专利名称：抗-Tau pS422抗体用于治疗脑病的应用的制作方法
抗-Tau pS422抗体用于治疗脑病的应用本发明涉及特异性结合SEQ ID NO 9的磷酸化Tau片段(pS422)的抗体用于治疗脑病的应用。
背景技术：
人Tau (微管相关蛋白Tau (神经原纤维缠结蛋白，配对螺旋丝-Tau (Paired helical filament-Tau),PHF-Tau)是主要在轴突中发现的神经元的微管相关蛋白，其功能是促进微管蛋白聚合并稳定微管。在人脑中发现六种同种型(同种型々』，(，0』，？，6，胎儿-Tau)，最长的同种型包含441个氨基酸(同种型F，Uniprot P10636-8)。Tau及其性质也被 Reynolds, C. H.等，神经化学杂志(J. Neurochem.) 69 (1997) 191-198 描述。处于超磷酸化形式的Tau是配对螺旋丝(PHF)的主要成分，配对螺旋丝(PHF)是阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD)脑中神经原纤维损伤的结构单元。Tau可在其丝氨酸或苏氨酸残基被数种不同的激酶(包括GSK3i3，cdk5，MARK和MAP激酶家族的成员) 磷酸化。Tau病(tauopathies)以Tau的异常超磷酸化为特征，并且根据Iqbal，K.等 (Biochimica et Biophysica Acta (BBA) 1739 Q005) 198-210)，Tau 病是: 阿尔茨海默病(Alzheimer disease)，包括该病的仅有缠结的形式(tangle-only form) 唐氏综合征，成人病例(Down syndrome, adult cases)·关岛型帕金森综合征痴呆复合征(Guam parkinsonism dementia complex)·拳击员痴呆(Dementia pugilistica)·皮克病(Pick disease)· ^Wnf IBIS Ι ^(Dementia with argyrophilic grains) 额颞叶痴呆(Fronto-temporal dementia)· i^MS/STi^ft (Cortico-basal degeneration) 苍白球脑桥黑质变性(Pallido-ponto-nigral degeneration)·进tit生核上t生) 搏(Progressive supranuclear palsy)‘ ^Wli^n WH- "Μ" (Gerstmann- Straussler- -Scheinker disease with tangles)。迄今为止，在阿尔茨海默病的脑中已经发现近40种丝氨酸(S)/苏氨酸⑴磷酸化位点(Hanger, D. P.等，生物化学杂志(J. Biol. Chem) 282 (2007) 23645-23654) 在阿尔茨海默病中Tau病理学的发展与其磷酸化状态有关。然而，40个磷酸化位点的大部分不与疾病病理学相关，因为它们也在从健康的胎儿脑组织提取的Tau中发现。仅有一些磷酸化位点是疾病状态特有的，推测其负责定义了阿尔茨海默脑PHFs中的Tau的异常的、特征性的不溶性和聚集(Morishima-Kawashima，Μ.等，生物化学杂志(J.Biol. Chem) 270 (1995)823-829)。根据Pei，J. J.等，阿尔茨海默病杂志(Journal of Alzheimer's Disease) 14 0008)385-392，现有文献对于这些位点中的哪些是AD脑特异性的提供了有限且不清楚的信息。Pei使用一系列Tau的磷酸特异性抗体并测量它们在来自22个AD和10个对照的内侧颞叶皮质的勻浆中的水平。Bussiere, T.等(神经病理学学报(Acta Neuropathol. ) 97 (1999) 221-230)描述了 Tau蛋白上磷酸化的丝氨酸422是在数种具有神经原纤维变性的疾病中发现的病理性表位。Augustinack, J. C.等，(神经病理学学报(Acta Neuropathol) 103 (2002) 26-35) 描述了 pS422与阿尔茨海默病中神经元病理学的严重性相关。Guillozet-Bongaarts， Α.(神经化学杂志(J. Neurochem) 97 (2006) 1005-1014)描述了 Tau 在 S422 的磷酸化是PHFs成熟过程的一部分。也发现Tau pS422与多种阿尔茨海默病转基因小鼠模型中的病理学发展相关。因此，Deters, N.等在生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 379 (2009) 400-405 中提到双重转基因 Dom5/pR5 小鼠显示增加7倍数目的含有特异性磷酸化病理性S422表位的海马神经元。Goetz，J.等(科学 (Science) 293 (2001) 1491-1495)报道注射A β 42原纤维的Tau P301L转基因小鼠脑中出现在S422磷酸化的Tau。EP 2 009 104涉及来自阿尔茨海默病PHFs的Tau蛋白磷酸化状态中存在的Tau 蛋白的表位，以及所述表位用于产生特异性检测阿尔茨海默Tau蛋白的抗体中的应用。WO 2002/06^51和US 7，446，180涉及对异常截短形式的Tau蛋白具有特异性的抗体以及与阿尔茨海默病和相关Tau病有关的诊断和治疗方面。WO 98/22120涉及治疗患有阿尔茨海默病的患者的方法，包括向该患者施用针对氨基酸约207至约222，氨基酸约2Μ至约240和氨基酸约390至约408的磷酸化Tau片段的抗体的步骤。使用磷酸化Tau片段379-408 [P-Ser396,404]来疫苗接种Tau转基因小鼠的动物研究在Asuni，A.A.等，神经科学杂志(J. Neuroscience) 27 (2007) 9115-91 中提及。US 2008/0050383涉及通过施用Tau蛋白片段治疗和预防受试者中阿尔茨海默病或其它Tau病的方法。针对Tau pS422的单克隆抗体在，例如EP 1 876 185中描述。针对TaupS422的多克隆抗体是可商购的(例如ProSci Inc.和Biosource International)。发明概述本发明包括结合在丝氨酸422磷酸化的Tau (Tau pS422)的抗体，其特征在于特异性结合磷酸化的 Tau 片段 Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser (PO3H2) -Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-L eu-Ala-Asp (SEQ ID NO 9)和结合 Tau pS422，但是不结合 Tau 和不结合 SEQ ID NO :17 的磷酸化的MCAK片段，所述抗体应用于治疗Tau病和此类治疗方法。本发明包括结合在丝氨酸422磷酸化的Tau (Tau pS422)的抗体，其特征在于特异性结合SEQ ID NO 9的磷酸化的Tau片段和结合Tau pS422，但是不结合Tau和不结合SEQ ID NO 17的磷酸化的MCAK片段，所述抗体应用于制备治疗Tau病的药物和此类制备方法。本发明包括结合磷酸化的Tau的抗体，其特征在于特异性结合与 Mab2. 10. 3 (抗-Tau pS422抗体)所结合的表位相同的表位。本发明包括结合磷酸化的Tau的抗体的应用，其特征在于特异性结合与Mab 2. 10.3(抗-Tau pS422抗体)所结合的表位相同的表位，所述应用为用于治疗Tau病中的应用或用于制备用于治疗Tau病的药物的应用。本发明所述的抗体特异性结合Tau pS422和聚集的(原纤维的)磷酸化的Tau。 本发明所述的抗体不结合未磷酸化的Tau、SEQ ID NO 10的未磷酸化的Tau片段和SEQ IDNO 17的磷酸化的MCAK片段。本发明所述的抗体优选是人IgGl亚型。在本发明的又一个实施方案中，本发明所述的抗体优选是人IgG4亚型。本发明包括抗-Tau pS422抗体，其特征是包含a) SEQ ID NO 6 的 CDR1H，SEQ ID NO 7 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 8 的 CDR3H，b)SEQ ID NO :23 的 CDR1H, SEQ ID NO 24 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 25 的 CDR3H,c) SEQ ID NO :31 的 CDR1H，SEQ ID NO 32 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 33 的 CDR3H，d) SEQ ID NO 39 的 CDR1H, SEQ ID NO 40 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 41 的 CDR3H,e)SEQ ID NO :47 的 CDR1H，SEQ ID NO 48 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 49 的 CDR3H，f) SEQ ID NO 55 的 CDR1H, SEQ ID NO 56 的 CDR2H,和 SEQ ID NO 57 的 CDR3H,或g) SEQ ID NO 63 的 CDR1H，SEQ ID NO 64 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 65 的 CDR3H。优选地所述抗体特征是包含a) SEQ ID NO 6 的 CDR1H，SEQ ID NO 7 的 CDR2H，SEQ ID NO 8 的 CDR3H 禾口 SEQ ID NO 3 的 CDR1L, SEQ ID NO 4 的 CDR2L, SEQ ID NO 5 的 CDR3L,b) SEQ ID NO 23 的 CDR1H, SEQ ID NO 24 的 CDR2H,和 SEQ ID NO 25 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 27 的 CDR1L，SEQ ID NO 28 的 CDR2L，SEQ ID NO 29 的 CDR3L，c) SEQ ID NO :31 的 CDR1H, SEQ ID NO 32 的 CDR2H,和 SEQ ID NO 33 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 35 的 CDR1L，SEQ ID NO 36 的 CDR2L，SEQ ID NO 37 的 CDR3L，d) SEQ ID NO 39 的 CDR1H, SEQ ID NO 40 的 CDR2H,和 SEQ ID NO :41 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 43 的 CDR1L，SEQ ID NO 44 的 CDR2L，SEQ ID NO 45 的 CDR3L，e) SEQ ID NO 47 的 CDR1H, SEQ ID NO 48 的 CDR2H,和 SEQ ID NO 49 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 51 的 CDR1L，SEQ ID NO 52 的 CDR2L，SEQ ID NO 53 的 CDR3L，f) SEQ ID NO 55 的 CDR1H, SEQ ID NO 56 的 CDR2H,和 SEQ ID NO 57 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 59 的 CDR1L，SEQ ID NO 60 的 CDR2L，SEQ ID NO 61 的 CDR3L，或g) SEQ ID NO 63 的 CDR1H, SEQ ID NO 64 的 CDR2H,和 SEQ ID NO 65 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 67 的 CDR1L，SEQ ID NO 68 的 CDR2L，SEQ ID NO 69 的 CDR3L。优选地所述抗体特征是包含a) SEQ ID NO 1的可变轻链和SEQ ID NO 2的可变重链，b)SEQ ID NO :26的可变轻链和SEQ ID NO 22的可变重链，c) SEQ ID NO 34的可变轻链和SEQ ID NO 30的可变重链，d) SEQ ID NO 42的可变轻链和SEQ ID NO 38的可变重链，e)SEQ ID NO :50的可变轻链和SEQ ID NO 46的可变重链，f) SEQ ID NO 58的可变轻链和SEQ ID NO 54的可变重链，或g) SEQ ID NO 66的可变轻链和SEQ ID NO 62的可变重链。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 2. 10. 3的人源化变体。本发明包括抗-Tau PS422抗体Mab 2. 10. 3的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 2. 10. 3的T细胞表位缺失变体(T-cell epitope depleted variant)。Mab2. 10. 3的特征在于其可变链 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 005的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 005的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab005的T细胞表位缺失变体。 Mab 005的特征在于其可变链SEQ ID NO 26和SEQ ID NO :22。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 019的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422 抗体Mab 019的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab019的T细胞表位缺失变体。 Mab 019的特征在于其可变链SEQ ID NO 34和SEQ ID NO :30。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 020的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422 抗体Mab 020的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab020的T细胞表位缺失变体。 Mab 020的特征在于其可变链SEQ ID NO 42和SEQ ID NO :38。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 085的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422 抗体Mab 085的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab085的T细胞表位缺失变体。 Mab 085的特征在于其可变链SEQ ID NO 50和SEQ ID NO :46。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 086的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422 抗体Mab 086的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab086的T细胞表位缺失变体。 Mab 086的特征在于其可变链SEQ ID NO 58和SEQ ID NO :54。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 097的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422 抗体Mab 097的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab097的T细胞表位缺失变体。 Mab 097的特征在于其可变链SEQ ID NO 66和SEQ ID NO :62。本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含 SEQ ID NO 6 的 CDR1H，SEQ ID NO 7 的 CDR2H，SEQ ID NO 8 的 CDR3H 和 SEQ ID NO 3 的 CDR1L，SEQ ID NO 4 的 CDR2L，SEQ ID NO 5 的 CDR3L 或 SEQ ID NO 1 的可变轻链和 SEQ ID NO 2的可变重链。本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含 SEQ ID NO 23 的 CDR1H，SEQ ID NO 24 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 25 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 27 的 CDR1L, SEQ ID NO 28 的 CDR2L, SEQ ID NO 29 的 CDR3L，或 SEQ ID NO 26 的可变轻链和SEQ ID NO 22的可变重链。本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含 SEQ ID NO :31 的 CDR1H，SEQ ID NO 32 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 33 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 35 的 CDR1L, SEQ ID NO 36 的 CDR2L, SEQ ID NO 37 的 CDR3L 或 SEQ ID NO 34 的可变轻链和SEQ ID NO 30的可变重链。本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含 SEQ ID NO 39 的 CDR1H，SEQ ID NO 40 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 41 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 43 的 CDR1L, SEQ ID NO 44 的 CDR2L, SEQ ID NO 45 的 CDR3L 或 SEQ ID NO 42 的可变轻链和SEQ ID NO 38的可变重链。本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含 SEQ ID NO 47 的 CDR1H，SEQ ID NO 48 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 49 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 51 的 CDR1L, SEQ ID NO 52 的 CDR2L, SEQ ID NO 53 的 CDR3L 或 SEQ ID NO 50 的可变轻链和SEQ ID NO 46的可变重链。本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含 SEQ ID NO 55 的 CDR1H，SEQ ID NO 56 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 57 的 CDR3H，和 SEQ
7ID NO 59 的 CDR1L，SEQ ID NO :60 的 CDR2L，SEQ ID NO :61 的 CDR3L 或 SEQ ID NO :58 的可变轻链和SEQ ID NO 54的可变重链。本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含 SEQ ID NO 63 的 CDR1H，SEQ ID NO 64 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 65 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 67 的 CDR1L，SEQ ID NO 68 的 CDR2L，SEQ ID NO 69 的 CDR3L 或 SEQ ID NO 66 的可变轻链和SEQ ID NO 62的可变重链。本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422 抗体的特征在于包含 SEQ ID NO 6 的 CDR1H，SEQ ID NO 7 的 CDR2H，SEQ ID NO 8 的 CDR3H 和 SEQ ID NO 3 的 CDR1L，SEQ ID NO 4 的 CDR2L，SEQ ID NO 5 的 CDR3L 或SEQ ID NO 1的可变轻链和SEQ ID NO 2的可变重链。本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422 抗体的特征在于包含 SEQ ID NO 6 的 CDR1H，SEQ ID NO 7 的 CDR2H，SEQ ID NO 8 的 CDR3H 和 SEQ ID NO 3 的 CDR1L，SEQ ID NO 4 的 CDR2L，SEQ ID NO 5 的 CDR3L 或SEQ ID NO 1的可变轻链和SEQ ID NO 2的可变重链。本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO 23的CDR1H, SEQ ID NO 24的CDR2H，和 SEQ ID NO 25 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 27 的 CDR1L，SEQ ID NO 28 的 CDR2L，SEQ ID NO 29的CDR3L，或SEQ ID NO 26的可变轻链和SEQ ID NO 22的可变重链。本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO 31的CDR1H, SEQ ID NO 32的CDR2H，和 SEQ ID NO 33 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 35 的 CDR1L，SEQ ID NO 36 的 CDR2L，SEQ ID NO 37的⑶R3L或SEQ ID NO 34的可变轻链和SEQ ID NO 30的可变重链。本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO 39的CDR1H, SEQ ID NO 40的CDR2H，和 SEQ ID NO 41 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 43 的 CDR1L，SEQ ID NO 44 的 CDR2L，SEQ ID NO 45的⑶R3L或SEQ ID NO 42的可变轻链和SEQ ID NO 38的可变重链。本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO 47的CDR1H，SEQ ID NO 48的CDR2H，和 SEQ ID NO 49 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 51 的 CDR1L，SEQ ID NO 52 的 CDR2L，SEQ ID NO 53的⑶R3L或SEQ ID NO 50的可变轻链和SEQ ID NO 46的可变重链。本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO 55的CDR1H，SEQ ID NO 56的CDR2H，和 SEQ ID NO 57 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 59 的 CDR1L，SEQ ID NO 60 的 CDR2L，SEQ ID NO 61的⑶R3L或SEQ ID NO 58的可变轻链和SEQ ID NO 54的可变重链。本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO 63的CDR1H，SEQ ID NO 64的CDR2H，和 SEQ ID NO 65 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 67 的 CDR1L，SEQ ID NO 68 的 CDR2L，SEQ ID NO 69的⑶R3L或SEQ ID NO 66的可变轻链和SEQ ID NO 62的可变重链。优选地结合Tau PS422并且特征在于上面提及的氨基酸序列和氨基酸序列片段的抗体是人IgGl亚型。优选地结合Tau pS422并且特征在于上面提及的氨基酸序列和氨基酸序列片段的抗体是人IgG4亚型。本发明的又一个实施方案是包含本发明所述抗体的药物组合物。本发明的又一个实施方案是本发明所述抗体用于制备药物组合物的应用。本发明的又一个实施方案是本发明所述抗体用于制备Tau病的应用，所述Tau 病选自由下列各项组成的组阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)(包括该病的仅有缠结的形式(tangle-only form of the disease)，唐氏综合征，成人病例(Down syndrome, adult cases))，关岛型中白金森综合征痴呆复合征(Guam parkinsonism dementia complex),拳击员痴呆(Dementia pugilistica),皮克病(Pick disease),具有嗜银颗粒的痴呆(Dementia with argyrophilic grains),客页聂页叶痴呆(Fronto-temporal dementia)，皮质基底节变性(Cortico-basal degeneration)，苍白球脑桥黑质变性 (Pallido-ponto-nigral degeneration)，进^ff生核上f生麻搏(Progressive supranuclear palsy)，禾口具有缠结的格一施一沙病(Gerstmann-Straussler--Scheinker disease with tangles)。本发明的又一个实施方案是用于制备包含本发明所述抗体的药物组合物的方法。本发明的又一个实施方案是编码本发明所述抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸。本发明还提供含有本发明所述核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸，以及提供用于重组产生此类抗体的含有此类载体的宿主细胞。本发明还包括原核或真核宿主细胞，该宿主细胞包含本发明所述的载体。本发明还包括用于产生本发明所述重组人抗体或人源化抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达本发明所述的核酸并且从所述细胞或细胞培养物上清液回收所述抗体。本发明还包括可通过此类重组方法获得的抗体。本发明还包括选择本发明所述单克隆抗体的方法，其特征在于提供一些结合Tau PS422的单克隆抗体，确定所述抗体与SEQ ID NO 9的磷酸化的Tau片段、Tau和SEQ ID NO 17的磷酸化的MCAK片段的结合，和选择这样的抗体，即与其对Tau的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段具有至少10，000-倍的特异性结合，和与其对磷酸化的MCAK片段Ile-G In-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO 17)的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段具有至少100-倍的特异性结合。优选地本发明还包括选择本发明所述单克隆抗体的方法，其特征在于提供一些结合Tau pS422的单克隆抗体，确定所述抗体与SEQ ID NO :9的磷酸化的Tau片段、Tau pS422、Tau和SEQ ID NO :17的磷酸化的MCAK片段的结合，和选择这样的抗体，即与其对Tau 的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段和所述Tau pS422具有至少10，000-倍的特异性结合，和与其对磷酸化的 MCAK 片段 Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser (PO3H2) -Val-Asn-Ser -Lys-Ile-Pro-Ala(SEQ ID N0 17)的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段具有至少100-倍的特异性结合。优选地本发明还包括选择本发明所述单克隆抗体的方法，其特征在于提供一些结合Tau pS422的单克隆抗体，确定所述抗体与SEQ ID NO :9的磷酸化的Tau片段、Tau pS422、Tau和SEQ ID NO 17的磷酸化的MCAK片段的结合，和选择这样的抗体，即与其对
9Tau的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段和所述Tau pS422具有至少10，000-倍的特异性结合，和与其对磷酸化的 MCAK 片段 Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser (PO3H2) -Val-Asn-S er-Lys-IIe-Pro-Ala (SEQ ID NO :17)的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段和Tau pS422 具有至少100-倍的特异性结合。本发明所述抗体显示出对于需要Tau靶向治疗的患者的益处。本发明所述抗体具有新的和创造性的性质，该性质产生对于患有Tau病(特别是AD)的患者的益处。本发明还提供治疗患有Tau病(特别是AD)的患者的方法，包括向诊断为患有此类疾病(并因而需要此类治疗)的患者施用本发明所述的结合PS422的抗体。优选地以药物组合物形式施用该抗体。本发明还一个实施方案是治疗患有Tau病(特别是AD)的患者的方法，其特征在于向患者施用本发明所述的抗体。本发明还包括本发明所述的抗体用于治疗患有Tau病(特别是AD)的患者的用途，以及在制备本发明所述药物组合物中的用途。此外，本发明包括制备本发明所述药物组合物的方法。本发明还包括药物组合物，该药物组合物包含本发明所述的抗体，任选地连同在配制药用目的的抗体中有用的缓冲液和/或辅剂。本发明还提供药物组合物，该药物组合物包含在药学上可接受载体中的本发明所述的抗体。在一个实施方案中，该药物组合物可包含于制品或试剂盒中。本发明的抗体可通过检测磷酸化的Tau多肽用于诊断神经病学病症，诸如阿尔茨海默病。本发明的抗体也可用于特异性检测Tau pS422或聚集的磷酸化的Tau。发明详述本发明所述的术语“Tau”包括包含441个氨基酸的人Tau的最长同种型(同种型 F, Uniprot P10636-8)。本发明所述的术语“磷酸化的Tau (pTau) ”包括包含441个氨基酸的人Tau的最长同种型(同种型F，Uniprot P10636-8)的磷酸化形式，其通过激酶ERK2在S422磷酸化产生。本发明所述的术语“聚集的磷酸化的Tau”或“聚集的(原纤维的)磷酸化的Tau” 包括包含441个氨基酸的人Tau的最长同种型(同种型F，Uniprot P10636-8)的聚集的和磷酸化的形式，其通过激酶ERK2磷酸化聚集的Tau产生。本发明所述的术语"Tau片段，，包括 Tau 片段 Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser-Pro -Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp(SEQ ID NO :10)。本发明所述的术语“磷酸化的Tau片段”包括磷酸化的Tau片段Ser-Ile-Asp-Me t-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp(SEQ ID NO :9)。本发明所述的术语“MCAK”包括人有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白(驱动蛋白样蛋白 KIF2C，UniProt Q99661))。MCAK_ 人(88-102) [95-pSer]是磷酸化的 MCAK 片段，由在丝氨酸95磷酸化的氨基酸88-102组成(SEQ ID NO 17)。这种磷酸化的MCAK片段相比于SEQ ID NO :9的磷酸化的Tau片段没有序列同一性或相似性。发明人认识到现有技术中针对磷酸化的Tau片段的抗体可显示与不相关的磷酸化的人肽和蛋白质相当大的交叉反应性。对于本发明所述抗体，其不结合磷酸化的MCAK片段，不能检测到此类不想要的交叉反应性。
对Tau PS422的结合和对Tau的结合通过具有电化学发光读出的ELISA来研究。 Tau或Tau pS422以2 μ g/ml的浓度固定并添加测试抗体(例如人或小鼠的抗体)。为检测结合的测试抗体，具有罗丹明标签的抗人或抗小鼠IgG分别以0. 5 μ g/ml的浓度添加。 如果在Tau pS422的最大结合信号使用Tau pS422和Tau的检测信号之间的关系是至少 10，000-倍，则发现对Tau pS422的特异性结合。通过ELISA研究对SEQ ID NO :9的磷酸化的Tau片段的结合，对SEQ ID N0:10的未磷酸化的Tau片段的结合，对SEQ ID NO 17的磷酸化的MCAK片段的结合。测试抗体与所述固定的磷酸化的Tau片段温育，并用于与所述固定的未磷酸化的Tau片段或MCAK片段相比较。抗体进行标记并检测所述标记。如果在磷酸化的Tau片段的最大结合信号使用磷酸化的Tau片段和未磷酸化的Tau片段的检测信号的关系是至少100，和如果在磷酸化的 Tau片段的最大结合信号使用磷酸化的Tau片段和磷酸化的MCAK片段的检测信号的关系是至少100，则发现对磷酸化的Tau片段的特异性结合。术语“Mab 2. 10. 3的表位”包括位于磷酸化的Tau片段Ser-Ile-Asp-Met-Val-As p-Ser (PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp (SEQ ID NO 9)内的被 Mab 2. 10. 3 特异性识别的表位。本发明所述的Tau抗体的表位结合性质通过体外交叉阻断结合测定(诸如 Biacore 体外交叉阻断结合测定)来确定，以确定Mab 2. 10. 3空间阻碍测试抗体对pTau 的结合的能力。对于此类测定，Mab 2. 10. 3作为一级抗体捕获到Biacore传感器，随之顺次注射PTau和待测的二级抗体。如果二级抗体不显示任何可检测的结合信号，则二级抗体结合与Mab 2. 10. 3相同的表位。本发明所述抗体以通过如上描述的Biacore 分析确定的^ΙΟ —1至ΙΟ—Μ—1的亲和力结合Tau pS422。通过Biacore分析研究对Tau pS422的原纤维聚集体的结合。对于这种测定，固定聚集的Tau pS422并且添加使用2的稀释因子且最大浓度为200nM的不同浓度的测试抗体。 本发明所述抗体以0. 1至30的Kd，优选地以10至20nM的Kd结合原纤维的Tau pS422。术语“单克隆抗体或抗体”涵盖各种形式的抗体，优选为单克隆抗体，并且特别优选为IgGl或IgG4单克隆抗体。本发明所述的抗体优选地是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或进一步遗传工程化的抗体，只要保留了本发明所述的特征性性质。T细胞表位缺失抗体可使用WO 98/08097中描述的方法产生。“抗体片段”包括全长抗体的一部分，优选为其可变结构域或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子、和由抗体片段形成的多特异性抗体。scFv 抗体是例如 Huston，J. S.在酶学方法(Methods in Enzymol.) 203 (1991) 46-88 中描述的抗体。另外，抗体片段包括单链多肽，所述单链多肽具有Vh结构域的特征，即能够与\结构域组装在一起或者具有结合Tau pS422的\结构域的特征，即能够与Vh结构域组装在一起成为功能性抗原结合位点。术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中构架和/或“互补决定区”(CDR)已被修饰成包括与亲本免疫球蛋白相比具有不同种类(species)的免疫球蛋白的CDR。在优选的实施方案中，a) SEQ ID NO 6 的 CDR1H，SEQ ID NO 7 的 CDR2H，SEQ ID NO 8 的 CDR3H 禾口 SEQ ID NO 3 的 CDR1L, SEQ ID NO 4 的 CDR2L, SEQ ID NO 5 的 CDR3L,b) SEQ ID NO 23 的 CDR1H, SEQ ID NO 24 的 CDR2H,和 SEQ ID NO 25 的 CDR3H,禾口SEQ ID NO 27 的 CDR1L，SEQ ID NO :28 的 CDR2L，SEQ ID NO :29 的 CDR3L，C) SEQ ID NO :31 的 CDR1H, SEQ ID NO :32 的 CDR2H,和 SEQ ID NO :33 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 35 的 CDR1L，SEQ ID NO :36 的 CDR2L，SEQ ID NO :37 的 CDR3L，d) SEQ ID NO :39 的 CDR1H, SEQ ID NO :40 的 CDR2H,和 SEQ ID NO :41 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 43 的 CDR1L，SEQ ID NO :44 的 CDR2L，SEQ ID NO :45 的 CDR3L，e) SEQ ID NO :47 的 CDR1H, SEQ ID NO :48 的 CDR2H,和 SEQ ID NO :49 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 51 的 CDR1L，SEQ ID NO :52 的 CDR2L，SEQ ID NO :53 的 CDR3L，f) SEQ ID NO :55 的 CDR1H, SEQ ID NO :56 的 CDR2H,和 SEQ ID NO :57 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 59 的 CDR1L，SEQ ID NO :60 的 CDR2L，SEQ ID NO :61 的 CDR3L，或g) SEQ ID NO :63 的 CDR1H, SEQ ID NO :64 的 CDR2H,和 SEQ ID NO :65 的 CDR3H,禾口 SEQ ID NO 67 的 CDR1L，SEQ ID NO :68 的 CDR2L，SEQ ID NO :69 的 CDR3L被移植到人抗体的构架区，以制备“人源化抗体”。参见，例如， Riechmann, L.，等，自然(Nature) 332 (1988) 323-327 ；和 Neuberger，Μ· S.，等，自然 (Nature)314(1985)268-270。“可变结构域”(轻链可变结构域(VJ，重链可变结构域(Vh))，当用于本发明时，指每对轻链和重链结构域的每个结构域，其直接参与抗体与抗原的结合。轻链和重链的可变结构域具有相同的通用结构，并且每个结构域包括序列是广泛保守的4个构架(FR)区，其由3个“高可变区”(或互补决定区，CDR)连接。所述构架区采用β-折叠构象，并且所述 CDR可以形成连接所述β-折叠结构的环。在每条链中的CDR通过构架区保持在它们的三维结构中，并且与另一条链的CDR —起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在本发明所述的抗体的结合特异性/亲和性中起着特别重要的作用，并且因此提供本发明的另一个目的。术语“抗体的抗原-结合部分”，当用于本发明时，是指抗体负责抗原-结合的氨基酸残基。抗体的抗原-结合部分包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或 “FR”区是除超变区残基之外的那些可变结构域区域，如本文所定义的。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N端到C端包括结构域FRl、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域，并且限定所述抗体的性质。CDR和FR区按照Kabat 等，免疫目的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公共健康服务(Public Health Service)，美国全国卫生研究所(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)的标准定义和/或来自于“高变环”的那些残基来确定。术语“⑶R1H”是指根据Kabat计算的重链可变区的⑶Rl区。⑶R2L，⑶R3H等意思是来自重链(H)或轻链(L)的各自的区域。例如，其特征在于包含SEQ ID NO 6的⑶RlH的抗体意思是所述抗体在其可变重链中包含作为重链可变链CDRl区的这种氨基酸序列。例如，其特征在于包含 SEQ ID NO 6 的 CDR1H，SEQ ID NO 7 的 CDR2H，SEQ ID NO 8 的 CDR3H 的抗体意思是所述抗体在其重链中包含作为⑶Rl的序列SEQ ID NO :6，作为⑶R2的序列 SEQ ID NO 7 和作为 CDR3 的序列 SEQ ID NO :8。用于本文时，术语“核酸”或“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选地是双链的DNA。当在本申请中应用时，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸的组，其包括丙氨酸(三字母符号ala，单字母符号A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，Ε)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，Μ)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，Τ)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸 (tyr, Y)和缬氨酸(val, V)。当核酸置于与另外的核酸的功能性关联中时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导区的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，所述DNA可操作地与多肽的 DNA连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，其可操作地与编码序列连接；或如果将核糖体结合部位定位以促进翻译，其可操作地与编码序列连接。通常，“可操作地连接”意味着连接的DNA序列是在同一直线上的，并且在分泌前导区的情况中，是连续的，并且在阅读框中。但是，增强子不一定是连续的。通过在适宜限制性位点的连接反应来完成连接。如果这些位点不存在，依照常规惯例，使用合成的寡核苷酸衔接物或接头。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以交换使用，并且所有这些命名都包括后代。因而，单词“转化子”和“经转化的细胞”包括原代所述细胞及源于它的培养物，不考虑转移的次数。还理解由于有意或无意的突变，所有后代可能在DNA内容上并不精确相同。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的不同后代。抗体的“Fe部分”不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应器功能。“抗体的Fc部分”是技术人员熟知的术语并基于木瓜蛋白酶切割抗体进行定义。取决于它们的重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体或免疫球蛋白分成下列种类IgA、IgD、IgE、IgG和 IgM,并且这些中的一些可以进一步分成亚类(亚型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4、IgAl 与IgA2。按照重链恒定区，不同种类的免疫球蛋白分别称为α、δ、ε、Y和μ。本发明所述的抗体优选地包括人来源的IgGl或IgG4亚型的Fc部分。人恒定轻链和重链和IgGl或IgG4亚型恒定链是本领域熟知的，并且例如被 Kabat (参见，例如 Johnson, G.和 ffu, Τ. T.，核酸研究(Nucleic Acids Res. )28 (2000) 214-218)描述。例如，有用的人重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO 13 或14 (IgGl)或SEQ ID NO 15或16 (IgG4)。例如，有用的人轻链恒定区包含SEQ ID NO: 11 的κ轻链恒定区的氨基酸序列。还优选的是所述抗体是小鼠来源并且包含根据Kabat (参见例如，免疫目的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest), Kabat, E. A.等，第五版(5th edition), DIANE Publishing (1992))的小鼠抗体的抗体可变序列框架。本发明包括用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用本发明所述抗体。本发明包括本发明所述抗体用于治疗的应用。本发明包括本发明所述抗体用于制备治疗Tau病(特别是AD)的药物的应用。本发明包括本发明所述抗体用于治疗脑病，优选地用于治疗Tau病(特别是AD) 的应用。本发明又一个实施方案是产生本发明所述的抗体的方法，其特征在于编码本发明所述抗体重链的核酸序列和编码所述抗体轻链的核酸插入到一个或两个表达载体，所述载体插入到真核宿主细胞，所编码的抗体被表达并从该宿主细胞或上清液回收。
本发明所述的抗体优选地通过重组方法产生。此类方法在本领域内是众所周知的并且包括在原核细胞和真核细胞中表达蛋白质，随后分离抗体多肽并且通常纯化至可药用的纯度。为了表达蛋白质，通过标准方法将编码重链和轻链或其片段的核酸插至表达载体内。在适宜的原核宿主细胞或真核宿主细胞如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌(E. coli)细胞内进行表达，并且从细胞(从上清液或细胞裂解后)回收抗体。抗体的重组生成，例如，记述在综述文章Makrides，S. C.，蛋白表达和纯化(Protein Expr. Purif.) 17 (1999) 183-202 ；Geisse, S.等，蛋白表达和纯化(Protein Expr. Purif.) 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R. J.，分子生物技术(Mol. Biotechnol.) 16 (2000) 151-160 ；Werner, R. G.，等，药物研究(Drug Res.) 48 (1998) 870-880中。抗体可以存在于完整细胞、细胞裂解产物中或以部分纯化或基本纯形式存在。通过标准技术(参见Ausubel，F.等，编辑，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology),Greene Publishing and Wiley Interscience, (1987))进行纯化，从而消除其他细胞成分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白。在NSO细胞中的表达记述在，例如，Barnes, L. Μ.等，细胞技术学 (Cytotechnology) 32 (2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.等，生物技术和生物工程(Biotech. Bioeng. )73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.等，核酸研究 (Nucl.Acids. Res. )3(K2002)E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.等，美国科学院院刊(Proc. Natl. Acad. ki. USA) 86 (1989) 3833-3837 ;Carter，P.等，美国科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 89 (1992) 4285-4289 ；Norderhaug, L.等，免疫学方法杂志(J. Immunol. Methods) 204 (1997) 77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在 Schlaeger, E. -J.和 Christensen, K.，在细胞技术学(Cytotechnology) 30 (1999) 71-83 中和 khlaeger，Ε. -J.，在免疫学方法杂志(J. Immunol. Methods) 194 (1996) 191-199 中。通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如例如，蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或亲合层析法，从培养基中适当分离单克隆抗体。编码单克隆抗体的DNA和RNA 容易利用常规程序分离和测序。杂交瘤细胞可以起所述DNA和RNA来源的作用。一旦分离后，可以将DNA插入到表达载体中，所述表达载体随后转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如HEK 293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中，以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。通过本领域内所知的多种方法制备了编码抗-PS422抗体氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体情况下) 或通过对较早制备的人源化抗-PS422抗体的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或位点定向的)诱变、PCR诱变以及盒式诱变制备。本发明所述的重链和轻链可变结构域与启动子、翻译起始、恒定区、3'非翻译区、 多腺苷酸化和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可组合成单个载体、共转染、顺次转染或单独转染进入宿主细胞，然后其融合以形成表达两条链的单个宿主细胞。另一方面，本发明提供一种组合物(例如药物组合物)，其含有一种本发明的单克
14隆抗体或其抗原结合部分或其组合，与药学上可接受的载体配制在一起。用于本文时，“药学上可接受的载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收/再吸收延缓试剂等。优选地，所述载体适合于注射或输注。可以通过许多本领域已知的各种方法施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解，施用路径和/或模式将取决于所需结果而变化。药学上可接受的载体包括用于制备无菌可注射溶液或分散体的灭菌水溶液或分散体和灭菌粉末。这些介质和试剂用于药学上可接受的活性物质的应用为本领域所知。除了水，载体可以是例如等渗的缓冲盐溶液。无论选择何种施用路径，通过为本领域技术人员已知的常规方法，将可以以适合的水合形式和/或本发明的药物组合物形式使用的本发明的化合物配制成可药学上可接受的剂型。对于特定患者、组合物和施用方式，本发明药物组合物的活性成分的实际剂量水平可以变化以获得对特定患者、组合物、和施用模式有效实现理想的治疗反应而不会对患者具有毒性的活性成分的量(有效量)。选定的剂量水平将取决于许多药物动力学因素，其包括所用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用的路径，施用的时间，所用的特定化合物的排泄率，与所用的特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质，待治疗的患者的年龄、性别、体重、疾病状况、一般健康和以前的疾病史等医学领域众所周知的类似因素。本发明包括本发明所述的抗体用于治疗患有Tau病(特别是AD)的患者的用途。本发明还包括通过向患者施用本发明所述的抗体来治疗患有此类疾病的患者的方法。本发明还提供制备药物组合物的方法，该组合物包括本发明所述的抗体以及药学上可接受的载体，提供用于此类方法的本发明所述的抗体的用途。本发明还提供本发明所述的抗体在制备用于治疗患有Tau病(特别是AD)的患者的药剂中的用途，该抗体优选与药学上可接受的载体在一起。本发明还提供本发明所述的抗体在制备用于治疗患有癌症(特别是Tau病，特别是AD)的患者的药剂中的用途，该抗体优选与药学上可接受的载体在一起。提供下述实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，其真正的范围在后附的权利要求中设定。应该理解，在不背离本发明的精神的条件下，可以在描述的方法中进行修改。序列表的描述SEQ ID NO 1 Mab 2. 10. 3 的可变轻链SEQ ID NO 2 Mab 2. 10. 3 的可变重链SEQ ID NO 3 CDRlLSEQ ID NO 4 CDR2LSEQ ID NO 5 CDR3LSEQ ID NO 6 CDRlHSEQ ID NO 7 CDR2HSEQ ID NO 8 CDR3H
SEQIDNO :9磷酸化的Tau片段SEQIDNO :10未磷酸化的 SEQ ID NO 9SEQIDNO 11人κ轻链恒定区SEQIDNO 12人λ轻链恒定区SEQIDNO 13人 Y 1 (同种异型 Glml，17)恒定区SEQIDNO 14人 γ 1(同种异型 Glml7)恒定区SEQIDNO 15人 IgG4 恒定区SEQIDNO 16人 IgG4SPLE_ 突变的恒定区SEQIDNO 17磷酸化的 MCAK 片段(MCAK_ 人(88-102) [95_pkr]SEQIDNO :18引物SEQIDNO: 19引物SEQIDNO:20引物SEQIDNO 21引物SEQIDNO 22Mab 005 的可变重链SEQIDNO:23CDRHlSEQIDNO :24CDRH2SEQIDNO :25CDRH3SEQIDNO :26Mab 005 的可变轻链SEQIDNO:27CDRLlSEQIDNO :28CDRL2SEQIDNO :29CDRL3SEQIDNO :30Mab 019 的可变重链SEQIDNO 31CDRHlSEQIDN0:32CDRH2SEQIDNO :33CDRH3SEQIDNO :34Mab 019 的可变轻链SEQIDN0:35CDRLlSEQIDNO :36CDRL2SEQIDNO :37CDRL3SEQIDNO :38Mab 020 的可变重链SEQIDN0:39CDRHlSEQIDNO :40CDRH2SEQIDNO :41CDRH3SEQIDNO :42Mab 020 的可变轻链SEQIDNO 43CDRLlSEQIDN0:44CDRL2SEQIDNO :45CDRL3SEQIDNO :46Mab 085 的可变重链SEQIDN0:47CDRHl
SEQ ID NO :48 CDRH2SEQ ID NO :49 CDRH3SEQ ID NO :50 Mab 085 的可变轻链SEQ ID NO :51 CDRLlSEQ ID NO :52 CDRL2SEQ ID NO :53 CDRL3SEQ ID NO :54 Mab 086 的可变重链SEQ ID NO :55 CDRHlSEQ ID NO :56 CDRH2SEQ ID NO :57 CDRH3SEQ ID NO :58 Mab 086 的可变轻链SEQ ID NO :59 CDRLlSEQ ID NO :60 CDRL2SEQ ID NO :61 CDRL3SEQ ID NO :62 Mab 097 的可变重链SEQ ID NO :63 CDRHlSEQ ID NO :64 CDRH2SEQ ID NO :65 CDRH3SEQ ID NO :66 Mab 097 的可变轻链SEQ ID NO :67 CDRLlSEQ ID NO :68 CDRL2SEQ ID NO :69 CDRL3SEQ ID NO 70 兔免疫球蛋白恒定区(κ)SEQ ID NO :71 兔免疫球蛋白恒定区(Y)SEQ ID NO :72 小鼠免疫球蛋白恒定区(κ )SEQ ID NO :73 小鼠免疫球蛋白恒定区(Y )附图的描述
图1 在TauPS2APP小鼠模型中ip施用后pS422 IgGl的脑内定位。用多色荧光染色的共聚焦显微照片显示结合的IgGl(A)和pTau(B)与用于细胞核的DAPI (C) —起沉积， 所述染色用缀合Alexa488的针对IgGl的一级抗体和缀合Alexa555的抗pTau抗体AT8进行。合并图片显示在一些PTau阳性细胞中抗IgGl和pTau的共定位染色(D)。图2 在TauPS2APP小鼠模型中IgGl的脑内定位的赋形剂对照。TauPS2APP脑切片的多色荧光染色之后的共聚焦显微照片显示海马结构的CAl区的概况。用缀合Alexa488 的针对IgGl的一级抗体的多色染色是阴性的(A)。缀合Alexa555的抗-pTau抗体AT8显示 PTau沉积(B)。DAPI染色细胞核(C)。合并图片显示于(D)。在注射赋形剂后的TauPS2APP 小鼠中没有观察到可见的抗IgGl免疫荧光。图3 在TauPS2APP小鼠模型中ip施用后IgGl的脑内定位。TauPS2APP脑切片的多色荧光染色之后的共聚焦显微照片显示在额前皮质内的阳性标记的细胞。缀合Alexa488 的针对IgGl的一级抗体和缀合Alexa555的抗p_Tau抗体AT8的多色染色显示结合的IgGl(A)和pTau沉积(B)。合并的图片显示与蓝色的细胞核的DAPI染色一起共定位的抗-IgGl和pTau的核周和树状染色(C)。图4 在TauPS2APP小鼠模型中ip施用后IgGl的脑内定位。TauPS2APP脑切片的多色荧光染色之后的共聚焦显微照片显示在海马的CAl区域的锥体层内的阳性标记的细胞。缀合Alexa488的针对IgGl的一级抗体和缀合Alexa555的抗p_Tau抗体AT8的多色染色显示结合的IgGl (A)和pTau沉积(B)。合并的图片显示与细胞核的DAPI染色一起共定位的抗-IgGl和pTau的核周和树状染色(C)。图5 在TauPS2APP小鼠模型中ip施用后IgGh的脑内定位。TauPS2APP脑切片的多色荧光染色之后的共聚焦显微照片显示在海马的CAl区域的锥体层内的阳性标记的细胞。缀合Alexa488的针对IgGh的一级抗体和缀合Alexa555的抗ρ-Tau抗体AT8的多色染色显示结合的IgGh(A)和pTau沉积(B)。合并的图片显示与细胞核的DAPI染色一起共定位的抗-IgGh和pTau的核周染色(C)。图6 在TauPS2APP小鼠模型中ip施用后IgG2b的脑内定位。TauPS2APP脑切片的多色荧光染色之后的共聚焦显微照片显示在额前皮质区域内的阳性标记的细胞。缀合 Alexa488的针对IgG2b的一级抗体和缀合Alexa555的抗ρ-Tau抗体AT8的多色染色显示结合的IgG2b (A)和pTau沉积(B)。合并的图片显示共定位的抗_IgG2b和pTau的核周染色，通过箭头标示(C)。图7 :TauPS2APP小鼠的分析。A 16月龄TauPS2APP小鼠矢状脑切片的Gallyas 银染色。可见黑色的典型缠结样神经元内结构并且确认了通过免疫荧光显微镜揭示的PTau 阳性神经元。B:16月龄TauPS2APP小鼠免疫金标记的超薄切片。如通过缀合IOnm胶体金的二级抗体所揭示的(箭头)，抗-Tau pS422mAb特异性结合海马CAl区的树状突的原纤维结构。标记的原纤维的大小和密度表明它们可与在阿尔茨海默病的变性神经元中发现的磷酸化的Tau蛋白的配对螺旋丝相比较。图8 抗-Tau pS422抗体对AD脑切片的体外结合。用标示浓度的抗_Tau pS422 单克隆抗体(克隆2. 10. 3，2. 20. 4和5. 6. 11)染色人皮质AD脑切片后的荧光显微照片显示阳性标记的PTau沉积。细胞内pTau沉积，像大的神经原纤维缠结和延伸的神经纤维网线是显著的。图9 与Tau相比抗-Tau pS422抗体对Tau pS422的选择性。使用Tau ( ▲)或 Tau pS422(·)包被的板通过ELISA测量抗-Tau pS422抗体的选择性。作为参照，Tau-选择性抗体4/2显示于顶部左手组图中。图10 体外聚集的Tau是原纤维的。电子显微照片显示负性染色的聚集的Tau。图11 用抗-Tau pS422 兔单克隆抗体 Mab 005(第一行)，Mab 019(第二行)，Mab 020 (第三行)，Mab 085 (第四行)，Mab 086 (第五行)和Mab097 (第六行)染色的人皮质 AD脑切片的荧光显微照片显示阳性标记的pTau沉积和细丝。系列稀释的IgGs显示于每排中，起始于 2. 0 μ g/ml (左)，0· 4 μ g/ml，0· 08 μ g/ml 和 0. 016 μ g/ml。实施例1制备和纯化抗体a)抗体产生小鼠用SEQ ID NO 9 (Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser (PO3H2) -Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp)的Tau片段免疫，该片段对应于Tau的最长人同种型的氨基酸416-430。 为了允许通过硫醇直接偶联至KLH，N端添加半胱氨酸至Tau片段。随后的免疫方案、融合和克隆和筛选抗-TaupS422特异性抗体描述于EP 1 876 185。b)纯化克隆 2. 10. 3,2. 20. 4 和 5. 6. 11无细胞杂交瘤培养上清液Q50-300ml)装载于25ml MEP Hypercell柱(pall Biosciences)上，柱用50mM TrisCl pH8. 0平衡。用平衡缓冲液洗涤后，抗体用30mM柠檬酸钠，IOOmM NaCl pH4. 1洗脱。汇集含抗体的级分，然后在Spectra-Por 6-8000透析管中针对5升IOmM TrisCl pH8. 0在4°C透析过夜。透析过的材料装载于IOml Source 17Q柱 (GE Healthcare)上，柱用IOmM TrisCl pH8.0(缓冲液A)平衡。用缓冲液A洗涤后，抗体用10倍柱体积的梯度0-25%的缓冲液B洗脱。缓冲液B含有IOmM TrisCl, IMNaCl pH8. 0。 抗体以约200mMNaCl洗脱。单个级分的纯度通过SDS-PAGE检查并且汇集最纯的级分。在注射至小鼠中的前一天，每种抗体针对PBS透析并且将抗体浓度调整至3. 2mg/ ml ο实施例2制备Tau，Tau pS422，聚集的 Tau 和聚集的 Tau pS422含有N端(His)6-SUMO融合标签的Tau在大肠杆菌(E. coli)中表达并且通过在HiTrapQ (GE Healthcare,瑞士)上的离子交换层析、随之通过在Ni-NTA Sepharose (Qiagen,瑞士)上的亲和层析纯化。融合标签随后通过用SUMO蛋白酶 (Invitrogen,荷兰)消化裂解，随之通过第二次Ni-NTAkpharose层析步骤去除融合标签。Tau-pSer422通过将Tau与ERK2蛋白激酶一起温育来制备。选择 ERK2 Tau (ca 1 10)的摩尔比通过在 37°C在含有 ImM MgCldP2mM ATP 的 IOmM TrisCl PH8. 0中温育过夜以产生在S422的最大磷酸化。然后推定这代表在422位点的化学计量磷酸化。通过蛋白质印迹使用特异于Tau中的pS422的内部单克隆抗体检查磷酸化。聚集的(原纤维的)Tau通过温育含有50 μ M的花生四烯酸(Sigma，瑞士)的 IOmM TrisCl pH8. 0中终浓度5 μ M的纯化的Tau来制备。温育在37°C进行16h。聚集状态通过在存在10 μ M Thio S时的荧光光谱法(Barghorn和Mandelkow[2002]生物化学 (Biochemistry)41 :14885-14896)和通过电子显微镜(图10)进行检查。如图10所示，聚集的Tau具有原纤维外观。聚集的磷酸化的Tau通过如上所述与ERK2激酶一起温育预-聚集的Tau来制备。实施例3抗-Tau pS422单克隆抗体对在S422磷酸化的Tau是高度选择性的a)肽合成肽合成在自动肽合成仪上使用Fmoc化学进行。在重复循环中，肽序列通过顺次偶联相应的Fmoc-氨基酸组装。在每个偶联步骤中，N端Fmoc-基团通过用N-甲基吡咯烷酮中的20%哌啶处理处理树脂来去除。偶联使用通过DMF中HBTU/HOBt (各lmmol)和 DIPEA(2mmol)活化的Fmoc-保护的氨基酸(Immol)来进行。每个偶联步骤后，未反应的氨基通过用NMP中的乙酸(0. 5M)，DIPEA (0. 125M)和HOBt (0. 015M)混合物处理(IOmin震荡) 来封端。各个步骤之间，树脂用N-甲基吡咯烷酮和DMF洗涤。空间阻碍氨基酸的并入通过自动双偶联完成。为此目的，树脂用Immol活化的结构单元处理两次，在偶联循环之间不进
19行封端步骤。在磷酸化肽序列中相应的丝氨酸衍生物作为Fmoc-Ser (PO (OBzl) OH) -OH结构单元并入。完成靶序列时，使用标准氨基酸偶联条件将Fmoc-Glu (生物素基-PEG)-0H(经 PEG-间隔臂附着的生物素)偶联至MCAK肽，而丙氨酸(U)和Ιχε-赖氨酸使用标准条件附着至磷酸-Tau序列。随后，Dffl1r-生物素缀合至磷酸-Tau肽，产生生物素化的靶序列。在最后Fmoc去保护(仅对MCAK)之后，所有肽树脂单独放置于过滤器玻璃料中并用三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(19mL 0. 5mL 0. 5mL)的混合物处理2. 5h。过滤裂解溶液并且通过添加冷的(0°C ) 二异丙醚(300mL)沉淀肽以提供无色固体，其用二异丙醚重复洗涤。粗制品重溶解于乙酸/水混合物中，冻干并且随后通过制备级反相HPLC使用含有 0. 1% TFA的乙腈/水梯度纯化。HBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲六氟磷酸酯HOBt 羟基苯并三唑DIPEA :N，N-二异丙基乙胺NMP N-甲基_2_吡咯烷酮b)用磷酸化的Tau肽的测定合成并生物素化代表Tau pS422序列416-430 (磷酸化的和未磷酸化的)和MCAK_ 人(88-10 [95-pSer]的肽以允许包被至链霉抗生物素蛋白标记的微量滴定板。为了测试 Tau磷酸肽对测定板的最大结合，范围在lng/ml至2000ng/ml的不同浓度的Tau磷酸肽， 用于包被。最后50ng/ml Tau磷酸肽用于在室温包被60min。抗Tau pS422抗体2. 10.3.， 2. 20. 4.和5. 6. 11以至多lOOOng/ml的浓度在肽标记的微量滴定板中温育60min。洗涤后， 抗体的结合使用抗小鼠-IgG Fc抗体(其是POD标记的)来检测。与ABTS 在室温温育 20min后，测量在405nm-492nm的吸光度(0. D.)。抗体结合通过EC5tl确定。可以确定的典型的 EC5tl 值范围对于 2. 10. 3.是 100ng/ml，对于 2. 20. 4.是 8ng/ml，和对于 5. 6. 11.是 Ing/ ml。未磷酸化的Tau片段和(MCAK_A (88-102) [95-pSer])用作对照。不能观察到对照肽的结合。典型的背景值是大约30mE (表1)，其是用磷酸化的Tau片段测量的最大值的大约 1%。因此，相比于 SEQ ID NO 10 的未磷酸化的 Tau肽和 MCAK_A (88-102) [95-pSer] ,Mab 2. 10. 3以至少100倍的选择性结合磷酸化的Tau片段。结果显示于表1。表1
抗体 Max. O.D.磷酸MaxO.D.关系(O.D.磷酸O.D.磷酸化的
化的Tau片段结Tau片段化的Tau片段MCAK片段合结合 /O.D. Tau片段)
2.10.3. 3300 mE30 mE 11030 mEc)用全长Tau和Tau pS422的测定测定使用Meso Scale Discovery 测定平台(MSD，Gaithersburg，Maryland， USAMD)进行。MSD 96-孔微量滴定板用PBS缓冲液中浓度为2 μ g/ml的Tau或Tau pS422 在室温包被Ih。然后通过添加含有5% BSA和Tween 20的PBS封闭Ih。抗体用含有 0. 1% BSA 和 0. l%Tween 20 的低交叉缓冲液(Low Cross Buffer, MSD)以浓度 30pg/ml 至20ng/ml (除了克隆2. 10. 3，其浓度范围是3ng/ml至250ng/ml)进行稀释并且添加至包被的封闭的板并且在室温温育3小时。然后用含有Tween的PBS缓冲液洗涤板三次。 为了检测结合的抗体，添加浓度0. 5 μ g/ml的具有SULFO标签的抗小鼠IgG(MSD)，并且在室温温育板1小时。添加读数缓冲液(MSD)后，板在MSD Sector Imager 6000板读数器中读数。图9显示使用Tau或Tau pS422作为抗-Tau pS422单克隆抗体(克隆5. 6. 11，2. 20. 4 和2. 10. 3)的结合配偶体获得的数据。Tau pS422抗体相对于识别Tau和Tau pS422两者的抗-Tau抗体(克隆4/ 进行比较。通过比较对Tau pS422和Tau的结合，发现对Tau 的结合的信号不能从背景中区分，因此没有检测到对Tau的结合。因此，据计算三种抗-Tau PS422抗体中的每种以相比于Tau的至少10，000-倍的选择性结合Tau pS422。实施例4抗-Tau pS422抗体结合Tau pS422的原纤维聚集体Biacore 分析用于测量抗-Tau pS422(克隆2. 10. 3)对聚集的原纤维的Tau PS422制品的结合。磷酸化的原纤维被认为体外代表存在于阿尔茨海默病脑的Tau的PHF 形式。如实施例2中的描述制备和磷酸化原纤维材料。在传感器芯片上固定聚集的Tau pS422通过胺偶联固定于CM5-传感器芯片上。为了该目的，聚集的 Tau pS422在IOmM乙酸钠pH 5.0中稀释19倍。活化的传感器表面与蛋白溶液接触直至期望水平的蛋白固定于芯片上。然后剩余的反应性N-羟基琥珀酰亚胺-酯通过注射IM乙醇 KpH 8.0封闭。固定450反应单位(RU)的蛋白质以便表征抗-Tau pS422 (克隆2. 10. 3) 的结合性质。固定测定在RT进行并且用PBS用作运行缓冲液。动力学滴定为表征抗体，运行缓冲液改变为IOmM Tris-Cl pH 8. 0,250mM NaCl，并且制备浓度系列的抗体5种不同浓度，稀释因子2，最大浓度200nM。不同抗体溶液以最低浓度开始连续注射。在所谓的动力学滴定后用IOOmM H3PO4再生传感器表面。测量进行三次。数据评价使用Biaeval软件进行。参数计算基于以下假定抗体聚集的Tau pS422 的结合是完全单价的。表征抗体对固定蛋白的结合行为的动力学和热动力学参数显示于表 2。表2 KdkdKaRmaxnMS-1MxsRU17. 0IxlO-2 6. 2xl05 208因此抗-Tau pS422 (克隆2. 10. 3)以17nM的Kd结合原纤维的磷酸Tau。实施例5抗-Tau pS422单克隆抗体对来自阿尔茨海默病患者脑切片中细胞内pTau的体外
纟口口。在阿尔茨海默病脑组织中特异性和灵敏性免疫装饰(immunodecoration)病理学相关pTau病理学通过免疫组织化学染色实验使用来自AD患者人脑组织的低温切片 (cryosections)进行研究。使用来自神经病理学分期为Braak VI的AD患者的冰冻死后脑组织进行评估。脑组织进行低温切片并免疫组织化学处理，不用任何化学剂即乙醛固定。 PTau沉积的检测使用荧光标记的特异于小鼠IgG的二级抗体进行并且通过荧光光学显微镜进行监测。简言之，来自阿尔茨海默病阳性诊断的患者死后获得的皮质脑区域的未固定的低温恒温切片通过间接免疫荧光标记。在本报告中显示了来自AD患者(病例01-05;内部脑库)的眼眶额回组织获得的图片。使用连续的两步温育来检测来自不同克隆的结合的鼠抗体，其通过亲和-纯化的缀合至Cy3的山羊抗-小鼠IgG (H+L) (Jackson Immuno Research) 显示。切片、染色和荧光显微镜检查根据标准程序进行。pTau病理学的特异性和灵敏性染色对于克隆2. 10. 3,2. 20. 4和5. 6. 11是明显的 (图8)。所有类型的pTau沉积，即神经原纤维缠结、神经纤维网线和营养不良的轴突的一致染色是清晰可见的。对于所有研究的克隆，最小有效浓度0. 05μ g/ml被确定，其表明对真正人pTau沉积的高度灵敏的结合。pTau沉积的检测也可通过使用本发明所述的IgG4抗体和特异于人IgG4的荧光标记二级抗体来进行并且通过荧光光学显微镜监测。实施例6产生TauPS2APP三重转基因小鼠转基因TauPS2APP小鼠通过将来自于品系B6. 172H(Ozmen, L.等，神经变性疾病 (Neurodegen. Dis.) 6 (2009) 29-36)的纯合 PS2APP 雌性与来自于品系 TauP301L (Goetz 等， 科学(Science) 293 0001) 1491-1495)的纯合Tau雄性杂交而产生。产生的转基因小鼠对于人APP Swedish突变，人Presenilin 2 N141I突变和人Tau P301L突变均是杂合的。转基因的表达在人APP和Tau转基因的情况中通过鼠Thy-I启动子驱动，在人I^resenilin 2 转基因的情况中通过朊病毒(prion)启动子驱动。动物以12小时光暗周期圈养并无限制地提供食物和水。圈养条件经过实验动物护理评审委员会(Accreditation of Laboratory Animal Care)认可。所有程序严格遵守瑞士联邦动物保护条例和实验动物评估和评审协会的规章并且经过当地兽医机构的明确批准。小鼠免疫组织化学分析的处理小鼠使用4%异氟烷麻醉并通过斩首处死。血液收集在EDTANaF包被的管(Milian)中。取出脑，立即在干冰上冰冻并且储存在_80°C直至
进一步使用。20月龄的雄性和雌性小鼠用于实验中。在该年龄，在迄今测试的来自所有小鼠的脑中增强的细胞内超磷酸化的Tau积累和神经原纤维病理学是明显的。实施例7TauPS2APP小鼠模型中pTau沉积的组织和超微结构分析TauPS2APP小鼠发生神经元内pTau沉积的年龄依赖性和进行性表型，该沉积具有类似于在数个脑区域中可检测的神经原纤维缠结的结构。在M月龄观察到大量的PTau病理学。典型地在额前皮质和海马CAl区和下脚(subiculum)附近的锥体细胞层内发现数个细胞内Tau PS422阳性的神经元。发现在这一年龄pTau扩展到起层并且沿着海马白质边界进入CA3和伞区并且也进入纹(stria)。Gallyas 银染色如描述(Gallyas, F. , Acta Morphologica Acad. Sci. Hung. 19(1971)1-8)进行，具有小的改进，即在3%的高碘酸中预温育并且在0. 5%的乙酸洗涤后另外在5%硫代硫酸钠中洗涤2分钟。复染法用标准的苏木素和伊红进行。Gallyas
22银染色确认在TauPS2APP小鼠的海马和皮质中存在许多缠结样沉积(图7A)。pTau沉积的超微结构通过免疫电子显微镜研究。16月龄的TauPS2APP小鼠用 PBS中的2%甲醛和0. 5%戊二醛灌注。脑薄片包埋入Lowicryl HM20中并且如以前的描述(Richards, J. G.等，神经科学杂志(J. Neurosci.) 23 (2003) 8989-9003)制备超薄切片。 简言之，切片与具有2% BSA的PBS中10 μ g/ml的抗-Tau pS422温育1小时。在PBS/2% BSA中6次洗涤后，切片与缀合至IOnm金的二级山羊抗-小鼠IgG(Amersham，Arlington Heights，IL)以 1 20与？85/2%85六/0.1%1^^61^20温育1小时并且用2%85六的卩83 溶液洗涤。对于对照，我们使用正常小鼠血清处理的切片，其在IOym2的面积中产生可忽略的低于10个金颗粒的背景。电子显微照片用JE0L1210在IOOkV采集。对16月龄的TauPS2APP小鼠具有许多pTau阳性神经元的海马超微结构检查揭示了对于树状突中配对螺旋丝(PHF)典型的免疫金标记的原纤维沉积(图7B)。用抗-Tau PS422 mAb标记的超薄切片揭示了对海马CAl区中树状突内的原纤维结构的特异性结合， 如通过缀合IOnm胶体金的二级抗体所揭示的，其作为黑点可见(图7B)。免疫金标记证明 Tau的pS422表位定位于所研究的TauPS2APP小鼠的神经元中的细胞内原纤维结构。标记原纤维的尺寸和密度表明它们在结构上可与AD患者变性神经元中观察到的PHFs相比较。 pTau PHF的定位清楚地证明转基因TauPS2APP小鼠中聚集的pTau沉积的细胞内分布。实施例8通过免疫组织化学和共聚焦激光扫描显微镜揭示的抗-Tau pS422单克隆抗体对阿尔茨海默病PTau小鼠模型脑中细胞内pTau的体内结合选择的抗-Tau pS422抗体(表1)在M月龄的TauPS2APP三重转基因小鼠中测试，并且评估对于体内PTau沉积的结合。研究在TauPS2APP小鼠模型中进行，该模型发生具有神经元内PTau沉积的年龄依赖性和进行性表型，该沉积包括类似于在数个脑区域中可检测的神经原纤维缠结(如实施例4中所述)的结构。所用的针对Tau pS422的抗体以20mg/kg的剂量i. p.施用。ip施用后两天进行免疫组织化学染色以检测PTau沉积和结合的小鼠IgG亚型抗体。给药后两天杀死每三只小鼠的组。小鼠被深麻醉(在5% v/v i^orene 中 2分钟，直至几乎达到窒息状态)，然后开胸并去除心包，并且用PBS灌注且斩首，将脑分成两半，迅速冰冻在干冰中。新鲜冰冻脑的矢状低温恒温切片用低温恒温切片机(CM3050S，Leica)切成20 μ m厚度，封固于预冷的 Histobond 载玻片(Marienfeld，Lauda-K0nigshofen,德国)上并且保存于 _20°C。应用三重免疫荧光染色以检测结合的抗-Tau pS422抗体。切片在PBS中水合并用预冷至_20°C的100%丙酮处理2分钟。所有进一步的步骤在染色自动装置(Autostainer Plus DakoCytomation, High Wycombe, UK)在室温顺次进行。带有脑切片的载玻片用含有 0.01% Tween 20的PBS，pH 7. 4洗涤5分钟，并且通过在含有1 %牛血清白蛋白，1 %卵白蛋白和1 %正常山羊血清的PBS中顺次温育20分钟封闭非特异性结合位点。用PBS和0. 01 % Tween 20洗涤后，载玻片与20ug/ml的IgG同种型特异性检测抗体一起在1 % BSA的PBS PH 7. 4溶液中温育1小时，所述抗体即亲和纯化的山羊抗小鼠IgGl，IgG2a或IgG2b，其共价缀合至 Alexa Fluor 488 染料(A21121，A21131 或 A21141，Molecular Probes)。在用含0. 01 % Tween 20的PBS洗涤后，pTau的定位如下评估通过用5ug/ml的抗pTau抗体 (AT-8, Pierce Biotechnology)标记，该抗体是针对Tau蛋白中磷酸化的S202/205表位的鼠单克隆抗体，其共价缀合至Alexa Fluor 555染料并应用于含有牛血清白蛋白， 卵白蛋白和正常山羊血清的PBS中1小时。用含0.01% Tween 20的PBS洗涤后，细胞核在lug/ml的4，6' - 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的PBS溶液中复染5分钟。在含有 0. 01%Tween 20的PBS中洗涤后，脂褐质的自发荧光经过在4mM CuS04于50mM乙酸铵pH 5中温育30分钟通过淬灭来降低。用双蒸水淋洗载玻片和用PBS和0. 01%Tween 20最后洗涤后，载玻片用荧光封固剂(S3023 DakoCytomation, High Wycombe, UK)包埋。最大投影图片在非重叠发射通道顺次记录，记录用Leica SP2，A0BS共聚焦激光扫描显微镜在1 艾里(Airy)的针孔设置下进行。在对月龄的TauPS2APP小鼠中注意到大量pTau病理学。典型地，对于细胞内 Tau pS422强阳性的数个神经元发现处于额前皮质和海马CAl区和邻近下脚的锥体细胞层。在这一年龄，发现PTau扩展到起层并且沿着海马槽边界进入CA3和伞区并且也进入终纹(stria terminalis)。来自M月龄的TauPS2APP小鼠额前皮质和海马结构的CAl区的免疫染色显示于共聚焦显微镜图片(图1-6)中。清楚地，细胞内pTau和施用的IgG亚型抗体是可检测的， 并且发现共定位于具有大量PTau病理学的脑区域中的细胞。细胞内IgGl定位的代表性实例显示于图1，3和4中，有赋形剂对照(图2)。IgGh阳性细胞(图5)和IgG2b(图6)也在一些细胞中发现。一些pTau阳性细胞显示典型的神经原纤维形态学，其提示在来自AD的患者脑组织的变性神经元中发现的神经原纤维缠结。小鼠IgG亚型抗体(特别是对于IgGl 和pTau的)共定位的免疫反应性在树状突中观察到，典型地在额前皮质和海马结构的CAl 区的颗粒细胞层(图3和4)。所有测试的抗-Tau pS422抗体显示对细胞内pTau沉积的特异性结合。然而，结合的程度在三种IgG同种型之间不同，如表3中所示。表 3
抗体 IgG同种型在rTauPSZAPP小鼠脑中的染色强度
Tau—2.10.3 IgGlXXX
Tau—2.20.4 IgG2aX
Tau—5.6.11 IgG2bX其中X =轻度，XX =中度，和XXX =强IHC反应性实施例9在阿尔茨海默病小鼠模型中用抗-Tau pS422单克隆抗体慢性治疗减少Tau病理学鼠抗-Tau pS422Mab在阿尔茨海默病小鼠模型中减少Tau病理学的能力通过在4 个月的期间施用所述抗体至Tau. PS2APP三重转基因小鼠来测试。因此，一组7月龄的20 只Tau. PS2APP三转基重因小鼠通过每周一次ip施用鼠抗-Tau pS422Mab (克隆2. 10. 3) 处理。抗体以赋形剂(20mM组氨酸，140mM NaCl pH6. 0)中ang/ml的浓度施用至给予终剂量20mg/kg。第二组20只三重转基因小鼠接受等同体积的赋形剂。4个月后杀死所有小鼠2并如实施例5中所述取出脑。然后每个脑分成两个半球，其中一个制备用于如实施例5所述的免疫组织化学分析。第二个半球用于通过下述的免疫测定来定量PTau水平。1.提取小鼠脑用于Tau和pTau测定称重脑并用玻璃勻浆器在10体积的含有25mM TrisCl,800mM NaCl，10%蔗糖 pH7. 5的冰冷缓冲液中勻浆。然后勻浆在20，OOOx g离心。产生的上清液用PBS/1 % BSA/1 % Tween 20以1 100 (对于Tau测定)或1 10 (对于pTau测定)稀释。2. Tau 和 pTau 测定所有测定使用 Meso Scale Discovery 测定平台(MSD, Gaithersburg, Maryland, USAMD)进行。捕获和检测抗体根据MSD提供的标准方案分别用生物素和SULFO-Tag 标记。 在测定中使用下述抗体(i)5A6，针对Tau中氨基酸19-46的鼠抗体，如Johnson，G. V.等， 神经化学杂志(J. Neurochem) 68 (1997) 430-433 中所述；(ii) AT180，针对 Tau 中 pT231 检测的鼠抗体[Innogenetics, Belgium] ； (iii)如 EP1876185A1 中描述的鼠抗-Tau pS422 克隆 2. 5. 2 ； (iv)针对全长Tau产生的鼠抗-Tau克隆4/53。抗体5A6用作捕获抗体，其余抗体用作检测抗体。链霉抗生物素蛋白包被的96孔MSD板在RT用5% BSA封闭1小时。用洗涤缓冲液 (PBS,0. 05%Tween 20)洗涤板三次。然后添加在测定缓冲液(PBS/1% BSA/Tween 20)中稀释的捕获抗体，在4°C温育板30分钟。随后洗涤板一次。接着，向每个孔添加75 μ 1 的测定缓冲液，随之添加25 μ 1稀释的脑上清液和25 μ 1具有硫标签(Sulfo-tagged)的检测抗体。板在4°C振荡1小时然后洗涤一次。最后，添加170μ1的MSD读数缓冲液并且在 MSD Sector Imager 6000上对板进行读数。为了允许定量小鼠脑提取物中的Tau和Tau pS422，使用实施例2所述制备的Tau 和Tau pS422构建标准曲线。与相同年龄的赋形剂处理的小鼠相比，在抗体处理的11月龄的小鼠中观察到典型的Tau病理学减少，证明了通过用抗-Tau pS422单克隆抗体慢性处理降低Tau. PS2APP 三重转基因小鼠中的Tau病理学。这种减少表现为减少的神经原纤维缠结负荷(如通过免疫组织化学检测的)和减少脑提取物中存在的各种PTau种类的水平(如通过定量免疫测定测量的)。实施例10制备和纯化兔抗体a)免疫5ft gg/K^H^W] (Charles River Laboratories International, Inc.)的NZW兔用于免疫。偶联在KLH上的磷酸肽TaiK416-430) [pS422]以浓度为lmg/ml 溶解于K3PO4缓冲液pH 7，0并且与完全弗氏佐剂(CFA) (1 1)混合直至产生稳定乳剂。三只兔接收真皮内(i.d.)注射2ml的乳剂，随之为第二次肌内(i.m.)和第三次皮下(s. c)注射，每次用Iml以一周的间隔注射。两周后进行第四次i.m.注射lml，随之为以四周的间隔进行两次进一步的s. c注射lml。在第三、四、五、六次注射后4-6天收集每只动物的IOml 外周全血细胞样品，并用于FACS中的单细胞分选。在相同时间收集每只动物的另外0，5ml 血清并且用于确定TaiK416-463) [pS422]特异性抗体应答。b)抗体应答
对免疫的抗体应答使用ELISA通过连续稀释的血清来确定，其中30ng/孔的生物素化的TaiK416-430) [pS422]在Ix PBS中在4°C于链霉抗生物素蛋白预包被的96孔微量滴定板(MC1347，Micro Coat Biotechnologie GmbH，Bernried，德国)上温育过夜。对于检测，连接至辣根过氧化物酶(The Jackson laboratory)的山羊抗兔IgG以1 16000稀释使用。来自罗氏诊断(RocheDiagnostics GmbH)的随时可用的BM Blue POD Substrat (起沉淀四甲基联苯胺(TMB)的作用)用于显示。通过IN HCl终止反应并且在Tecan Infinite 通过450/690nm测量。c) B-细胞克隆板的包被无菌链霉抗生物素蛋白包被的6孔板(细胞培养级)与3个生物素化的对照肽(未磷酸化的 TaiK416-430)，MCAK_ 人(88-102) [95-pSer]和 MAP2_ 人(1802-1816) [pSer-1802])的混合物或与生物素化的磷酸肽TaiK416_430) [pS422] 一起温育，每种以 PBS中0.5-1 μ g/ml的浓度在室温温育1小时。使用前以无菌PBS洗涤板三次。细胞培养 6孔板以碳酸盐缓冲液(0，IM碳酸氢钠，34mM碳酸氢二钠(Disodiumhydrogencarbonate)， pH9. 5 中2 μ g/ml KLH(匙孔血蓝蛋白)在4°C包被过夜。使用前在无菌PBS中洗涤板三次。分离兔外周血单核细胞(PBMC)在进行分离兔PBMC的淋巴细胞分离哺乳动物(lympholyte mammal) (Cedarlane Laboratories)上密度离心之前，含EDTA的全血用IxPBS稀释两倍。用抗体染色之前洗涤 PBMCs两次。EL-4 B5 培养基RPMI 1640 (Pan Biootech，Aidenbach，德国)，补充 10% FCS(Hyclone，Logan，UT， USA)，2mM 谷氨酰胺(Glutamin)，1 % 青霉素 / 链霉素溶液(PAA，Pasching, Austria)，2mM 丙酮酸钠，IOmM HEPES (PAN Biotech, Aidenbach，德国)和 0，05mM β-巯基乙醇(Gibco， I^aisley，苏格兰)。巨噬细胞/单核细胞的清除无菌6孔板(细胞培养级)用于通过非特异性粘附清除巨噬细胞和单核细胞。孔用KLH(匙孔血蓝蛋白)或用链霉抗生物素蛋白和对照肽包被。每个孔填充最大^il培养基和至多6xl06个来自免疫的兔的外周血单核细胞，并且允许在恒温箱中37°C结合1小时。 上清液中50%的细胞用于淘选(panning)步骤；剩余的50%的细胞直接进行免疫荧光染色和单细胞分选。在肽上淘选B细胞用链霉抗生物素蛋白和生物素化的肽Tau (416-430) [pS422]包被的6孔组织培养板接种至多6xl06细胞/細1培养基并且允许在恒温箱中在37°C结合1小时。未粘附的细胞通过用IxPBS小心地洗涤孔1-2次去除。剩余的粘着细胞通过胰蛋白酶在恒温箱中在 370C 10分钟进行解离，然后在培养基中洗涤两次。细胞保持在冰上直至进行免疫荧光染色。免疫荧光染色和单细胞分选用于单细胞分选的抗兔IgG FITC 来自 AbD Serotec (STAR121F，Diisseldorf，德国)。对于表面染色，来自清除和淘选步骤的细胞与PBS中抗兔IgG FITC抗体在冷室内于暗中在4°C滚动温育30分钟。离心后，上清液通过抽吸去除。PBMCs用冰冷PBS进行2个循环的离心和洗涤。最后，PBMCs在冰冷PBS中重悬浮并且立即进行FACS分析。在FACS分析前添加5 μ g/ml浓度的碘化丙啶(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)以便分辨死亡细胞和活细胞。FACS 使用带有 FACSDiva 软件的 BectonDickinson FACSAria (BD Biosciences, USA)进行，单个、FITC-标记的活细胞沉积于96孔板中。B细胞培养B细胞培养通过类似于Zubler，R.H.等，免疫学杂志(J Immunol.) 134 (1985) 3662-3668.所述的方法制备。简言之，单个分选的B细胞在96孔板中培养，用 210 μ 1/ 孔 EL-4 Β5 培养基和 Pansorbin 细胞(1 20000) (Calbiochem(Merck)， Darmstadt，德国)，5%兔胸腺细胞上清液和Y-照射的EL-4-B5鼠胸腺瘤细胞QXlO4/ 孔)于恒温箱中在5% CO2的气氛中37°C培养7天。为了筛选去除B细胞培养上清液，立即收获细胞用于可变区基因克隆或在ΙΟΟμ 1 RLT缓冲液Oliagen，Hilden，德国)中冰冻于-80°C。d) B-细胞克隆筛选通过ELISA筛选B细胞培养上清液对生物素化的Tau (416-430) [pS422]的结合。 非磷酸化的TaiK416-430)，KLH(匙孔血蓝蛋白)和不相关的磷酸肽MCAK_人(88-102) [95-pSer]用作对照抗原。对于ELISA板的制备，链霉抗生物素蛋白预包被的微量滴定板与 50ng/ml的生物素化的TaiK415_430) [pS422]在室温温育1小时。KLH或对照肽的包被在 1 μ g/ml进行。B细胞上清液以1 5至1 10稀释并且与抗原包被的板温育60分钟。强烈洗涤后，兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。 与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。与生物素化的Tau (416-430) [pS422] 但是不与KLH和MCAK_A (88-102) [95-pSer]产生高于背景信号的B细胞克隆被进一步考虑，并且进行可变区基因克隆。e) PCR扩增V结构域和测序总RNA 使用NucleoSpin 8/96RNA 试剂盒(Macherey&Nagel ；740709. 4，740698) 根据制造商的方案制备。所有步骤在印Motion 5075液体处理系统(Eppendorf)上进行。 RNA用60 μ 1无RNase水洗脱。6 μ 1的RNA用于通过逆转录酶反应使用Superscript III 第一链合成超混合物(Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix, Invitrogen 18080-400)和寡聚dT引物根据制造商的说明产生cDNA。4μ 1的cDNA用于扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH 和 VL)，使用 AccuPrime Supermix (Invitrogenl2344-040)，终体积50 μ 1，使用引物rbHCfinal. up和rbHCfinal. do用于重链和使用引物rbLCfinal. up禾口 rbLCfinal. do 用于轻链(表 4)。PCR 条件如下热启动于 94°C 5min ；94°C，20s，70°C，20s， 68°C，45s，35个循环；最终延伸在68°C进行7min。表4 rbHCfinal.up AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTC
rbHCfinal.do CCATTGGTGAGGGTGCCCGAG
rbLCfinal.up AAGCTTGCCACCATGGACAYGAGGGCCCCCACTC
rbLCfinal.do CAGAGTRCTGCTGAGGTTGTAGGTAC50 μ 1 PCR溶液的 8μ 1 装载于 48E-Gel 2% (Invitrogen G8008-02)上。阳性
PCR 反应使用NucleoSpin Extract II 试剂盒(Macherey&Nagel ；740609250)根据制造商
的方案清洁并且洗脱在50μ 1洗脱缓冲液中。12μ 1的纯化的PCR产物在两个方向上使用 rbHCfinal. up 和 rbHCfinal. do 用于重链和 rbLCfinal. up 和 rbLCfinal. do 用于轻链(表 4)进行直接测序。d)重组表达兔单克隆抗体和兔/小鼠嵌合抗体为了重组表达兔单克隆抗体，编码VH或VL的PCR产物作为cDNA通过悬突克隆方法(Haun, R. S.等，生物技术(Biotechniques) 13 (1992) 515-518 ;Li，Μ. Z.，等，自然方法 (Nature Methods) 4 (2007) 251-256)克隆至表达载体中。编码兔κ或γ恒定区的线性化表达质粒和VL或VH插入物通过PCR使用重叠引物扩增。纯化的PCR产物与产生单链悬突的T4DNA聚合酶温育。反应通过添加dCTP终止。下一步，质粒和插入物组合并且与诱导位点特异性重组的recA温育。重组质粒转化入大肠杆菌中。次日，挑选生长的克隆并且通过质粒制备、限制性分析和DNA测序测试正确重组的质粒。对于抗体表达，分离的HC和LC质粒瞬时共转染至HEK293细胞中，1周后收获上清液。为了克隆和表达兔小鼠嵌合抗体，VH 和VL区通过PCR扩增并且亚克隆至含有小鼠恒定κ区或小鼠恒定Yl区的表达载体中。 兔/小鼠嵌合HC和LC质粒被分离，通过限制性分析和DNA测序检测正确的插入，并且瞬时共转染至HEK293细胞中。转染后一周收集上清液。e)抗体纯化在MabklectSuRe 柱(GE Healthcare)上从细胞培养上清液中纯化重组表达的兔抗体。样品装载前，柱用25mmol/L Tris-HCl，25mmol/L NaCl，pH 7. 4平衡。抗体洗脱用50mmol/L乙酸盐pH 3. 14完成。洗脱的样品立即装载于脱盐柱(S印hadex G25，GE Healthcare)并且在 20mmol/L His-HCl, 140mmol/L NaCl pH 6. 0 中洗脱。这种缓冲液也用于储存纯化的抗体。在纯化过程中一般存储温度是4°C，室温，在分装后为_80°C。来自细胞培养上清液的重组表达的兔/小鼠嵌合抗体在MabklectSuRe 柱(GE Healthcare) 上纯化。样品装载前，柱用Ix PBS，pH 7. 4平衡。抗体洗脱用lOOmmol/L柠檬酸盐pH 3.0 完成。洗脱的样品立即用2mol/L Tris/HCl pH9.0中和。然后，抗体装载于尺寸排阻柱 (Superdex 200,GE Healthcare)上并且在 20mmol/L His-HCl, 140mmol/L NaCl pH 6· 0 中洗脱。这种缓冲液也用于储存纯化的抗体。在纯化过程中一般存储温度是4°C，室温，在分装后为-80°C。实施例11抗-Tau pS422单克隆兔抗体对在pS422磷酸化的Tau是高度选择性的并且结合 Tau pS422的原纤维聚集体a) ELISA兔单克隆抗体在HEK 293细胞中重组表达。通过ELISA测试细胞培养上清液或纯
28化的兔抗体对生物素化的TaiK416-430) [pS422]，非磷酸化的TaiK416_430)，KLH(匙孔血蓝蛋白)和不相关的磷酸肽MCAK_A (88-102) [95-pSer]结合。为了制备ELISA板，链霉抗生物素蛋白预包被的微量滴定板与50ng/ml的生物素化的TaiK415_430) [pS422]在室温温育1小时。用KLH或对照肽的包被在1 μ g/ml进行。不同浓度的兔抗Tau pS422抗体 (Abeam AB51071)或含有兔抗体的上清液在抗原标记的微量滴定板中温育60分钟。强烈洗涤后，兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与 TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。抗体结合通过其EC50值表征。抗体结合生物素化的TaiK416-430) [pS422]和非磷酸化的TaiK416_430)肽通过其EC50值表征。 与KLH或MCAK磷酸肽的交叉反应性在高浓度(即细胞培养上清液的1 5稀释)通过单点测量来估计。结果显示于表5。发现结合Tau磷酸肽的EC50值比结合Tau肽的EC50值低超过100倍，表明与非磷酸化的Tau肽相比较，对磷酸化的Tau片段至少100倍的选择性。 对于所有抗体结合KLH和MCAK对照磷酸肽在背景水平，其是用Tau磷酸肽测量的最大值的约 1 < 3%。表5
1:5稀释的上清液的OD
EC50磷酸EC50非磷酸上清液的IgG滴度KLH MCAK 化的 Tau 肽化的 Tau 肽(pg/ml)(mE) (mE)
g/ml) g/ml)
Mab 005<0.0033.7275.8180.0260.067
Mab 019<0.0031.0766.9580.0260.023
Mab 0200.002>3.3693.3690.0160.010
Mab 0850.00090.1466.460.0290.062
Mab 0860.00110.2668.840.0460.104
Mab 097 0.0013 1.28119.870.042 0.029 也测试了对可溶性和全长Tau pS422的特异性。Tau pS422的原纤维聚集体 (300 μ g/ml)在RT过夜包被于基于聚苯乙烯的MaxiSorb微量滴定板(Nunc)。以类似的方式，可溶性全长Tau和Tau pS422包被于MaxiSorb微量滴定板。添加兔抗Tau pS422抗体对照(Abeam AB51071)或纯化的兔抗体并且以至多lOOOng/ml的浓度温育60分钟。强烈洗涤后，对兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。 与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。抗体结合通过其EC50值表征。结果显示于表6.表6 兔 Mab EC50 Tau pS422 EC50 Tau 蛋白质 EC50 原纤维的蛋白质TaupS422
g/ml)
Mab 005 0.00034无结合0.00755
Mab 019 0.00038无结合0.00059
Mab 020 0.00036无结合0.00042
Mab 085 0.00025无结合0.00074
Mab 086 0.00023无结合0.00048
Mab 097 0.00040无结合0.01358兔单克隆抗体以低于lng/ml的EC50值结合Tau-pS422蛋白。检测的原纤维的Tau PS422的EC50值范围为0. 4ng/ml至14ng/ml。结合非磷酸化的全长Tau蛋白的信号与背景水平不可区分。因此，估计相比于Tau，每种抗体以至少100倍的选择性结合Tau pS422 和原纤维的Tau pS422。b)Biacore 通过BIAcore 分析进一步研究和确认对原纤维的Tau pS422聚集体的结合。测量使用BIAcore 3000仪器在37°C实施。系统和样品缓冲液是HBS-EP (IOmM HEPES, 150mM NaCl, 3. 4mM EDTA，0. 005%聚山梨酯20 (ν/ν))。BIAcore CM5传感器芯片进行预处理程序。对于流动池 FC1，FC2, FC3 和 FC4 相继注射 0. 1% SDS,50mM NaOH, IOmM HCl 和 IOOmM H3PO4 30seco使用BIAcore 3000 wizard v. 4. 1根据制造商说明书进行胺偶联程序。在 EDC/NHS活化传感器表面后，非-磷酸选择性的抗-Tau抗体mAb<TAU>M-4/53-IgG固定在传感器流动池FC2，FC3和FC4上。作为对照，针对CK-MM(肌酸激酶同种型)的抗体，其识别不相关抗原，被捕获于FCl。mAb<TAU>M-4/53-IgG和针对CK-MM的抗体以30 μ g/ml稀释在 IOmM NaAc pH 5. 0中，并且以10 μ 1/min注射7min接触时间以固定10. 000RU的抗体捕获系统。表面通过IM乙醇胺去活化。传感器通过5个循环的用磷酸化的丝状Tau蛋白(原液0. ;3mg/ml，在HBS-EP中1 100稀释)作为溶液中的分析物以10 μ 1/min进行^iiin来适应。再生用IOmM甘氨酸pH 2. 5以30 μ 1/min进行!Bmin。推定结合mAb 4/53的分析物不解离pTau丝，因为没有观察到pTau丝从mAb 4/53的解离。对于所有进一步的测量循环， 0. 3mg/ml pTau丝在HBS-EP缓冲液中稀释1 100并且以10 μ 1/min注射lmin,以便以异质夹心方式(heterogeneous sandwich-mode)将pTau呈递给相应抗体分析物。抗体分析物在HBS-EP缓冲液中稀释至浓度IOOnM并且以20 μ 1/min注射!Bmin至系统中。！Min解离后，通过以100 μ 1/min 2次注射IOmM甘氨酸pH 2. 5Imin随之以100 μ 1/min HBS洗涤 Msec使传感器表面再生。监测相互作用的结合相和解离相。由于溶液中的抗体分析物是二价的，抗体亲抗原性负荷的(avidity-burdened)抗体-pTAU动力学通过二相性解离模型表征，其由下述组成快速的基于亲和力(affinity-based)的早期解离步骤，随之是后面的复合物解离中的抗体亲抗原性稳定的(avidity-stabilized)但是限速的动力学步骤。分析物注射结束后IOsec (早期)和50SeC (晚期)，如果可能，定量kd和t/2 diss。动力学测量使用双重参照程序评价。首先来自FCl参照的信号被扣除以纠正缓冲液体积效应和非特异性结合。次之OnM分析物注射被扣除以纠正来自各自捕获系统的一级抗体的解离。动力学速率使用Langmuir 1. 1解离拟合模型根据Biacore 评价软件v. 4. 1.进行评价。抗原/抗体复合物稳定性半衰期(min)根据公式lr^2)/60*kd计算。结果总结于表7中。表7
早期(IOs)晚期(50s)
克隆kd(l/s)t/2disskd (1/s)t/2diss
(min)(min)
Mab 005 2.19E-035.33.12xl0"34
Mab 019 1.43E-020.86.17xl0"419
Mab 020 3.28E-033.54.08 xlO"428
Mab 085 n.d.n.d.6.60 xlO"418
Mab 086 1.62E-037.23.68 xlO"432
Mab 097 n.d.n.d.n.d.n.d.实施例12抗-Tau pS422单克隆兔抗体对阿尔茨海默病患者脑切片中细胞内pTau的结合通过免疫荧光染色实验，使用来自AD患者的人脑组织的低温切片来研究通过单克隆兔抗-Tau pS422抗体特异性和灵敏性免疫组织化学检测阿尔茨海默病脑组织中的 pTau病理学。该程序与实施例X(鼠抗体)中所述的基本相同。兔Igk通过山羊抗兔 AlexaFluor488 缀合的二级抗体(Invitrogen/Molecularfrobes A11034)检测。对于克隆 Mab 005，Mab 019，Mab 020，Mab 085，Mab 086 和 Mab 097，pTau 沉积和丝的特异性和灵敏性染色是明显的。细胞内PTau沉积，如大的神经原纤维缠结和延长的神经纤维网线是显著的。对于所有研究的克隆，确定了范围在0. 08和0. 016μ g/ml之间的最小有效浓度，其表明对真正的人PTau沉积的高敏感性的结合。
权利要求
1.结合在丝氨酸422磷酸化的Tau(Tau pS422)的抗体，其特征在于特异性结合SEQ ID NO :9的磷酸化的Tau片段和结合Tau pS422，但是不结合Tau和不结合SEQ ID N0:17的磷酸化的MCAK片段，其应用于治疗Tau病。
2.根据权利要求1的应用的抗体，其特征在于所述抗体是人IgGl或IgG4亚型。
3.结合在丝氨酸422磷酸化的Tau(TaupS422)的抗体用于制备治疗Tau病的药物中的应用，其特征在于所述抗体特异性结合SEQ ID NO :9的磷酸化的Tau片段和结合Tau PS422，但是不结合Tau和不结合SEQ ID NO 17的磷酸化的MCAK片段。
4.根据权利要求3的应用，其特征在于所述抗体是人IgGl或IgG4亚型。
5.结合在丝氨酸422磷酸化的Tau(Tau pS422)的抗体，其特征是包含a)SEQ ID NO 6 的 CDR1H，SEQ ID NO 7 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 8 的 CDR3H，b)SEQID NO 23 的 CDR1H, SEQ ID NO 24 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 25 的 CDR3H,c)SEQ ID NO 31 的 CDR1H, SEQ ID NO 32 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 33 的 CDR3H,d)SEQ ID NO 39 的 CDR1H, SEQ ID NO 40 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 41 的 CDR3H,e)SEQID NO :47 的 CDR1H, SEQ ID NO 48 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 49 的 CDR3H,f)SEQ ID NO 55 的 CDR1H，SEQ ID NO 56 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 57 的 CDR3H，或g)SEQ ID NO 63 的 CDR1H，SEQ ID NO 64 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 65 的 CDR3H。
6.根据权利要求5的抗体，其特征是包含a)SEQ ID NO 6 的 CDR1H，SEQ ID NO 7 的 CDR2H，SEQ ID NO 8 的 CDR3H和 SEQ ID NO 3 的 CDR1L，SEQ ID NO 4 的 CDR2L，SEQ ID NO 5 的 CDR3L，b)SEQID NO 23 的 CDR1H, SEQ ID NO 24 的 CDR2H，禾口 SEQ ID NO 25 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 27 的 CDR1L, SEQ ID NO 28 的 CDR2L, SEQ ID NO 29 的 CDR3L,c)SEQ ID NO 31 的 CDR1H, SEQ ID NO 32 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 33 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 35 的 CDR1L, SEQ ID NO 36 的 CDR2L, SEQ ID NO 37 的 CDR3L,d)SEQ ID NO 39 的 CDR1H, SEQ ID NO 40 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 41 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 43 的 CDR1L, SEQ ID NO 44 的 CDR2L, SEQ ID NO 45 的 CDR3L,e)SEQID NO :47 的 CDR1H, SEQ ID NO 48 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 49 的 CDR3H，和 SEQ ID NO :51 的 CDR1L，SEQ ID NO 52 的 CDR2L，SEQ ID NO 53 的 CDR3L，f)SEQ ID NO 55 的 CDR1H, SEQ ID NO 56 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 57 的 CDR3H，禾口 SEQ ID NO 59 的 CDR1L, SEQ ID NO 60 的 CDR2L, SEQ ID NO 61 的 CDR3L，或g)SEQ ID NO 63 的 CDR1H, SEQ ID NO 64 的 CDR2H，和 SEQ ID NO 65 的 CDR3H，和 SEQ ID NO 67 的 CDR1L, SEQ ID NO 68 的 CDR2L, SEQ ID NO 69 的 CDR3L。
7.根据权利要求6的抗体，其特征在于包含a)SEQ ID NO 1的可变轻链和SEQ ID NO 2的可变重链，b)SEQID NO 26的可变轻链和SEQ ID NO 22的可变重链，c)SEQ ID NO 34的可变轻链和SEQ ID NO 30的可变重链，d)SEQ ID NO 42的可变轻链和SEQ ID NO 38的可变重链，e)SEQID NO :50的可变轻链和SEQ ID NO 46的可变重链，f)SEQ ID NO 58的可变轻链和SEQ ID NO 54的可变重链，或g)SEQ ID NO 66的可变轻链和SEQ ID NO 62的可变重链。
8.根据权利要求5至7的抗体，其特征在于是人IgGl或IgG4亚型。
9.根据权利要求5至8的抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的抗体变体。
10.根据5至9的抗体用于制备治疗Tau病的药物的应用。
11.根据权利要求10的应用，其特征在于所述抗体是人IgGl或IgG4亚型。
12.药物组合物，其特征在于包含根据权利要求5至9的抗体。
13.根据权利要求5至9的抗体用于制备药物组合物的应用。
14.根据权利要求5至9的抗体用于治疗Tau病的应用，所述Tau病选自由以下各项组成的组阿尔茨海默病(AD)(包括该病的仅有缠结的形式，唐氏综合征，成人病例)，关岛型帕金森综合征痴呆复合征，拳击员痴呆，皮克病，具有嗜银颗粒的痴呆，额颞叶痴呆，皮质基底节变性，苍白球脑桥黑质变性，进行性核上性麻痹和具有缠结的格-施-沙病。
15.用于制备药物组合物的方法，所述药物组合物特征在于包含根据权利要求5至9的抗体。
16.核酸，其特征在于编码根据权利要求5至9的抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域。
17.产生根据权利要求5至9的重组人抗体或人源化抗体的方法，其特征是在原核或真核宿主细胞中表达根据权利要求16的核酸并从所述细胞或所述细胞培养上清液回收所述抗体。
18.治疗患有Tau病，特别是患有AD的患者的方法，其特征是向所述患者施用根据权利要求5至9的抗体。
19.抗体用于制备治疗Tau病的药物的应用，所述抗体的特征在于特异性结合与包含 SEQ ID NO 1的可变轻链和SEQ ID NO 2的可变重链的抗体所结合的在丝氨酸422磷酸化的Tau的表位相同的表位。
20.根据权利要求19的应用，其特征在于所述抗体是IgGl或IgG4亚型。
21.应用于治疗Tau病的抗体，其特征在于特异性结合与包含SEQID NO :1的可变轻链和SEQ ID NO 2的可变重链的抗体所结合的在丝氨酸422磷酸化的Tau的表位相同的表位。
22.根据权利要求20的应用的抗体，其特征在于所述抗体是IgGl或IgG4亚型。
23.药物组合物，其包含治疗有效量的结合在丝氨酸422磷酸化的TauCTaupS422) 的抗体和药用载体，所述抗体特异性结合SEQ ID NO :9的磷酸化的Tau片段和结合Tau PS422，但是不结合Tau和不结合SEQ ID NO 17的磷酸化的MCAK片段。
全文摘要
结合在丝氨酸422磷酸化的Tau(pS422)的抗体，其特征在于特异性结合SEQ ID NO9的磷酸化的Tau片段和结合Tau pS422，但是不结合Tau和不结合SEQ ID NO17的磷酸化的MCAK片段，所述抗体在Tau病治疗中是有用的。
文档编号C07K16/18GK102459333SQ201080025548
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月8日 优先权日2009年6月10日
发明者乌尔里希·格普费特, 劳伦斯·奥兹曼, 奥拉夫·蒙迪戈尔, 汉斯-威利·克雷尔, 瓦尔特·胡贝尔, 瓦莱里娅·利夫可, 索尼亚·奥夫纳, 菲奥娜·格吕宁格尔, 贝恩德·博尔曼, 迈克尔·施雷尔姆 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司