治疗性触角足-抗体分子及其使用方法

专利名称：治疗性触角足-抗体分子及其使用方法
治疗性触角足-抗体分子及其使用方法发明背景发明领域本发明一般涉及分子向细胞的递送，更具体而言，本发明涉及含有触角足(Antp) 或Antp片段的治疗性抗体-蛋白质偶联物(嗫合物，conjugate)。背景信息触角足(Antp)基因编码转录因子，其已被证明控制果蝇属(Drosophila)胚中的前后形态发生。触角足的蛋白质序列以存在与特异性DNA靶元件结合的60个氨基酸基序 (同源域)为表征。已经在几乎所有的多细胞生物体中发现了触角足同源染色体，它们显示很高程度的氨基酸序列同一性。人类和果蝇属触角足蛋白在同源域序列中的差异仅在于一个保守的氨基酸替代。经观察，触角足及其同源域能够易位跨过哺乳动物细胞的细胞质膜。易位并不取决于细胞胞吞作用，据报道，易位在4°C和37°C下发生。由D氨基酸组成的同源域合成肽也能够跨过细胞质膜。这种发现将排除Antp通过受体介导的机制而易位的可能性。该特性已被用来将小的病毒序列运载入(vehiculate)到培养细胞的细胞质中，以及被用来引起针对流感病毒的核蛋白的MHCI类限制性细胞毒性免疫应答。然而，到目前为止，Antp的同源域仅被用来输送小的合成肽。碱性肽，如果蝇属触角足或HIV-I的Tat，可促进连接的肽和拟肽 (P印tidomimetic)分子的细胞内化。平截的HIV-I Tat蛋白碱性结构域通过质膜迅速易位并在细胞核中积聚。具有细胞穿透特性的非天然碱性肽也已经被合成。这些肽被统称为蛋白质转导结构域(PTDs)。已经注意到与PTD结合的肽、反义寡核苷酸和蛋白质有效地内化，并且，已经在几种细胞和动物模型中检测到它们的生物学作用。这种生物学活性大分子细胞内递送的非侵入途径可能是非常有效的策略，因为可以直接攻击(attack)细胞内蛋白质靶。抗体及其重组片段的高度特异性和长效半衰期使它们成为选择性靶向剂的优秀候选者。单链可变区片段(Single chain fragment variable) (scFv)和单克隆抗体(mAbs) 能够采用有功能的三维构象，其将VH和VL结构域连接在一起。标准IgG抗体的分子量为 150，OOODa, scFv抗体的分子量为30，OOODa,因此，内化整个IgG以及小的scFv分子是潜在可行地。利用重组DNA转染技术可有效获得细胞中的单链mAb表达，然而，靶细胞对DNA构建物的通常较低的接近性以及对抗体水平的药理学调节的缺乏给治疗应用前景造成限制。发明概述本发明基于这样一个基本发现即，与触角足结合的抗体或其片段是有效的治疗齐U。本发明描述了在触角足羧基或氨基末端与其重组融合或化学偶联的抗体或抗体片段的构建(“货物-运载体”构建物)。令人惊奇地，Antp能够输送作为大的复杂分子的抗体。能够穿透细胞膜的触角足-抗体或抗体片段偶联物或构建物显著扩大了创新治疗剂的潜能。用共聚焦显微镜在完整的人类培养的细胞中观察到荧光素抗体-Antp构建物的内化(参见实施例)。在培养基中温育几个小时之后，在单个细胞中测定细胞质和核区室的荧光强度。相对于胞外培养基浓度，细胞质、胞核和多个核仁中构建物的浓度水平实质上更高。通过在细胞中引入重组载体或蛋白质而使基因功能沉默已是细胞生物学的主要目标，该目标最初通过各种侵入性技术，如显微注射、红细胞影融合(red cell ghost fusion)或电穿孔来实现。本发明提供用于递送到细胞的核酸构建物和蛋白质偶联物。如本文所述的，使PTD与IgG和SCFv抗体融合允许产生能有效抑制细胞内靶的功能的“细胞穿透”抗体。这些特征使本发明的分子从治疗前景来看更有效。Antp的同源域可被用于易位抗体——包括其片段(例如，scAb)。本发明的一个关键益处是Antp同源域可被用于将功能和调节抗体易位到细胞。
附图简介

图1显示荧光素抗体到细胞的输送。图IA-人胚肾(293)细胞；图IB-人类前列腺癌(PC3)细胞。发明详述本发明是基于这样的发现即，Antp的同源域可被用于将抗体或其片段输送到细胞中，其比现有的递送工具更有效。这样的融合蛋白或偶联物提供有效的调节或治疗组合物。如本文所使用的，“抗体”包括作为B细胞产物的免疫球蛋白和其变体以及作为T 细胞产物的T细胞受体(TcR)及其变体。免疫球蛋白是这样的蛋白质，其包含一个或多个基本上由免疫球蛋白κ和λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定区基因以及多种免疫球蛋白可变区基因编码的多肽。轻链被分类为κ或者λ。重链被分类为Y、μ、α、δ或ε，其反过来又分别限定免疫球蛋白类别——IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链的亚类也是已知的。例如， 人类中的IgG重链可以是IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚类任一种。本发明的抗体可以是，例如嵌合的、人源化的或全人或鼠源性抗体及其抗原结合部分。本文考虑抗体的各种形式。例如，本发明的单克隆抗体可包括或由完整的抗体 (即，全长，具有完整的Fc区)、基本上完整的抗体、其抗原结合部分(例如，Fab, Fab'、 F(ab' )2)或单链Fv片段组成。应该理解，抗体的所有这些形式均包含在本文中并且贯穿在术语“抗体”内。此外，本发明的抗体可被标记有可检测的标记。此外，本发明的抗体被考虑为是单克隆起源的，即使它们的糖基化模式不同。虽然Antp-Ab偶联物是有效的治疗剂，但任选地，融合多肽——包括Antp和抗体或其片段可进一步包括5，000道尔顿或更小的小分子有机化合物，如药物、蛋白质、肽、拟肽、糖蛋白、蛋白聚糖、脂质糖脂、磷脂、脂多糖、核酸、蛋白聚糖、糖类等等。另外的靶向剂可以包括熟知的治疗用化合物，包括抗肿瘤剂。抗肿瘤靶向剂可以包括紫杉醇、柔红霉素、多柔比星、洋红霉素、4'-表阿霉素(印iadriamyCin)、4-脱甲氧基-道诺霉素、11-脱氧柔红霉素、13-脱氧柔红霉素、阿霉素-14-苯甲酸酯、阿霉素-14-辛酸酯、阿霉素-14-萘-醋酸酯、长春碱、长春新碱、丝裂霉素C、N-甲基丝裂霉素C、博来霉素A2、双去氮杂四氢叶酸、 氨基蝶呤、氨甲蝶呤、秋水仙碱(cholchicine)和顺钼等等。抗微生物剂包括氨基糖苷—— 包括艮他霉素、抗病毒化合物，如利福平、3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷(AZT)和无环鸟苷 (acylovir)、抗真菌剂，如唑系(azoles)——包括氟康唑(fluconazole)、plyre大环内酯类(plyre macrolides)，如两性霉素B和杀假丝菌素、抗寄生物化合物，如含锑化合物 (antimonial)等等。激素靶向剂包括毒素，如白喉毒素、细胞因子，如CSF、GSF、GMCSF、TNF、 红细胞生成素、免疫调节剂或细胞因子，如干扰素或白细胞介素、神经肽、生殖激素，如HGH， FSH或LH、甲状腺激素、神经递质，如乙酰胆碱，和激素受体，如雌激素受体。Antp-抗体靶向剂——包括将Antp与抗体或靶向剂共价连接到该抗体的氨基酸残基所必需的任何连接部分——大小可以为至少约1-300道尔顿，以及大小可以为至少约 400、500、600、700、800、900、1，000,1, 100,1, 200,1,300,1,400,1,500,1,600,1,700、 1，800,1, 900,2, 000,2, 500,3, 000,3, 500,4, 000,4, 500 或者甚至 5，000 道尔顿，在大小上甚至更大也是可能的。在另一实施方式中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的Antp-抗体偶联物。 本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。在药物组合物中，本发明的抗体偶联物为活性成分。优选地，药物组合物包含均质或基本上均质的本发明的抗体群。用于治疗用途的组合物是无菌的，并可被冻干，任选地，可补充有适当的稀释剂。本发明的抗体偶联物可包含天然的或合成的触角足同源域。可从果蝇属获得的 Antp 基因的同源域示于 SEQ ID N0:1 中。(SEQ ID NO 1 Arg Lys Arg Gly Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg lie Glu lie Ala His Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln lie Lys lie
Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn)。已从其它生物体-包括脊椎
动物、哺乳动物和人类分离与该同源域同源的序列，并且，这些序列包括在本发明中。可以利用标准技术如克隆，利用 Joliet 等(1991)Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 :1864-1868 描述的程序来制备同源域。如前所说明的，在这样的多细胞生物体的序列中的差异在自然界中通常是保守的。然而，事实不一定如此，其它这样的序列包括在本发明中，并例如，其中与可从果蝇属获得的序列的序列同一性为约50 %或更大，例如60 %、70 %、80 %或90 %。可以利用如GAP这样的商售的程序来测定序列同一性。此外，合成的或其它变体可被使用，条件是它们保持易位膜的能力。合成的或其它变体可以通过替代，尤其是保守替代而与天然产生的蛋白质不同。保守氨基酸替换 (change)意为用来自相同基团的氨基酸取代来自氨基酸基团之一——即，疏水的、极性的、 酸性的或碱性——的氨基酸。这种替换的例子是用甲硫氨酸取代缬氨酸，反之亦然。可以利用标准重组DNA技术，如位点定向诱变来制备这样的变体。在将进行插入的情况下，合成 DNA编码插入片段和与插入位点任一侧的天然生成的序列对应的5'和3'侧翼区。侧翼区将含有与天然生成的序列中的位点相应的方便的限制性位点，使得序列可被合适的酶(一种或多种)切割，并且合成的DNA被连接到切割片段上。然后，按照本发明表达DNA，以利用编码选择的抗体的DNA序列产生编码的融合蛋白。Antp被连接在抗体序列的5’或3’末端。这些方法对本领域中已知的用于处理DNA序列的众多标准技术仅是说明性的，而且其它的已知技术也可以被使用。天然生成的或合成的序列易位膜的能力可通过本领域中已知的常规方法检测并在所附实施例中被说明。本领域中已经报道了保持易位膜的能力的同源域的一些变体， 这些变体以及任何可得的变体都被包括在本发明的范围内。例如，EP-B-O 485 578公开了含有Antp的螺旋3序列的同源肽(homeop印tide)，这些同源肽通过引用被并入本文。 W097/12912公开了 Antp的螺旋3的实际序列及其变体。其它变体公开在，例如，Gehring W(1987) Homeo Boxes in the Study of Development 中。Science 236 1245—1252 公开了 62个氨基酸的同源域，S卩，glu位于位置O和Iys位于位置61。Bloch-Gallego E等 (1993)Antennapedia Homeobox Peptide Enhances Growth and Branching of Embryonic Chicken Motoneurons In Vitro. The Journal of Cell Biology 120(2)485-492公开了被称为pAntp40P2的突变体，其仍然能够通过运动神经元(motoneuron)膜易位并达到胞核。 在该突变体中，在位置40和41的亮氨酸和苏氨酸残基被两个脯氨酸残基取代。Le Roux 等(1993)Neurotropic activity of the Antennapedia homeodomain depends on its specific DNA-binding properties. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 9120—9124 公开了两个突变体pAntp 50A和pAntp 40P2，它们保持通过神经元膜易位的能力。khutze-Redelmeier M-P等(1996)在前公开了 16个氨基酸C-末端(第三螺旋)区段已被用于将寡核苷酸和寡肽引导到培养中的细胞的细胞质和胞核。当Antp和抗体区域通过连接体而偶联时，连接体可以是可切割的连接体区域。优选地，可切割的连接体区域是蛋白酶可切割的连接体，尽管其它连接体，例如可被小分子切割的连接体也可以被使用。这些包括Met-X位点——可被溴化氰切割、Asn-Gly——可被羟胺切割、Asp-Pro——可被弱酸切割和Trp-X——尤其可被NBS-粪臭素切割。蛋白酶切割位点因为必需的温和的切割条件而被优选并在例如，因子Xa、凝血酶和胶原酶中被发现。可以利用这些中的任一种。精确的序列在本领域中是可得的，并且，选择合适的切割位点对技术人员来说没有困难。通过举例，因子叙靶向的蛋白酶切割区域为IEGR。肠激酶靶向的蛋白酶切割区域为DDDDK。凝血酶靶向的蛋白酶切割区域为LVPRG。优选地，可切割的连接体区域是被胞内蛋白酶靶向的连接体区域。Antp可被用于向癌细胞输送抗体分子，所述抗体分子调节转录因子并能够修复细胞周期控制或诱导分化。例如，应该理解，如果功能性P53分子被上调，则许多癌细胞会经历程序性细胞死亡。本发明可被用于递送这样的抗体产物，以直接或间接调节基因或蛋白质。本发明的抗体-Antp分子对于抗菌和抗病毒方案(measure)是有用的。例如，Antp 可被用于在病毒或细菌或其它病原体感染细胞的细胞质中输送抗体，抗体干涉细菌和病毒复制的关键步骤。本发明的抗体偶联物对于治疗疾病和病症是有用的，所述疾病和病症，例如但不限于癌症、炎症或炎性疾病、皮肤病、发热、心血管作用、出血、血凝和急性期应答、恶病质、厌食、急性感染、HIV感染、休克状态(shock states)、移植物抗宿主反应、自身免疫性疾病、再灌注损伤、脑膜炎、偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓形成；肿瘤生长、侵入和扩散、 血管发生、转移、恶性的、腹水和恶性胸腔积液；脑缺血、缺血性心脏病(ischaemic heart disease)、骨性关节炎、类风湿性关节炎、骨质疏松、哮喘、多发性硬化症、神经变性、阿耳茨海默病、动脉粥样硬化、中风、血管炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎；牙周炎、龈炎；牛皮癣、特应性皮炎、慢性溃疡、表皮水泡症；角膜溃疡、视网膜照相术和手术伤口愈合；鼻炎、变应性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、子宫内膜组织异位、动脉粥样坏死或内硬化症(endosclerosis)。
如本文所使用的，术语癌症指增生性疾病，如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞(bronchioloalviolar cell)肺癌、骨癌、胰腺癌、 皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌症、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈(cervix)癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、 甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、 肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNQ瘤、脊柱轴向肿瘤、 脑干神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤(schwanomas)、室管膜瘤 (印endymona)、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤恩肉瘤，包括任意以上癌症的顽固形式或者一种或多种以上癌症的组合。Antp-抗体偶联物可被用于多种活性和疾病，包括，例如，巨噬细胞抑制和/或T 细胞抑制活性，因而包括抗炎活性；抗免疫活性，例如，针对细胞和/或体液免疫应答—— 包括与炎症无关的应答——的抑制作用；抑制巨噬细胞和T细胞粘附到胞外基质成分和纤连蛋白的能力，以及上调的fas受体在T细胞中的表达；抑制不期望的免疫反应和炎症，包括关节炎——包括类风湿性关节炎、与过敏性有关的炎症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其它自身免疫性疾病；与动脉粥样硬化有关的炎症、动脉硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心动停止、心肌梗塞、血管炎性病症、呼吸窘迫综合征或其它心肺疾病、与消化性溃疡有关的炎症、溃疡性结肠炎和胃肠道其它疾病、肝纤维化、肝硬化或其它肝疾病、甲状腺炎或其它腺疾病、肾小球性肾炎或其它肾和泌尿学疾病、耳炎或其它耳鼻喉科疾病、皮炎或其它皮肤病、牙周疾病或其它牙科疾病、睾丸炎或附睾-睾丸炎(印ididimo-orchitis)、不育、睾丸损伤(orchidal trauma)或其它免疫相关的睾丸疾病、胎盘功能不全、胎盘不足、习惯性流产、惊厥、先兆子痫和其它免疫和/或炎性相关妇科学疾病、后眼色素层炎，中间眼色素层炎、前眼色素层炎、结膜炎、脉络视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症，例如，视网膜炎或细胞状黄斑水肿、交感性眼炎、巩膜炎 (scieritis)、色素性视网膜炎、退行性眼底疾病(fondus disease)的免疫和炎性部分、目艮外伤的炎性部分、由感染引起的眼部炎症、增生性玻璃体视网膜病、急性缺血性视神经病、 过量结疤(excessive scarring)，例如，在青光眼滤过术之后、针对眼移植的免疫和/或炎症反应和其它免疫和炎性相关的眼疾病、与自身免疫性疾病或状况或病症有关的炎症， 其中，在中枢神经系统(CNQ或在任何其它器官中，免疫和/或炎症抑制都是有益的，帕金森氏病、帕金森氏病的治疗产生的并发症和/或副作用、AIDS相关痴呆复征(dementia complex)、HIV-相关脑病、德维克氏病、西登哈姆氏舞蹈病、阿耳茨海默病和CNS的其它退行性疾病、状况或病症、中风的炎性部分、脊髓灰质炎后综合征(post-polio syndrome)、精神病的免疫和炎性部分、骨髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、格-巴二氏综合征、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham chora)、重症肌无力、脑假瘤、唐氏综合征、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、CNS压迫或CNS外伤或CNS感染的炎性部分、肌萎缩症和营养不良的炎性部分、以及中枢和周围神经系统的免疫和炎性相关的疾病、状况或病症、创伤后炎症、败血症性休克、感染疾病、外科手术的炎性并发症或副作用、骨髓移植或其它移植并发症和/或副作用、基因治疗的炎性和/或免疫并发症和副作用，例如，由于感染病毒载体、或与AIDS有关的炎症，通过减少单核细胞或淋巴细胞的量，阻止或抑制体液和/或细胞免疫应答、治疗或改善单核细胞或白细胞增生性疾病，例如，白血病，以预防和/或治疗在移植天然或人工细胞、组织和器官，如角膜、骨髓、器官、晶状体 (lenses)、起搏器、天然或人工皮肤组织情况下的移植排斥。如本文所使用的，“药学载体”包括任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等，它们是生理学上相容的。优选地，载体适于静脉内、肌肉、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。如本文所使用的，用语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”意为除肠内施用和局部施用以外的施用方式，通常是通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、 框内、心内、真皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、胸骨内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在适当的情况下，药物组合物可以通过以下一种或多种的任一种被施用吸入、以栓或阴道栓的形式、局部以洗液、溶液、乳、软膏或撒粉的形式、通过使用皮肤贴剂、口服施用以含赋形剂，如淀粉或乳糖的片剂形式、或者胶囊或卵的形式——单独地或与赋形剂混合、或者以含调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液的形式，或者它们可以经肠胃外，例如海绵体内(intracavernosally)、静脉内、肌肉内或皮下注射。对于肠胃外施用，组合物可以最佳为无菌水溶液的形式，其可含有其它物质，例如足够的盐或单糖，以使溶液与血液等渗。对于口腔或舌下施用，组合物可以片剂或锭剂的形式被施用，所述片剂或锭剂可以常规方式被配制。本发明的Antp-抗体偶联物的递送可以被单独应用或者与其它治疗或治疗组件组合应用。在一些实施方式中，在包括给对象施用治疗有效量的Antp-抗体偶联物的治疗对象的方法中，可以单独使用Antp-抗体偶联物，或者可以使用包含Antp-抗体偶联物和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在优选实施方式中，对象是哺乳动物。示例性哺乳动物包括人、猪、绵羊、山羊、马、 小鼠、狗、猫、母牛等。可用Antp-抗体偶联物治疗的疾病包括癌症，如可以治疗的皮肤癌、 头颈癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、脑癌、胃癌、胰腺癌或淋巴系统癌。可通过施用治疗量的本发明的抗体-药物偶联物来治疗遭受B或T细胞癌症、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、淋巴或髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、肉瘤和黑素瘤的患者。Antp-抗体偶联物可静脉内、腹腔内、动脉内、鞘内、膀胱或瘤内施用。偶联物可以在重复和/或循环的基础上作为大丸剂或作为输注被给予。根据药物剂量和就副作用而言对偶联物的耐受能力，输注可被重复一次或多次，这由主管医师(managing physician)确定。普通技术人员将会理解，抗体-药物偶联物的有效量可根据经验而被确定。剂可以作为药物组合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂联合被施用给需要治疗癌症的对象。将会理解，当施用给人类患者时，剂或组合物的总的日用量应该由主治医师在合理的医疗判断的范围内决定。对于任何特定的患者，具体的治疗有效剂量水平将取决于多种因素要达到的细胞应答的类型和程度；应用的具体Antp-抗体偶联物或组合物的活性；应用的具体Antp-抗体偶联物或组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；剂的施用时间、 施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与具体剂联合使用或同时使用的药物；以及医疗领域中悉知的类似因素。例如，以低于达到期望治疗效果所需要的水平开始给药剂，并逐渐增加剂量直到达到期望的效果，这在本领域的技术人员中是悉知的。在一个实施方式中，Antp-抗体偶联物可在其它标准治疗——包括辐射治疗、外科手术或化学疗法之前、同时或之后被施用。在一个实施方式中，抗体和Antp的两种或更多种偶联物被施用，其中，偶联物影响相同患病细胞中的不同的靶。在另一个实施方式中，抗体和蒽环类抗生素药物的偶联物可在另一种基于抗体的治疗之前、同时或之后被施用。该另外的基于抗体的治疗可以包括施用两种或更多种基于抗体的治疗——包括裸治疗(naked therapy)，其中，抗体被单独施用或者与另外的治疗剂联合施用，所述另外的疗剂与抗体偶联或非偶联施用。偶联可以利用当前公开的连接体或另外类型的连接体。当施用两种基于抗体的治疗时，这些治疗是这样的，即无论那个抗体被另外施用，其都靶向不同抗原或患病细胞上相同抗原上的不同表位。第二抗体也可以与另外的(不同的)药物或与治疗同位素偶联，从而提供基于抗体的联合治疗。同样应该理解，该治疗可在细胞因子施用之前、同时或之后与细胞因子联合，所述细胞因子增强抗肿瘤作用或预防或减轻治疗偶联物的副作用。上述确定的每一个治疗方法均可另外地包括施用一种或多种免疫调节剂。这些免疫调节剂可选自干扰素、细胞因子、干细胞生长因子、集落刺激因子、淋巴细胞毒素和其它造血因子。干扰素优选为α-干扰素、β-干扰素或Y-干扰素，而造血因子可选自红细胞生成素、血小板生成素、白细胞介素(ILs)、集落刺激因子(CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)禾PG-CSF。白细胞介素可选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL_18 和IL-21。免疫调节剂或造血因子可在免疫偶联物治疗之前、期间或之后被施用。免疫调节剂被施用以增强所施用的本发明的偶联物的效力。如在当前申请中使用的，术语“价”表示在抗体分子中存在指定数目的结合位点。因此，术语“二价的”、“四价的”和“六价的”表示在抗体分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。根据本发明的双特异性抗体为至少“二价的”并可以是“三价的”或“多价的”(例如，“四价的”或“六价的”)。 优选地，根据本发明的双特异性抗体为二价的、三价的或四价的。在一个实施方式中，所述双特异性抗体为二价的。在一个实施方式中，所述双特异性抗体为三价的。在一个实施方式中，所述双特异性抗体为四价的。如本文所使用的，术语“重组人抗体”意图包括所有通过重组手段制备、表达、产生或分离的人抗体，如从宿主细胞如NSO或CHO细胞分离的抗体，或从人类免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体，或者利用转染到宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。这样的重组人抗体具有重新排列的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体以被进行体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然衍生自人类种系VH和VL序列并与其有关，但可以不是天然地存在于体内人抗体种系所有组成成分中。如本文所使用的，“可变结构域”(轻链的可变结构域(VL)、重链的可变区(VH)) 表示一对轻链和重链对中的每一条链，其直接涉及使抗体与抗原结合。可变的人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构，并且，每个结构域包含四个构架(FR)区，所述构架区的序列是广泛保守的，由三个“高变区”(或者互补决定区，CDR)连接。构架区采用β片层构象，而⑶R可形成连接β片层结构的环。每条链中的⑶R通过构架区而保持其三维结构， 并与其它链的CDR —起形成抗原结合位点。根据本发明的Antp-抗体一般通过重组手段而产生。因此，当前发明的一个方面是编码根据本发明的抗体和Antp的核酸或其部分(例如，同源域)，而再一方面是宿主细胞，其含有编码根据本发明的Antp-抗体的核酸。重组生产的方法在本领域的技术发展水平中是众所周知的，包括原核和真核细胞中的蛋白质表达和随后的Antp-抗体分离和通常纯化至药学上可接受的纯度。为了在宿主细胞中表达前述抗体，编码与分别修饰的轻链和重链融合的Antp的核酸通过标准方法被插入到表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞，如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER. C6细胞、酵母或大肠杆菌 (E. coli)细胞中进行表达，并且从细胞中回收抗体(上清或裂解后的细胞)。用于重组产生抗体的一般方法在本领域的技术发展水平中是众所周知的并被描述。(例如，在以下综述文章:Makrides,S. C. ,Protein Expr· Purif. 17(1999) 183-202 ；Geisse,S.等，Protein Expr. Purif. 8(1996) 271—282 ；Kaufman, R. J.，Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-160 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 中)。通过常规免疫球蛋白纯化程序，如例如，Antp蛋白A-琼脂糖的抗体柱、羟基磷灰石层析(hydroxylapatite chromatography)、凝胶电泳、透析或亲禾口层析,使Antp-抗体适当地与培养基分离。编码抗体的DNA和RNA易于分离并且利用常规程序进行测序。杂交瘤细胞可充当这样的DNA和RNA的来源。一旦被分离，DNA可被插入到表达载体中，然后，该表达载体被转染到宿主细胞，如HEK 293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中——所述细胞并不另外产生免疫球蛋白蛋白质，以在宿主细胞中获得重组抗体的合成。这些组合物也可含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过在前的灭菌程序和通过包含各种抗菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等等均可保证防止微生物的存在。将等渗剂，如糖、氯化钠等等包含在组合物中也是期望的。此外， 通过包含延迟吸收的剂，如单硬脂酸铝和明胶，可产生可注射药物形式的延长吸收。不考虑选择的施用途径，通过本领域技术人员已知的常规方法，本发明的化合物——可以合适的水合形式被使用——和/或本发明的药物组合物被配制成药学上可接受的剂型。本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以得到一定量的活性成分，所述一定量的活性成分对于特定的患者、组合物和施用方式可有效达到期望的治疗反应(therapeutic response)而对患者没有毒性。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素——包括应用的本发明的具体组合物的活性、施用途径、施用时间、被应用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与应用的具体组合物联合使用的其它药物、化合物和 /或材料、被治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和先前的病史以及医学领域中悉知的类似因素。如本文所使用的，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可被互换使用。这些术语指通过任何手段——包括化学偶联或重组手段而将两个以上的元件或组件连在一起。“符合读框的融合(in-frame fusion) ”指以维持正确阅读原始ORF框的方式将两个或更多个开放阅读框(ORF)连在一起，以形成连续的较长的0RF。因此，产生的重组融合蛋白为单个蛋白质，其含有与原始ORF编码的多肽对应的两个或更多个区段(其中，区段通常实质上并不这样连接)。尽管因此使得阅读框在整个融合的区段都是连续的，但该区段可以通过，例如， 符合读框的连接体序列从物理上或空间上分开。以下实施例意图说明而非限制本发明。
实施例1本实施例说明了荧光标记的scFv-Antp构建物。具有Antp (同源域肽)的抗-HIS 抗体(被FITC标记的货物)被用于递送。利用共聚焦显微镜，在保存于培养基的完整细胞中观察到肽/货物构建物的非常有效的内化。在每个检查的单个细胞的多个点中测定荧光强度。在最近的研究中，报道了培养细胞中针对Bcl-XL的scFv-TAT的穿透。这些作者在固定剂存在的情况下研究内化(Cohen-Saidon，C.，等Q003))。然而，其它作者已经证明即使是在温和条件下，细胞固定也导致假(artifactual)的肽摄取(Richard等，(2003)， J. Biol. Chem. 278 :585-590)。意识到该假象，发明者研究了在非固定的活细胞中scFv-Antp构建物的内化。获得了感兴趣区域的局部荧光强度，其中明显的优势是降低远离焦平面的背景信息以及收集连续切片的可能性。对于肽或抗体，使用药理学上可得到的微摩范围内的浓度。进行的实验表明实现了内化(见图IA和1B)。IgG和scFv抗体的经验显示可以常常实现针对靶的10_8到ΙΟ,Μ范围内的Kd值 (Hanes, J. , Schaffitzel, C. , Knappik, A. , and Pluckthun, Α. (2000)Nat. Biotechnol. 18, 1观7-1292)，并且就它们与靶的相互作用而言可以是非常特异和选择的。因此，获得非常有效的内化尤其令人感兴趣。这些实验表明Antp-抗体分子具有较高的细胞内稳定性和提高的药效和药代动力学特性。对于现代癌症治疗，发现在维持恶性新稳态(neohomeostasis)中可能重要的信号蛋白的好的抑制剂至关重要。靶向膜信号转导蛋白(是显性癌蛋白质型，例如表皮生长因子受体家族蛋白质、CD20蛋白质和其它蛋白质)的单克隆抗体在现代抗肿瘤治疗中已经具有共同的和不断扩展的应用。可利用载体将抗体-Antp核酸构建物递送到细胞。如本文所使用的，“载体”意为构建物，其能递送、并且优选地在宿主细胞中表达感兴趣的一个或多个基因或序列(一条或多条)。载体的例子包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、黏粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂有关的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体和某些真核细胞，如生产细胞中的DNA或RNA表达载体。如本文所使用的，“表达控制序列”意为指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或可诱导型启动子、或者增强子。表达控制序列可操作地与待转录的核酸序列连接。利用确立的重组DNA技术，可将核苷酸序列与各种其它核苷酸序列相连。例如， 多核苷酸可被克隆到多种克隆载体——包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和黏粒——的任一种。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体(probe generation vectors)和测序载体。通常，载体将包含在至少一种生物体中有功能的复制起点、方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个可选择标记。其它元件将取决于期望的用途，并对本领域的普通技术人员来说将是显而易见的。在某些实施方式中，多核苷酸可被配制，以便允许另外的易于进入哺乳动物细胞中，以及允许在其中表达。如下所描述的，对于治疗目的，这样的制剂尤其有用。本领域的普通技术人员应该理解，有许多实现多核苷酸在靶细胞中表达的方法，并且可以应用任何合适的方法。例如，多核苷酸可被并入病毒载体中，例如但不限于腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒或牛痘或其它痘病毒(例如，禽类痘病毒)。将DNA并入这样的载体的技术是本领域的普通技术人员悉知的。反转录病毒载体可另外转移或并入可选择标记(以助于鉴别或选择转导的细胞)和/或靶向部分的基因，如编码特异性靶细胞上的受体的配体的基因，以赋予载体靶特异性。通过本领域普通技术人员已知的方法，也可利用抗体来完成靶向。本文已经描述了本发明的一些实施方式和Antp，所述Antp固有地是用于进入细胞的细胞穿透肽/易位肽。用于治疗目的的其它制剂包括胶体分散体系，如大分子复合体、纳米胶囊、微球体、珠和脂质基体系——包括水包油乳剂、微团、混合型微团和脂质体。用作体外和体内递送工具的优选胶体体系是脂质体(即，人工膜小泡)。这种体系的制备和应用在本领域中是熟知的。针对细胞内靶的单克隆抗体已被广泛用于通过多种技术，如显微注射、红细胞影融合或电穿孔沉默细胞中的基因功能的基础研究中。然而，从获得新的基础生物学知识的观点来看，这是合适的途径，但这不是从药理学/治疗的观点来看，对于药理学/治疗，可逆的和剂量调节效应以及实际上进入每个细胞的潜在能力是关键的药理学要求。将PTD，如Antp融合和/或构建到scFv和完整抗体允许我们产生细胞穿透抗体， 其能有效抑制细胞中的抗原或序列特异性靶的功能。尽管已经通过参考上述实施例描述了本发明，但应该理解，修饰和变化包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由以下权利要求书限定。
权利要求
1.融合蛋白，其包括与Antp或其片段融合或化学偶联的抗体或其片段。
2.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体片段是scFv。
3.权利要求1所述的抗体，其中所述Antp在其氨基或羧基末端被融合或偶联。
4.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是荧光标记的。
5.核酸序列，其编码权利要求1所述的融合蛋白。
6.宿主细胞，其包含权利要求5所述的核酸序列。
7.治疗方法，包括将权利要求1所述的蛋白质施用给细胞或者将权利要求5所述的核酸序列施用给细胞。
8.权利要求7所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
9.权利要求7所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物。
10.权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
全文摘要
与触角足或其片段结合的抗体或其片段是有效的治疗剂。本发明描述了在触角足羧基或其氨基末端与其融合或化学偶联的抗体或抗体片段的构建(“货物-载体”构建物)。
文档编号C07K16/00GK102459329SQ201080026328
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者A·埃佩内托斯, C·库斯帕鲁 申请人:特洛伊科技有限公司