三或四特异性抗体的制作方法

专利名称：三或四特异性抗体的制作方法
三或四特异性抗体本发明涉及新型三或四特异性抗体、它们的制备和使用。
背景技术：
工程化蛋白质，诸如能够结合两种或更多种抗原的双或多特异性抗体是本领域已知的。此类多特异性结合蛋白可使用细胞融合、化学偶联、或重组DNA技术来生成。通过例如IgG抗体格式和单链域的融合，最近已经开发了极其多种重组多特异性抗体格式，例如四价双特异性抗体(参见例如Coloma，Μ. J.，et. al.， Nature Biotech. 15(1997) 159-163 ；WO 2001/077342 ； R Morrison, S. L. , Nature Biotech. 25(2007) 1233-1234)。还有，已经开发了不再保留抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的数种其它新格式诸如二抗体、三抗体或四抗体，微型抗体，能够结合两种或更多种抗原的数种单链格式(scFv、Bis-scFv)(Holliger,P.，et. al,Nature Biotech. 23(2005) 1126-1136 ；Fischer, N. , and Leger, 0. , Pathobiology 74(2007)3—14 ；Shen, J. , et. al. , J. Immunol. Methods 318(2007) 65-74 ；ffu, C.，et al.，Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297)。所有此类格式使用接头来融合抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)至别的结合蛋白(例如scFv)或融合例如两种Fab片段或scFv(Fischer, N.，and Leger, 0.， Pathobiology 74 Q007) 3_14)。虽然显而易见的是接头对于双特异性抗体的工程化具有优势，但是它们也可在治疗背景中引起问题。确实，这些外来肽可引发针对接头自身或蛋白质和接头之间连接的免疫应答。另外，这些肽的柔性性质使得它们更加倾向于蛋白水解切割， 潜在导致差的抗体稳定性、聚集和升高的免疫原性。另外，通过维持高程度的与天然存在抗体的相似性，可能想要保留效应器功能，诸如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，它们是经由Fc部分介导的。如此，理想地，应当瞄准开发在一般结构方面与天然存在抗体(像IgA、IgD、IgE、 IgG或IgM)非常相似、相对于人序列的偏差最小的双特异性抗体。在一种办法中，基于两种不同杂交瘤细胞系(它们表达具有双特异性抗体的期望特异性的鼠单克隆抗体)的体细胞融合，已经使用四源杂交瘤技术生成了与天然抗体非常相似的双特异性抗体(参见 Milstein，C.，and Cuello,A. C. ,Nature 305(1983)537-540)。 由于所得杂交瘤-杂交瘤(或四源杂交瘤)细胞系内两种不同抗体重和轻链的随机配对， 生成多至10种不同抗体种类，其中只有一种是期望的功能性双特异性抗体。由于错误配对副产物的存在和显著降低的生产产量，因此需要精细纯化规程(参见例如Morrison，S. L.， Nature Biotech. 25(2007) 1233-1234)。一般而言，如果使用重组表达技术，仍有相同的错误配对副产物的问题。规避错误配对副产物问题的一种办法，称作‘结-入-穴’，瞄准通过将突变引入 CH3域以修饰接触界面，迫使两种不同抗体重链的配对。在一条链上，将大体积氨基酸用具有短侧链的氨基酸替换以创建‘穴’。相反，将具有大侧链的氨基酸引入另一 CH3域以创建‘结’。通过共表达这两条重链(和两条相同轻链，其必须适合于这两条重链)，观察到异二聚体形成(‘结-穴’)对同二聚体形成(‘穴-穴’或‘结-结’)的高产量(Ridgway，J. B.，et al. ,Protein Eng. 9 (1996) 617-621 ；和WO 96/027011)。通过使用噬菌体展示办法重塑两种CH3域的相互作用表面及引入二硫桥来稳定异二聚体，可进一步提高异二聚体的百分比(Merchant, A.M. , et al. , Nature Biotech. 16(1998)677—681 ；Atwel 1, S. , et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) ο例如EP 1 870459 Al中记载了结-入-穴技术的新办法。 虽然这种格式看来非常吸引人，但是当前没有获得描述通向临床的进展的数据。这种策略的一项重要约束在于两种亲本抗体的轻链不得不相同以防止错误配对和无活性分子形成。 如此，这种技术不适合作为自针对第一和第二抗原的两种抗体开始容易开发针对三种或四种抗原的重组三或四特异性抗体的基础，因为首先不得不优化这些抗体的重链和/或相同轻链，然后不得不添加针对第三和第四抗原的别的抗原结合肽。WO 2006/093794涉及异二聚体蛋白结合组合物。WO 99/37791记载了多目的抗体衍生物。Morrison，S. L.，et al.，J. Immunol. 160 (1998)沘02_2808 提到可变区域交换对 IgG功能特性的影响。发明概述本发明涉及三特异性或四特异性抗体，其包含a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中可变域VL 和VH彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl彼此替换；和c)其中特异性结合另外的一种或两种抗原的一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和/或b)的轻链或重链的C或N端。本发明的另一个实施方案是一种用于制备依照本发明的三特异性或四特异性抗体的方法，其包括下述步骤a)用包含核酸分子的载体转化宿主细胞，该核酸分子编码aa)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和ab)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中可变域VL 和VH彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl彼此替换；和ac)其中特异性结合另外的一种或两种抗原的一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和/或b)的轻链或重链的C或N端；b)在容许所述抗体分子合成的条件下培养该宿主细胞；并且c)自所述培养物回收所述抗体分子。本发明的另一个实施方案是包含载体宿主细胞，该载体包含核酸分子，该核酸分子编码a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中可变域VL 和VH彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl彼此替换；和c)特异性结合另外的一种或两种抗原的其中一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和/或b)的轻链或重链的C或N端。本发明的另一个实施方案是依照本发明的抗体的组合物，优选药物组合物或诊断组合物。本发明的另一个实施方案是包含依照本发明的抗体和至少一种药学可接受赋形剂的药物组合物。本发明的另一个实施方案是一种用于治疗需要治疗的患者的方法，特征在于对该患者施用治疗有效量的依照本发明的抗体。依照本发明，通过只在特异性结合第二抗原的全长抗体(第二抗体)的重链和轻链对(HC/LC)中替换某些域，可改善想要的三特异性或四特异性抗体与不想要的副产物相比的比率。这样，可减少轻链与错误重链的不想要的错误配对(第一抗体的轻链与第二抗体的重链或第二抗体的轻链与第一抗体的重链)。发明详述本发明涉及三特异性或四特异性抗体，其包含a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中可变域VL 和VH彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl彼此替换；和c)其中特异性结合另外的一种或两种抗原的一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和/或b)的轻链或重链的C或N端。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体在C)下包含特异性结合另外的一种或两种抗原的一个或两个抗原结合肽。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体特征在于所述抗原结合肽选自下组SCFv片段和scFab片段。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体特征在于所述抗原结合肽是scFv片段。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体特征在于所述抗原结合肽是scFab片段。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体特征在于所述抗原结合肽融合至a)和/或b)的重链的C端。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体在C)下包含特异性结合一种另外的抗原的一个或两个抗原结合肽。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体在C)下包含特异性结合第三抗原的两个相同抗原结合肽。优选地，所述两个相同抗原结合肽都经相同肽连接子融合至a)和b)的重链的C端。优选地，所述两个相同抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的三特异性或四特异性抗体在C)下包含特异性结合第三和第四抗原的两个抗原结合肽。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽都经相同肽连接子融合至a)和b)的重链的C端。优选地，所述两个抗原结合肽是scFv 片段或scFab片段。依照本发明，通过只在一对重链和轻链(HC/LC)中替换某些域，可改善想要的三特异性或四特异性抗体与不想要的副产物(由于轻链与特异性结合另一抗原的抗体的“错误”重链的错误配对)相比的比率。虽然两种全长HC/LC对中第一对源自特异性结合第一抗原的抗体且基本上保持不变，但是两种全长HC/LC对中第二对源自特异性结合第二抗原的抗体，且通过下述替换被修饰
-M^.可变轻链域VL用特异性结合第二抗原的所述抗体的可变重链域VH替换， 和/或恒定轻链域CL用特异性结合第二抗原的所述抗体的恒定重链域CHl替换，且可变重链域VH用特异性结合第二抗原的所述抗体的可变轻链域VL替换， 和/或恒定重链域CHl用特异性结合第二抗原的所述抗体的恒定轻链域CL替换。对此比率改善的双特异性抗体，然后，特异性结合另外的一种或两种抗原的一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至所述特异性结合第一和第二抗原的两种抗体的轻链或重链的C或N端，得到依照本发明的三特异性和四特异性抗体。如此，所得依照本发明的三特异性和四特异性抗体是人工抗体，其包含a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中所述(特异性结合第二抗原的抗体的)轻链含有可变域VH来代替VL和/或恒定域CHl来代替CL，其中所述(特异性结合第二抗原的抗体的)重链含有可变域VL来代替VH和/或恒定域CL来代替CH1。在本发明的另一个方面，通过修饰所述三或四特异性抗体内所述特异性结合第一和第二抗原的全长抗体的CH3域，可进一步改善所述想要的二价双特异性抗体与不想要的副产物相比改善的比率。如此，在本发明的一个优选实施方案中，通过“结-入-穴”技术，可改变依照本发明的所述三或四特异性抗体(重链中和经修饰重链中)的CH3域，“结-入-穴” 技术及数个例子详细记载于例如WO 96/027011, Ridgway, J. B.，et al.，Protein Eng. 9 (1996) 617-621 ；及 Merchant, Α. Μ.，et al.，Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681。在这种方法中，改变两种CH3域的相互作用界面以提高含有这两种CH3域的两种重链的异二聚化。(两种重链的)两种CH3域的每一个均可以是“结”，而另一是“穴”。引入二硫桥进一步稳定异二聚体(Merchant，A.M.，et al. , Nature Biotech. 16(1998)677-681 ；Atwel 1, S.，et al.，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)及提高产量。如此，在本发明的一个方面，所述三特异性或四特异性抗体特征还在于a)的全长抗体的重链的CH3域和b)的全长抗体的经修饰重链的CH3域在包含抗体CH3域之间初始界面的界面处相遇；其中所述界面经过改变以促进三特异性或四特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于i)改变一种重链的CH3域，使得在一种重链的CH3域遇见所述三或四特异性抗体内另一种重链CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一种重链的CH3域的界面内生成隆起，其可定位在另一种重链的CH3域的界面内的空腔中；并且ii)改变另一种重链的CH3域，使得在第二 CH3域遇见所述三或四特异性抗体内第一 CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二 CH3域的界面内生成空腔，其中可定位第一 CH3域的界面内的隆起。优选地，所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组精氨酸(R)，苯丙氨酸 (F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。优选地，所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组丙氨酸(A)，丝氨酸(S)， 苏氨酸(T)，缬氨酸(V)0
在本发明的一个方面，进一步改变这两种CH3域，即引入半胱氨酸(C)作为每种 CH3域的对应位置中的氨基酸，使得这两种CH3域之间能形成二硫桥。在一个优选实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体包含“结链”的CH3域中的 T366W突变和“穴链”的CH3域中的T366S、L368A、Y407V突变。也可使用CH3域之间的另一链间二硫桥(Merchant, A.M.，et al.，Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)，例如通过将 Y349C突变引入“结链”的CH3域及将E356C突变或S354C突变引入“穴链”的CH3域。如此，在另一个优选实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体包含所述两种CH3域中一种中的Y349C、T366W突变和所述两种CH3域中另一种中的E356C、T366S、L368A、Y407V突变， 或者所述三特异性或四特异性抗体包含两种CH3域中一种中的TO49C、T366W突变和两种 CH3域中另一种中的S3MC、T366S、L368A、Y407V突变(一种CH3域中的另一 Y349C突变和另一种CH3域中的另一 E356C或S354C突变形成链间二硫桥)(编号方式始终依照Kabat 的EU索引)。但是或者/另外也可使用其它结-入-穴技术，如EP 1 870 459A1记载的。 所述三特异性或四特异性抗体的一个优选例子是“结链”CH3域中的R409D ；K370E突变和 “穴链” CH3域中的D399K ；E357K突变(编号方式始终依照Kabat的EU索引)。在另一个优选实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体包含“结链” CH3域中的 T366W突变和“穴链”CH3域中的T366S、L368A、Y407V突变和另外“结链”CH3域中的R409D ； K370E突变和“穴链” CH3域中的D399K ；E357K突变。在另一个优选实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体包含两种CH3域中一种中的Y349C、T366W突变和两种CH3域中另一种中的S3MC、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述三特异性或四特异性抗体包含两种CH3域中一种中的TO49C、T366W突变和两种CH3域中另一种中的S3MC、T366S、L368A、Y407V突变和另外“结链” CH3域中的R409D ；K370E突变和“穴链” CH3域中的D399K ；E357K突变。术语“全长抗体”表示由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的抗体(见

图1)。 全长抗体的重链是N端至C端方向由抗体重链可变域(VH)、抗体重链恒定域1 (CHl)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定域2 (Cffi)、和抗体重链恒定域3 (OK)组成的多肽，缩写为 VH-CH1-HR-CH2-CH3 ；在亚类IgE的抗体的情况中，还有任选的抗体重链恒定域4 (CH4)。优选地，全长抗体的重链是N端至C端方向由VH、CHl、HR、CH2和CH3组成的多肽。全长抗体的轻链是N端至C端方向由抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。抗体轻链恒定域(CL)可以是κ (卡帕)或λ (拉姆达)。全长抗体链经CL域和CHl域之间的(即轻和重链之间的)和全长抗体重链铰链区之间的多肽间二硫键连接到一起。典型全长抗体的例子是天然抗体，像IgG(例如IgGl和IgG^、IgM、IgA、IgDjP IgE。 依照本发明的全长抗体可来自单一物种，例如人，或者它们可以是嵌合化或人源化抗体。依照本发明的全长抗体包含两个抗原结合位点，均由都特异性结合相同抗原的VH和VL对形成。所述全长抗体的重或轻链的C端表示所述重或轻链的C端处的最后一个氨基酸。如本发明内使用的，术语“肽连接子”表示具有优选合成起源的氨基酸序列的肽。这些依照本发明的肽连接子用于融合抗原结合肽至全长和/或经修饰全长抗体链的C或N端以形成依照本发明的三特异性或四特异性抗体。优选地，所述肽连接子在c)下是具有长度至少5个氨基酸、优选长度5至100个、更优选10至50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽连接子是跃礼或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S=丝氨酸，且(x = 3，n = 3、4、5或 6，且 m = 0、1、2 或幻或(χ = 4，η = 2、3、4 或 5，且 m = 0、1、2 或 3)，优选地，χ = 4 且 η = 2或3，更优选地，χ = 4，η = 2。在一个实施方案中，所述肽连接子是(QS) 2。如使用的，术语“抗原结合肽”指全长抗体的单价抗原结合片段或衍生物，其包括抗体重链可变域(VH)和/或抗体轻链可变域(VL)，或自全长抗体衍生的VH/VL对，或抗体片段诸如VH域和/或VL域、单链Fv(ScFv)片段、或单链Fab (scFab)片段。优选地，抗原结合肽至少包含抗体重链可变域(VH)和抗体轻链可变域(VL)。在一个优选实施方案中，此类抗原结合肽选自下组VH域，单链Fv(ScFv)片段，和单链Fab (scFab)片段，优选选自下组单链Fv(ScFv)片段和单链Fab (scFab)片段。如本文中使用的，术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示抗体分子中配体(例如它的抗原或抗原片段)实际结合的及自抗体衍生的区域。抗原结合位点包括抗体重链可变域(VH)和/或抗体轻链可变域(VL)，或VH/VL对。特异性结合期望抗原的抗原结合位点可衍生自a)针对该抗原的已知抗体或b)通过从头免疫接种方法使用抗原蛋白质或核酸或其片段等或者通过噬菌体展示获得的新抗体或抗体片段。本发明抗体的抗原结合位点可含有六个互补决定区(CDR)，其对结合位点对抗原的亲和力做出不同程度的贡献。有三个重链可变域⑶R(⑶RHl、⑶RH2和⑶Rro)和三个轻链可变域⑶R (⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3)。⑶R和框架区(FR)的范围通过与氨基酸序列的汇编数据库(其中已经依照序列间的变异性定义那些区)比较来确定。本发明的范围还包括由更少CDR构成的功能性抗原结合位点(即其中结合特异性由三个、四个或五个CDR决定)。 例如，少于全套6个⑶R可能足够进行结合。在一些情况中，VH或VL域会是足够的。抗体特异性指抗体对特定抗原表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。 双特异性抗体是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。三特异性抗体因而是具有三种不同抗原结合特异性的本发明抗体。依照本发明的四特异性抗体是具有四种不同抗原结合特异性的抗体。若抗体具有超过一种特异性，识别的表位可以与一种抗原或与超过一种抗原相关。如本文中使用的，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点，其中每一个结合相同抗原的相同表位的抗体。如本申请内使用的，术语“效价”或“价”表示抗体分子中存在指定数目的结合位点。例如，天然抗体或依照本发明的全长抗体具有两个结合位点且是二价的。如此，术语“三价”表示抗体分子中存在三个结合位点。如本文中使用的，术语“三价三特异性”抗体表示具有三个抗原结合位点，每一个结合另一种抗原(或所述抗原的另一种表位)的抗体。本发明的抗体具有三个至六个结合位点，即是三、四、五、或六价的(优选三或四价的)且是三或四特异性的。"scFv片段”或“单链Fv片段”(见图2b)是由抗体重链可变域(VH)、抗体轻链可变域(VL)、和单链Fv接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述单链Fv接头N端至C端方向具有下述次序之一 a) VH-单链Fv接头-VL，b) VL-单链Fv接头-VH ；优选a) VH-单链Fv接头-VL，且其中所述单链Fv接头是具有长度至少15个氨基酸、在一个实施方案中长度至少 20个氨基酸的氨基酸序列的多肽。术语“N端”表示N端最后一个氨基酸，术语“C端”表示C端最后一个氨基酸。如单链Fv片段内使用的，术语“单链Fv接头”表示具有优选合成起源的氨基酸序列的肽。所述单链Fv接头是具有长度至少15个氨基酸、在一个实施方案中长度至少20个氨基酸和优选长度介于15和30个氨基酸之间的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述单链接头是(SS)n，其中G =甘氨酸，S =丝氨酸，(χ = 3且η = 4、5或6)或(χ = 4且 η = 3、4、5或6)，优选地，χ = 4，η = 3、4或5，更优选地，χ = 4，η = 3或4。在一个实施方案中，所述单链Fv接头是Oi4Q3或(G4S) 4。另外，所述单链Fv片段优选是二硫化物稳定的。单链抗体的此类进一步二硫化物稳定化通过引入单链抗体的可变域之间的二硫键来实现，而且记载于例如WO 94/029350, Rajagopal, V. ， et al, Prot. Engin. 10(1997) 1453-1459 ；Kobayashi, H. ， et al. ， Nuclear Medicine & Biology 25(1998)387-393 -M Schmidt, Μ. ， et al. ， Oncogene 18(1999)1711-1721。在二硫化物稳定的单链Fv片段的一个实施方案中，依照本发明的抗体中包含的单链Fv片段的可变域之间的二硫键对于每一个单链Fv片段，独立地选自i)重链可变域位置44至轻链可变域位置100，ii)重链可变域位置105至轻链可变域位置43，或iii)重链可变域位置101至轻链可变域位置100。在一个实施方案中，依照本发明的抗体中包含的单链Fv片段的可变域之间的二硫键在重链可变域位置44和轻链可变域位置100之间。“scFab片段”或“单链Fab片段”(见图2a)是由抗体重链可变域(VH)、抗体恒定域I(CHl)、抗体轻链可变域(VL)、抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头N端至C端方向具有下述次序之一 a) VH-CHl-接头-VL-CL，b)VL_CL_接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CHl或d)VL-CHl-接头-VH-CL ；且其中所述接头是至少 30个氨基酸、优选介于32和50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段a) VH-CHl-接头-VL-CL、b) VL-CL-接头-VH-CH1、c) VH-CL-接头-VL-CH1 和 d) VL-CHl-接头-VH-CL 经 CL 域和CHl域之间的天然二硫键稳定化。术语“N端”表示N端最后一个氨基酸，术语“C端” 表示C端最后一个氨基酸。如本发明内使用的，术语“接头”表示具有优选合成起源的氨基酸序列的肽。这些依照本发明的肽用于连接a) VH-CHl至VL-CL，b) VL-CL至VH-CHl，c) VH-CL至VL-CHl或 d) VL-CHl至VH-CL以形成下述依照本发明的单链Fab片段a) VH-CHl-接头-VL-CL，b) VL-CL-接头-VH-CHl，c) VH-CL-接头-VL-CHl 或 d) VL-CHl-接头-VH-CL。单链 Fab 片段内的所述接头是具有长度至少30个氨基酸、优选长度32至50个氨基酸的氨基酸序列的肽。 在一个实施方案中，所述接头是((ixS)n，其中G =甘氨酸，S =丝氨酸，(χ = 3，η = 8、9或 10 且 m = 0、1、2 或 3)或(χ = 4 且 η = 6、7 或 8 且 m = 0、1、2 或 3)，优选地，χ = 4，η = 6或7且m = 0、1、2或3，更优选地，χ = 4，n = 7且m = 2。在一个实施方案中，所述接头是(G4S) 6G2。在一个优选实施方案中，所述单链Fab片段中的所述抗体域和所述接头N端至C 端方向具有下述次序之一 a) VH-CHl-接头-VL-CL，或b) VL-CL-接头-VH-CHl，更优选地， VL-CL-接头-VH-CHl。
在另一个优选实施方案中，所述单链Fab片段中的所述抗体域和所述接头N端至 C端方向具有下述次序之一 a) VH-CL-接头-VL-CHl或b) VL-CHl-接头-VH-CL。任选地，在所述单链Fab片段中，在CL域和CHl域之间的天然二硫键的之外，抗体重链可变域(VH)和抗体轻链可变域(VL)也是二硫化物稳定的，通过引入下述位置之间的二硫键来实现i)重链可变域位置44至轻链可变域位置100，ii)重链可变域位置105至轻链可变域位置43，或iii)重链可变域位置101至轻链可变域位置100 (编号方式始终依照Kabat的EU 索引)。单链Fab片段的此类进一步二硫化物稳定化通过引入单链Fab片段的可变域 VH和VL之间的二硫键来实现。为了稳定单链Fv而引入非天然二硫桥的技术记载于例如 WO 94/029350，Rajagopal et al. , Prot. Engin. 10(1997) 1453-1459 ；Kobayashi et al. , Nuclear Medicine & Biology 25(1998)387-393;或 Schmidt et al. , Oncogene 18(1999) 1711-1721。在一个实施方案中，依照本发明的抗体中包含的单链Fab片段的可变域之间的任选二硫键在重链可变域位置44和轻链可变域位置100之间。在一个实施方案中，依照本发明的抗体中包含的单链Fab片段的可变域之间的任选二硫键在重链可变域位置105和轻链可变域位置43之间(编号方式始终依照Kabat的EU索引)。在一个实施方案中，没有单链Fab片段的可变域VH和VL之间的所述任选二硫化物稳定化的单链Fab片段是优选的。本发明的全长抗体包含一类或多类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白的类包括IgG、IgM、IgA、IgD、* IgE同种型，及在IgG和IgA的情况中的它们的亚型。在一个优选实施方案中，本发明的全长抗体具有IgG型抗体的恒定域结构。如本文中使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。术语“嵌合抗体”指包含来自一种来源或物种的可变区，即结合区和自不同来源或物种衍生的恒定区至少一部分的抗体，通常通过重组DNA技术来制备。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是那些其中恒定区相对于初始抗体的恒定区经过修饰或改变以生成依照本发明的特性，尤其是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合的。此类嵌合抗体也称作“类转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因表达的产物。用于生成嵌合抗体的方法涉及常规重组DNA，而且基因转染技术是本领域公知的。参见例如 Morrison，S. L.，et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ;US 5，202，238 及 US 5，204，244。术语“人源化抗体”指其中框架或“互补决定区”(OTR)经过修饰以包含特异性与亲本免疫球蛋白的特异性相比不同的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选实施方案中， 将鼠⑶R嫁接入人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmarm，L.，et al.， Nature 332 (1988) 323-327 ；及 Neuberger，Μ· S.，et al. ,Nature 314(1985)268-270。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中恒定区相对于初始抗体的恒定区经过另外修饰或改变以生成依照本发明的特性，尤其是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合的。
如本文中使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术公知的(van Dijk, M.A.，and van de Winkel, J.G.，Curr.Opin.Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。也可在免疫接种时能够在内源免疫球蛋白生成缺失下生成人抗体的完整全集或选集的转基因动物(例如小鼠)中生成人抗体。 在此类种系突变型小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列会导致在抗原攻击时生成人抗体(参见例如 Jakobovits，Α.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555 ； Jakobovits, Α. , et al. , Nature 362 (1993) 255-258 ；Bruggemann, Μ. , et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40) 也可在噬菌体展示文库中生成人抗体(Hoogenboom， H. R. ， and Winter, G. ， J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D. ， et al. ， J. Mol. Biol. 222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体 (Cole,et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, p. 77(1985)； 及Boerner，P. , et al.，J. Immunol. 147(1991)86-95)。正如关于依照本发明的嵌合和人源化抗体早就提到的，如本文中使用的，术语“人抗体”也包括在恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性，尤其是关于Clq结合和/或FcR结合的此类抗体，例如通过“类转换”，即 Fc部分的改变或突变(例如从IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突变)。如本文中使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，正如自宿主细胞诸如NSO或CHO细胞或自对于人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体或使用转染入宿主的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然衍生自及涉及人种系VH和VL序列，但是可以在体内在人抗体种系全集中不是天然存在的序列。如本文中使用的，“可变域”(轻链的可变域(VL)、重链的可变域(VH))表示直接涉及抗体结合抗原的轻和重链对中每一个。人轻和重链的可变域具有相同的一般结构，而且每种域包含其序列广泛保守、通过三个“高变区”(或互补决定区，OTR)连接的四个框架 (FR)区。框架区采取β-片层构象，而⑶R可形成环，连接β-片层结构。每条链中的⑶R 在它们的三维结构中通过框架区保持，并与来自另一条链的CDR—起形成抗原结合位点。 抗体重和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用， 因此提供了本发明的另一个目标。在本文中使用时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR” 区是可变域中本文中定义的高变区残基以外的那些区。因此，抗体的轻和重链N至C端包含域FR1、⑶R1、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、和FR4。每条链上的⑶R由此类框架氨基酸分开。尤其，重链的⑶R3是对抗原结合贡献最多的区。⑶R和FR区依照Kabat，et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)的标准定义来确定。如本文中使用的，术语“结合” / “特异性结合”指体外测定法中，优选使用纯化的野生型抗原的等离振子共振测定法(BIAcore，GE-HealthcareUppsala, Sweden)中抗体对抗原表位的结合。结合的亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合的速率常数)、kD(解离常数)、和KD(kD/ka)来定义。在一个实施方案中，结合或特异性结合表示10_8mol/l或更少、优选ΙΟ—Μ至10_13mOl/l的结合亲和力(Kd)。如此，依照本发明的三或四特异性抗体优选以10_8mol/l或更少、优选10_9至10_13mol/l的结合亲和力(Kd)特异性结合它所特异性的每一种抗原。抗体对Fc γ RIII 的结合可通过 BIAcore 测定法(GE-Healthcare Uppsala, Sweden)来调查。结合的亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合的速率常数)、kD(解离常数)、和KD(kD/ka)来定义。术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面成组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基，而且在某些实施方案中，可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。表位是抗原中受到抗体结合的区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或高分子的复杂混合物中优先识别它的靶抗原时，就说它特异性结合抗原。在另一个实施方案中，依照本发明的三或四特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgGl亚类的或具有突变L234A和L235A的人IgGl亚类的。在另一个实施方案中，依照本发明的三或四特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG2亚类的。在另一个实施方案中，依照本发明的三或四特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG3亚类的。在另一个实施方案中，依照本发明的三或四特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG4亚类的或具有另一突变的人IgG4亚类的。优选地，依照本发明的三或四特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgGl亚类的或具有另一突变的人IgG4亚类的。现在已经发现依照本发明的三或四特异性抗体具有改善的特征，诸如生物学或药理学活性、药学特性或毒性。它们可用于例如治疗疾病，诸如癌症。如本申请内使用的，术语“恒定区”表示抗体中可变区以外的域之和。恒定区不直接涉及抗原结合，但是展现各种效应器功能。根据它们的重链恒定区氨基酸序列，抗体分成类IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，而且这些中的数类可进一步分成亚类，诸如IgGl、IgG2、IgG3、 和IgG4、IgAl和IgA2。与抗体的不同类对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ、和μ。 能在所有五类抗体中找到的轻链恒定区(CL)称作κ (卡帕)和λ (拉姆达)。如本申请中使用的，术语“自人起源衍生的恒定区”表示亚类IgGl、IgG2、 IgG3、或IgG4的人抗体的重链恒定区和/或轻链卡帕或拉姆达恒定区。此类恒定区是现有技术公知的，而且例如记载于Kabat，Ε. Α.，(参见例如Johnson，G. and Wu, Τ. Τ.， Nucleic Acids Res. 28(2000)214-218 ；Kabat, E. A. ， et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(1975)2785-2788)。虽然IgG4亚类的抗体显示降低的Fc效应器(FcYRIIIa)结合，但是其它IgG 亚类的抗体显示强结合。然而，Pro238、Asp265, Asp270、Asn297 (丧失Fc碳水化合物)、 Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、 和His435是在改变时也提供降低的Fc受体结合的残基(Shields, R. L.，et al.，J. Biol. Chem. 276(2001)6591-6604 ；Lund, J.，et al.，FASEB J. 9(1995) 115-119 ；Morgan, Α.，etal. , Immunology86(1995)319-324 ；EP 0 307 434)。在一个实施方案中，依照本发明的抗体具有与IgGl抗体相比降低的FcR结合。如此，关于FcR结合，全长亲本抗体是IgG4亚类的或具有S2^、L234、L235和/或D265中的突变的IgGl或IgG2亚类的，和/或含有PVA236突变。在一个实施方案中，全长亲本抗体中的突变是S2^P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，全长亲本抗体中的突变在IgG4S2^P中和在IgGlL234A和L2!35A中。抗体的恒定区直接涉及ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。补体激活(CDC)是由补体因子Clq结合大多数IgG抗体亚类的恒定区启动的。Clq结合抗体是由所谓结合位点处的限定蛋白质-蛋白质相互作用引起的。此类恒定区结合位点是现有技术已知的且记载于例如Lukas，T.J.， et al. , J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ；Bunkhouse, R. and Cobra, J. J. , Mol. Immunol. 16 (1979)907-917 ；Burton, D. R.，et al.，Nature 288 (1980) 338-344 ； Thomason, J.Ε., et al. , Mol. Immunol. 37(2000) 995-1004；Idiocies, Ε.Ε., et al., J. Immunol. 164(2000)4178-4184 ；Hearer, Μ.，et al.，J.Virol.75 (2001) 12161-12168 ； Morgan, Α. , et al.，Immunology86 (1995) 319-324 ；及 EP 0 307 434。此类恒定区结合位点特征在于例如氨基酸 L234、L2!35、D270、N297、E318、K320、K322、P331、和 P329(编号方式依照Kabat的EU索引)。术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC) ”指在效应细胞存在下依照本发明的抗体对人靶细胞的裂解。优选地，在效应细胞诸如新鲜分离的PBMC或自血沉棕黄层纯化的效应细胞，像单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系存在下通过用依照本发明的抗体处理抗原表达细胞制备物来测量ADCC。术语“补体依赖性细胞毒性(⑶C) ”表示由补体因子Clq结合大多数IgG抗体亚类的Fc部分启动的过程。Clq结合抗体是由所谓结合位点处的限定蛋白质-蛋白质相互作用引起的。此类Fc部分结合位点是现有技术已知的(见上文)。此类Fc部分结合位点特征在于例如氨基酸 L2;34、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、和 P329(编号方式依照 Kabat的EU索引)。亚类IgGl、IgG2、和IgG3的抗体通常显示补体激活，包括Clq和C3结合，而IgG4不激活补体系统且不结合Clq和/或C3。单克隆抗体的细胞介导的效应器功能可通过工程化改造它们的寡糖成分来增强，如 Umana，P.，et al.，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 及 US6, 602，684 记载的。 IgGl型抗体，最常用的治疗性抗体，是在每一个CH2域的Asn297处具有保守N连接糖基化位点的糖蛋白。附着至Asn297的两个复合双触角寡糖埋藏在CH2域之间，形成与多肽主链的广泛接触，而且它们的存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)是至关重要的(Lifely,M.，R.，et al. ,Glycobiology 5(1995)813-822 Jefferis, R. , et al. , Immunol. Rev. 163(1998) 59-76 ；Wright, Α. , and Morrison, S.L., Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。Umana，P.，et al.，Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 和TO 99/54342显示了在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中过表达β (1，4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III ( “&1ΤΙΙΙ”)，一种催化二分寡糖形成的糖基转移酶，显著提高抗体的体外ADCC 活性。Asn297碳水化合物的组成变化或其消除也影响对Fc YR和Clq的结合(Umana， P. , et al. , Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 ；Davies, J. , et al., Biotechnol.Bioeng. 74 (2001) 288-294 ；Mimura, Y.，et al.，J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547 ； Radaev, S.，et al.，J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478—16483 ；Shields, R. L.，et al.，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ；Shields, R. L.，et al.，J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740 ； Simmons, L. C.，et al.，J.Immunol. Methods 263 (2002) 133-147)。增强单克隆抗体的细胞介导的效应器功能的方法报告于例如W02005/018572， WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, W02005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267，US 2006/0134709，US2005/0054048, US 2005/0152894，WO 2003/035835，WO 2000/061739。在本发明的一个优选实施方案中，三或四特异性抗体是在Asn297处被糖链糖基化的(如果它包含IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚类的，优选IgGl或IgG3亚类的Fc部分的话)，其中所述糖链内岩藻糖的量是65%或更低(编号方式依照Kabat)。在另一个实施方案中，所述糖链内岩藻糖的量介于5%和65%之间，优选介于20%和40%之间。依照本发明，“Asn297”表示位于Fc区中大约位置四7的氨基酸天冬酰胺。基于抗体的微小序列变异，Asn297也可位于位置297上游或下游的一些氨基酸(通常不超过士3个氨基酸)，即介于位置294和300之间。在一个实施方案中，依照本发明的IgG亚类糖基化抗体是人IgGl 亚类的、具有突变L234A和L235A的人IgGl亚类的或IgG3亚类的。在另一个实施方案中， 所述糖链内N-乙醇酰基神经氨酸(NGNA)的量是或更少和/或N端α-1，3-半乳糖的量是或更少。优选地，糖链显示附着至CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297的N连接聚糖的特征。术语“糖链显示附着至CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297的N连接聚糖的特征”表示依照本发明的全长亲本抗体的Asn297处的糖链具有与未修饰CHO细胞中表达的抗体，例如WO 2006/103100中报告的那些相同的结构和糖残基序列，除了岩藻糖残基。如本申请内使用的，术语“NGNA”表示糖残基N-乙醇酰基神经氨酸。人IgGl或IgG3的糖基化发生于ASM97，核心岩藻糖基化双触角复合寡糖糖基化以多至两个Gal残基作为末端。IgGl或IgG3亚类的人恒定重链区详细报告于 Kabat, Ε. , A. , et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)及 Bruggemann, Μ. , et al. , J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 ；Love, Τ. , W. , et al. , Methods Enzymo 1. 178(1989)515-527。根据末端Gal残基的量，这些结构称作GO、Gl(a -1,6-或 0-1，3-)、或62聚糖残基(Raju,T. ,S. ,Bioprocess Int. 1(2003)44-53) 抗体 Fc 部分的 CHO 型糖基化记载于例如 Routier，F.，H.，Glycoconjugate J. 14(1997)201-207。在未糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常以至少85%的量在Asn297处岩藻糖基化。全长亲本抗体的经修饰寡糖可以是杂合的或复合的。优选地，二分还原/非岩藻糖基化寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，二分还原/非岩藻糖基化寡糖是复合的。依照本发明，“岩藻糖的量”表示通过MALDI-T0F质谱术测量并作为平均值计算的， Asn297处的糖链内所述糖相对于附着至Asn297的所有糖结构总和(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的量。岩藻糖的相对量是通过MALDI-T0F，含岩藻糖结构相对于经N-糖苷酶F 处理的样品中鉴定的所有糖结构(例如分别为复合、杂合和寡和高甘露糖结构)的百分比。通过重组手段来生产依照本发明的抗体。如此，本发明的一个方面是编码依照本发明的抗体的核酸，而另一个方面是包含所述编码依照本发明的抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术公知的，而且包括原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体且通常纯化至药学可接受纯度。为了在宿主细胞中表达上述抗体，通过标准方法将编码各经修饰轻和重链的核酸插入表达载体。在适宜原核或真核宿主细胞像CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER. C6细胞、酵母、或大肠杆菌细胞中实施表达，并自细胞(上清液或裂解后的细胞)回收抗体。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术公知的，而且记载于例如综述论文 Makrides，S. C.，Protein Expr. Purif. 17(1999) 183-202 ； Geisse, S. ， et al. ， Protein Expr. Purif. 8(1996)271-282 ；Kaufman, R. J. ， Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-161；Werner, R.G.，Drug Res.48 (1998)870-880。通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-kpharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析，将依照本发明的三或四特异性抗体与培养液适当分开。编码单克隆抗体的DNA和RNA易于使用常规规程分离和测序。杂交瘤细胞可充当此类DNA和RNA的来源。一旦分离，可将DNA插入表达载体，然后将其转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞，以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。通过将适宜核苷酸变化引入抗体DNA或通过核苷酸合成来制备三或四特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)。可实施此类修饰，然而，只在非常有限的范围中，例如如上所述。例如，修饰不改变上文所述抗体特征，诸如IgG同种型和抗原结合，但可改善重组生产的产量、蛋白质稳定性或促进纯化。如本申请中使用的，术语“宿主细胞”表示可工程化改造以生成依照本发明的抗体的任何类别的细胞系统。在一个实施方案中，使用HEK293细胞和CHO细胞作为宿主细胞。 如本文中使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，而且所有此类称谓包括后代。如此，词语“转化子”和“经转化细胞”包括原代受试细胞及自其衍生的培养物， 不管转移次数。还要理解，所有后代在DNA内容方面可能不是精确相同的，这是由于有意或无意的突变。包括与对初始转化细胞所筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代。在意指不同称谓时，根据上下文会是清楚的。NSO 细胞中的表达记载于例如 Barnes, L. Μ.，et al.，Cytotechnology 32(2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.，et al.，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270o 瞬时表达记载于例如 Durocher，Y.，et al.，Nucl. Acids. Res. 30(2002)E9o 可变域的克隆记载于 Orlandi, R. ，et al. ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P. ，et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)4285-4289 ；及 Norderhaug, L.，et al.，J. Immunol. Methods 204(1997)77-87。一种优选的瞬时表达系统(HEK 293)记载于 Schlaeger， E. -J. , and Christensen, K. , in Cytotechnology 30 (1999)71-83 及 Schlaeger, Ε. -J., J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199。例如，适合于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和聚腺苷酸化信号。当一条核酸与另一条核酸序列处于功能性相互关系中时，它是“可操作连接”的。 例如，若前序列(pre-sequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(pre-protein)，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般地，“可操作连接”表示相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中表示相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl成带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳、和本领域公知的其它技术，实施抗体的纯化以清除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质° 参见 Ausubel, F. , et al. , ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。不同方法已完善建立且广泛用于蛋白质纯化，诸如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)、 亲硫吸附(例如使用β巯基乙醇和其它SH配体)、疏水相互作用或芳香族吸附层析(例如使用苯基-sepharose、氮杂-亲砷树脂、或间氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和层析(例如使用Ni (II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻层析、和电泳方法(诸如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vi jayalakshmi，Μ. Α.，App 1. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93—102)。本发明的一个方面是包含依照本发明的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是依照本发明的抗体用于制备药物组合物的用途。本发明的另一个方面是用于制备包含依照本发明的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面，本发明提供含有依照本发明的抗体、 与药物载体一起配制的组合物，例如药物组合物。本发明的一个实施方案是用于治疗癌症的依照本发明的三或四特异性抗体。本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。本发明的另一个方面是依照本发明的抗体用于制备治疗癌症的药物的用途。本发明的另一个方面是治疗患有癌症的患者的方法，其通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的抗体来进行。如本文中使用的，“药物载体”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、 抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、等等。优选地，载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。本发明的组合物可通过本领域已知的多种方法来施用。正如熟练技术人员会领会的，施用路径和/或模式会随期望结果而变化。为了通过某些施用路径来施用本发明的化合物，可能必须用某材料包被化合物或与某材料一起共施用化合物以防止其失活。例如，可以在适宜载体例如脂质体或稀释剂中对受试者施用化合物。药学可接受稀释剂包括盐水和含水缓冲溶液。药物载体包括无菌含水溶液或分散体和用于临场制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂对药学活性物质的使用是本领域已知的。如本文中使用的，短语“胃肠外施用”表示肠和表面施用以外的施用模式，通常通过注射，而且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、 经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。如本文中使用的，术语癌症指增殖性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、 非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、胃的癌症、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴门癌、何杰金氏病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经系统(CNQ新生物、脊柱肿瘤、 脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、施旺细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌规程 (见上文)及通过包括各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、 等等)二者，可确保防止存在微生物。可能还想要在组合物中包括等张剂，诸如糖、氯化钠、 等等。另外，通过包括延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶，可引起可注射药物形式的延长吸收。不管选择的施用路径，通过本领域技术人员已知的常规方法，将本发明的化合物 (其可以以合适水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。本发明的药物组合物中活性组分的实际剂量水平可有所变化，以获得对于特定患者、组合物、和施用模式有效实现期望治疗响应，对患者没有毒性的活性组分量。选择的剂量水平会取决于多个药动学因素，包括采用的本发明特定组合物的活性、施用路径、施用时间、采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和在先医学史、医学领域公知的等等因素。组合物必须是无菌的且流动性程度达到可通过注射器来投递组合物。在水之外， 载体优选是等张缓冲盐水溶液。恰当的流动性可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂、通过维持所需粒度(在分散的情况中)及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况中，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇或山梨醇、和氯化钠。如本文中使用的，术语“转化”指载体/核酸转移入宿主细胞的过程。如果使用没有难对付的细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞的话，例如通过磷酸钙沉淀法进行转染，如 Graham and Van der Eh, Virology 52(1978)546以下记载的。然而，也可使用其它用于将 DNA导入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或含有坚固细胞壁构造的细胞的话，例如一种转染方法是使用氯化钙的钙处理，如Cohen，F. N, et al.， PNAS 69(1972)7110 等等记载的。如本文中使用的，“表达”指核酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA (也称作转录物)随后翻译成肽、多肽、或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸衍生自基因组DNA的话，真核细胞中的表达可包括mRNA剪接。“载体”是将插入的核酸分子转移入宿主细胞和/或在宿主细胞之间转移的核酸分子，特别是自我复制的。该术语包括主要发挥将DNA或RNA插入细胞(例如染色体整合) 功能的载体、主要发挥复制DNA或RNA功能的主要复制载体、和发挥转录和/或翻译DNA或 RNA功能的表达载体。还包括提供超过一项所述功能的载体。“表达载体”是在导入适宜宿主细胞时能转录和翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常指包含表达载体、能发挥功能来生成期望表达产物的合适宿主细胞。
提供下述实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求书中列出。要理解，所列规程中可进行更改而不背离本发明的精神。氨基酸序列描述SEQ ID NO 1 轻链 <Ang_2>SEQ ID NO 2 具有 C 端融合的 <EGFR>scFv 的结-重链 <Ang_2>SEQ ID NO 3 具有 CH1-CL 交换的轻链 <VEGF>SEQ ID NO 4具有CHl-CL交换和C端融合的<IGF_lR>scFv的穴-重链<VEGF>SEQ ID NO 5 具有 C 端融合的 <EGFR>scFab 的结-重链 <Ang_2>SEQ ID NO 6具有CH1-CL交换和C端融合的<IGF_lR>scFab的穴-重链<VEGF>SEQ ID NO 7具有CH1-CL交换和C端融合的<EGFR>scFv的穴-重链<VEGF>SEQ ID NO 8 具有 CH1-CL 交换的穴-重链 <VEGF>SEQ ID NO 9具有CH1-CL交换和C端融合的<EGFR>scFab的穴-重链<VEGF>SEQ ID NO :10 具有 C 端融合的 <IGF_lR>scFab 的结-重链 <Ang_2>附图简述图1特异性结合第一抗原1、无CH4域的全长抗体的示意结构，其具有以典型次序包含可变和恒定域的两对重和轻链。图加特异性结合抗原的四种可能单链Fab片段的示意结构。图2b 特异性结合抗原的单链Fv片段的示意结构。图3a_d依照本发明的不同三或四特异性抗体的示意结构，其特征在于特异性结合第二抗原的抗体的全长抗体轻/重链中的VL/VH域和/或CL/CH1域替换(CH3域无和有别的结入穴修饰)。图乜依照本发明识别血管生成素(Angiopoietin)-2、VEGF-A、EGFR和IGF-IR的四特异性抗体的示意结构，其是四价的且使用二硫化物稳定的单链Fv片段作为抗原结合肽(实施例 1)。图4b 依照本发明识别血管生成素_2、VEGF-A, EGFR和IGF-1R的四特异性抗体的示意结构，其是四价的且使用单链Fab片段作为抗原结合肽(实施例1)。图fe 依照本发明识别血管生成素_2、VEGF-A和EGFR的三特异性抗体的示意结构，其是四价的且使用二硫化物稳定的单链Fv片段作为抗原结合肽(实施例2)。图釙依照本发明识别血管生成素-2、VEGF-A和EGFR的三特异性抗体的示意结构，其是四价的且使用单链Fab片段作为抗原结合肽(实施例2)。0187]图6依照本发明识别血管生成素_2、VEGF-A和EGFR的三特异
0188]性抗体的示意结构，其是三价的且使用二硫化物稳定的单
0189]链Fv片段作为抗原结合肽(实施例3)。
0190]图7 依照本发明识别EGFR、IGF-lR、c_Met和HER3的四特异
0191]性抗体的示意结构，其是四价的且使用二硫化物稳定的单
0192]链Fv片段作为抗原结合肽。
0193]图8 依照本发明识别血管生成素_2、VEGF-A, EGFR和IGF-IR
0194]的四特异性抗体在高载荷沈/60SuperdeX 200柱上的大小
0195]排阻层析，其是四价的且使用单链Fab片段作为抗原结合
0196]肽(实施例1)。
0197]图9 依照本发明识别血管生成素_2、VEGF-A, EGFR和IGF-1R
0198]的四特异性抗体在天然和变性条件下的SDS-PAGE分析，
0199]其是四价的且使用单链Fab片段作为抗原结合肽(实施例
0200]1)。
0201]图10依照本发明识别血管生成素_2、VEGF-A和EGFR的三特异
0202]性抗体在高载荷^/60SuperdeX 200柱上的大小排阻层析，
0203]其是四价的且使用单链Fab片段作为抗原结合肽(实施例
0204]2)。
0205]图11依照本发明识别血管生成素-2、VEGF-A和EGFR的三特异
0206]性抗体在天然和变性条件下的SDS-PAGE分析，其是四价
0207]的且使用单链Fab片段作为抗原结合肽(实施例2)。
实施例材料和一般方法关于人免疫球蛋白轻和重链核苷酸序列的一般信息见Kabat，Ε. Α.，et al.， Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed· ,Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。抗体链的氨基酸依照 EU 编号方式来编号和提及(Edelman, G. M.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85 ；Kabat, Ε. Α.，et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991))。重组DNA技术使用标准方法来操作 DNA，如 Sambrook, J. et al.，Molecular Cloning :A laboratory manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York, 1989中记载的。依照制备商的说明书来使用分子生物学试剂。基因合成自通过化学合成生成的寡核苷酸制备期望基因区段。通过退火和连接寡核苷酸来装配侧翼为唯一限制性内切核酸酶位点的600-1800bp长基因区段，包括PCR扩增，随后经指定限制性位点例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆入基于pPCI^cript (Stratagene) 的pGA4克隆载体。通过DNA测序来验证亚克隆的基因片段的DNA序列。在Geneart (Regensburg, Germany)依照给定规格订购基因合成片段。DNA序列测定通过在 MediGenomi χ GmbH (Martinsried, Germany)或 Sequi serve GmbH(Vaterstetten, Germany)实施的双链测序来测定DNA序列。DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理使用GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)软件包 10. 2 版和 Infomax的Vector NTl Advance套件8. O版来进行序列创建、绘图、分析、注解和说明。表达载体为了表达描述的抗体，为了瞬时表达(例如在HEK293EBNA或HEK293-F细胞中) 应用基于有或无CMV内含子A启动子的cDNA组织或基于具有CMV启动子的基因组组织的表达质粒变体。在抗体表达盒之外，载体含有-容许此质粒在大肠杆菌中复制的复制起点，和-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。抗体基因的转录单元由下述元件构成-5’端处的一种或多种唯一限制性位点，-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，-在cDNA组织的情况中，接着是内含子A序列，-人抗体基因的5’非翻译区，-免疫球蛋白重链信号序列，-人抗体链(野生型或具有域交换的)，作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子组织的基因组组织，-3’非翻译区及聚腺苷酸化信号序列，和-3’端处的一种或多种唯一限制性位点。通过PCR和/或基因合成生成包含如下所述抗体链的融合基因，并通过已知重组方法和技术通过连接相应核酸区段来装配，例如使用各载体中的唯一限制性位点。通过DNA 测序来验证亚克隆的核酸序列。为了瞬时转染，通过来自经转化大肠杆菌培养物的质粒制备(NucleobondAX，Macherey-Nagel)来制备更大数量的质粒。细胞培养技术使用标准细胞培养技术，如Current Protocols in Cell Biology(2000), Bonifacino, J. S. , Dasso, Μ. , Harford, J. B. , Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K. M. (eds·)，John Wiley & Sons, Inc.中记载的。如下所述通过各表达质粒在贴壁生长的HEK293-EBNA中或在悬浮生长的HEK29-F 细胞中的瞬时共转染来表达三或四特异性抗体。HEK293-EBNA系统中的瞬时转染通过各表达质粒(例如编码重链和经修饰重链的，以及对应轻链和经修饰轻链的)在补充有 10% Ultra Low IgG FCS (胎牛血清，Gibco )、2mM L-谷氨酰胺(Gibco )、 和250 μ g/ml遗传霉素(Gibco )的DMEM (Dulbecco氏改良fegle氏培养基，Gibco )中培养的贴壁生长HEK293-EBNA细胞(表达EB病毒核抗原的人胚肾细胞系四3 ；美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC#CRL-10852，Lot.959 218)中的瞬时共转染来表达三或四特异性抗体。为了转染，以4 1(范围为3 1至6 1)的FuGENE 试剂(μ 1)对DNA(yg) 之比使用FuGENE 6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals)。分别使用1 1 (等摩尔)(范围为1 2至2 1)的(修饰型和野生型)轻链和重链编码质粒之摩尔比自各质粒表达蛋白质。第3天给细胞补料L-谷氨酰胺ad 4mM、葡萄糖[Sigma]和NAA [Gibco ]。转染后5至11天通过离心收获含有三或四特异性抗体的细胞培养物上清液并保存于-20°C。 关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息见Meissner，P. et al., Biotechnol.Bioeng. 75(2001) 197-203。HEK293-F系统中的瞬时转染使用HEK293-F系统(Invitrogen)依照制备商的指令通过各质粒(例如编码重链和经修饰重链的，以及对应轻链和经修饰轻链的)的瞬时转染来生成三或四特异性抗体。简言之，用四种表达质粒和293feCtinTM或fectin (Invitrogen)的混合物转染在摇瓶中或在搅拌式发酵罐中在无血清Fre必tyle 293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)。对于2L摇瓶(Corning)，以1. 0E*6个细胞/mL的密度在 600mL中接种HEK293-F细胞，并于120rpm，8% CO2温育。次日，以大约1. 5E*6个细胞/mL 的细胞密度用大约42mL混合物A)带有600 μ g等摩尔比的编码重链或经修饰重链和对应轻链的总质粒 DNA(ly g/mL)的 2OmL Opti-MEMQnvitrogen)和 B) 20ml Opti-MEM+1. 2mL ^3feCtin或fectinQyl/mL)转染细胞。发酵过程期间根据葡萄糖消耗添加葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌的抗体的上清液，并自上清液直接纯化抗体或将上清液冷冻并保存。蛋白质测定使用依照Pace，et al.，Protein Science，1995，4，M11-1423 根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测S^Onm处的光密度(OD)来测定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。上清液中的抗体浓度测定用蛋白A琼脂糖珠(Roche)通过免疫沉淀来评估细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。将 60μ L 蛋白 A 琼脂糖珠在 TBS-NP40(50mM Tris, pH7. 5,150mM NaCl, 1% Nonidet-P40)中清洗三次。随后，将l_15mL细胞培养物上清液应用至在TBS-NP40中预平衡的蛋白A琼脂糖珠。于室温温育1小时之后，将珠在Ultrafree-MC-滤器柱(Amicon)上用0. 5mL TBS-NP40清洗一次，用0. 5mL 2x磷酸盐缓冲盐水(2xPBS, Roche)清洗两次，并用0. 5mL100mM柠檬酸钠pH 5，0简单清洗四次。通过添加35 μ 1 NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)来洗脱结合的抗体。分别将一半样品与NuPAGE 样品还原剂组合或保持不还原，并于70°C加热lOmin。因此，将5_30 μ 1应用至4-12%NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen) (MOPS缓冲液用于非还原SDS-PAGE，带NuPAGE 抗氧化剂运行缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液用于还原SDS-PAGE)，并用考马斯蓝染色。通过亲和HPLC层析定量测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简言之， 在Agilent HPLC 1100系统上，将含有结合蛋白A的抗体和衍生物的细胞培养物上清液应用至 200mM KH2PO4, IOOmM 柠檬酸钠，pH 7. 4 中的 Applied Biosystems Poros A/20 柱，并用200mM NaCl，IOOmM柠檬酸，pH 2,5自基质洗脱。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白质。纯化的标准IgGl抗体充当标准。或者，通过三明治式IgG-ELISA测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。 简言之，将Mi^ptaWell高结合链霉亲合素A_96孔微量滴定板(Roche)用IOOyL/孔 0. 1 μ g/mL生物素化抗人IgG捕捉分子F(ab，)2<h-Fc y >BI (Dianova)于室温包被1小时或于 4°C包被过夜，随后用 200μ L/孔 PBS，0. 05% Tween (PBST, Sigma)清洗三次。将 100 μ L/ 孔各含有抗体的细胞培养物上清液在PBS(Sigma)中的稀释系列添加至孔，并在微量滴定板摇床上于室温温育1-2小时。将孔用200 μ L/孔PBST清洗三次，并在微量滴定板摇床上用100 μ 1 0. 1 μ g/mL F(ab')2<hFc y >P0D (Dianova)作为检测抗体于室温检测结合的抗体 1-2小时。三次用200 μ L/孔PBST洗掉未结合的检测抗体，并通过添加100 μ L ABTS/孔来检测结合的检测抗体。在Tecan荧光分光仪上实施吸光度测定，测量波长405nm(参照波长 492nm)。蛋白质纯化参照标准方案自经过过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之，将抗体应用至蛋白A kpharose柱(GE healthcare)，并用PBS清洗。在pH 2. 8实现抗体洗脱，接着立即中和样品。通过大小排阻层析(Superdex 200,GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸，150mM NaCl pH 6. 0中将聚集的蛋白质与单体抗体分开。合并单体抗体级分，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWC0)离心浓缩器浓缩(在需要时)，冷冻并保存于_20°C 或_80°C。提供部分样品进行后续蛋白质分析和分析性表征，例如通过SDS-PAGE、大小排阻层析(SEC)或质谱术。SDS-PA GE依照制备商的指令使用NuPAGE I^e-Cast凝胶系统(Invitrogen)。特别地，使用 10%或 4-12%NuPAGE Novex Bis-TRIS ft~e-cast 凝胶(pH 6.4)和NuPAGE MES (还原的凝胶，有NuPAGE 抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS (非还原的凝胶)运行缓冲液。分析性大小排阻层析通过HPLC层析来实施用于测定抗体聚集和寡聚状态的大小排阻层析(SEC)。简言之，将蛋白A纯化的抗体应用至Agilent HPLC 1100系统上300mM NaCl, 50mM KH2PO4/ K2HPO4, pH 7. 5 中的 iTosoh TSK 凝胶 G3000SW 柱或至 Dionex HPLC 系统上 2x PBS 中的 Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白质。 BioRad凝胶过滤标准151-1901充当标准。质谱术经电喷射离子化质谱术(ESI-MS)测定并验证交换型抗体的去糖基化总质量。简言之，以高至ang/ml的蛋白质浓度将IOOyg纯化的抗体用50mU N-糖苷酶F(PNGaseF， ProZyme)在 IOOmM KH2P04/K2HP04, pH 7 中于 37°C去糖基化 12_24h，随后在 kphadex G25 柱(GE Healthcare)上经HPLC脱盐。在去糖基化和还原之后通过ESI-MS测定各重和轻链的质量。简言之，将115μ 1中的50μ g抗体与60μ 1 IM TCEP和50μ1 8Μ胍-盐酸一起温育，随后脱盐。在配备有NanoMate 源的Q-Mar Elite MS系统上经ESI-MS测定总质量及还原重和轻链的质量。IGF-1R、EGFR、HER3 和 c-Met ECD Biacore
BIACORE TlOO iX^ (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden) 通过表面等离振子共振来调查生成的抗体对人IGF-1R、EGFR、HER3和c_Met E⑶(胞外域)的结合。简言之，为了亲和力测量，经胺偶联在CM5芯片上固定化山羊抗人IgG，JIR 109-005-098抗体以呈现针对人ECD-Fc标签的抗体。在HBS缓冲液(HBS_P(10mM HEPES, 150mM NaCl，0. 005% Tween 20，ph 7.4)中于25°C测量结合。在溶液中以各种浓度添加来自c-Met、IGF-IR或EGFR的ECD (R&D Systems或内部纯化)。通过80秒钟至3分钟的ECD注射来测量结合；通过用HBS缓冲液清洗芯片表面3-10分钟来测量解离，并使用 1 ILangmuir结合模型来估算Kd值。由于低加载密度和捕捉水平，获得单价ECD结合。 自样品曲线减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)以修正系统内在基线漂移及降低噪声信号。使用Biacore TlOO评估软件1.1. 1版来分析传感图及技术亲和力数据。图11显示 Biacore测定法的纲要。ANGPT2 和 VEGF 结合 BIACORE还使用BIACORE TlOO 仪器(GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala，Sweden)通过表面等离振子共振来调查生成的抗体对人ANGPT2和VEGF的结合。简言之，为了亲和力测量，经胺偶联在CM5或CM4芯片上固定化山羊<hIgG-Fcg>多克隆抗体以呈现针对人ANGPT2 和 VEGF的抗体。在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES, 150mM NaCl,0. 005% Tween 20,ph 7.4) 中有或无5mM Ca2+于25°C测量结合。在溶液中以各种浓度分别添加纯化的ANGPT2_His或 VEGF165/VEGF121-His (R&D Systems 或内部纯化)。通过 3 分钟的 ANGPT2/VEGF 注射来测量结合；通过用HBS缓冲液清洗芯片表面3-5分钟来测量解离，并使用1 ILangmuir结合模型来估算Kd值。自样品曲线减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)以修正系统内在基线漂移及降低噪声信号。使用Biacore TlOO评估软件1. 1. 1版来分析传感图及技术亲和力数据。BIACORE中的同时结合四和三特异性抗体分别对 EGFR、IGF-1R、Ang-2 和 VEGF 或者 EGFR、IGF-1R、HER3 和c-Met或者EGFR、Ang-2和VEGF的同时结合。将四或三特异性抗体格式的结合与衍生结合模块和双特异性抗体的‘野生型’ IgG 的结合比较。如上所述通过应用表面等离振子共振(Biacore)来进行这些分析。为了显示同时结合，使用Biacore T100仪器(Biacore AB, Uppsala)通过表面等离振子共振技术 (SPR)来分析结合特性。使用胺偶联化学在CM5生物传感器芯片的表面上固定化捕捉用抗人IgG抗体。用 0. IM N-羟基琥珀酰亚胺和0. IM 3-(N，N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺的1 1混合物以5 μ 1/min的流速活化流动室。在乙酸钠，pH 5. 0中以10 μ g/ml注射抗人IgG抗体， 这导致大约12000RU的表面密度。以相同方式但只用媒介缓冲液代替捕捉用抗体处理参照对照流动室。用IM乙醇胺/HC1，pH8. 5注射来封闭表面。在HBS-P中稀释多特异性抗体， 并以5 μ 1/min的流速注射。对于浓度介于1和50nM之间的抗体，接触时间(结合阶段)为 lmin。分别以渐增浓度注射 EGFR/IGF-lR/HER3/c-Met-ECD 和 Ang-2 或 VEGF。于 25°C (标准温度)实施所有相互作用。在每一个结合循环之后以5 μ 1/min流注射再生溶液3M氯化镁60sec以除去任何非共价结合的蛋白质。以每秒一个信号的速率检测信号。以渐增浓度注射样品。实施例1 识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-1R的四特异性和四价抗体的生成、表达、纯化和表征在第一个实例中，通过经(G4S)4连接子融合二硫化物稳定的针对EGFR的scFv 和针对IGF-IR的scFv分别至具有结-入-穴、以它的可变域识别血管生成素-2和VEGF 的CH1/CL(C卡帕)域交换抗体的第一重链和第二重链的C端部分，生成了识别血管生成素-2、VEGF-A、EGFR和IGF-IR的四特异性和四价抗体(图如)。4条抗体链的序列分别见 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO :4。
权利要求
1.一种三特异性或四特异性抗体，其包含a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中可变域VL和VH 彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl彼此替换；和c)其中特异性结合另外的一种或两种抗原的一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和/或b)的轻链或重链的C或N端。
2.依照权利要求1的抗体，特征在于其在c)下包含特异性结合另外的一种或两种抗原的一个或两个抗原结合肽。
3.依照权利要求1的抗体，特征在于其在c)下包含特异性结合第三抗原的一个或两个抗原结合肽。
4.依照权利要求1的抗体，特征在于其在c)下包含特异性结合第三抗原的两个相同抗原结合肽。
5.依照权利要求1的抗体，特征在于其在c)下包含特异性结合第三抗原的一个抗原结合肽和特异性结合第四抗原的一个抗原结合肽。
6.依照权利要求1至5任一项的抗体，特征在于所述抗原结合肽选自下组SCFv片段和scFab片段。
7.依照权利要求1至5任一项的抗体，特征在于所述抗原结合肽是scFv片段。
8.依照权利要求1至5任一项的抗体，特征在于所述抗原结合肽是scFab片段。
9.依照权利要求1至8任一项的抗体，特征在于所述抗原结合肽融合至a)和/或b) 的重链的C端。
10.依照权利要求1至8任一项的抗体，特征在于a)的全长抗体的重链的CH3域和 b)的全长抗体的经修饰重链的CH3域在构成所述抗体CH3域之间初始界面的界面处相遇； 其中所述界面经过改变以促进所述三特异性或四特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于i)改变一种重链的CH3域，使得在一种重链的CH3域遇见所述三或四特异性抗体内另一种重链CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在一种重链的CH3域的界面内生成隆起，其可定位在另一种重链的CH3域的界面内的空腔中；并 )改变另一种重链的CH3域，使得在第二 CH3域遇见所述三或四特异性抗体内第一 CH3域初始界面的初始界面内，氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二 CH3域的界面内生成空腔，其中可定位第一 CH3域的界面内的隆起。
11.依照权利要求10的抗体，特征在于所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)且所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)。
12.依照权利要求10或11的抗体，特征在于进一步改变这两种CH3域，即引入半胱氨酸(C)作为每种CH3域的对应位置中的氨基酸，使得这两种CH3域之间能形成二硫桥。
13.一种用于制备依照权利要求1或10的三特异性或四特异性抗体的方法，包括下述步骤a)用包含核酸分子的载体转化宿主细胞，该核酸分子编码aa)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和ab)特异性结合第二抗原的全长抗体的经修饰轻链和经修饰重链，其中可变域VL和VH 彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl彼此替换；和ac)其中特异性结合另外的一种或两种抗原的一个至四个抗原结合肽经肽连接子融合至a)和/或b)的轻链s或重链的C或N端，b)在容许所述抗体分子合成的条件下培养该宿主细胞；并且c)自所述培养物回收所述抗体分子。
14.包含依照权利要求13的载体的宿主细胞。
15.依照权利要求1至12的抗体的组合物，优选药物组合物或诊断组合物。
16.包含依照权利要求1至12的抗体和至少一种药学可接受赋形剂的药物组合物。
17.一种用于治疗需要治疗的患者的方法，特征在于对该患者施用治疗有效量的权利要求1至12的抗体。
全文摘要
本发明涉及三或四特异性抗体、它们的制备和使用。
文档编号C07K16/22GK102448985SQ201080024090
公开日2012年5月9日 申请日期2010年5月25日 优先权日2009年5月27日
发明者C.克莱恩, J.M.尚泽尔, R.克罗亚斯达尔, W.谢弗 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司