗体，该新型抗体包含与小鼠抗原特异性VH结构域融合的人ε恒定区。所得到的嵌合IgE保留抗原特异性，并显示IgE的预期效应子活性(参见Neuberger等(198 Nature，314，268-270)。重链工程的其它文献实例包括产生包含与人IgA或IgG恒定区融合的小鼠VH的嵌合小鼠-人抗体(参见 Morrison 等(1984) PNAS，81，6851-6855 ；Sun 等(1987) PNAS，84， 214-218)；和 Heinrich 等(1989) J. Immunol.，143，；3589_97)。因而，到 20 世纪 80 年代末期， 已明确确立了重链工程的观念。可将任何表征的VH结合结构域与任何抗体恒定区融合， 导致保留抗原特异性结合活性。通过所选择的重链恒定区(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA、IgE等)确定效应子功能。在所有情况中最终表达的嵌合抗体包含四聚体抗体。为了工程改造完整人重链，需要明确了结合特异性的人VH结构域来源。该问题部分通过人VH结合结构域阵列文库的发展解决，该文库是使用幼稚种系人V、D和J区段的组合或从源自人淋巴细胞的四聚体抗体获得的亲和力成熟的VH结构域而获得。然后可从获自产生抗体的人外周血B细胞的mRNA的VH结合结构域展示文库(参见Ward等(1989) Nature, 341，544-546)，或从获自幼稚人种系DNA的随机VDJ阵列(参见EP-A-0368684)，分离结合亲和力在20nM-100nM范围内的抗原特异性VH结构域。这些方法提供抗原特异性哺乳动物VH结构域的来源，特别是人VH结构域的来源。有人提出“分离的可变(VH)结构域可提供单克隆抗体的替代物，并作为构建高亲和力人抗体的关键起作用”；“通过将可变区与轻链恒定区或合适的重链恒定区连接并在哺乳动物细胞中表达装配的基因，可制备完整的抗体，并应该具有天然效应子功能，例如补体溶解(complement lysis) ” ；和“该方法可证明对构建治疗价值的人抗体有用”(参见Ward等(1989) Nature，341， 544-546 和 EP-A-0368684)。使用备选方法Sitia等((1990)Cell，60，781-790)证明，除去重排小鼠μ基因的 CHl结构域，导致培养物中的哺乳动物细胞合成并分泌缺失轻链只有重链的抗体。在这种情况下，分泌的重链包含VH结合结构域和由柔性铰链结构域和IgM CH2、CH3和CH4恒定结构域组成、提供重链二聚化和效应子功能的恒定区。因而，到1990年，可获得基本工具用于体外工程改造具有确定的VH结合特异性和选择缺失CHl的重链效应子区的人只有重链的抗体同源二聚体(有时阐述为Dabs-Fc)。该方法的问题有两个由阵列方法选择的VH结构域具有相对低的(20-100nM)抗原结合亲和力；和不存在轻链时VH结构域为“粘的”、不可溶，并倾向于聚集，因此不适合药物应用。
分离的VH结构域聚集的倾向是由于不存在轻链。当轻链不存在时，正常埋在重链 /轻链界面内的某些疏水侧链暴露。而且，热力学稳定性受到损害，因为VH结构域稳定性取决于在轻链界面处的接触(参见 Worn 和 Pluckthun (1999) Biochemistry，38，8739-8750)。Hamers-Casterman描述除了正常的骆驼科(camelid)四聚体抗体外，在骆驼科中循环天然存在的缺失轻链的只有重链的IgG同源二聚体抗体(参见Hamers-Casterman等 (1993)Nature，363，446-448)，这提供对溶解性问题的洞悉。与由Sitia等((1990)Cell, 60，781-790)工程改造的分子一致，由于可变剪接位点从加工的抗体重链mRNA除去CH1，故在只有重链的骆驼科抗体中不存在CHl结构域的功能性。通过抗原攻击获得的只有重链的骆驼科抗体VH结构域(下文中按照通常用法称为VHH结构域)，在B细胞中体内亲和力成熟，具有低纳摩尔范围的结合亲和力，可溶，且不倾向于聚集(参见Ewert等(2002) Biochemistry，41，3628-3636)。相对于由展示方法分离的种系来源的VH结构域，骆驼科VHH结构域通常亦显示提高热稳定性，且某些在变性剂例如去污剂及漂白剂存在下并在热处理后保留结合活性(参见Dumoulin等Q002) Protein Science,11,500-511 禾口 Dolk 等(2005)Applied Environmental Microbiology, 71,442-450)。可通过标准克隆技术或通过噬菌体展示或其它展示技术，从骆驼科B细胞mRNA 重新获得只有重链的抗原特异性抗体(参见Riechmann和Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods, 231, 25-38)。源自骆驼科的只有重链的抗体具有高亲和力。编码只有重链的抗体的mRNA的序列分析证明，多样性主要是由于VHHDJ重排和体细胞高变的组合，其如在产生正常四聚体抗体中亦观察到的。然而，仍然有待确定的是，与四聚体抗体相对比，骆驼科产生只有重链的抗体是否是通过正常B细胞。实际上，几乎不知道骆驼科中的前B细胞发育 (参见 W02004/049794 和 hu 等 ^00 J. Immunology, 175，3769-3779)。而且，仍然有待确定的是，只有重链的骆驼科抗体是否与包含重链和轻链的免疫球蛋白一样，经由记忆细胞或长寿命的浆细胞参与长期抗体应答。只有重链的骆驼科抗体的特定特征是，在正常VH结构域中与VL结构域作用相互作用的某些氨基酸残基在VHH结构域中发生突变。因而，在98%人和鼠VH序列中存在于 45位的亮氨酸已突变。已有人提出，在种系中保守的这些骆驼科突变，与不存在轻链时保持 VHH溶解性一致。亦阐述了与正常VH结构域相比的骆驼科VHH结构域中的其它特征氨基酸突变。其中最为常见和重要的变化发生在第二框架区的4个位置(VHH四联体)，并起降低以前轻链界面的疏水性的作用。通常在正常VH结构域中存在的亲水性较弱的Gly-44和 Leu-45的位置发现Glu-44和Arg-45，同时通过用较小的残基取代Trp提高了 47位的亲水性。第四个变化需要由Phe或Tyr取代Val-37。结构分析显示，这形成了通常包含Tyr_91、 Trp-103、Arg-45和存在于VHH结构域⑶R3环中的疏水残基的小疏水核心。这些改变通过用更亲水的侧链直接取代，或通过由CDR3和框架残基之间的相互作用将疏水侧链与溶剂隔绝来增加以前轻链界面的亲水性(参见Bond等(2003) J. Mol. Biol.，332，643-655)。相对于骆驼科四聚体抗体和来自人及小鼠的其它明确特征的四聚体抗体上存在的CDR3环，VHH结构域中的CDR3环扩大(参见Riechmann和Muyldermans (1999) J. Immunol. Methods，231，25-38)。存在于 VHH CDR3 环(例如大羊马它(llama) VHH 结构域中) 的关键疏水残基的作用，证明了 CDR3在VHH结构域的稳定性和溶解性中的结构作用(参见Bond等Q003)J.Mol.Biol.，332，643-655)。关于VHH结构域的结构研究全体证明，这些结构域的稳定性和溶解性除了取决于框架氨基外，还取决于CDR3，并且相对于VH结构域，对关键疏水残基的要求对与VHH结构域的有利生物物理学特征适合的CDR3环类型提出显著限制(参见 Barthelemy 等(2008) J. Biol. Chem.，283，3639-3654)。然而，尽管在骆驼科和人之间序列高度保守，但骆驼科VHH结构域仍然为骆驼科来源，因此在人中潜在具有抗原性。体外人源化可减少这种风险，但由于所涉及的体外工程改造而以潜在降低亲和力和溶解性为代价。人VH结合结构域和溶解件问题从种系序列或从相对于骆驼科VHH结构域为正常的四聚体抗体获得的人和其它哺乳动物VH结构域的差生物物理学特性，尤其是聚集的倾向，目前限制了其作为试剂、诊断试剂及作为药物的效用(参见 Rosenberg(2006) The AAPS Journal, 8 (3), Article 59 E501-E507 和 Fahrner 等 Q001) Biotechnol. Gen. Eng. Rev.，18，301-327)。解决溶解性问题的最初尝试依赖于将骆驼源化氨基酸序列在VH/VL界面引入所选择的人VH结合区。已证明该方法令人失望，因为通过仅VH/VL界面的45位“骆驼源化”不能解决稳定性和溶解性(参见Domantis 2007年5月18日及2007年6月5日的反对EP-B-0656946的提交意见)。事实上，引入靶向的“骆驼源化”突变不足以解决分离人 VH 结构域中的“粘性”问题(参见 Riechmann 和 Muyldermans (19^)J. Immunol. Methods, 231，25-38)。引入骆驼源化突变导致框架折叠变形，这可能是造成这些实验结果观察的蛋白质稳定性降低的原因(参见Riechmann (1996) J. Mol. Biol.，259，957-969)。此外， 包含关键疏水残基的CDR3在维持不存在轻链的VHH结构域的结构稳定性和溶解性中的作用增加了复杂性，这可能将⑶R3多样性限制于与骆驼科框架适合的那些⑶R3序列(参见 Barthelemy 等(2008)J. Biol. Chem.，283，3639-3654)。因而，在缺失轻链时，从亲和力成熟的天然四聚体抗体或从幼稚种系VDJ区段的阵列获得的哺乳动物VH结构域(包括来自人的)相对不可溶，并倾向于聚集。这样的VH 结构域缺少适合用作药物的可溶的VH结构域必需的生物物理学特性。通过转基因体内产生的只有重链的抗体和可溶的人VH结构域对于药物应用，可溶的VH结合结构域应优选人来源，在生理条件下不存在聚集时具有例如高抗原结合亲和力和溶解性等特征。亦可将这样的可溶的VH结合结构域用作诊断试剂和试剂，并在工业和农业中有广泛应用。用于产生抗原特异的只有重链的抗体的备选方法是，利用包含缺少CHl功能性的重链基因座的转基因小鼠(参见Janssens等Q006) PNAS，103 :15130-5和W002/085944)。开始时，不知道正常鼠B细胞是否被激活和由于抗原攻击而分泌只有重链的抗体，或这样的抗体是否将证实是可溶的。而且，不知道是否如同在骆驼科中需要IgM，是否表达限于Ig Y 2和Ig γ 3类抗体，或甚至不知道潜在不溶的VH结构域是否能由正常鼠B细胞分泌。Janssens等G2006)PNAS，103 :15130-5)阐述了包含以下的嵌合重链基因基因座两种大羊驼VHH基因区段、全部人D和J基因区段和编码人C μ和C γ 2和C γ 3恒定区的基因区段的组合，它们全部缺少CHl功能性。选择大羊驼VHH基因区段确保了，维持在骆驼科中的VH/VL界面处的种系框架突变亦存在于表达的骆驼源化人基因座中，以便提高得到的“骆驼源化"VH结构域可保留由骆驼科VHH表现的溶解性和稳定性特性的可能性，从而提高甚至是在源自骆驼科的CDR3环不存在时对抗原攻击的功能响应的可能性。结果证明，只有重链的抗体转基因以B细胞特异性方式表达，发生B细胞扩增，且不存在CHl功能性时，存在任何功能轻链基因是不相关的。只有重链的转基因响应抗原攻击而经历VDJ重排，接着B细胞激活和亲和力成熟。只有重链的IgM和IgG之间亦发生类转换，如同Cy同种型转换。在基因座不存在Cy时，同等良好地使用CY。抗体的特异性主要由VDJ(⑶旧)重排决定，而体细胞突变分析显示，这些发生在整个VH区，且优选在表达的大羊驼VHH基因区段的CDRl和CDR2区。在所表征的有限数量的骆驼源化的人只有重链的抗体中，全部证明为可溶，而不管其为通过VH结构域的噬菌体展示还是通过杂交瘤选择从脾B细胞获得，但是事实上完全从人序列获得的CDR3环比在骆驼科VHH结构域中发现的小。该有限系列的最佳大羊驼/人杂合只有重链的抗体具有1-3ηΜ范围的亲和力。 小鼠亦将转基因作为另一重链基因座，因为在即使轻链重排不存在时B细胞扩增和脾构造也基本上正常(参见Janssens等(2006)PNAS，103 :15130-5)。此外，等位基因排斥机制决定是内源小鼠重链基因座还是缺少CHl功能性的重链转基因生产性表达(参见 W02007/09677)。Janssens等((2006)PNAS，103 =15130-5)的观察结果令人惊讶地证明，即使在包含骆驼科序列的CDR3环不存在时可使用骆驼科框架获得稳定可溶的骆驼源化的只有重链的抗体。作为这些实验的延伸(参见W02006/008M8)，构建了另外的转基因小鼠品系，其包含完整的人只有重链的基因座，因此缺少编码骆驼科VHH框架的序列，并另外包含自非骆驼科序列获得的⑶R3环。在该方法中，引进了四种天然人种系VH基因区段(V4天然基因座)，因此完全依赖通过用于产生所得到的可溶的人VH结构域的抗原特异性和结构稳定性的亲和力成熟进行的天然选择。两种基因座都包含所有人D和J基因区段、人C γ 2和C γ 3恒定区基因区段 (各缺少CHl)、人免疫球蛋白增强子调节元件和优选抗体重链LCR。人V4基因座是功能性的，而人只有重链的抗体在未受攻击的动物的血浆中循环。在抗原攻击后，用常规Elisa测定检测到抗原特异性人抗体。包含工程改造的V基因区段(V17基因座)(亦参见W02008/035216)的人基因座亦是功能性的(亦参见The Antibody Engineering and Antibody Therapeutics Meeting (抗体工禾呈禾口抗体治疗会议)· F. Grosveld 陈述，San Diego Antibody Meeting (圣地亚哥抗体会议)，2007 年 I2 月 3-4 日)。而且，令人惊讶地，包含V4基因座的转基因小鼠的抗原攻击，使得在不存在骆驼科种系特征框架突变和骆驼科VHH结构域特有的骆驼科样CDR3环时，能够分离并表征可溶的抗原特异的高亲和力人VH结构域。此外，从抗原特异性人只有重链的抗体获得的VH结构域为可溶的(参见W02006/008M8)。在抗原攻击、VDJ重排和随后的B细胞扩增之后， 在包含人V4基因座的小鼠中的脾构造与响应抗原攻击的野生型小鼠的免疫球蛋白基本类似。光学显微镜检查显示，由含有滤泡的富含B细胞区域和存在于白髓外边界处的边缘区包围的微动脉周围淋巴细胞鞘(PALS)中的T细胞聚集的分离。在T细胞依赖性抗体应答期间，在可与野生型小鼠比较的周围淋巴组织的B细胞滤泡中亦存在与生发中心相似的结构。鉴定和工程改造合成人VH结构域的备选展示方法(其不依赖对天然骆驼科VHH 结构域序列的预测性分析)亦证明，用与在骆驼科中发现的不同的非天然突变，可获得具有超出天然框架范围的结构特性的自主VH结构域(参见Barthelemy等Q008) J.Biol. Chem.，283，3639-36 和美国专利申请号11/102,502)。然而，该资料未显示这样的VH结构域在生理条件下不存在聚集时是否保留溶解性的生物物理学特性连同低纳摩尔范围的结合亲和力。用于通过展示鉴定和工程改造合成人VH结构域的方法虽然精致，但是费力，并将范围限制于人VH结构域和骆驼科VHH三维结构信息的可用性。微小的差异视VDJ组合而定将变得明显，这将限制对合成的具不受结构需求约束的CDR3多样性的基于阵列的VH文库的开发，所述VH文库保留高亲和力抗原结合。虽然结果证明，与骆驼科VHH结构域形成对比，人VH结构域的可溶稳定构象不取决于CDR3环和在以前轻链界面处的骆驼科特征氨基酸取代之间的相互作用，但是该数据限于生物物理学特性。例如，尚未顾及在这些变化情景中高亲和力抗原结合的维持。本发明本发明阐述非常适合用作药物的新的可溶的高亲和力的只有重链的抗体和结构上与源自正常四聚体抗体或种系阵列的VH结构域不同的可溶的VH结构域，以及用于从抗原攻击后的转基因动物分离所述新的只有重链的抗体和可溶的VH结构域的优选途径。因此，本发明第一方面提供新的高亲和力的抗原特异性的可溶的只有重链的抗体，所述抗体缺少特征骆驼科相关氨基酸取代并具有未在正常四聚体抗体中发现的FR2取代；显示CDRl内的净疏水性提高和CDR3中存在的荷电氨基酸数目增加；和包含导致FRl内的净疏水性提高和FR3中存在的荷电氨基酸数目增加的框架β 折叠内的一个或多个氨基酸取代。只有重链的抗体优选为人抗体。人只有重链的抗体缺少特征骆驼科相关氨基酸取代并具有未在正常人四聚体抗体中发现的FR2取代。只有重链的抗体优选具有IOnM或更好的结合亲和力，并在生理缓冲条件下作为凝胶过滤时的可溶性单体。本发明亦提供高亲和力的抗原特异性的可溶的VH结构域，所述VH结构域缺少特征骆驼科相关氨基酸取代和具有未在正常四聚体抗体中发现的FR2取代；显示CDRl内的净疏水性提高和CDR3中存在的荷电氨基酸数目增加；和包含导致提高FRl内的疏水性并增加FR3中存在的荷电氨基酸数目的框架β折叠内的一个或多个氨基酸取代。可溶的VH结构域优选为人来源。可溶性人VH结构域缺少特征骆驼科相关氨基酸取代并具有未在正常人四聚体抗体中发现的FR2取代。可溶的VH结构域优选具有IOnM或更好的结合亲和力，并在生理缓冲条件下作为凝胶过滤时的可溶性单体。本发明进一步提供V基因区段，当与D基因区段和J基因区段重组并随后经历亲和力成熟时，所述V基因区段编码本发明的可溶的VH结构域。任选地，可相对于V基因区段的天然种系序列，通过至少一个取代、插入或缺失或其组合对V基因区段序列进行工程改造，使得其包含编码氨基酸残基或氨基酸序列的密码子，所述氨基酸残基或氨基酸序列不同于宿主动物种系序列，不是特征骆驼科相关氨基酸取代，并可以为通常未在正常四聚体抗体中发现的FR2取代。所述变化可包含V基因区段的CDRl和/或CDR2区内的取代、插入或缺失或其组合，以便相对于种系序列增加可供抗原结合利用的氨基酸的多样性。本发明进一步提供D基因区段，当与本发明的V基因区段和J基因区段重组时，所述D基因区段编码本发明的VH结构域。任选地，可相对于D基因区段的天然种系序列，通过至少一个取代、插入或缺失或其组合对D基因区段序列进行工程改造。所述取代、插入或缺失或其组合，使得D基因区段可包含编码氨基酸残基的密码子，所述氨基酸残基业已确定有助于维持可溶的VH结构域 (包含由D基因区段编码的序列)的溶解性和稳定性，或备选地可相对于种系序列在任何得到的CDR3环中提高D基因区段的多样性。本发明还进一步提供J基因区段，当与本发明的V基因区段和D基因区段重组时， 所述J基因区段编码本发明的可溶的VH结构域。任选地，可相对于J基因区段的天然种系序列，通过至少一个取代、插入或缺失或其组合对J基因区段序列进行工程改造。所述取代、插入或缺失或其组合，使得J基因区段可包含编码氨基酸残基的密码子，所述氨基酸残基业已确定有助于维持VH结构域(包含由J基因区段编码的序列)的溶解性和稳定性，或备选地可相对于种系序列在任何得到的 CDR3环中提高J基因区段的多样性。本发明优选提供异源只有重链的基因座，所述基因座包含一个或多个本发明的V 基因区段、一个或多个本发明D基因区段、一个或多个本发明J基因区段和各自编码缺少 CHl功能性的抗体恒定效应子区的一个或多个恒定效应子区基因区段，其中排列所述基因区段，使得V、D和J基因区段和恒定区基因区段可重组，以产生编码本发明的高亲和力的抗原特异性的可溶的只有重链的抗体的重排基因。只有重链的基因座具有脊椎动物重链恒定效应子区，其优选为哺乳动物来源，更优选源自人、小鼠、大鼠或骆驼科。优选地，排列重链基因座，以产生包含可溶的人VH结构域和哺乳动物来源的恒定效应子区的只有重链的抗体。本发明还进一步提供包含本发明异源重链基因座的转基因非人哺乳动物。优选哺乳动物为啮齿动物，最优选小鼠或大鼠。优选转基因非人哺乳动物的内源重链基因座的功能已通过本领域已知的任何方法损害，或通过缺失沉默(参见US 5, 591,669 ；US 6, 162, 963 ；US5, 877, 397 ；Kitamura 和 Rajewsky(1992)Nature,3 月 12 日；356(6365) 154-6) 0备选地，可除去(ablate)表达与转基因相对比的内源免疫球蛋白基因的B细胞。 内源κ和λ轻链基因可保留功能性，或任选可在功能上沉默或缺失(ΕΡ139959)。不太优选地，在缺失内源重链或轻链基因功能性的宿主背景中，转基因可为包含CHl功能性的正常重链抗体基因座(参见 ΕΡ139959 和 hu 等 J. Exp. Med.，204，3271-3283)。只有重链的免疫球蛋白转基因亦可包含内源重链免疫球蛋白基因座，该内源重链免疫球蛋白基因座业已经工程改造以消除CHl功能性，并任选进一步经工程改造以引入或替代一个或多个具有备选V、D和J基因区段的内源V、D和J基因区段(优选为人来源)。在另一方面，本发明提供用于生产高亲和力的抗原特异性的可溶的只有重链的抗体的方法，所述方法包括用抗原攻击本发明的转基因非人哺乳动物。优选可溶的只有重链的抗体为人抗体。优选所述方法包括使来自哺乳动物的产抗体细胞无限增殖化的步骤。可通过与骨髓瘤细胞融合来使细胞无限增殖化，或可通过用病毒例如EBV转化来使细胞无限增殖化。优选所述方法进一步包括从产生所需抗原特异性的只有重链的抗体的B细胞或无限增殖化细胞系分离可溶的VH结构域或编码可溶的VH结构域的核酸的步骤。备选地，所述方法可进一步包括步骤从哺乳动物产生的产生只有重链的抗体的细胞，或从哺乳动物产生的通过展示方法产生只有重链的抗体的无限增殖化细胞，分离可溶的VH结构域或编码可溶的VH结构域的核酸。本发明亦提供通过本发明方法获得的可溶的VH结构域或编码可溶的VH结构域的核酸，在制备只有重链的抗体、VH胞内抗体、VH多蛋白、VH结构域复合体或VH融合体中的用途。本发明进一步提供包含至少一种本发明的可溶的VH结构域的只有重链的抗体、 VH胞内抗体、VH多蛋白、VH结构域复合体或VH融合体。本发明还进一步提供用于治疗的包含至少一种本发明的可溶的VH结构域的只有重链的抗体、VH胞内抗体、VH多蛋白、VH结构域复合体或VH融合体。本发明亦提供包含至少一种本发明的可溶的VH结构域的只有重链的抗体、VH胞内抗体、VH多蛋白、VH结构域复合体或VH融合体，在制备用于治疗包括但不限于以下疾病或病症及用于免疫治疗的药物中的用途伤口愈合；细胞增殖病，包括瘤、黑色素瘤、肺瘤、 结直肠瘤、骨肉瘤、直肠瘤、卵巢瘤、肉瘤、子宫颈瘤、食管瘤、乳腺瘤、胰腺瘤、膀胱瘤、头颈瘤和其它实体瘤；骨髓增殖病，例如白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、白细胞减少症、血小板减少症、血管发生疾病、卡波西肉瘤；自身免疫性/炎性疾病，包括变态反应、炎性肠病、关节炎、 牛皮癣和呼吸道炎症、哮喘、免疫病和器官移植排斥；心血管病和血管病，包括高血压、水肿、咽峡炎、动脉粥样硬化、血栓症、脓毒、休克、再灌注损伤和缺血；神经学疾病，包括中枢神经系统病、阿尔茨海默病、脑损伤、肌萎缩性侧索硬化和疼痛；发育病；代谢病，包括糖尿病、骨质疏松症和肥胖、AIDS和肾病；感染，包括病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染、与胎盘有关的病理学病症和其它病理学病症。本发明再进一步提供用于制备本发明的可溶的VH结构域的盒，所述盒包含编码 FRU FR2和FR3的基因序列，其中编码FRl和FR2和FR2和FR3的基因序列由使能够引入合适的CDRl-编码序列和CDR2-编码序列的序列隔开，且在编码FR3的序列的3’端存在使能够引入编码合适CDR3-编码序列的序列的序列。本发明利用非人转基因哺乳动物(优选小鼠或大鼠)中的天然哺乳动物B细胞机制来响应抗原攻击产生新的高亲和力的可溶的只有重链的抗体。本发明可溶的只有重链的抗体具有IOnmol或更好的结合亲和力。自抗原特异性的高亲和力的缺失轻链的人只有重链的抗体获得的可溶的人VH结合结构域的序列分析意想不到地显示，不存在骆驼科VHH结构域特有的所有氨基酸特征共有序列。事实上，天然选择不由于亲和力成熟而通过选择骆驼科样特征序列来补偿。因此， 当种系中不存在骆驼科特征序列时，补偿不存在轻链的不同机制起作用，以便维持人VH结构域的结构稳定性和溶解性。最意想不到的特征是，不仅抗原特异性的高亲和力的人缺失轻链只有重链的抗体可溶，而且抗原结合区(CDR)除了抗原结合外，还应该在结构稳定性和溶解性方面起作用， 以及在以前轻链界面处补偿不存在轻链的特征骆驼科VHH种系编码的框架共有氨基酸取代，不仅在转基因的只有重链的基因座中不存在，而且在天然选择加工期间不因亲和力成熟而被插入来补偿溶解性。在转基因编码的可溶的人VH结构域中，备选氨基酸取代可在亲和力成熟后发生在所有三个框架区内。框架突变主要但排它地位于以前轻链界面处的β 折叠内，从而补偿不存在轻链。在存在和不存在轻链时获得的人抗原结合VH结构域的框架区和CDR区的净电荷和疏水性的比较分析揭示不存在轻链时的显著变化。在不存在轻链时，提高了存在于CDRl 中的氨基酸的净疏水性，并增加了存在于CDR3中的荷电氨基酸。框架β折叠内的氨基酸取代导致降低总体疏水性，并增加框架3中存在的荷电氨基酸。框架1中的荷电氨基酸数和疏水性有提高，而框架2中的疏水性有小的降低。这是与骆驼科例如大羊驼的VHH结构域形成某种程度的对比，其中比较分析显示特征与不存在轻链的人VH结构域共同，但亦有差别。在骆驼科例如大羊驼中，框架2的净疏水性显著降低，这与通过在以前轻链界面处的特征氨基酸取代引入提高的亲水性一致，以及CDR3中的净电荷增加。因而，抗原攻击后，即使是当种系中不存在必需氨基酸取代时，B细胞也补偿轻链的不存在，如在骆驼科科动物例如大羊驼和相关物种中所发现。在不存在补偿不存在的轻链的种系序列时，体内存在不同的解决方法，所有方法都导致在不存在轻链时产生高亲和力的稳定可溶的只有重链的抗体和可溶的VH结构域。这些观察结果与抗原结合区(OTR)除抗原结合外在稳定VH结构域中的主要作用一致。这通过随后框架内尤其是在β折叠内以前轻链界面处的罕见或新的氨基酸取代来补充。在通过转基因方法体内获得的非骆驼科来源的可溶的VH结构域中，不存在对VHH溶解性和稳定性重要的特征骆驼科氨基酸取代。包含这些特征的非骆驼科抗原特异性的只有重链的抗体为可溶的，并在正常生理条件下不聚集。此外，自这些抗体分离的可溶的VH结构域保留VH结构域稳定性和溶解性的有利特征。这些只有重链的抗体和自其获得的可溶的VH结构域在抗原攻击后以B细胞特异性方式通过天然选择机制演变。自相同的VDJ重排获得的高亲和力抗体(IOnrn或更好)， 通常包含比在较低亲和力的只有重链的抗体中观察到的更多的框架取代。因而，抗原结合结构域(CDR)和β -折叠框架，有助于这些缺失轻链只有重链的抗体或自其获得的可溶的VH结构域的总体稳定性、溶解性和结合亲和力。稳定的高亲和力的抗原特异性的可溶的VH结合结构域的序列分析确定抗原结合区(CDR)内的选择和亲和力成熟与总体增加的疏水性和电荷一致，这产生抗原结合的特异性和亲和力及结构稳定性；存在于以前的轻链界面周围的框架2和3中的突变与改进的VH结构域溶解性和稳定以及因此改进的抗原结合亲和力一致；框架1和3中的突变与提高VH结构域的总体稳定性的补偿性结构突变一致。
因而，在不存在抗体轻链时，哺乳动物B细胞可通过亲和力成熟和选择重链VH结合结构域固有的不稳定性及不可溶性同时保留抗原结合亲和力来补偿。我们的分析显示，天然机制似乎与所用的V基因区段无关地起作用。因而，在不存在轻链时在人V4转基因小鼠脾中产生的人VH结构域的大量序列分析使得能够进行突变频率的可比较分析。在CDRl和CDR2内观察到最大的突变负荷。然而，在框架1、框架2和大部分框架3内可辨明突变负荷热点。出现的总体图式似乎对所用的特定V基因区段并不罕见，因为在该系列实验中，已用具有突变负荷出现相似图式的V3-23、V3-11和V1-46获得高亲和力抗体。类似地，在CDR3中，J4占优势，但并未排它使用。似乎B细胞亲和力成熟机制在不存在轻链时加工和分泌可溶的VH结构域中具有多种作用。CDR内的高变主要反映抗原结合亲和力，但似乎亦在结构稳定性中发挥作用。框架区内的高变补偿轻链的不存在，但似乎亦提高VH结构域的稳定性并因此提高VH结构域的溶解性，并通过这点，还使抗原结合亲和力最大化。我们推定缺少轻链只有重链的抗体的溶解性和稳定性是细胞内有效运输到细胞表面、呈递及随后B细胞扩增的必要条件。亦可将有利的框架突变构建到包含工程改造的人V区段的新的种系只有重链的抗体基因座中，所述V区段各包含优选氨基酸取代。同样地，可将优选的氨基酸取代工程改造到J和D基因区段中，以进一步提高VDJ 重排后的VH结构域的溶解性和稳定性。因而，提供高亲和力的可溶的人只有重链的抗体，所述人抗体缺少特征骆驼科相关氨基酸取代，并相对于正常四聚体人抗体中发现的VH结构域，显示提高CDRl内的疏水性及增加CDR3内的荷电氨基酸。高亲和力的可溶的人只有重链的抗体亦包含一个或多个框架β折叠内的氨基酸取代，这导致相对于正常四聚体人抗体，提高框架1的总体疏水性，降低框架3的疏水性，和增加框架3中存在的荷电氨基酸。所述方法使能够天然选择新的只有重链的抗体。从所述抗体获得的可溶的VH结构域包含在天然四聚体抗体中罕见或不存在的突变，在天然四聚体抗体中，VH溶解性取决于与免疫球蛋白κ或λ轻链的VL结构域的相互作用。在不存在轻链时，所观察到的氨基酸取代赋予所得到的抗原特异的只有重链的抗体和可溶的VH结构域优选的生物物理学属性。具体而言，通过该方法获得的只有重链的抗体和可溶的VH结构域，缺少源自种系阵列或天然四聚体抗体的天然VH结构域的“粘的”、相对不可溶的及易于聚集的倾向。本发明这些只有重链的抗体和可溶的VH结构域具有高亲和力(IOnM或更好)，在不存在聚集时是可溶的，并特别适合用作药物。将在高亲和力的人可溶的VH抗原结合结构域中发现的氨基酸取代重叠到存在于正常四聚体抗体中的人VH结构域的已知3D结构上，提供对明确的氨基酸取代的位置及功能影响的理解。例如从13-15位氨基酸观察到框架1取代，其中13位更普遍，这导致疏水性整体提高。 13位变化位于导致局部提高亲水性的小环中；框架2取代可发生在集中于35和50位周围的β折叠内以前轻链界面处；和框架3取代显示在框架/⑶R界面处普遍，例如在⑶R2末端(56和57位)和在 CDR3起始处(93位)。本发明任选提供优选的新的框架氨基酸插入或取代，其被工程改造到天然V基因区段中，用于优化转基因的只有重链的抗体基因座，以得到具有优选生物物理学特性(包括不存在聚集时的溶解性)的高亲和力的只有重链的抗体和VH结构域。因而，提供所选择的可溶性人VH结构域，其具有优选的生物物理学特性，例如在不存在聚集时的溶解性。它们提供天然重链框架区的来源，当与一个或多个CDR组合时，所述天然重链框架区提供进一步产生VH结合蛋白的文库、新的抗原结合蛋白的来源(参见美国专利申请号 11/102, 502 和 11/745,644)。本发明人亦意想不到地显示，转基因编码的只有重链的抗体亦由鼠长寿命的浆细胞或记忆B细胞表达，并从抗原攻击的包含只有重链的基因座的转基因动物的周围淋巴腺、骨髓和脾中纯化。而且，业已开发了更高效的方法，所述方法无需杂交瘤或经典展示方法来重新获得抗原特异性的只有重链的抗体或可溶的VH结构域。有利地克隆的编码源自抗原攻击的转基因动物的纯化的浆细胞或记忆细胞群的只有重链的抗体或可溶的VH结构域的cDNA，可用所选择的能够表达、累积、分泌或呈递VH 结构域融合蛋白或只有重链的抗体到细胞表面上的任何细胞系来表达。优选的选择为适合制备临床级材料的微生物细胞系或哺乳动物细胞系。因而，按照本发明第二方面，本发明第一方面的只有重链的抗体和可溶的VH结构域从宿主记忆B细胞或长寿命的浆细胞得到。本发明第二方面提供制备特异性结合抗原的只有重链的抗体的方法，所述方法包括(a)用抗原来免疫非人转基因哺乳动物，其中哺乳动物在转录和加工的重链mRNA 中表达缺少CHl功能性的只有重链的抗体；(b)从免疫的哺乳动物分离长寿命的浆细胞或记忆B细胞；(c)从源自步骤(b)的细胞分离mRNA群；(dl)将源自步骤(c)中分离的mRNA的cDNA群克隆到表达载体中，并在所选择的细胞系中表达所述cDNA;(el)选择至少一种产生特异性结合抗原的只有重链的抗体的细胞系；或(d2)将源自步骤(c)中分离的mRNA的包含VH结构域的cDNA群克隆到所选择的表达载体中，使得可包含重链效应子区的VH融合蛋白在所选择的细胞系中表达；(e2)选择至少一种产生特异性结合抗原的VH融合蛋白的细胞系。选择的细胞系优选为哺乳动物来源，但可源自能够累积或分泌只有重链的抗体和 VH结构域融合蛋白或呈递所述只有重链的抗体和VH结构域融合蛋白到细胞表面上的酵母或任何生物体。该方法适合用于分离只有重链的抗体，而不管所述只有重链的抗体是在宿主生物体(例如大羊驼)中天然产生还是由于在非人宿主生物体中表达的转基因座产生。优选地，所选择的哺乳动物细胞系适合制备临床级材料，例如CHO细胞。所述方法简单、高效且很适合自动化，因为只有重链的抗体为同源二聚体，而不是复杂的四聚体。不必搜寻同族(cognate)轻链，搜寻同源轻链这个问题大大增加了从记忆细胞和浆细胞群获得抗原特异性四聚体抗体的复杂性(参见Meijer等Q009) Therapeutic Antibodies :Methods and Protocols,525,261-277)。
可通过本领域非常确实的一些技术从宿主生物体分离在长寿命的浆细胞或记忆细胞中富含的B细胞群。优选的宿主生物体为小鼠。在小鼠中，充分表征了 B细胞群，可使用细胞表面标记来区分不同亚群。例如，小鼠浆细胞在细胞表面上表达⑶138 (Syndecan-1)。 B细胞系的细胞上的⑶138表达将发育阶段、定位及粘附相关联(参见Sanderson等(1989) Cell Regulation, 1，27-35 ；Kim 等(1994)Mol. Biol. Cell.，5，797-805)。主要在脾、淋巴结和骨髓中发现CD 138+浆细胞。可进一步将浆细胞与鼠幼稚B细胞、记忆B细胞和非B细胞群区分开，因为它们是CD138+、CD45R(B220)低/阴性和CD19低/阴性的。识别细胞表面标记的抗体的可用性使得能够通过荧光激活的细胞分选或在试剂盒中广泛可用的非常确实的细胞分离技术将浆细胞与其它B细胞群分开，所述试剂盒基于例如用使得能结合一个细胞群而不是另一细胞群的与固体底物缀合的抗体进行的磁分离、 柱分离或离心分离步骤。因而，例如，包含抗⑶45R(有时称为B220)的磁珠将从混合B细胞群中除去大部分非浆细胞。随后与包含抗CD138的磁珠孵育将捕获高度富集的浆细胞群 (参见Miltenyi Biotec用于小鼠⑶138+浆细胞分离的磁分选试剂盒)。亦可将其它细胞表面标记用于分离这些细胞(例如Anderson等(2007) J. Exp. Med.，204，2103-14)。同样， 可自淋巴结和/或派伊尔斑(Peyer’ s patch)获得初始细胞群。当不能获得区分特定宿主B细胞系的抗体混合物时，那么从骨髓和淋巴结分离B 细胞后用针对泛B细胞表面标记的抗体纯化B细胞的组合将同样提供高度富集的浆细胞群。这对于细胞表面标记例如CD138可能不可用的物种尤其相关，所述物种例如母牛 (cow)、兔、绵羊等，甚至人。可获得选择其它物种的特定B细胞群的标记(例如httD:// www, miltenyibiotec. com/en/PG 91 625 CD138 Plasma Cell Isol ation Kit.aspx ； Klein 等，Human immunoglobulin(Ig)M+IgD+peripheral blood B-cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes :CD27 as a general marker for somatically mutated (memory) B cells (表达 CD27 细胞表面抗体的人免疫球蛋白(Ig)M+IgD+外周血B细胞原携带体细胞突变可变区基因CD27作为体细胞突变(记忆)B 细胞的通用标记)，(1998) J. Exp. Med. ,188, (9), 1679-89 ；Denham 等，Monoclonal antibodies putatively identifying porcine B cells (单克隆抗体推定鉴定猪 B 细胞)，(1998) Vet Immunol Immunopathol. 30 ；60 (3-4) :317-28 ;Boersma 等， Summary of workshop findings for porcine B-cell markers (猪 B 细胞标记石if究会结果概述)，(2001)Vet. ImmunolImmunopathol.，80，(1-2),63-78 ；Naessens，Surface Ig on B lymphocytes from cattle and sheep (来自牛和绵羊的B淋巴细胞上的表面Ig)， (1991)Int. Immunol.，9，(3)，349-54 ；Sehgal 等，Distinct clonal Ig diversification patterns in young appendix compared to antigen-specific splenic clones (与抗原特异性脾克隆比较年幼阑尾中的独特的克隆Ig的多样化图式)，(2002) J. Immunol. ,168, (11),5424-33)。在从分离的浆细胞或记忆细胞群分离mRNA后，将cDNA (代表HCAb或单独的VH结构域)克隆到所选择的表达载体中，并将载体转染到靶标细胞群中用于表达只有重链的抗体或VH融合蛋白。可例如通过96孔格式板或微阵列格式板的标准Elisa或荧光激活细胞分选术(FACS)选择表达抗原特异性的只有重链的抗体的细胞以得到细胞系。
为了使该过程的效率最大化，优选将表达载体首先转染到细菌中，将含有表达载体中的克隆的cDNA的菌落挑选到96孔(或其它可高通量可自动化的)格式板中，在96孔格式板中培养，并在相同格式板中分离DNA。随后在相同格式板中将质粒DNA转染到表达细胞(例如HEK细胞或酵母等)中，让转化体在相同96孔格式板中生长。随后在相同格式板(或用较少的抗原的另一种，优选更高密度格式板，例如微阵列)中检测细胞上清液的抗原结合。然后可进一步扩增抗原阳性HCAb-表达细胞，可从原始96孔格式板立即获得阳性 cDNA，在96孔格式板中制备DNA用于进一步表征，例如用于序列分析，或可将相关VH结构域立即克隆到不同主链中，例如来自相同物种或不同物种的不同恒定区。亦可立即将DNA 转染到其它细胞类型中以建立其它细胞系。然后可扩增表达高亲和力抗体的细胞系，建立细胞库，并用作只有重链的靶抗体的来源，用于研究目的或可能的临床前或临床研究。因而，所述方法进一步包括维持所选择的细胞系的步骤，所述细胞系产生特异性结合靶抗原的只有重链的抗体或VH融合蛋白。这种直接克隆方法对于正常转基因获得的四聚体抗体亦有利，其中每孔使用单个 CD138+细胞。用链特异性引物单独PCR扩增编码重链和轻链的(高丰度)mRNA，然后将每一种克隆到表达载体中。二者共转染将导致四聚体抗体表达，可用所述用于只有重链的抗体的同样方法来鉴定所述四聚体抗体。所选择的表达载体为本领域技术人员所熟悉，应设计为有效驱动只有重链的抗体或VH融合蛋白在所选择的细胞类型中表达。如果预期分泌，那么载体应在氨基末端掺入信号肽。如果预期细胞表面表达，那么在羧基末端也应存在疏水肽序列。优选但非必需地，所述氨基和羧基肽可源自哺乳动物的重链免疫球蛋白。应将载体设计为盒式，以便从抗原特异性的只有重链的抗体克隆的可溶的VH结构域可作为融合蛋白产生。得到的融合蛋白可为只有重链的抗体，并将包含可溶的VH结构域和所选择的重链效应子结构域。若可溶的VH 结构域和所选效应子结构域为人来源，那么得到的融合蛋白应为由选择的效应子区(例如 IgM, IgG, IgA, IgE或IgD)规定的类型(及亚类)的人只有重链的抗体。在任何只有重链的抗体中，可溶的VH结构域和恒定效应子区将通过铰链区连接。优选但不是必需地，这应为从合适类或亚类获得的天然重链免疫球蛋白铰链区。以上方法优于其它方法(例如噬菌体展示或用源自全脾的材料的杂交瘤)的优点为，所述方法在至今未知的体内选择过程之后选择在浆细胞或记忆细胞中产生的高亲和力的只有重链的抗体(IOnmol或更好)。所述B细胞群产生只有重链的抗体(HCAb)，所述HCAb 可溶并且不在胞内小室中累积(否则所述累积导致细胞凋亡)。可用标准表达系统尤其是在已建立的哺乳动物细胞系例如HEK或CHO中有效表达所述HCAb。然后可用已确定的技术通常为可自动化的微孔格式板(例如96孔)将转染细胞形成阵列。然后可选择以下细胞用于进一步分析表达高亲和力HCAb抗原结合剂的细胞，或备选的表达以明确亲和力范围结合抗原的HCAb的细胞。备选地，可通过FACS分析来选择高亲和力结合剂。从一种或多种抗原攻击的转基因非人动物例如小鼠(其作为HCAb mRNA来源表达抗原特异性HCAb)获得的记忆细胞或浆细胞的使用，提供用于HCAb选择的异常有效的途径，这使得能够选择可能百万计的产生HCAb的细胞用于随后分析。然后可在培养物中扩增所选择的表达高亲和力HCAb抗原结合剂的细胞，这在不存在另外克隆步骤的情况下提供产HCAb细胞的来源。任选可将分离的长寿命的浆细胞或记忆B细胞在抗原特异性的只有重链的抗体或VH结构域的mRNA分离和克隆之前无限增殖化。本发明亦提供转基因非人哺乳动物，其具有包含显性选择标记基因的转基因重链基因座或只有重链的基因座(缺少CHl功能性)。同样预期包含多于一个的选择标记，各标记与不同基因座或基因座组连接，使得能够优先选择表达与能够表达只有重链的抗体的一个基因座或基因座组形成对比的另一个基因座或基因座组的杂交瘤。不同基因座上的多种选择标记的使用依赖以下发现如果转基因非人哺乳动物具有多个只有重链的基因座，那么这些基因座遭受等位基因排斥(PCT/IB2007/001491)。因此，抗原攻击后，只有一个基因座被随机选择并成功地重组，导致产生只有重链的抗体。因此，可在相同转基因非人哺乳动物中使用多个只有重链的VH基因座，以使从该哺乳动物获得的抗体库和多样性最大化。当用抗原攻击时，转基因非人哺乳动物的基因座相继地进行随机重组，不优选任何特定基因座，直到重组之一为“生产性的”，即导致产生抗体。停止进一步重组，藉此“排除”其它等位基因(基因座)。将优选扩增产生高亲和力抗体的细胞。通常显性选择标记基因为原核来源，且选自赋予对毒性药物例如嘌罗霉素、潮霉素和G418抗性的基因，或这样的基因其消除某些营养需求，使得其表达将毒性物质转化为必需氨基酸，例如将吲哚转化为色氨酸或将组氨醇转化为组氨酸。必需的要求是，若使用显性选择标记，则其与所需的只有重链的免疫球蛋白等位基因共表达，由此确保不依赖B 细胞表达和整合位点的转基因基因座表达。备选地，可用同源重组与ES细胞或核转移方法组合，将药物抗性基因插入内源或外源(转基因)免疫球蛋白基因座中。因此，提供用于制备单克隆抗体的方法，所述方法需要选择优选从表达确定的免疫球蛋白的只有重链的基因座的记忆细胞或浆细胞得到的杂交瘤或转化B细胞系，所述杂交瘤或转化B细胞系包含存在于非人转基因哺乳动物中的多个只有重链的基因基因座之一，所述基因座包含插入到所述基因座中的共表达的显性选择标记基因。优选基因座为包含显性选择标记基因的只有重链的基因座，所述基因座表达只有重链的抗体。优选地，从经工程改造为缺少CHl功能性的内源只有重链的基因座或从引入的缺少CHl功能性的重链转基因产生只有重链的抗体，任选在不存在免疫球蛋白轻链基因表达的情况下。所述基因座亦可在不存在轻链基因座的情况下包含显性选择标记和重链基因座，当表达时，所述重链基因自发产生缺少CHl功能性的mRNA转录物，这导致以B细胞依赖方式表达只有重链的抗体。根据本发明第三方面，当预期将杂交瘤或B细胞转化方法用于使浆细胞或记忆细胞无限增殖化时，那么在各重链基因座中包含功能显性选择标记基因，使得能够随后选择并稳定维持在抗原攻击后表达目标基因座的杂交瘤或转化B细胞系，同时丢失不表达该目标基因座的所有杂交瘤细胞或转化B细胞。为本发明目的，可使用任何显性选择标记基因， 前提是该基因的表达在存在选择性(例如毒性)攻击时赋予杂交瘤选择性益处(参见Vara 等(1986)NAR, 14,4617-4624 ；Santerre 等(1984)Gene, 30,147-156 ；CoIbere-Garapin ^ (1981) 150，1-14 ；Hartmann 和 Mulligan(1988)PNAS，85，8047-8051)。异源只有重链的基因座在本发明上下文中，术语‘异源’意即本文所述的核苷酸序列或基因座相对其处于其中的哺乳动物不是内源的，或者已通过取代或除去内源序列修改的内源基因座。本发明上下文中“只有重链的基因座”涉及编码VH结构域的基因座，其包含一个或多个V基因区段、一个或多个D基因区段和一个或多个J基因区段，任选与一个或多个重链效应子区(每个都缺少CHl结构域功能性)连接。可通过增加存在于基因座中的V基因区段数目，或通过用各包含不同V基因区段的不同基因座，来增加V基因区段复杂性。优选只有重链的基因座包含源自任何脊椎动物物种的5-20个不同的V基因区段。优选V基因区段为人来源，任选针对改进的溶解性选择或工程改造。优选只有重链的基因座包含2-4(K2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30 或 40)或更多个D基因区段。D基因区段可源自任何脊椎动物物种，但最优选D基因区段为人 D基因区段(正常25个功能性D基因区段)。优选只有重链的基因座包含2-2(^2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20)或更多个J基因区段。J基因区段可源自任何脊椎动物物种，但最优选J基因区段为人J基因区段(通常6个J基因区段)。优选只有重链的基因座包含2个以上的V基因区段、25个功能性人D基因区段和 6个人J基因区段。术语‘V基因区段’涵盖天然存在的V基因区段，其源自脊椎动物，包括骆驼科和人，并任选针对改进特性例如溶解性经选择、突变或工程改造。亦在其它脊椎动物物种例如鲨鱼中发现V基因区段(参见Kokubu等(1988) EMBO J.，7，3413-3422)，或V基因区段例如在抗体轻链VL库或T细胞受体VH库的进化过程中业已进化产生例示性结合蛋白的多样化 VH-样家族。当核酸表达时，V基因区段必须能够与本发明D基因区段、J基因区段和重链恒定 (效应子)区(其可包含若干外显子但不包含CHl外显子)重组，产生只有重链的抗体。本发明的V基因区段在其范围内亦包含编码同源物、衍生物或蛋白片段的任何基因序列，所述V基因区段能够与本发明D基因区段、J基因区段和重链恒定效应子区(包含一个或多个外显子但不包含功能CHl外显子)重组，产生如本文所定义的只有重链的抗体。 重链恒定效应子区可在以下情况下包含CHl结构域其中免疫球蛋白重链基因座在缺少免疫球蛋白轻链基因表达的宿主动物背景中表达。因而，VH编码序列可源自天然存在的来源，或可用本领域技术人员熟悉的方法工程改造或合成它们。本发明上下文中的“可溶的VH结构域”指V基因区段当与上文定义的D基因区段和J基因区段重组时的表达产物。在天然选择和亲和力成熟母体HCAb后，本文所用的可溶的VH结构域在表达和分离后在不存在聚集的情况下仍留在溶液中，在生理介质中不需任何其它维持溶解性的因子即具有活性。亦可单独用多种不同的蛋白质结构域对可溶的VH 结构域进行工程改造，以产生用于靶向治疗及诊断目的的融合蛋白，例如可用毒素、酶和显像剂或者用血液蛋白例如白蛋白，以便体内操纵可溶的VH结构域药代动力学及组织分布 (参见 US5, 843，440 和 Smith 等 Q001) Bioconjugate Chem.，12，750-756)。在本发明上下文中，术语‘D基因区段’和‘J基因区段’包含天然存在的D和J基因区段序列。优选D和J基因区段源自与V基因区段所源自的相同脊椎动物。例如，若V 基因区段源自人，那么可溶的或工程改造的D和J基因区段优选亦源自人。备选地，V基因区段可源自例如大鼠或小鼠，而D和J基因区段源自骆驼(camel)或人。
术语D基因区段和J基因区段在其范围内亦包含其衍生物、同源物及片段，只要所得到的区段可与本文所述的重链抗体基因座的其余组分重组产生本文所述的只有重链的抗体即可。D和J基因区段可源自天然存在的来源，或它们可用本领域技术人员所熟悉和本文所述的方法来合成。为了增加CDR3多样性，D和J基因区段可掺入确定的另外的氨基酸残基或确定的氨基酸取代或缺失。V、D和J基因区段能够重组并优选经历体细胞突变。V、D和J基因区段优选源自单个脊椎动物物种。其可为任何脊椎动物物种，但优选为人。特征序列为存在于骆驼科VHH结构域但不存在于可溶的VH结构域中的四个充分明确的种系编码的氨基酸序列取代(VHH四联体)。它们全部存在于第二框架区中，并起降低以前轻链界面的疏水性的作用。发现Glu-44和Arg-45取代存在于VH结构域中的亲水性较差的Gly-44和Leu-45，同时通过用较小的残基取代Trp提高47位的亲水性。第四个变化需要用Phe或Tyr取代Val_37。重链恒定区在操作上，在B细胞中通过能够与V基因区段、D基因区段和J基因区段重组的天然存在的或工程改造的基因区段编码重链恒定区。优选重链恒定区源自抗体基因座。每个重链恒定区基本上包含至少一个重链恒定区基因，其在没有功能CHl结构域的情况下表达，从而可产生只有重链的抗体。在内源免疫球蛋白轻链时基因表达不存在时， 那么重链恒定区可包含在重链基因表达期间以低频率自发缺失的CHl功能性。每个重链恒定区亦可包含一个或多个另外的重链恒定区外显子，所述外显子选自CS、C γ 1_4、Cμ ,C ε 和Ca 1-2。视所需的优选抗体类别或抗体类别混合物来选择重链恒定区基因区段。任选异源重链基因座缺失Cy和C δ。例如，缺少CHl的所有或部分异源重链Cy基因座的表达，将产生任选某些或全部 IgG同工型，其视异源IgG基因座中存在的IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同工型而定。备选地，可获得所选择的抗体混合物。例如，当重链恒定区包含Ca和Cy基因时可获得IgA和IgM。存在于转基因基因座中的重链恒定区可为人来源，但可与宿主哺乳动物的重链恒定区相同或紧密相关，以体内最大化抗原应答。因而，对于用于人治疗应用的只有重链的抗体或可溶的VH结构域的来源而言，存在于基因座中的VDJ基因将源自任选经修饰的人种系序列，如果宿主动物为啮齿动物例如小鼠，那么恒定区可为啮齿动物来源。然后可克隆所选择的包含可溶的人VH结合结构域和啮齿动物恒定效应子区的只有重链的抗体，啮齿动物效应子区可用以下取代所选择的人恒定效应子区或用于获得备选VH融合蛋白、VH结构域抗体复合体等的可溶的VH结构域。如果将只有重链的抗体用于兽医或备选目的时，那么V、D和J基因区段优选源自最符合预期目的的脊椎动物或哺乳动物。例如，V基因区段及D和J基因区段可源自其它哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猪、母牛、山羊、绵羊、骆驼等)，其视预期用途而定，所述计划用途例如兽医应用、工业应用、农业应用、诊断应用或试剂应用。本文所定义的‘重链恒定区外显子’ (‘CH外显子’)包含天然存在的脊椎动物(但尤其包含哺乳动物)CH外显子的序列。其以经典的特定方式变化。例如，IgG和IgA为天然缺失CH4结构域。术语‘CH外显子’在其范围内亦包含其衍生物、同源物和片段，只要当其为重链恒定区组分时，CH外显子能够形成本文所定义的功能的只有重链的抗体。哺乳动物本发明方法中使用的转基因哺乳动物不是人。转基因哺乳动物优选为啮齿动物， 例如兔、豚鼠、大鼠或小鼠。特别优选小鼠和大鼠。亦可采用备选哺乳动物，例如山羊、猪、 牛、绵羊、猫、狗或其它动物。优选用以下技术产生包含整合到种系中的异源的只有重链的抗体基因座的转基因动物已建立的卵母细胞注射技术、在已建立时用ES细胞技术、iPS细胞技术或核转移 (克隆)技术。备选地，可将基因座引入到以上细胞中，或用以下技术直接引入到受精卵中 锌指核酸酶(Remy等(2009) Transgenic Res. , 2009年9月沈日.[印刷前的电子版]， Kandavelou 等(2009) Biochem. Biophys. Res. Commun.，；388，(1)，56-61)或重组酶技术(例如Sakurai等(2010)Nucleic Acids Res.，1月13日[印刷前的电子版]及其中参考文献)例如ere等。亦可使用ES细胞中的标准同源重组，以从内源重链基因消除CHl功能性，并取代内源V基因区段或D和J基因区段内的元件或序列，导致从内源重链基因座产生只有重链的抗体。有利地，当对于哺乳动物而言为内源的抗体重链基因座被缺失或沉默或降低产生内源抗体的能力时，增强异源的只有重链的基因座转基因表达。当内源宿主重链基因座被工程改造以消除CHl功能性，且VDJ和任选恒定效应子区被来自其它物种(优选人)的序列取代时，那么不必加入另外的转基因重链基因座。如上所述产生只有重链的抗体和可溶的VH结构域的这种方法，可特别用于产生用于人治疗用途的无聚集的可溶的抗体和抗体复合体。因此，在另一方面，本发明提供响应抗原攻击而表达本发明异源重链基因座的转基因哺乳动物。产抗体细胞可源自本发明转基因动物，并用于例如优选的实施方案以重新获得记忆细胞或长寿命的浆细胞，但亦用于从杂交瘤或通过本文所定义的排列方法产生只有重链的抗体。另外或备选地，可用本领域技术人员熟悉的重组DNA技术，在抗原攻击后从本发明转基因哺乳动物的B细胞(尤其记忆细胞或长寿命的浆细胞)分离编码只有重链的抗体和 /或可溶的VH结构域的核酸序列，并将其用于产生可溶的VH结构域、只有重链的抗体、可溶的双特异性/双功能的VH结构域复合体或可溶的VH结构域多蛋白(参见WO 99/23221)。备选地或另外，可通过使本发明转基因动物免疫来产生多克隆抗原特异性的只有重链的抗体。因而，在另一方面，本发明提供用于通过用抗原免疫本发明转基因哺乳动物来产生高亲和力的只有重链的抗体的方法。在本发明该方面的优选实施方案中，哺乳动物为啮齿动物，优选小鼠或大鼠。R有重链的抗体禾Π可溶的VH结构域融合g白的泡丨备用于只有重链的抗体和可溶的VH结构域融合蛋白的制备系统包括适合大量饲育技术的哺乳动物细胞培养物(例如CHO细胞)、植物(例如玉米)、转基因山羊、兔、牛、绵羊、鸡和昆虫幼虫。包括病毒感染(例如昆虫幼虫和细胞系中的杆状病毒)在内的其它制备系统为细胞培养和种系方法的备选。其它制备方法亦应为本领域技术人员所熟悉。当需要装配只有重链的IgA或IgM时，共表达“J链”可是有益的。用于制备只有重链的抗体或单独的可溶的VH结合结构域或VH结合结构域复合体的合适方法为本领域已知。例如，已在细菌系统中产生VH结合结构域和VH结合结构域复合体，且已在杂交瘤和转染的哺乳动物细胞中产生只有重链的同源二聚体(参见Reichmann和Muyldermans，(1999) J. Immunol. Methods,231,25-38)。用于表达用噬菌体展示技术获得的工程改造的人VH结合结构域的方法亦是非常确定的(Tanha 等(2001) J. Biol. Chem.，276，M774-M789 及其中的参考文献)。本发明亦提供由异源重链基因座组成的多核苷酸序列、分离的编码本发明只有重链的抗体的多核苷酸，和包含异源重链基因座或其片段或分离的编码本发明的只有重链的抗体的多核苷酸的载体。本发明亦提供编码可溶的VH结构域和VH结构域融合蛋白的多核苷酸序列和包含所述序列的载体。本发明亦提供一种宿主细胞，其用本发明的异源的只有重链的基因座或其片段， 或分离的编码只有重链的抗体、可溶的VH结构域或VH结构域融合蛋白的多核苷酸转化。摘_偏本、VH辦編口 VH紐始船口絲_ 用涂本发明的可溶的高亲和力的只有重链的抗体、VH结构域融合蛋白、VH结构域多肽复合体和可溶的VH结构域尤其适合用作胃肠外和非胃肠外药物。在本发明上下文中，优选这些全部为人来源，但任选却不太优选地，可包含来自其它物种的V、D或J基因区段。除治疗之外，本发明提高溶解性的包含可溶的VH结构域的只有重链的抗体、分离的可溶的VH结构域和可溶的VH结构域结合复合体和多蛋白还尤其适合用作试剂和诊断。全部都适合用于人的药物用途，因此本发明提供一种药物组合物，其包含含可溶的VH结构域的只有重链的抗体、分离的可溶的VH结构域、可溶的VH结构域结合复合体或可溶的VH结构域多蛋白。本发明亦提供本发明包含可溶的VH结构域的只有重链的抗体、 分离的可溶的VH结构域、可溶的VH结构域结合复合体或可溶的VH结构域多蛋白在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。药物组合物和药物通常在给予患者之前配制。例如，包含可溶的VH结构域的只有重链的抗体、分离的可溶的VH结构域、可溶的 VH结构域结合复合体或可溶的VH结构域多蛋白可与稳定剂混合，尤其是如果要将其冻干。 加入糖(例如甘露醇、蔗糖或海藻糖)通常提供冻干期间的稳定性，优选的稳定剂为甘露醇。人血清白蛋白(优选重组的)亦可作为稳定剂加入。亦可使用糖混合物，例如蔗糖和甘露醇、海藻糖和甘露醇等。可将缓冲液加入到组合物中，例如Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或优选磷酸盐缓冲液(例如含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)。优选加入缓冲液获得7. 2和7. 8 之间的ΡΗ，特别是约7.5的ρΗ。为了在冻干后复溶，可使用注射用无菌水。亦可用包含人血清白蛋白(优选重组的)的水性组合物复溶冻干饼。通常，包含可溶的VH结构域的只有重链的抗体、分离的可溶的VH结构域、可溶的 VH结构域结合复合体或可溶的VH结构域多蛋白以纯化形式与药理学上合适的载体一起使用。
因而，本发明提供用于治疗患者的方法，所述方法包括将本发明药物组合物给予患者。患者优选为人，可为小孩(例如幼儿或婴儿)、青少年或成年人，但通常为成年人。本发明亦提供用作药物的本发明包含可溶的VH结构域的只有重链的抗体、分离的可溶的VH结构域、可溶的VH结构域结合复合体和可溶的VH结构域多蛋白。本发明亦提供本发明的包含可溶的VH结构域的只有重链的抗体、分离的可溶的 VH结构域、可溶的VH结构域结合复合体和可溶的VH结构域多蛋白在制备用于治疗患者的药物中的用途。 这些用途、方法和药物优选用于治疗包括但不限于以下疾病或病症及用于免疫治疗伤口愈合；细胞增殖病，包括瘤、黑色素瘤、肺瘤、结直肠瘤、骨肉瘤、直肠瘤、卵巢瘤、肉瘤、子宫颈瘤、食管瘤、乳腺瘤、胰腺瘤、膀胱瘤、头颈瘤和其它实体瘤；骨髓增殖病，例如白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、白细胞减少症、血小板减少症、血管发生疾病、卡波西肉瘤；自身免疫性/炎性疾病，包含变态反应、炎性肠病、关节炎、牛皮癣和呼吸道炎症、哮喘、免疫病和器官移植排斥；心血管病和血管病，包括高血压、水肿、咽峡炎、动脉粥样硬化、血栓症、脓毒、休克、再灌注损伤和缺血；神经学疾病，包括中枢神经系统病、阿尔茨海默病、脑损伤、肌萎缩性侧索硬化和疼痛；发育病；代谢病，包括糖尿病、骨质疏松症和肥胖、AIDS和肾病；感染，包括病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染、与胎盘有关的病理学病症和其它病理学病症。在再一方面，本发明提供本发明包含可溶的VH结构域的只有重链的抗体、分离的可溶的VH结构域、可溶的VH结构域结合复合体或可溶的VH结构域多蛋白单独或与合适效应子剂联合作为诊断、预后或治疗显像剂的用途。本发明提供本文所述的包含可溶的VH结构域的只有重链的抗体、分离的可溶的 VH结构域、可溶的VH结构域结合复合体或可溶的VH结构域多蛋白作为细胞内结合试剂或抗体酶的用途。优选抗原特异性的可溶的VH结合结构域、可溶的VH结构域结合复合体和可溶的VH结构域多蛋白。本发明亦提供本发明抗原特异性的只有重链的抗体或可溶的VH结合结构域作为酶抑制剂或受体阻断剂的用途。优选的只有重链的抗体片段为抗原特异性的可溶的VH结合结构域。本发明亦提供与效应子分子融合的一个或多个可溶的VH结构域用作治疗、成像齐IJ、诊断、抗体酶或试剂的用途。现在在参考以下附图的以下详述中仅举例阐述本发明。MM

图1.两个人只有重链的免疫球蛋白基因座，一个携带4个VH基因区段，另一个携带18个VH基因区段。包含18个VH基因区段的基因座包含小鼠恒定效应子区(-CH1)，覆盖正常人四价抗体中使用的多于90%的VH基因区段。图2.通过噬菌体展示的人VH结构域或通过标准杂交瘤技术的人只有重链的抗体的免疫和分离方案。图3. Luk-sPV免疫的血清(V4相比wt正常小鼠)的Elisa(顶部)和蛋白质印迹 (底部)，以及使用Luk-sPV蛋白凝胶电泳、点印迹并用来自噬菌体展示筛选的不同阳性克隆检测单独分离的VH结构域的蛋白质印迹。
图4.用Luks-PV免疫后的两个VH结构域序列实例，其显示产生IgG2和IgG3 二者(类转换)和同样的VDJ重排导致不同突变。图5.在用人CRl免疫后用V3-23基因区段获得的VH结构域序列，其显示产生IgG2 和IgG3 二者(类转换)，和当与顶部所示的V3-23区段的种系序列比较时，同样的VDJ重排导致不同突变。经由杂交瘤获得部分的序列，其余经由展示文库获得。图6.在用人CRl免疫后用V3-11基因区段获得的VH结构域序列，其显示产生IgG2 和IgG3 二者(类转换)，和当与顶部所示的V3-11区段的种系序列比较时，同样的VDJ重排导致不同突变。经由杂交瘤(箭头)获得部分的序列，其余经由展示文库获得。图7.在SUMO杂合蛋白系统(InVitrogen)中纯化和表达后的VH结构域(α CRl) 的凝胶电泳(左)实例。该实例显示三个不同长度的正确分子量的VH结构域。标记泳道在左边。中间图显示在kphadex 75Smart系统上VH结构域的洗脱曲线。右图为同样的曲线，但为完整的只有重链的化6在kphadex 200上的曲线。下图显示浓缩至> %ig/ml的两个其它VH结构域的洗脱曲线。图8. L光散射图和B. VH结构域的热稳定性。图9. 一些α CRl只有重链的抗体(左)的亲和力测量，以及抗体之一在Octet系统上用以获得结合亲和力的结合和解离曲线。图10. —些抗CRlVH结构域的溶解性。图11.大量平行测序以确定优选突变。图12.与来自骆驼、大羊驼和来自正常四聚体重链/轻链抗体的人重链的相同区比较的人只有重链的抗体(HCAb)的框架I(FRl)和⑶Rl区的盒图分析。通过 Henderson-Hasselbach 方程在 pH = 7. 4 时测定净电荷；通过 Cowan-Whittaker 指数在 pH =7. 5时测定净疏水性。不同抗体下方的数字是唯一的输入序列序号。图13.与来自骆驼、大羊驼和来自正常四聚体重链/轻链抗体的人重链的相同区比较的人只有重链的抗体(HCAb)的框架2(FR2)和⑶R2区的盒图分析。通过 Henderson-Hasselbach 方程在 pH = 7. 4 时测定净电荷；通过 Cowan-Whittaker 指数在 pH =7. 5时测定净疏水性。不同抗体下方的数字是唯一的输入序列序号。图14.与来自骆驼、大羊驼和来自正常四聚体重链/轻链抗体的人重链的相同区比较的人只有重链的抗体(HCAb)的框架3(FR3)和⑶R3区的盒图分析。通过 Henderson-Hasselbach 方程在 pH = 7. 4 时测定净电荷；通过 Cowan-Whittaker 指数在 pH =7. 5时测定净疏水性。不同抗体下方的数字是唯一的输入序列序号。图15.与人CRl或金黄色葡萄球菌(staph A) Luk-sPV结合的VH结构域的3D结构。抗原结合位点在顶部右边位置，以前的VL相互作用结构域面对读者。在3D结构中由颜色标出氨基酸变化。图16. VH结构域(除⑶R3外)各位置处的平均疏水性差异，表明在只有重链的抗体中，尤其是在VH结构域的N末端，变化趋向更疏水。与平均人四聚体VH比较，就疏水性差异而言的一些热点显然在49、62和72位。图17.通过分选⑶138阳性细胞并直接表达克隆到HEK细胞中的人HCAb的免疫和分离方案。图18.用于哺乳动物细胞表达HCAb的载体。载体具有标准pUC主链(未显示)，与氨苄青霉素抗性基因和哺乳动物抗性基因(潮霉素)。相关部分含有标准CMV增强子和鸡β -肌动蛋白启动子anVitrogen)，接着是Kozak核糖体结合位点，接着是VH3-23的信号序列。由IgG2或IgG3恒定区组成的盒的后端以铰链结构域和CH2结构域开始。用箭头所指的引物扩增后在这两个区之间克隆VH cDNA。图19.将HCAb直接表达克隆到HEK细胞中的实例及概述。左边上图显示测定阳性地响应HA抗原免疫的免疫小鼠的标准ELISA (红色小鼠用于HEK细胞表达克隆)。右边上图显示在96孔格式板中对转染的HEK细胞进行的ELISA的两个实例。图20.源自3-1IVH种系序列的ELISA-阳性HCAb的序列分析。图21.源自3-23VH种系序列的ELISA-阳性HCAb的序列分析。图22.完整的只有重链的IgG在kphadex 200Smart柱上的洗脱曲线。图23.在Octet上的两个抗HA HCAb的亲和力测量。图24.与在人抗CRlHCAb (参见以上)、人四聚体HCAb和大羊驼HCAb中观察到的相比的跨越抗HA HCAb的VH区的氨基酸。图25.在单细胞分选并直接表达克隆到HEK细胞中后人HCAb的免疫和分离方案。图26.在单细胞分选并直接表达克隆到HEK细胞中后正常四聚体人重链和轻链抗体的免疫和分离方案。实施例1抗Luk-sFV抗体的产牛用来自金黄色葡萄球菌的Luks-PV蛋白在含有完整人重链抗体基因座的转基因小鼠中进行免疫，其如W02006/008548中所述。这些小鼠携带4个人VH区段、全部人重链 D区、全部人JH区和人Cy2禾口 CY3区(图1)。业已从人C γ恒定区缺失CHl结构域，使得能够如所述制备人只有重链的抗体 (Janssens等(2006) PNAS，103，15130-15135)。用标准方案免疫小鼠，并如图2概略所示地分离抗体。通过标准方案免疫小鼠4次，并通过标准ELISA检验血清的阳性反应(图3)。免疫后，收集脾细胞，并用VH结构域特异性引物通过标准方法将mRNA逆转录并扩增为cDNA(参见例如Janssens等(2006)PNAS, 103，15130-15135)。将得到的VH片段克隆到噬菌体展示载体中。通过标准展示方案筛选并淘选3轮后，将VH结构域(VH-D-J)克隆到细菌表达载体中。通过蛋白质印迹证实阳性克隆，随后通过标准方法对克隆的DNA测序， 得到示于图4的VH结构域区的氨基酸序列定义。备选地，可通过标准杂交瘤技术获得抗体。可通过标准克隆方法将由噬菌体展示技术获得的VH结构域工程改造回到所选择的重链恒定效应子区(缺少CHl功能性)上，以产生所选择的就恒定区而言完整的只有重链的抗体(例如为C α而不是CY)。同样地，可通过标准cDNA和PCR技术克隆由杂交瘤技术获得的只有重链的抗体。这使得能够分离单独的VH结构域。因而，两种方法均可用来获得抗原特异性的VH结构域或抗原特异性的只有重链的抗体。实施例2抗人CRl抗体的制备实施例2与实施例1极为相似，除了用CRl作为抗原免疫外，CRl为通常在人红细胞表面表达的蛋白。亦通过注射在其细胞表面表达人CRl的鼠红细胞来免疫。不同免疫的结果非常相似。在含有完整人重链抗体基因座的转基因小鼠中进行免疫，其如WO 2006/008548中所述。这些小鼠携带4个人VH区段、全部人重链D区、全部JH区和人C γ 2 禾口 C γ 3区(图1)。业已从人CY恒定区缺失CHl区，以使得能够如所述制备人只有重链的抗体 (Janssens等(2006) PNAS，103，15130-15135)。用标准方案免疫小鼠，并如图2概略所示地分离抗体。免疫后，收集脾细胞，并用VH结构域特异性引物通过标准方法将mRNA逆转录并扩增为cDNA(例如Janssens等(2006)PNAS, 103，15130-15135)。将得到的VH片段克隆到噬菌体展示载体中。通过标准展示方案筛选并淘选3轮后，将VH结构域(VH-D-J)克隆到细菌表达载体中。随后通过标准方法对克隆的序列测序，得到示于图5和6中的VH结构域区。 备选地，可通过标准杂交瘤技术获得抗体(图5和6)。可通过标准克隆方法将由噬菌体展示技术获得的VH结构域工程改造回到所选择的恒定效应子区(缺少CHl功能性)上，以产生完整的只有重链的抗体(例如为C α而不是Cy)。同样地，可通过标准cDNA和PCR技术克隆由杂交瘤技术获得的只有重链的抗体，这使得能够分离其单独的VH结构域。因而，两种方法均可用来获得抗原特异性的VH结构域或抗原特异性的只有重链的抗体。_仿丨丨3VH辦編口 R摘本白腫汰、十牛可在细菌表达系统中表达实施例1和2的VH结构域，以获得大量纯化的VH结构域。例如，可在细菌中用SUMO杂合表达系统(InVitrogen)将VH结构域作为杂合蛋白表达。 当纯化时，将这些作为单一片段在变性凝胶电泳凝胶上泳动(图7)。当在非变性条件下在 Smart kphadex色谱系统中流动时，这些VH结构域主要作为正确分子量的单主峰流动(图 7)，且几乎没有可溶的聚集体的迹象。源自杂交瘤上清液的只有重链的抗体亦主要作为单主峰流动，且在该峰的前缘有小百分比的抗体二聚体的迹象。VH结构域的单峰表明它们为可溶单体，这通过运行散点图证实(图8A)，因为光散射峰与蛋白吸收峰在运行期间一致。最后，当加热时，VH结构域在至高55°C时稳定，其如标准圆二色性分析所测量(图8B)。最后，用BiaCore和Octet系统测试可溶的VH结构域和HCAb的结合亲和力。获得的亲和力在低纳摩尔范围或更好(图9)。还通过真空离心浓缩源自HCAb的一些VH结构域，并通过高速离心除掉胶体物质。 这获得为最小估计值的溶解性数字，因为少量样本阻碍了进一步浓缩。测试的所有VH结构域显示溶解性超过細g/ml (图10)。实施例4.大量测序以确定突变图式从收集自抗体结合Luk-sPV、CRl和其它抗原的所有序列的检查来看，显然源自在鼠B细胞中表达的HCAb转基因的可溶的人VH结构域的VDJ重组和成熟(高变)，与在骆驼和大羊驼VHH结构域或源自正常四聚体重链和轻链抗体的人VH结构域中观察到的极为不同。因此进行大量平行测序(Roche 4 测序)来跟踪从重组到高变的过程。使用该测序来验证过程确实不同，并理解在最初选择特定VDJ重组后抗体的哪些参数及部分对于产生高亲和力的可溶的人只有重链的抗体是重要的。结果提供了该过程如何发生的概观(图 11)。
该分析显示，小鼠能够引入大量氨基酸取代跨越表达的转基因的VH结构域。大部分在⑶Rl和⑶R2的位置。然而，取代亦在FRl和FR2内显然，并分布跨越FR3。⑶R/FR相互作用区似乎为取代的热点。从该分析看，就位置及氨基酸取代而言，明显的是突变过程与在骆驼科VHH结构域和存在于正常四聚体人抗体中的VH结构域中所观察到的极为不同。t施例5.存在干可溶的VH结构域、VHH结构域和源自四聚体杭体的VH结构域中的单独框架区和CDR区的比较分析将可溶的人抗原结合VH结构域的所有突变列表，并与来自骆驼科只有重链的抗体、大羊驼只有重链的抗体的VHH结构域和从正常四聚体人抗体获得的人VH结构域进行比较，分析不同区(FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3)。该比较包含10个已知的骆驼VHH结构域序列、58个已知的大羊驼VHH结构域序列和超过4000个源自正常四聚体抗体的已知的人VH结构域序列，所有的都从文献及公共抗
体数据库获得。可溶的人VH结构域的FRl区(图12)显示，当与骆驼和大羊驼比较时净电荷增加， 当与骆驼、大羊驼和源自正常人四聚体抗体的VH结构域比较时疏水性提高，同时荷电氨基酸数目增加。CDRl区(图12)在净电荷方面具有极小的变化(与大羊驼比较少许减少)，相对于等价的来自人四聚体抗体的VH结构域，大羊驼和骆驼VHH结构域疏水性提高。荷电氨基酸数显示几乎无显著差异。可溶的人VH结构域的FR2区(图13)显示，与骆驼和大羊驼VHH结构域比较净电荷没有差异，与骆驼和大羊驼VHH结构域比较疏水性显著提高，同时与骆驼和大羊驼VHH 结构域比较荷电氨基酸数目减少。其在两个方面都与源自四聚体抗体的人VH结构域相似。 CDR2区(图1 具有与大羊驼相似的净电荷，该净电荷比骆驼和人四聚体抗体高，并具有与其它的极为相似的疏水性，同时荷电氨基酸数目与源自四聚体抗体的人VH结构域相似，但比其它的稍低。可溶的人VH结构域的FR3区(图14)显示，当与源自四聚体抗体的人VH结构域比较时净电荷增加，当与源自四聚体抗体的人VH结构域比较时疏水性降低，同时与源自四聚体抗体的人VH结构域比较荷电氨基酸数目增加。在所有方面，其都与骆驼和大羊驼VHH 结构域相似。可溶的人VH结构域的CDR3区(图14)相对于大羊驼和骆驼科VHH结构域和源自四聚体抗体的人VH结构域具有减少的净电荷，同时与所有其它的比较荷电氨基酸数目增加。可溶的人VH结构域的CDR3区具有与大羊驼VHH极为相似的疏水性，但比在存在于正常人四聚体抗体和正常骆驼四价抗体中的VH结构域中所观察到的低。结果显示，在初始VDJ重组中，当与人四聚体(⑶R3)抗体比较时，选择有较高荷电氨基酸数目的重组事件。接着在⑶Rl和⑶R2区和在所有三个框架区(FRl、FR2、FR3)中亲和力成熟。这产生具有可溶的VH结构域的人只有重链的抗体，其与源自人四聚体抗体的 VH结构域比较，疏水性在FRl中提高但在FR3中降低。在FR2或CDRl和CDR2区中存在极小的差异。因此，总体图式显示，相对于可溶性较差且具有聚集倾向的源自四聚体抗体的VH 结构域，疏水性跨越可溶的VH结构域不同分布(移向FRl并离开FR3和CDR3)。该分析未显示是否在VH结构域的特定位置或区中进行特定突变(参见实施例6)，但存在与跨越可溶的人VH结构域的电荷分布和疏水性有关的特征，电荷分布和疏水性将它们与大羊驼和骆驼科VHH结构域和源自四聚体抗体的人VH结构域区分开。实施例6. 3D结构实施例4的分析表明，当放置在源自四聚体抗体的人VH结构域的三维结构上时， 初始VDJ重排后可溶的人VH结构域的框架区(FR1、FR2、FR3)中的变化主要集中于特定位置(图15)。在可溶的人VH结构域中，从13-18位氨基酸观察到FRl突变，其中普遍的变化在 13位，这导致提高疏水性，即使荷电氨基酸数目增加，但净电荷未增加。重要的是，13位周围的变化位于提高亲水性(推测增加溶解性)的小环中。在可溶的人VH结构域的FR2中，在35位周围存在明确中心，且一个在50位周围， 当与源自人四聚体抗体的VH结构域比较时，总体疏水性没有变化。相对于源自人四聚体抗体的VH结构域，可溶的VH结构域中FR3的变化与CDR2区末端和FR3的极末端(紧邻CDR!3)周围的区域一致。当将在源自HCAb的可溶的人VH结构域中观察的这些变化叠加在VH结构域的3D 结构上时，立即明显的是FR2突变发生在β折叠中，β折叠通常在四聚体抗体中构成VH与 VL结构域的相互作用表面。在FRl中，变化亦产生更疏水的结构域。结果表明，VH结构域的N-末端半部分具有提高的疏水性，以提高VH结构域的稳定性/溶解性，并补偿轻链的不存在。相比之下，C末端半部分疏水性较弱。最重要的变化是疏水性图式的“重新分布”(N 末端更疏水，C末端疏水性较弱，图16)和影响以前轻链界面的框架突变。通过小鼠免疫系统进行的疏水性的总体移动和特定模体的变化使得能够产生高亲和力的可溶的只有重链的抗体和可溶的VH结构域，可溶的VH结构域具有将其与源自人四聚体抗体的倾向于聚集的VH结构域区分开的特征。实施例7.人抗HA抗体的产生和表达克隆实施例7所用的免疫步骤如在实施例1和2中所述，除了用流感HA (Η3Ν2)作为抗原来进行免疫之外。通过将蛋白注射到包含完整人重链抗体基因座的转基因小鼠中来进行免疫，其如在Janssens等(2006) PNAS，103，15130-15135中所述。这些小鼠携带4个人VH 区段、全部人重链D区、全部JH区和人C γ 2和C γ 3区(图1)。业已从人Cy恒定区缺失CHl区，使得能够如所述制备人只有重链的抗体 (Janssens等(2006)PNAS，103，15130-15135)。用标准方案免疫小鼠，并如图17概略所示地分离抗体。免疫后，收集浆细胞，并通过标准方法针对存在CD138抗原和不存在谱系标记分选(FACS)(参见 Sanderson 等(1989) Cell Regulation 1，27-35 ；Kim 等(1994)Mol. Biol. Cell，5，797-805和参见Miltenyi Biotec用于小鼠CD138+浆细胞分离的磁分选试剂盒 (magnetic sorting Kit))。收集细胞，并用VH结构域特异性引物通过标准方法将mRNA逆转录并扩增为cDNA(例如Janssens等(2006)PNAS, 103，15130-15135)。所用引物在5，端， 且被设计为引入PvuII位点用于克隆目的(图18)。3’端引物来自IgG2或IgG3CH2铰链区，且被设计为具有BstEII位点。当这不可能时，用于IgG3的引物含有McI位点用于克隆目的(图18)。将所得到的VH片段克隆到两个哺乳动物表达载体中，载体含有CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子，接着是Kozak和在VH区段本身(proper)的PvuII位点结束的VH3-23的信号序列。在第一载体(图18)中，这接着是在CH2的铰链区(从BstEII位点)开始的人IgG2，与CH2、CH3、终止密码子和聚腺苷酸序列。在第二载体中，所有IgG2序列被等价的人IgG3序列取代。后者使得能够用作为备选的Mel位点克隆不含有BstEII位点的HCAb。质粒的其余部分具有标准哺乳动物细胞选择标记，例如基于pUC的质粒中的潮霉素抗性盒。显然，人IgG2或3可被来自人或任何其它物种的任何其它缺少CHl的恒定区取代。同样很显然，对于载体的VH部分一样也是这样。然后在PvuII和BstEII (或PvuII 和McI)位点之间克隆cDNA，并通过标准技术将载体转染到大肠杆菌(E.coli)中。将菌落挑到含有细菌生长培养基的96 (或384)孔微量滴定板中。孵育板(通常> 10个)以使细菌生长和在各孔中制备DNA。随后将来自各孔(即各完整板)的DNA加到含有哺乳动物 HEK细胞(或用于表达目的的其它细胞)的新的96孔板中，用于通过标准转染试剂和方法转化。转化的细胞在基于表达质粒上存在的选择标记(例如潮霉素)的选择下生长。随后通过标准ELISA测定对含有表达的抗体的培养基分析抗原特异性HCAb的存在情况。这可在相同96孔格式板中进行，但亦可在其它格式板例如通过微阵列进行，以节省待使用抗原的量。阳性孔立即鉴定含有编码抗原特异性HCAb的人HCAb的质粒。图19显示来自免疫的小鼠血清的ELISA及96孔格式板中转染的HEK细胞的ELISA实例。还总结HA克隆实验， 在总计用960孔的实验中，使用的cDNA不到一百万。通过序列分析，这产生28种不同的抗原特异性抗体，落入13个组，源自VH区VH3-11(图21)和VH3-23 (图22)中的两个。使用 IgG2(SSERKCCVE)和IgG3 (SSELKTPLG) 二者，VH区经历高变，且与人相似，J4区使用频率最高，但亦使用其它区。分泌的HCAb为可溶的且为单体，如通过它们在标准SMART柱上的洗脱曲线(图23)所测定。抗体的亲和力介于纳摩尔到亚纳摩尔亲和力范围，如通过Octet (图 24)或BiaCore分析的标准结合和解离曲线所测定。突变和与其它免疫球蛋白序列比较的分析(图25)产生如图11-13所示的不同区的相同特性。如上所述，可将源自浆细胞的可溶的HCAb与可溶的VH结构域分离。实施例8来自单细胞的人HCAb的产生和表达克隆通过直接克隆到HEK细胞的以上所述方案的变体，将用于分选⑶138+谱系阴性细胞和获得能直接克隆到HEK或其它哺乳动物细胞中的来自单细胞的cDNA(图26)。这些将通过与上述极为相似的方法分析。实施例9来自单细胞的正常人重链和轻链(四聚体)抗体的产生和表达克隆通过表达克隆到HEK或其它哺乳动物细胞中，亦可将实施例8所示的方法变体用于直接克隆转基因表达的正常四聚体抗体。在变体中，通过分选再次分离单细胞。RNA分离自单细胞，VH和VL结构域二者都经由PCR扩增克隆到与上述类似的重链和轻链表达载体中。将克隆的重链和轻链表达质粒的单独组合一起转染到HEK或其它哺乳动物细胞中。格式板、筛选和分析与上文对于HCAb 96孔格式板(实施例8和9)所述的完全类似。
权利要求
1.一种高亲和力的抗原特异性的可溶的只有重链的抗体，其缺少特征骆驼科相关氨基酸取代和具有未在包含重链和轻链的抗体中发现的FR2取代；显示CDRl内的净疏水性提高和CDR3中存在的荷电氨基酸数目增加；和包含导致FRl内的净疏水性提高和FR3中存在的荷电氨基酸数目增加的框架β折叠内的一个或多个氨基酸取代。
2.权利要求1的只有重链的抗体，其为人抗体。
3.权利要求2的只有重链的抗体，其缺少特征骆驼科相关氨基酸取代和具有未在包含重链和轻链的人抗体中发现的FR2取代。
4.权利要求1-3中任一项的只有重链的抗体，其具有IOnM或更好的结合亲和力。
5.一种高亲和力的抗原特异性的可溶的VH结构域，其缺少特征骆驼科相关氨基酸取代和具有未在包含重链和轻链的抗体中发现的FR2取代；显示CDRl内的净疏水性提高和CDR3中存在的荷电氨基酸数目增加；和包含导致FRl内的疏水性提高和FR3中存在的荷电氨基酸数目增加的框架β折叠内的一个或多个氨基酸取代。
6.权利要求5的VH结构域，其为可溶的人VH结构域。
7.权利要求6的可溶的VH结构域，其缺少特征骆驼科相关氨基酸取代和具有未在包含重链和轻链的人抗体中发现的FR2取代。
8.权利要求5-7中任一项的可溶的VH结构域，其具有IOnM或更好的结合亲和力。
9.一种V基因区段，当与D基因区段和J基因区段重组并亲和力成熟后，其编码权利要求5-8中任一项的可溶的VH结构域。
10.权利要求9的V基因区段，其中相对于所述V基因区段的天然种系序列，通过至少一个取代、插入或缺失或其组合对所述V基因区段的序列进行工程改造，使得其包含编码已显示有助于VH结构域的溶解性和稳定性的氨基酸残基或氨基酸序列的密码子。
11.一种D基因区段，当与权利要求9或10的V基因区段和J基因区段重组并亲和力成熟后，其编码权利要求5-8中任一项的可溶的VH结构域。
12.权利要求11的D基因区段，其中相对于所述D基因区段的天然种系序列，通过至少一个取代、插入或缺失或其组合对所述D基因区段的序列进行工程改造，使得其包含编码已确定有助于维持可溶的VH结构域的溶解性和稳定性的氨基酸残基的密码子，所述可溶的VH结构域包含由所述D基因区段编码的序列。
13.一种J基因区段，当与权利要求9或10的V基因区段和D基因区段重组并亲和力成熟后，其编码编码权利要求5-8中任一项的可溶的VH结构域。
14.权利要求13的J基因区段，其中相对于所述J基因区段的天然种系序列，通过至少一个取代、插入或缺失或其组合对所述J基因区段的序列进行工程改造，使得其包含编码已确定有助于维持可溶的VH结构域的溶解性和稳定性的氨基酸残基的密码子，所述可溶的VH结构域包含由所述J基因区段编码的序列。
15.一种异源只有重链的基因座，其包含一个或多个权利要求9或10的V基因区段、 一个或多个权利要求11或12的D基因区段、一个或多个权利要求13或14的J基因区段和一个或多个各编码缺少CHl功能性的抗体恒定效应子区的恒定效应子区基因区段，其中排列所述基因区段，使得V、D和J基因区段和恒定区基因区段可重组，以产生编码权利要求 1-4中任一项的高亲和力的抗原特异性的可溶的只有重链的抗体的重排的亲和力成熟的只有重链的基因座。
16.权利要求15的只有重链的基因座，排列所述只有重链的基因座以产生人只有重链的抗体或包含可溶的人VH结构域和来自另一物种的恒定区基因区段的杂合抗体。
17.权利要求15或16的只有重链的基因座，其中所述恒定区基因区段为啮齿动物来源，优选小鼠来源。
18.一种转基因非人哺乳动物，其包含权利要求15-17中任一项的异源只有重链的基因座。
19.一种转基因非人哺乳动物，其不表达任何功能性免疫球蛋白轻链基因，并包含异源只有重链的基因座，所述基因座包含一个或多个权利要求9或10的V基因区段、一个或多个权利要求11或12的D基因区段、一个或多个权利要求13或14的J基因区段和一个或多个各编码包含CHl功能性的抗体恒定效应子区的恒定效应子区基因区段，其中排列所述基因区段，使得V、D和J基因区段和恒定区基因区段可重组，以产生编码高亲和力的抗原特异性的可溶的只有重链的抗体的重排的亲和力成熟的只有重链的基因座。
20.权利要求19的转基因非人哺乳动物，其中排列所述只有重链的基因座以产生人只有重链的抗体或包含可溶的人VH结构域和来自另一物种的恒定区基因区段的杂合抗体。
21.权利要求19或20的转基因非人哺乳动物，其中所述恒定区基因区段为啮齿动物来源，优选小鼠来源。
22.权利要求18-21中任一项的转基因非人哺乳动物，其为小鼠。
23.一种用于制备高亲和力的抗原特异性的可溶的只有重链的抗体的方法，其包括用抗原攻击权利要求18-22中任一项的转基因非人哺乳动物。
24.权利要求23的方法，其中所述只有重链的抗体的可溶的VH结构域为人的。
25.一种用于获得编码只有重链的抗体链或可溶的VH结构域的核酸的方法，其包括 从包含只有重链的基因座的转基因哺乳动物获得长寿命的浆细胞或记忆B细胞，所述哺乳动物已被抗原攻击；和从所述长寿命的浆细胞或记忆B细胞分离编码对抗原特异的只有重链的抗体链或可溶的VH结构域的核酸。
26.权利要求25的方法，其中从抗原攻击的非人转基因哺乳动物的周围淋巴腺、骨髓或脾纯化所述长寿命的浆细胞或记忆B细胞。
27.权利要求25或沈的方法，其中用细胞的细胞表面标记纯化所述长寿命的浆细胞或记忆B细胞。
28.权利要求27的方法，其中所述细胞表面标记为⑶138标记。
29.权利要求M-26中任一项的方法，其中从所述细胞分离mRNA群，并从所述mRNA群产生编码只有重链的抗体或可溶的VH结构域的cDNA群。
30.权利要求四的方法，其中将所述cDNA群克隆到表达载体中；任选将克隆到cDNA表达载体中的序列转染到所选择的细菌中，扩增并挑取菌落，和纯化重组载体DNA ；用所述表达载体转化能够表达、累积、分泌或呈递由所述表达载体编码的蛋白质的细胞系；和选择表达、累积、分泌或呈递识别所述抗原的只有重链的抗体链的细胞系。
31.权利要求25-27中任一项的方法，其中从所述细胞分离mRNA群，并从所述mRNA群产生编码由所述细胞产生的任何抗体的VH结构域的cDNA群。
32.权利要求31的方法，其中将编码由所述细胞产生的任何抗体的VH结构域的cDNA群克隆到表达载体中；用所述表达载体转化能够表达、累积、分泌或呈递由所述表达载体编码的蛋白质的细胞系；和选择表达、累积、分泌或呈递识别所述抗原的VH结构域的细胞系。
33.权利要求30或32的方法，其中所述细胞系为微生物细胞系或哺乳动物细胞系。
34.一种制备与抗原特异性结合的只有重链的抗体的方法，其包括(a)用所述抗原免疫非人转基因哺乳动物，其中所述哺乳动物表达在转录和加工的重链mRNA中缺少CHl功能性的只有重链的抗体；(b)从所述免疫的哺乳动物分离长寿命的浆细胞或记忆B细胞；(c)从源自步骤(b)的细胞分离mRNA群；(dl)将源自步骤(c)的mRNA的cDNA群克隆到表达载体中，并在细胞系中表达所述 cDNA ；(el)选择至少一个产生与所述抗原特异性结合的只有重链的抗体的细胞系；或(d2)将包含编码源自步骤(c)的mRNA的VH结构域的cDNA的cDNA群克隆到表达载体中，以便在所述细胞系中表达可包含重链效应子区的VH融合蛋白；(e2)选择至少一个产生与所述抗原特异性结合的VH融合蛋白的细胞系。
35.权利要求25-34中任一项的方法，其中在mRNA分离之前使分离的长寿命的浆细胞或记忆B细胞无限增殖化。
36.权利要求25-35中任一项的方法，其中任何只有重链的抗体基因座包含至少一个显性选择标记基因。
37.权利要求23或M的方法，其包括使来自所述哺乳动物的产生抗体的细胞无限增殖化的步骤。
38.权利要求35或37的方法，其中通过与骨髓瘤细胞融合使所述细胞无限增殖化。
39.权利要求35或37的方法，其中通过用病毒例如EBV转化使所述细胞无限增殖化。
40.权利要求25-39中任一项的方法，其还包括步骤从产生所需抗原特异性的只有重链的抗体的B细胞或无限增殖化细胞系，分离所述可溶的VH结构域或编码所述可溶的VH 结构域的核酸。
41.权利要求23-40中任一项的方法，其还包括步骤从由所述哺乳动物产生的产生只有重链的抗体的细胞，或从通过展示方法由所述哺乳动物产生的无限增殖化的产生只有重链的抗体的细胞，分离可溶的VH结构域或编码可溶的VH结构域的核酸。
42.通过权利要求23-40中任一项的方法获得的可溶的VH结构域或编码可溶的VH结构域的核酸，在制备只有重链的抗体、VH胞内抗体、VH多蛋白、VH结构域复合体或VH融合体中的用途。
43.一种只有重链的抗体、VH胞内抗体、VH多蛋白、VH结构域复合体或VH融合体，其包含至少一个权利要求5-8中任一项的VH结构域。
44.一种只有重链的抗体、VH胞内抗体、VH多蛋白、VH结构域复合体或VH融合体，其包含至少一个权利要求5-8中任一项的VH结构域，并用于治疗。
45.包含至少一个权利要求5-8中任一项的VH结构域的只有重链的抗体、VH胞内抗体、VH多蛋白、VH结构域复合体或VH融合体在制备药物中的用途。
46.一种用于制备权利要求5-8中任一项的VH结构域的盒，其包含编码FR1、FR2和 FR3的基因序列，其中所述编码FRl和FR2及FR2和FR3的基因序列由使得能够引入合适的 CDRl编码序列和CDR2编码序列的序列隔开，且在编码FR3的序列的3’端存在使得能够引入编码CDR3编码序列的序列的序列。
全文摘要
本发明提供一种高亲和力的抗原特异性的可溶的只有重链的抗体，其缺少特征骆驼科相关氨基酸取代和具有未在包含重链和轻链的抗体中发现的FR2取代；显示CDR1内的净疏水性提高和CDR3中存在的荷电氨基酸数目增加；和包含导致FR1内的净疏水性提高和FR3中存在的荷电氨基酸数目增加的框架β折叠内的一个或多个氨基酸取代。本发明亦提供具有同样性质的VH结构域、用于其制备的基因区段、用于其制备的方法、转基因动物和VH结构域的抗体在治疗中的用途。
文档编号C07K16/28GK102482342SQ201080023562
公开日2012年5月30日 申请日期2010年3月19日 优先权日2009年3月24日
发明者D·德拉贝克, E·德博尔, F·G·格罗斯维德, R·W·詹森斯, 罗杰·金登·克雷格, 陈韬 申请人:伊拉兹马斯大学鹿特丹医学中心, 罗杰·金登·克雷格