专利名称：对生物学样品中的sith-1抗体进行检测的方法
技术领域：
本发明涉及对生物学样品中的HHV-6潜伏感染中间阶段转录物所编码的小蛋白质(Small protein encoded by the Intermediate stage Transcript of HHV-6)(SITH-1) 抗体定性和/或定量地进行检测的方法。通过本发明的方法，针对尤其是在生物学样品中微量存在、通常难以检测的SITH-I蛋白的抗体，也能够进行检测。
背景技术：
在疱疹病毒科的病毒中，核心蛋白的周围具有分子量80 150 X IO6道尔顿的双链线状DNA，该DNA包裹在由162个壳微粒(capsomere)形成的直径约IOOnm的20面体衣壳(capsid)中而形成核衣壳(nucleocapsid)，该核衣壳被包膜包裹而形成整体为约150 200nm大小的病毒。疱疹病毒几乎可以在所有的哺乳动物和两栖类中找到，特别是将以人为宿主的疱疹病毒科的病毒，称为人疱疹病毒(HHV:human herpesvirus)。HHV各自分类为 α (单纯疱疹病毒、水痘/带状疱疹病毒等)、β (巨细胞病毒等)以及Y (EB病毒等)亚科。这样的疱疹病毒以“潜伏感染(latent infection) ”为特征。所谓“潜伏感染”， 是指病毒在宿主细胞内不产生具有感染性的病毒颗粒而持续存在的感染状态，在此潜伏感染中，病毒基因及辅助该病毒基因存在的基因产物被保留在宿主细胞内。已知显示潜伏感染的疱疹病毒，当宿主出现某种原因(例如衰老、健康状态不佳(包括疲劳))时，重新开始产生病毒颗粒，大量的病毒被复制(再活化)。S卩，疱疹病毒具有如下特异性的性质如果宿主没有异常则保持潜伏感染状态，一旦宿主的身体发生异常，疱疹病毒察觉到宿主的危机，则为了寻找其他的健康宿主而再活化。为了对这样的疱疹科的病毒的生态进行讨论，对病毒的潜伏感染/再活化的理解是不可或缺的。但是，在疱疹病毒中，关于潜伏感染的知识多的只有属于Y-疱疹病毒的EB 病毒，对于其他则有很多不明之处。尤其是，对于与疱疹病毒的潜伏感染相关的因子，实际情况是除了本发明人等中的部分人员在之前明确的知识之外，没有获得其他的信息。例如，在非专利文献1中， 揭示了 HHV-6在末梢血中的分化度较高的巨噬细胞中潜伏感染，从而明确了在宿主中的 HHV-6的潜伏感染部位。此外，在非专利文献2中，记载着HHV-6在初次感染时以非常高的比例向脑内转移，并产生持续感染/潜伏感染。在非专利文献3中，揭示了在HHV-6的潜伏感染时表达的基因(潜伏感染基因)，给出了如下启示该基因具有控制病毒的潜伏感染和再活化的功能。在非专利文献4中，揭示了在HHV-6的潜伏感染状态中，存在比较稳定且基因表达活跃的状态，即“中间阶段intermediate stage”，会大量表达潜伏感染基因和由该基因编码的蛋白质(潜伏感染基因蛋白质)。并且，在非专利文献5中，记载了在慢性疲劳综合症患者的血清中存在对在中间阶段表达亢进的潜伏感染基因蛋白质的抗体。
非专利文献非专利文献 1 :Kondo. K 等人，Ltatent human herpesvirus 6 infection of human monocytes/macrophages, J Gen Virol 72:1401-1408,1991非专利文献 2 :Kondo. K 等人，Association of human herpesvirus 6infection of the central nervous system with recurrence of febrile convul sions.JInfect Dis 167 :1197-1200,1993非专利文献 3 :Kondo. K 等人’ Identification of human herpesvirus 6latency-associated transcripts. , J Virol. 76 :4145-4151,2002非专利文献4 =Kondo K 等人，Recognition of a Novel Stage of Beta-Herpesvirus Latency in Human Herpesvirus 6. , J Virol. 77 :2258-2264,2003非专利文献5 :近藤一博著，《疱疹病毒感染与疲劳》，病毒，第55卷第1号，p9-18， 200
发明内容
发明要解决的课题本发明人等中的部分人员对在HHV-6潜伏感染中特异性基因活跃表达的中间阶段(intermediate stage)中表达的新基因，以及由该新基因编码的新蛋白质 (SITH)-1 (Small protein encoded by the Intermediate Transcript of HHV-6)进行了鉴定。并且，对这些基因和由该基因编码的蛋白质SITH-I的功能进行了分析，发现了如下新事实(i)和(ii)，并进行了专利申请(PCT/JP2008/67300) (i) SITH-1蛋白具有使细胞内钙浓度上升的功能，(ii)在情绪障碍患者中显著地检测出这些抗SITH-I蛋白抗体的同时，在健康人中则几乎检测不出来。如上所述，示出了通过对来源于人体的生物学样品中所含有的抗SITH-I蛋白抗体进行检测，能够应用于精神障碍等的诊断中。在这里，以表达了 SITH-I蛋白的细胞作为抗原，通过通常进行的荧光抗体法测定了针对所述SITH-I蛋白的血清抗体效价。本发明人等通过继续研究，发现在荧光抗体法中存在如下问题需要制作SITH-I表达哺乳类细胞、需要制作显微镜用标本、需要较多的劳力、人血清中针对SITH-I蛋白的的抗体效价低、检测工作需要熟练的技术，因SITH-I 蛋白不稳定需要谨慎处理等。此外，在荧光抗体法中，为了与血清样本反应后在显微镜下目测判断荧光，操作繁杂，不适合多个样本同时处理。并且，因血清样本的不同非特异性结合会成为问题，经常有难于测定的情况。基于本发明人等的这样的新认识，本发明的目的在于，提供如下方法简便并且定性和/或定量地对生物学样品中的抗SITH-I蛋白抗体进行检测的方法。本发明特别是以提供如下方法为目的在抑制背景信号的同时，简便并且定性和 /或定量地对生物学样品中的抗SITH-I蛋白抗体进行检测/测定的方法。解决问题的方法本发明人等发现了 SITH-I蛋白与担载体结合的体系对于抗体的检测是有效的， 从而想到了本发明。特别是，在该体系中，为了检测在生物学样品中微量存在的抗SITH-I蛋白抗体，如何处理背景信号成为问题，因此进一步做了使该背景信号降低的努力。具体而言，通过向生物学样品中添加细胞破碎提取液而成功降低了非特异性结合。此外，在利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合使SITH-I蛋白固定化在担载体上时，在生物学样品中，添加细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，降低非特异性结合的效果更显著。或此时，通过添加下述细胞破碎提取液来代替添加生物素结合性蛋白，该细胞破碎提取液是由通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白的细胞所制备的的细胞破碎提取液，也获得了同样的效果。本发明基于以上知识，提供了 在将SITH-I蛋白固定化在担载体的体系中，减少了非特异性结合、灵敏度更高的对抗SITH-I蛋白抗体进行检测的方法。虽不局限于此，但本发明包括如下实施方式[实施方式1]用于检测生物学样品中的由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质(Small protein encoded by the Intermediate stage Transcript of HHV-6)的 (SITH-I)抗体的方法，该方法包括1)准备 SITH-I 蛋白；2)使工序1)准备的SITH-I蛋白与担载体结合；3)使生物学样品与工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体接触，检测SITH-I 蛋白抗体。[实施方式2]实施方式1所述的方法，其中，SITH-I蛋白选自以下的组(a)具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；(c)具有与SEQ ID NO 1的氨基酸序列的同一性至少为80%的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；(d)具有由SEQ ID NO 2的碱基序列所构成的核酸编码的氨基酸序列的蛋白质；(e)具有由SEQ ID NO 2的碱基序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸而得到的碱基序列所构成的核酸编码的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；(f)具有由与SEQ ID NO :2的碱基序列的同一性至少为80%的核酸序列所构成的核酸编码的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；以及(g)由与SEQ ID NO 2的碱基序列的互补碱基序列所构成的核酸在严格杂交条件下杂交的核酸编码，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质。[实施方式3]实施方式1或2所述的检测方法，其特征在于在实施方式1的工序3)中，将(a)生物学样品，以及(b)由与用于表达工序1)的SITH-I蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液混合后添加至由工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体中。[实施方式4]
实施方式1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于在实施方式1的工序2)中，利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，使 SITH-I蛋白与担载体结合。[实施方式5]实施方式4所述的检测方法，其特征在于在实施方式1的工序3)中，将(a)生物学样品；以及 (b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，所述细胞破碎提取液由与用于表达工序1)或2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备，或(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)或 2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；混合后添加至由工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体中。[实施方式6]实施方式3至5中任一项所述的方法，其特征在于在实施方式3的工序3(b)或实施方式5的工序3 (b-i)中，添加由含任意载体的细胞提取的细胞破碎提取液作为细胞破碎提取液。[实施方式7]实施方式4至6中任一项所述的方法，其中，生物素结合性蛋白质是tamavidin或其变体。[实施方式8]实施方式1至6中任一项所述的检测方法，其中，生物学样品选自血液、血清、脑脊髓液、唾液、咽喉拭子、汗、尿、泪、淋巴液、精液、 腹水以及母乳。[实施方式9]用于检测生物学样品中的由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质 (SITH-I)的抗体的担载体，其是结合有所述SITH-I蛋白的担载体。[实施方式10]实施方式9所述的担载体，其特征在于通过生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，SITH-I蛋白与担载体结合。[实施方式11]用于检测生物学样品中的由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质 (SITH-I)的抗体的试剂盒，其包括A)结合有所述SITH-I蛋白的担载体；以及，B)用于稀释生物学样品的试剂，其含有由与用于表达A)的SITH-I蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液。[实施方式12]实施方式11所述的试剂盒，其中，
A)的担载体是通过生物素-生物素结合性蛋白之间的结合与SITH-I蛋白结合的担载体；并且，B)的试剂是用于稀释生物学样品的包含下述i)或ii)的试剂，i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，所述细胞破碎提取液由与用于表达A) 的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备，或ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序A)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞。[实施方式13]用于检测生物学样品中的由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质 (SITH-I)的抗体的试剂盒，其包括A)所述 SITH-I 蛋白；B)用于固定化A)的SITH-I蛋白的担载体；以及C)用于稀释生物学样品的试剂，其含有由与用于表达A)的SITH-I蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液。[实施方式14]实施方式13所述的试剂盒，其中，A)的SITH-I蛋白是生物素化的；B)的担载体直接或间接地与生物素结合性蛋白结合；C)的试剂，是用于稀释生物学样品的包含下述i)或ii)的试剂，i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，所述细胞破碎提取液由与用于表达A) 或B)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备，或ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序A)或B)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞。发明的效果通过本发明的方法，能够在生物学样品中的SITH-I蛋白抗体的检测中，在抑制背景信号的同时，稳定地进行灵敏度更高的检测。通过本发明的方法，尤其还使得在生物学样品中微量存在的、用通常方法检测困难的SITH-I蛋白抗体的检测和测定成为可能。
[图11图1示出了Biofese标签(生物素化标签)融合SITH-1蛋白的表达。具体来讲，图IA是用于检测SITH-I蛋白的Western印迹的结果，图IB是用于检测生物素化蛋白质的活性染色的结果。将表达BioEase标签融合SITH-I蛋白的大肠杆菌BL21 (DE3)进行超声破碎，将得到的大肠杆菌粗提取液级分，按总蛋白质20μ g/泳道展开于SDS-PAGE(15%丙烯酰胺凝胶)中，之后转印到PVDF上。
具体来讲，图IA为使抗SITH-I抗体(1/1000稀释)反应后，与碱性磷酸酶(AP) 标记抗兔IgG抗体(1/1000稀释)反应，此后进行了 AP染色。图IB是与链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP) (1/1000稀释)反应后的染色图像。图IA和图IB均给出了来源于只具有表达载体的大肠杆菌的提取样本，作为对照。用箭头表示出Biofese标签融合 SITH-I蛋白的位置。在图IB的链霉抗生物素蛋白-HRP染色中，检测出2条粗带。因在图IA的抗 SITH-I抗体中没有检测到，图IB中位于下方的带被认为是SITH-I部位的一部分被分解的附有Biofese标签的蛋白质。[图2]图2是显示了各种血清稀释液对非特异性结合产生的效果的图。以白四角形(虚线)表示用PBS稀释的血清区域，以白四角形(实线)表示用向PBS中加入纯化 tamavidin2(TM2)的溶液稀释的血清区域，以星号(虚线)表示用只含有表达载体的大肠杆菌破碎提取液稀释的血清区域，以星号(实线)表示用向只含有表达载体的大肠杆菌破碎提取液中加入纯化TM2的液体稀释的血清区域，以黑圆(实线)表示由表达TM2的大肠杆菌破碎提取液稀释的血清区域。各图的纵轴(发光量)表示抗SITH-I抗体的检测量，横轴表示分级稀释的抗SITH-I抗体的稀释比例。[图3]图3是将图2所示的结果，按照抗SITH-I抗体的稀释比例，分别求出的S/ N比的图。以白四角形(虚线)表示用PBS稀释血清的区域，以白四角形(实线)表示用向 PBS中加入纯化tamavidin2(TM2)的溶液稀释血清的区域，以星号(虚线)表示用只含有表达载体的大肠杆菌破碎提取液稀释血清的区域，以星号(实线)表示用向只含有表达载体的大肠杆菌破碎提取液中加入纯化TM2的液体稀释血清的区域，以黑圆(实线)表示由表达TM2的大肠杆菌破碎提取液稀释血清的区域。[图4]图4表示使用了结合有生物素化SITH-I的TM2板时，对人血清中的抗 SITH-I抗体效价测定的结果。人血清用TBS-T(三羟甲基氨基甲烷缓冲液生理食盐水， 0. 1% Tween 20)中含有酪蛋白1 %的溶液稀释后，使之与TM2板接触。[图5]图5表示了使用结合有生物素化SITH-I的TM2板时，对人血清中的抗 SITH-I抗体效价测定的结果。使大肠杆菌粗提取液稀释的人血清与TM2板接触。[图6]图6表示了使用结合有生物素化SITH-I的TM2板时，对人血清中的抗 SITH-I抗体效价测定的结果。使总蛋白质5mg/ml的TM2表达大肠杆菌粗提取液稀释的人血清与TM2板接触。[图7]图7是表示使用结合有His标签融合SITH-I蛋白的镍板的情况下，对抗 SITH-I兔血清中的抗SITH-I抗体效价进行测定的结果。作为抗SITH-I兔血清，加入了用包括0.2% BSA的PBS (-)稀释100倍的血清。作为对照，使用了用无任何表达的大肠杆菌， 以及使用了 His标签EGFP。[图8]图8是表示使用结合有His标签融合SITH-I蛋白的镍板的情况下，对抗 SITH-I兔血清中的抗SITH-I抗体效价进行测定的结果。作为抗SITH-I兔血清，加入了用包括0.2% BSA的PBS (-)稀释500倍的血清。作为对照，使用无任何表达的大肠杆菌以及 His 标签 EGFP。[图9]图9表示使用结合有His标签融合SITH-I蛋白的镍板的情况下，对人血
9清中的抗SITH-I抗体效价进行测定的结果。人血清稀释100倍后加入。作为对照，使用了 His标签EGFP。此外，作为血清稀释液，使用了 1%BSA、或大肠杆菌粗提取液。[图10]图10表示使用结合有His标签融合SITH-I蛋白的镍板的情况下，对人血清中的抗SITH-I抗体效价进行测定的结果。人血清稀释500倍后加入。作为对照，使用了 His标签EGFP。此外，作为血清稀释液，使用了 1%BSA、或大肠杆菌粗提取液。
具体实施例方式1.对生物学样品中的SITH-I抗体进行检测的方法本发明提供一种用于检测生物学样品中的由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编石马的小蛋白质(Small protein encoded by the Intermediate stage Transcript of HHV-6) (SITH-I)的抗体的方法，该方法包括1)准备 SITH-I 蛋白；2)使工序1)准备的SITH-I蛋白与担载体结合；3)使生物学样品与工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体接触，检测SITH-I 蛋白抗体。1.牛物学样品本发明涉及对生物学样品中的SITH-I蛋白抗体进行检测的方法。作为本发明中的生物学样品，只要是来源于人、感染HHV-6的实验动物、或导入 SITH-I基因的实验动物，可能含有成为检测对象的SITH-I蛋白抗体的样品即可，没有特别限定。具体来讲，是包含从人、感染HHV-6的实验动物(猴子等)、或导入SITH-I基因的实验动物(鼠等)采集的细胞、组织或其碎片等的样本，例如体液、更优选为血液、血清、脑脊髓液、唾液、咽喉拭子、汗、尿、泪、淋巴液、精液、腹水以及母乳等。这些体液，按需要稀释后使用。稀释率通常为10倍至10000倍左右，优选100倍至1000倍左右，但不局限于此。用于稀释的溶液可以使用任意的缓冲液，也可以含有适当的封闭剂。作为封闭剂，理想的是抑制非特异性结合的效果高的封闭剂，例如可以使用BSA、 酪蛋白等本领域技术人员周知的封闭剂。通过本发明，例如，使对来源于虽是自身免疫性疾病的患者或健康人，但自身抗体等背景高的检验对象的样本的SITH-I蛋白抗体的测定也成为可能。这些样本在以往的方法中非特异性结合多，难于进行检测和正确定量。这些样本中SITH-I蛋白抗体的抗体效价低，需要抑制血清的稀释率，结果来源于血清中成分的非特异性结合也增加，因此用现有的方法难于对该抗体进行检测和定量。但通过本发明的方法能够容易地检测、或更加正确地进行定量。2. SITH-I 蛋白在本发明中，所谓SITH-I蛋白，是指由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质(Small protein encoded by the Intermediate Transcript of HHV-6)及其变体。基于PCT/JP2008/67300 的记载内容的 SITH-I(I)SITH-I 蛋白、核酸SITH-I蛋白、核酸的结构及功能，揭示于PCT/JP2008/67300中，将其全部内容引入本说明书中。
SITH-I是与疱疹病毒的潜伏感染相关的因子，更详细地讲，是在疱疹病毒的潜伏感染时特异性表达的蛋白质。在这里“在疱疹病毒的潜伏感染时特异性表达”，是指在感染了疱疹病毒的宿主中，在疱疹病毒潜伏感染(没有增殖感染)时，来源于疱疹病毒的基因或基因产物进行特异性表达。SITH-I蛋白优选选自以下的组(a)具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；(c)具有与SEQ ID NO=I的氨基酸序列的同一性至少为80%的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；(d)具有由SEQ ID NO 2的碱基序列所构成的核酸编码的氨基酸序列的蛋白质；(e)具有由SEQ ID NO 2的碱基序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸而得到的碱基序列所构成的核酸编码的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；(f)具有由与SEQ ID NO :2的碱基序列的同一性至少为80%的核酸序列所构成的核酸编码的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；以及(g)由与SEQ ID NO 2的碱基序列的互补碱基序列所构成的核酸在严格杂交条件下杂交的核酸编码，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质。 SITH-I蛋白典型地具有SEQ ID NO 1氨基酸序列。SEQ ID NO 1的氨基酸序列优选是由SEQ ID NO :2碱基序列构成的核酸编码的。由SEQ ID NO :1的SITH-1氨基酸序列所构成的SITH-1蛋白，如后述的参考例所示，是作为人疱疹病毒-6(HHV-6)的潜伏感染时特异性表达的蛋白质被分离和鉴定的。SITH-I蛋白具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，是由159氨基酸构成的，分子量约 17. 5kDa的蛋白质。SITH-I蛋白质由SITH-I基因的核酸编码。该SITH-1基因的cDNA如SEQ ID NO 3所示，具有1795个碱基对(约1. 79kbp)的大小，第％4 第956位的碱基序列为起始密码子(Kozak ATG)，第1431 第1433位的碱基序列为终止密码子(TAA)。因此，在如SEQ ID NO 3所示的碱基序列中，上述SITH-I核酸具有从第卯4 1430位的碱基序列作为开放阅读框(ORF)，该ORF具有477个碱基对(约0. 48kbp)的大小。在SITH-I的cDNA中，表示ORF区域的碱基序列如SEQ ID N0:3所示。需要说明的是，所记载的SEQ ID NO :2所示的碱基序列含有终止密码子的3个碱基。SITH-I核酸通常均在HHV-6潜伏感染的细胞的细胞质中表达，另一方面，在增殖感染细胞中未发现有表达。编码SITH-I蛋白质的核酸由与到目前为止报告的HHV-6潜伏感染特异的基因(H6LT)成互补链的关系的DNA编码，其表达在HHV-6的潜伏感染的中间阶段增强。从这些事实可以认为=SITH-I蛋白质是在HHV-6的潜伏感染时进行特异表达的蛋白质。SITH-I蛋白，与作为宿主蛋白的CAML (钙调节性亲环蛋白配体，Accesion# ； U18242)结合，使神经胶质细胞内钙浓度上升。CAML已知是在宿主生物内在脑和淋巴细胞CN 102449483 A
说明书
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中大量存在，使细胞内的钙浓度上升的蛋白质。还有，由SITH-I蛋白的表达引起的细胞内钙浓度的上升能引起潜伏感染细胞内普遍的信号传达的活化，被认为有助于HHV-6的高效
再活化。已知HHV-6在脑内的神经胶质细胞中潜伏感染，可以认为在潜伏感染时、或在作为活性高的潜伏感染状态的中间阶段，HHV-6表达SITH-I时，神经胶质细胞内的钙浓度升高。认为脑细胞中的细胞内钙浓度的升高与情绪障碍等精神障碍有较大关系(日本理研年报 2003)。SITH-I蛋白具有与宿主的蛋白质即CAML结合并保持活性、使细胞内钙浓度升高的功能。此外，通过在被认为是表达SITH-I蛋白最强的细胞-脑内的神经胶质细胞中表达该蛋白质，可以诱导精神障碍。由此认为=SITH-I蛋白在疱疹病毒的潜伏感染时或再活化初期表达，具有使宿主产生精神障碍的功能。(b)作为SITH-I蛋白的变体的一个例子，可以是在SEQ ID NO 1氨基酸序列中， 有1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并且具有与SITH-I蛋白同样的使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质。具体来讲，由SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或多个(优选1个或几个，例如，1 40个、1 30个、1 20个、1 15个、更优选10、9、 8、7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸的氨基酸序列所构成，并且具有本发明的所述活性的蛋白质。在这里，氨基酸序列的缺失、取代、插入和/或添加，是指在同一序列中的任意1个或数个氨基酸序列中的位置上，有1个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加。该氨基酸缺失、取代、插入和/或添加，可以是其中的2种以上同时发生，该氨基酸缺失、取代、插入和/ 或添加的数目一般来说越小越好。在上述中，取代优选保守性取代，保守性取代是指特定的氨基酸残基被具有类似物理化学特征的残基所取代，但只要不实质性改变原序列的结构特征，则任意取代均可。作为保守性取代的非限定实例，包括Ile、Val、LeU或Ala的相互取代这样的含脂肪族基团的氨基酸残基之间的取代、Lys与Arg、Glu与Asp、Gln与Asn的相互取代这样的极性残基之间的取代等。在非保守性取代的场合，可以将上述种类中的某1个成员与其他种类的成员交换，不过此时，为了保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选考虑氨基酸的亲水指数(亲水氨基酸指数)(Kyte等，J. Mol. Biol. ,157 :105-131 (1982))。此外，在非保存性取代时，可以根据亲水性进行氨基酸的取代。由在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中缺失、取代、和/或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列所构成的蛋白质，可以通过《Molecular Cloning, ALaboratory Manual 3rd ed. )) (Cold Spring Harbor Press (2001))等中记载的定点变异诱发法等方法制备。在本说明书中，所谓“一个或多个氨基酸”，优选是能够通过定点变异诱发法而缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。需要说明的是，作为对蛋白质的氨基酸序列在保持其活性的同时缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸的方法，在所述的定点变异诱发法之外，还可以列举使用变异原处理基因的方法、选择性地使基因裂开而去除、置换和/或添加选定的核苷酸后进行连接的方法。
(c)本发明的SITH-I蛋白的变体，可以是具有与SEQ ID NO=I的氨基酸序列的同一性至少为80%的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质。氨基酸序列的同一性，优选至少为85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，更优选99. 3%0两个氨基酸序列的同一性％可通过目测检查和数学计算来确定。或者，两个蛋白质序列的同一性百分比可以通过使用以Needleman，S. B. R Wunsch, C. D. (J. Mol. Bol.， 48 :443-453,1970)的算法为基础、从威斯康星大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来确定。GAP程序优选的默认参数包括= (I)Henikoff, S.以 R Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 10915-10919,1992)中记载的计分矩阵 (scoring matrix)、blosum62 ； (2) 12分的空位罚分；(3)4分的空位长度罚分；以及(4)末端空位不罚分。也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比，例如可以使用 Altschul 等(Nuc 1. Acids. Res.，25，p. 3389-3402，1997)中记载的 BLAST程序来对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information (NCBI) ^DNA Data Bank of Japan (DDBJ)网立占i^ffi。i亥网立占对利用BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常使用默认值来进行。此外，两个氨基酸序列的同一性％也可用遗传信息处理软件GENEITX Ver. 7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值检索。(e)本发明的SITH-I蛋白的变体，可以是具有由SEQ ID NO :2的碱基序列中缺失、 取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸而得到的碱基序列所构成的核酸编码的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质。具体来讲，可以使用由在SEQ ID NO :2所示的碱基序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或多个(优选1个或几个，例如，1 120个、1 90个、1 60个、1 30个、1 20个、1 15个、更优选10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)核苷酸而得到的核苷酸序列所构成， 并且，是包括编码具有本发明的所述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。在这里，碱基序列中的核苷酸缺失、取代、插入和/或添加，是指在同一序列中的任意1个或数个的碱基序列的位置上有1个或多个核苷酸缺失、取代、插入和/或添加。该缺失、取代、插入和/或添加可以是其中的2种以上同时发生，该缺失、取代、插入和/或添加的数目一般来说越小越好。(f)本发明的SITH-I蛋白的变体，可以是具有由与SEQ ID NO 2的碱基序列的同一性至少为80%的核酸序列所构成的核酸编码的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质。碱基序列的同一性，优选至少为85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，更优选 99. 3%。两个碱基序列的同一性％可通过目测检查和数学计算来确定。或者更为优选的是，该比较通过使用计算机程序进行序列信息比较来实现。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组(GCG ；威斯康星州Madison)的威斯康星软件包、10. O版“GAP”程序 (Devereux等，1984，Nucl. Acids Res.，12 :387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个碱基序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列，以及进行碱基序列与氨基酸序列之间的比较。
(g)本发明的SITH-I蛋白的变体，可以是由与SEQ ID NO 2的碱基序列的互补碱基序列所构成的核酸在严格杂交条件下杂交的核酸编码，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质。杂交条件的强度主要是由杂交条件，更优选是由杂交条件及清洗条件而决定。本说明书中的“严格条件”中，包括中度严格条件或高度严格条件。具体来讲，作为中度严格条件，例如杂交条件为1XSSC 6XSSC，42°C 55°C& 条件，更优选1 X SSC 3 X SSC，450C 50°C的条件，最优选2 X SSC，50°C的条件。在杂交溶液中，例如，包括约50%的甲酰胺时，采用比所述温度低5至15°C的温度。作为清洗条件，可以举出0. 5 X SSC 6 X SSC, 400C 60°C。在杂交以及清洗时，一般来说可以加入0. 05% 0. 2%，优选加入约0. 1% SDSo作为高度严格的(高严格)条件，包括比中度严格条件在更高温度和/或低的盐浓度下进行杂交和/或清洗。例如可以列举杂交条件为0. IXSSC 2XSSC，55°C 65°C 的条件，更优选0. IXSSC 1父55(，601 651的条件，最优选0. 2XSSC，63°C的条件。作为清洗条件，有0. 2 X SSC 2 X SSC, 500C 68°C的条件，更优选0. 2 X SSC, 60°C 65°C的条件。作为杂交条件，例如可以列举但不限于如下条件在5XSSC，1 % SDS,50mM Tris-HCl (pH7. 5)及50%甲酰胺中在42°C条件下进行预杂交后，添加探针并在42°C下放置一晚使杂交体形成，此后，在0. 2XSSC 0. SDS中，进行3次在65°C下20分钟的清洗。( 抗 SITH-I 抗体以抗SITH-I抗体、SITH-I蛋白或其变体、或它们的部分肽段作为抗原，通过公知的方法，得到作为多克隆抗体或单克隆抗体的抗SITH-I抗体。作为公知的方法，可以举出例如文献(Harlow 等人的"Antibodies :Alaboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New ^rk (1988)) ”、岩崎等人的“单克隆抗体杂交瘤与ELISA、讲谈社(1991) ”) 中所述的方法。这样得到的抗体可以用于SITH-I蛋白的检测/测定等。用语“抗体”表示免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及它们的Fab片段、F(ab，)2 片段、Fc片段)，作为实例，可以列举多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗独特型抗体及人源化抗体，但不限于这些抗体。用语“识别SITH-I蛋白的抗体”是指包括能够与SITH-I蛋白特异性结合的完整的分子及抗体片段(例如，Fab及F(ab’)2片段)。可以使用依据本说明书中公开的方法，或公知的方法而获得Fab和F(ab’ )2以及SITH-I抗体的其它片段。这样的片段，代表性地， 使用以木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)这样的酶，通过基于蛋白质分解的切断而产生。认为情绪障碍患者或有情绪障碍可能性的个体，SITH-I蛋白的表达量增加，其结果SITH-I抗体效价也升高。就本发明而言，在一种方式中，通过对生物学样品中的SITH-I 抗体进行检测，可以鉴定情绪障碍患者或有情绪障碍可能性的个体。
_3] 3.结合有SITH-Ig白的担载体本发明的检测方法1)准备 SITH-I 蛋白；2)使工序1)准备的SITH-I蛋白与担载体结合，
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使用结合有SITH-I蛋白的担载体。SITH-I蛋白的准备为了检测SITH-I抗体，可以使用用于制备蛋白的公知的方法来准备SITH-I蛋白。 虽不局限于此，但例如可以如下进行制备。为了表达SITH-I蛋白，可通过将编码SITH-I蛋白的基因重组到表达载体中，在所期望的宿主细胞中表达。作为宿主细胞，可以列举出哺乳类细胞(例如，虽不局限于此，如来源于人、猴等的灵长类，小鼠(mouse)、大鼠(rat)、中国仓鼠(Chinese hamster) 等的啮齿类，或狗等的细胞)、昆虫细胞(利用杆状病毒(baculovirus)的表达系统、果蝇 (Drosophila)系统等)、酵母、大肠杆菌、植物、枯草芽孢杆菌等。优选大肠杆菌。此外，优选使用例如人的HEK293、HeLa, HepG2,293T,啮齿类的CHO、NIH3T3、PCI2，其他哺乳类的 COS-1、C0S-7、MDCK、Vero，昆虫细胞的Sf9、S2等确立的培养细胞体系。此外还可以使用小麦胚芽提取液、昆虫细胞提取液等无细胞表达系统使蛋白质表达。关于表达载体，本领域技术人员可以适当选择适合用于宿主细胞的表达载体。表达的SITH-I蛋白可以进行纯化。此外，在后述的利用抗生物素蛋白-生物素结合这样的强结合而固定化于担载体的情况下，不需要预先纯化，可以使结合有抗生物素蛋白或者生物素的担载体直接与SITH-I蛋白表达细胞提取液反应，同时进行纯化和固定化。作为SITH-I蛋白的纯化方法，可以使用本领域技术人员周知的方法。可以组合使用通常的离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析等的层析，也可以使用纯化用的标签序列。此时，例如，可以作为与谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、纤维素结合蛋白质、甲壳质结合蛋白质、硫氧还蛋白等的融合蛋白，使SITH-I蛋白在大肠杆菌、哺乳类等的任意宿主中表达，分别利用与谷胱甘肽、麦芽糖、纤维素、甲壳质、硫氧还蛋白的亲和性(例如采用谷胱甘肽固定化柱)来进行纯化。此外，如果预先在和SITH-I的融合部位上预先导入蛋白酶的识别部位，则通过在纯化后用该蛋白酶处理该标签序列，能够进行去除。作为蛋白酶，例如可以是肠激酶、因子 )(a等本领域技术人员周知的蛋白酶。此外，可以使用Hishg、Flaghg、或Mi^p(II)-I1ag 等，通过固定化有离子化的镍、抗Flag抗体、StrepTactin的柱分别进行纯化。并且，为了进一步提高纯化度，可以使多个标签与SITH-I蛋白融合，将纯化法组合后使用。例如，使 SITH-I蛋白的末端与HisTag、BioEASE 等的生物素化序列融合，在宿主中作为重组蛋白表达后，通过镍柱进行纯化，并且通过低亲和性抗生物素蛋白、低亲和性链霉抗生物素蛋白 (例如SA突变蛋白，Roche公司)柱纯化。担载体构成固体担载体的材料包括纤维素、特氟隆(teflon)(注册商标)、硝酸纤维素、琼脂糖、高交联球状琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、聚苯乙烯胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、钼、 银、铜、铁、不锈钢、铁氧体(ferrite)、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、 蛋白质(白蛋白等)、碳或它们的组合等，但不限于上述这些。此外，优选具有一定强度，组成稳定，并且非特异性结合少的材料。固体担载体的形状包括微珠、磁珠、薄膜、微管、滤膜、板、微孔板、碳纳米管、传感器芯片等，但并不限于上述这些。如本技术领域中所知的，可以在薄膜、板等平坦固体担载体上设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。在发明的一个实施方式中，微珠可以具有约25nm 约Imm范围的球体直径。在优选的实施方式中，珠子具有约50nm 约10 μ m范围的直径。虽不局限于此，例如，在期望具有高检测灵敏度的情况下，从待检测物质和与其特异性结合的物质之间的接触频繁程度、清洗操作的容易性这样的观点来看，可以优选使用上述这样的珠子作为固体担载体。使SITH-I蛋白与担载体结合的方法使工序1)准备的SITH-I蛋白与担载体结合。作为使SITH-I蛋白与担载体结合的方法，可以使用用于将蛋白质结合在担载体上的任意的方法。虽不局限于此，例如，疏水结合、共价结合、使用各种各样的标签的方法， 或，利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合的方法等。利用疏水结合、共价结合时，优选预先纯化SITH-I蛋白。利用疏水结合时，利用担载体的疏水性表面与SITH-I蛋白的疏水性部分的相互作用使之结合。具体来讲，例如，将SITH-I蛋白溶液与微孔板等担载体表面直接接触，放置一定时间而使其通过SITH-I蛋白的疏水性部分与担载体的疏水性部分之间的相互作用而结合，从而固定化。所述微孔板等例如有Nimc-Immimo ？板(Nunc公司)、 SpectraPlate-96HB(Perkin Elmer 公司)或 Reacti-Bind 96-ffell Plates Corner Notch (PIERCE公司)等，但不局限于此。另一方面，在共价结合时，通过将官能团配置在担载体表面上，使其与SITH-I蛋白中的官能团结合。为了这样结合，优选使用市售的、在表面上配置有各种官能团的各种担载体。例如，虽不局限于此，作为在表面配置有官能团的微孔板，可以列举无水马来酸板， 例如Reacti-Bind(商标)Maleic马来酸酐活化的聚苯乙烯96孔板(PIERCE公司)；活性氨基板，例如Immobilizer (商标)-氨基模组/板(Nunc公司)；或羧基板，例如ELISA用板MS-8796F(96孔/C型/平底/Carbo)(住友电木公司)。SITH-I蛋白与固体担载体的连接，依照担载体所附的说明书即可。具体来讲，虽不局限于此，可以使用如下所述的，本领域技术人员公知的蛋白质和固体担载体的偶联(coupling)法来进行。例如，通过在交联剂 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的存在下，使经过表面修饰而使羧基外露在表面上的固体担载体的羧基与蛋白质的氨基发生耦合反应，能够使蛋白质与固体担载体连接在一起。或者，在不含伯氨基的PH6. 5 9缓冲液中，将蛋白质与表面通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯化的固体担载体混合，从而使固体担载体表面的羧基与蛋白质的氨基相结合。或者，使用交联剂BS3 (双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸)、DSS (辛二酸二琥珀酰亚胺酯)，将固体担载体表面的氨基和蛋白质的氨基连接在一起、或使用交联剂SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、GMBS (4-马来酰亚胺-N-琥珀酰胺酯)，使固体担载体表面的氨基与蛋白质的硫醇基连接在一起。此外，也可以通过基因工程使SITH-I与固定化用的标签融合。作为这样的固定化标签，例如，除了利用后述的抗生物素蛋白-生物素结合的方法，也可以利用HisTag、 HaloTag (商标)、Flag等。例如在HisTag的场合，使表面上融合有多个(通常5-10个)组氨酸的SITH-I与镍离子化担载体反应，利用HisTag和镍离子的亲和性固定化即可。Mm^Am -勿素结合+牛蛋白之.丨、曰 的结合的，SITH-I蛋白与牛旦iH本的结合
作为本发明中的SITH-I蛋白与担载体的结合方法，可以适宜地使用任意方法。但是，最为优选的是利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合。在本发明中，有时将“生物素-生物素结合性蛋白之间的结合”称为“抗生物素蛋白-生物素结合”。利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合的SITH-I蛋白与担载体的结合方法例如有，A)在结合有生物素结合性蛋白的担载体上，结合生物素化的SITH-I蛋白的方法； B)利用很多生物素结合性蛋白为四聚体这个特点，使结合有生物素的担载体与生物素结合性蛋白结合，并且进一步结合生物素化的SITH-I蛋白的方法；C)在结合有生物素的担载体上，结合生物素结合性蛋白-SITH-I融合蛋白的方法等。以下详细叙述。牛物素 “生物素”是D-[⑴-顺-六氢-2-氧代-IH-噻吩并-(3，4)-咪唑_4_戊酸]的一般名称。是分类于维生素B族的水溶性维生素的一种，也称为Vitamin B7(维生素B7), 或者有时也被称为维生素H、辅酶R。生物素与蛋清中所包含的糖蛋白中的一种、即抗生物素蛋白的结合非常强，从而使其吸收受阻。为此，存在由于大量摄取生蛋清而导致的生物素缺乏症。本说明书中的“生物素”除上述生物素之外，还包括亚氨基生物素(imino biotin) (Hofmann 等人(1980) Proc Natl Acad Sci USA 77 :4666-4668)、脱硫生物素(desthio biotin) (Hirsch 等人 Q002) Anal Biochem 308 :343-357)、或生物胞素(biocytin)、生物素亚砜(biotin sufoxide)等生物素类似物。使用生物素-抗生物素蛋白(生物素结合性蛋白)复合体的系统广泛用于生物化学、分子生物学、组织免疫学、DNA分析、临床化验等领域。在本发明中，作为使SITH-I与担载体结合的方法之一，可举出利用生物素-抗生物素蛋白结合，使SITH-I结合在担载体上的方法。生物素结合性蛋白作为生物素结合性蛋白，只要是能够与抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、卵白素(neutravidin)、AVR 蛋白(Biochem. J.，(2002)，363 :609-617)、Bradavidin (J. Biol. Chem.，(2005)，280 :13250-13255)、Rhizavidin (Biochem. J.，(2007),405 :397-405)、 tamavidin (W002/07^17)、它们的变体等生物素强结合的蛋白质，其中的任何物质均可优选使用。优选至少与生物素的解离常数(KD)为10_8以下、更优选为10,以下，进而更优选为10_12以下。但是，就添加到被检测样品中的生物素结合性蛋白、以及用于封闭担载体的生物素结合性蛋白而言，并不局限于此。作为生物素结合性蛋白，尤其是可以优选使用在大肠杆菌中高表达的tamavidin 和其变体。tamavidin是从作为食用蘑菇的担子菌白黄侧耳(Pleurotus conucopiae)中发现的生物素结合性蛋白(W002/072817、Takakura 等人 Q009)FEBS J 276:1383-1397)。 作为tamavidin的变体，可以列举例如高结合能力/低非特异性结合tamavidin(PCT/ JP2009/64302)等。本发明的“tamavidin” 是指 tamavidin 1 (TMl)、tamavidin 2(TM2)、或它们的变体。具体来说，典型地，本发明的tamavidin可以是包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7的氨基酸序列的蛋白质，或也可以是由包含SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的碱基序列的核酸编码的蛋白质。或者，本发明的tamavidin可以是这样的蛋白质，其是包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7的氨基酸序列的蛋白质或由包含SEQ ID NO :4或SEQ IDNO :6的碱基序列的核酸编码的蛋白质的变体，并且与tamavidin 1或2具有同样的生物素结合活性；或者可以是具有高结合能力/低非特异性结合活性的蛋白质。在本说明书中，有时将tamavidin Utamavidin 2以及它们的变体统称为“tamavidin”。tamavidin 1或2的变体是包含在SEQ ID NO :5或7的氨基酸序列中缺失、取代、 插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且是与tamavidin 1或2具有同样生物素结合活性的蛋白质。关于“缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸”的定义，与上述SITH-I蛋
白中一样。tamavidin 1或2的变体，进一步而言可以是包含与SEQ ID NO :7或5的氨基酸序列具有至少60%以上、优选65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上、更优选99. 3%以上氨基酸同一性的氨基酸序列，并且与tamavidinl或2具有相同生物素结合活性的蛋白质，或具有高结合能力/低非特异性结合活性的蛋白质。关于“氨基酸序列的同一性％”的定义，与上述SITH-I蛋白中一样。并且，tamavidin的变体也包括如下(i)具有由在SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的碱基序列中，有1个或多个核苷酸缺失、取代、插入和/或添加的碱基序列所构成的核酸所编码的氨基酸序列，并且与 tamavidin 1或2具有相同生物素结合活性的蛋白质，或具有高结合能力/低非特异性结合活性的蛋白质。(ii)具有由与SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列所构成的核酸所编码的氨基酸序列，并且与tamavidin 1或2具有相同生物素结合活性的蛋白质，或具有高结合能力/低非特异性结合活性的蛋白质。(iii)具有由与SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的碱基序列的互补碱基序列所构成的核酸在严格杂交条件下杂交的核酸所编码的，且与tamavidin 1或2具有相同生物素结合活性的蛋白质，或具有高结合能力/低非特异性结合活性的蛋白质。关于“1个或多个核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加”、碱基序列的“80%以上的同一性”、“严格杂交条件”等的定义，与上述SITH-I蛋白中一样。需要说明的是，利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合使SITH-I蛋白与担载体结合时，优选在此使用的“生物素结合性蛋白”具有生物素结合能力。由此，虽不局限于此，上述tamavidin 1或tamavidin 2的变体，与利用它们的野生型形成融合蛋白的情况相比，优选生物素结合活性无明显减少。由此，非限定地，tamavidin 1的变体优选如下序列SEQ ID NO 5的氨基酸序列中N14、S18 J34、S36、S78、W82、W98、W110、D118未被修饰。需要说明的是，该表述例如TO4 是表示SEQ ID NO :5的氨基酸序列34位的酪氨酸残基。或者，在对这些氨基酸进行修饰的情况下，优选被修饰为性质或结构类似的氨基酸，优选分别进行如下修饰，例如当为天冬酰胺(附4)时，可以修饰为谷氨酰胺⑴)、天冬氨酸(D)，优选修饰为天冬氨酸；当为丝氨酸(S18、S36、S78)时，可以修饰为苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)，优选修饰为苏氨酸；当为酪氨酸 (Y34)时，可以修饰为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或苯丙氨酸(F)，优选修饰为苯丙氨酸；当为色氨酸(W82、W98、W110)时，可以修饰为苯丙氨酸(F)；当为天冬氨酸(Dl 18)时，可以修饰为谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)，优选修饰为天冬酰胺。此外，tamavidin 2的变体优选在SEQ ID NO 7的氨基酸序列中的四个色氨酸残基(W69、W80、W96、W108)未被修饰。或者，在对这些氨基酸进行修饰的情况下，优选被修饰为性质或结构类似的氨基酸，例如苯丙氨酸(F)。此外，期望被认为与生物素直接进行相互作用的氨基酸残基(附4、S18、Y34, S36、S76、T78、D116)也未被修饰。或者，在对这些氨基酸进行修饰的情况下，优选修饰为性质或结构类似的氨基酸从而可以保持与生物素的结合，优选分别进行如下修饰，例如为天冬酰胺(N14)时，可以修饰为谷氨酰胺⑴)、天冬氨酸(D)，优选修饰为天冬氨酸；当为天冬氨酸(D40)时，可以修饰为天冬酰胺(N)；当为丝氨酸(S18、S36、S76)时，可以修饰为苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)，优选修饰为苏氨酸；当为酪氨酸(TO4)时，可以修饰为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或苯丙氨酸(F)，优选修饰为苯丙氨酸；当为苏氨酸(T78)时，可以修饰为丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)，优选修饰为丝氨酸；当为天冬氨酸 (D116)时，可以修饰为谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)，优选修饰为天冬酰胺。在本发明中，优选的tamavidin修饰体包含以下(PCT/JP2009/64302)在包含SEQ ID NO 7所述的氨基酸序列、或者在该序列中具有1个 多个氨基酸突变的氨基酸序列、或者与该序列具有80%以上同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自下组中的1个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质DSEQ ID NO 7的104位的精氨酸残基；2) SEQ ID NO 7的141位的赖氨酸残基；3) SEQ ID NO 7的洸位的赖氨酸残基；以及4) SEQ ID NO 7的73位的赖氨酸残基。更优选选自下组中的修饰型生物素结合蛋白质在SEQ ID NO 7中，104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(R104E-K141E)；在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E)；在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-K141E)；以及在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E-K141E)。结合有生物素结合性蛋白的担载体作为利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合将SITH-I蛋白结合到担载体上的方法，例如可以列举出如下方法:A)在结合有生物素结合性蛋白的担载体上结合生物素化SITH-I蛋白的方法；B)利用很多生物素结合性蛋白为四聚体这个特点，使结合有生物素的担载体与生物素结合性蛋白结合，并且进一步结合生物素化的SITH-I蛋白的方法；C)在
19结合有生物素的担载体上，结合生物素结合性蛋白-SITH-I融合蛋白的方法等。作为制作结合有生物素结合性蛋白的担载体的方法，可以使生物素结合性蛋白与担载体直接结合(上述实施方式A)。或者，可以购买预先固定化有生物素结合性蛋白的担载体(上述实施方式A)。或者，利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，在生物素化的担载体上，结合生物素结合性蛋白质(上述实施方式B)。或者，利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，在生物素化担载体上结合生物素结合性蛋白-SITH-I融合蛋白(上述实施方式C)。作为直接结合生物素结合性蛋白的方法，如在所述SITH-I蛋白与担载体的结合方法中详细记载的那样，有利用疏水结合和共价结合的方法等。此外，可以在如NEW ELISA Plate试剂盒(住友电木公司)的微孔板上，按照试剂盒所附的说明书使生物素结合性蛋白直接结合，而进行固定化。需要说明的是，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白，是例如SIGMA 公司等市售的。作为固定化有生物素结合性蛋白的担载体，可以列举例如=Reacti-Bind ？ Streptavidin Coated Plates(PIERCE 公司)> Nunc Streptavidin Coated 96 Micro Well Plates (Nalge Nunc 公司)等的微孔板类，或 Dynabeads M-280Streptavidin (Dynal 公司)、MagnaBind ？ Streptavidin Beads (PIERCE公司)等的磁珠类的市售品，但不局限于此。此外，如同上述，可以将担载体生物素化，利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，使生物素结合性蛋白与担载体结合。作为使担载体生物素化的方法，可以列举使用例如生物素化试剂的方法。作为生物素化试剂，可以利用例如=PIERCE公司制造的(括号内按照顺序为接头长度、反应基团)EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-生物素(13.5A、伯胺)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LC-生物素(22.4A、伯胺)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LCLC-生物素(30.5A 、伯胺)、EZ-Link(注册商标)PFP-生物素(9.6 A、胺)、EZ-Link(注册商标)马来酰亚胺-PE02-生物素09.1A、巯基)、EZ-Link(注册商标)生物素-PE02胺( 20.4A、羧基)、EZ-Link (注册商标)生物素-PE03-LC Amine ( 22.9A、羧基)、EZ-Link (注册商标) 生物素-酰胼(15.7A、醛基)、EZ-Link(注册商标)生物素-LC-酰胼(24.7A、醛基)、 EZ-Link(注册商标)NHS-亚感激生物素(13.5A、伯胺)等，但并不限于上述物质。利用上述生物素化试剂，使用公知的方法，可以使生物素结合在微孔板、微珠、或传感器芯片等期望的担载体上。例如有使用具有氨基、羧基、巯基、甲苯磺酰基、环氧基、 马来酰亚胺基、活性酯等各种官能团的担载体(例如磁珠、kpharose珠子、琼脂糖珠子 (agarose beads)、胶乳珠子、微量滴定板等)的方法。此时例如，在使用含NHS酯的生物素化试剂的情况下，可以利用如DMSCKdemethlvsulfoxide，二亚基亚砜)这样的有机溶剂或 PH7至9的磷酸缓冲液溶解含NHS酯的生物素化试剂，并通过添加到具有氨基的固定化担载体中从而使生物素结合。此外例如，在使用含氨基的生物素化试剂的情况下，还可以使用如 EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(l-ethyl-3-(3-dimethylaminopr opyDcarbodiimide hydrochloride))这样的碳二亚胺，使固定化担载体的羧基变成活性酯，然后，添加在PH5附近的缓冲液中溶解的生物素化试剂，从而使生物素结合。需要说明的是，就经生物素化的固定化担载体而言，优选对未反应的官能团进行去活化后，利用BSA 等进行封闭。此外，可以利用经生物素化的市售担载体。作为经生物素化的微孔板，可以利用例如Reacti-Bind 生物素包被的聚苯乙烯板(PIERCE公司制造)，但不限定于此。作为经生物素化的微珠，例如，作为磁珠，可以利用BioMagBiotin (Polysciences公司制造)，或作为纳米磁珠，可以利用Corefront公司制造的nanomag(注册商标)-D生物素、nanomag(注册商标)-二氧化硅生物素，或作为聚苯乙烯制的微珠，可以使用Beadlyte (注册商标)生物素珠子(Upstate公司制造)，或作为琼脂糖可以使用Sigma公司制造的生物素琼脂糖、 2-亚氨基生物素-琼脂糖，或作为高交联琼脂糖，可以使用生物素-S印harosdBiosearch Technologies公司制造)，但并不限定于上述这些。就连接担载体与生物素的接头的长度而言，优选至少长于5 A，更优选为13.5 A 以上。牛物素化SITH-I蛋白在本发明中，也可以使SITH-I蛋白与生物素结合而制作生物素化SITH-I蛋白，利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，将其结合在结合有生物素结合性蛋白的担载体上。作为结合有生物素结合性蛋白的担载体，如上所述，可以使生物素结合性蛋白与担载体直接结合，或者，可以购买预先固定化有生物素结合性蛋白的担载体(上述实施方式A)。或者，利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，在生物素化的担载体上结合生物素结合性蛋白质(上述实施方式B)。作为生物素化SITH-I蛋白的制作方法，没有特别的限制。例如，可以使用生物素标记试剂盒(虽不局限于此，例如=EZ-Link (注册商标)NHS-Lc-生物素PIERCE公司)、生物素标记试剂盒-NH2 (D0JIND0 MOLECULAR TECHNOLOGIES INC.公司)等，使 SITH-1 蛋白与生物素结合。或者使SITH-I基因与编码包括生物素化序列在内的肽的DNA融合，通过构建表达该融合基因的载体，在任意的宿主中作为与生物素化序列的融合蛋白表达，可以制作生物素化 SITH-I (Schwarz 等人.，(1988) · J. Biol. Chem. 263 :9640-9645.)。作为这样的载体虽不局限于此，例如可以列举包含hvitrogen公司的 BioEase (商标)标签的载体。其中，作为哺乳类细胞表达用，有pcDNA (商标)6载体；作为大肠杆菌表达用，有PET104载体；或作为果蝇表达用，有pMT/Biofese载体。并且，优选在SITH-I蛋白的生物素化时，也可以使用于将所述载体生物素化时相同的方法。也就是说，可以列举使用例如生物素化试剂的方法。作为生物素化试剂，可以利用例如=PIERCE公司制造的(括号内按照顺序为接头长度、反应基团)EZ-Link(注册商标) 磺基-NHS-生物素(13.5A、伯胺)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LC-生物素(22.4A 、伯胺)、EZ-Link (注册商标)磺基-NHS-LCLC-生物素(30.5A、伯胺)、EZ-Link (注册商标)PFP-生物素(9.6A、胺)、EZ-Link(注册商标)马来酰亚胺-PE02-生物素(29.lA、 巯基)、EZ-Link (注册商标)生物素-PE02 Amine ( 20.4A、羧基)、EZ_Link (注册商标)生物素-PE03-LC胺(22.9A、羧基)、EZ-Link(注册商标)生物素-酰胼(15.7A、醛基)、
EZ-Link (注册商标)生物素-LC-酰胼24.7A、醛基)、EZ_Link (注册商标)NHS-亚氨基生物素(13.5A、伯胺)等，但并不限于上述物质。利用上述生物素化试剂，使用公知的方法，可以使生物素结合在SITH-I蛋白上。 例如，在使用含NHS酯的生物素化试剂的情况下，可以利用如DMSO ( 二亚基亚砜)这样的有机溶剂或PH7至9的磷酸缓冲液溶解含NHS酯的生物素化试剂，并添加到具有氨基的固定化担载体中从而使生物素结合。此外例如，在使用含氨基的生物素化试剂的情况下，还可以使用如EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(l-ethyl-3-(3-dimethylamin propyl) carbodiimide hydrochloride))这样的碳二亚胺，使固定化担载体的羧基变成活性酯，然后，添加在PH5附近的缓冲液中溶解的生物素化试剂，从而使生物素结合。此外，使用这样的生物素化试剂制造生物素化SITH-I蛋白时，优选如同上述，预先纯化SITH-I蛋白。 在本发明中，可以准备结合有生物素结合性蛋白的担载体和生物素化SITH-I蛋白后使两者接触，通过生物素-生物素结合性蛋白之间的结合使担载体与SITH-I蛋白结
I=I O虽不局限于此，生物素化SITH-I蛋白与担载体的结合，例如可以通过如下方法进行。将含有生物素化SITH-I蛋白的细胞破碎粗提取液，制作成总蛋白浓度0. lmg/ml至5mg/ ml，优选0. 2mg/ml至2mg/ml。将此在4°C至40°C，优选15°C至30°C条件下与结合有生物素结合性蛋白的担载体接触5分钟至2小时，优选30分钟至1小时。通过此操作，生物素化 SITH-I蛋白被固定化在结合有生物素结合性蛋白的担载体上。此后，优选在0. 05%至1%， 进一步优选0. 1 %至0. 3%的Tween20等界面活性剂的PBS或者TBS等的缓冲液中，洗去多余的细胞破碎粗提取物。此外，通过这样与使细胞破碎粗提取液接触而使生物素化SITH-I蛋白结合，事实上，是同时进行了纯化和固定化。因此，此时不需要其他的纯化操作。再或者，也可以使制备为0. 1 μ g/ml至5 μ g/ml浓度的纯化生物素化SITH-I蛋白与结合有生物素结合性蛋白的担载体接触。4.牛物学样品与结合有SITH-I蛋白的担载体接触本发明的方法中，在工序2)准备结合有SITH-I蛋白的担载体之后，工序3)是使工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体与生物学样品接触，从而进行SITH-I蛋白抗体的检测。生物学样品与担载体的接触没有特别限制，可以用任意的方法进行。一般来说， 在利用了担载体的检测方法中，为了使导致背景信号的非特异性结合减少，有使在检测用试剂中包含细菌成分提取液的方法(日本特开昭59-99257)；将导入有与用于生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的载体同种的、且不含编码该蛋白质的基因的载体的宿主细胞的培养成分添加到样品中的方法(日本特开平8-4339 ；对来自和生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的细胞相同种、且不含该蛋白质的细胞的水提取液进行加热处理后，将其水溶性级分添加到样品中的方法(日本特开2004-301646)等。添加细胞提取液以往的方法对来源于自身免疫性疾病患者、或虽是健康人但自身抗体等的背景高的检验对象的SITH-I蛋白抗体的测定，因非特异性结合多而难以实现。
本发明人等深入研究，结果发现了即使是来源于这样的检验对象的样本，通过使得生物学样品与担载体接触时有细胞破碎提取液存在，能够进行SITH-I蛋白抗体的测定。因此，作为本发明的一种实施方式，优选在工序3)中，将(a)生物学样品，以及(b)由与用于表达工序1)的SITH-I蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液混合后添加至由工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体中。特别是，在利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，将SITH-I蛋白结合在担载体上的体系中，通过如下方法，能够得到更加显著的效果。在工序3)中，将(a)生物学样品；以及(b)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，所述细胞破碎提取液由与用于表达工序1)或2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备，混合后添加至由工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体中。细胞破碎提取液的来源细胞可以是大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳类细胞、昆虫细胞、植物细胞等，没有特别限制，优选与用于表达SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/ 或用大肠杆菌制备的生物素结合性蛋白的宿主细胞相同种的细胞。例如，在SITH-I蛋白、 生物素化SITH-I蛋白、和/或用大肠杆菌制备的生物素结合性蛋白是利用大肠杆菌制备的情况下，优选细胞破碎提取液也通过大肠杆菌来制备。此外，在通过无细胞系表达SITH-I 蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白时，使用的细胞破碎提取液可以直接使用，或者可以将细胞破碎提取液悬浮在所期望的缓冲液中来使用。此外，SITH-I蛋白、和/或生物素化SITH-I蛋白可以不是通过基因工程技术来表达的，而是从本来就具有这些蛋白质的细胞中间进行提取和纯化的。例如，用tamavidin作为生物素结合性蛋白时，可以使用担子菌白黄侧耳(Pleurotus conucopiae)细胞的细胞破碎提取液。如上所述，本发明的细胞提取液也包括本来就含有生物素结合性蛋白和/或 SITH-I蛋白的细胞的破碎提取液。此外，用于制备细胞破碎提取液的细胞可以含有任意载体，优选含有空载体。空载体可以是与用于表达SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白时使用的载体相同种、并且不含编码上述这些蛋白质的基因的载体，或者，例如可以是使这些空载体进一步含有任意核酸的任意的载体。此外，用于表达SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、 和/或生物素结合性蛋白时使用的载体，可以是不同种类的载体。作为细胞的破碎提取液，只要是细胞来源的成分即可，没有特别限制，例如，可以使用其蛋白质成分、糖类成分、脂质成分或它们的混合成分。优选可以使用细胞的可溶性提取物。细胞的破碎提取液的制备方法没有特别限制，可以使用各种方法。通常，可以如下制备将在适当的培养基培养的细胞，通过使用超声波等物理方法或表面活性剂等化学方法、或酶处理等进行破碎或可溶化，以及进行离心分离或过滤等操作，从而得到可溶性成分。此外，为了延长保存寿命，优选向通过离心分离或过滤等得到的澄清液体中，添加例如蛋白酶抑制剂，或实施高压灭菌处理等加热处理，对来源于细胞的各种酶等进行抑制或使其失活。细胞破碎提取液的添加浓度，可以根据产生的非特异反应的强度来改变，可以适当设定吸收该非特异反应的充分的浓度。作为制备细胞破碎提取液的具体方法的实例，虽不局限于此，例如在大肠杆菌细胞的情况下，可以将大肠杆菌(可以含有载体，或载体可以含有编码生物素结合性蛋白的基因)，接种到含抗生素的LB培养基中，在25°C 37°C振荡培养使0D600的吸光度达到 0. 1 1，优选达到0. 3 0. 8，然后，添加0. OlmM 5mM、优选0. ImM ImM的IPTG，进一步，在4°C 37°C，优选25 V 37°C，进行2小时 48小时、优选进行4小时 M小时的振荡培养。对培养液进行离心回收菌体，将菌体悬浮到所期望的缓冲液中，然后破碎，离心破碎液，回收其上清作为大肠杆菌粗提取液。在向生物学样品中混合细胞破碎粗提取液的情况下，虽不局限于此，使通过所期望的缓冲液(可以含有BSA或酪蛋白、市售的封闭剂等)制备的总蛋白质浓度为0. 05mg/ ml 5mg/ml、优选为0. 5mg/ml 5mg/ml的细胞破碎粗提取液，与样品在4°C 37°C、优选在15°C 30°C反应1分钟 M小时、优选反应10分钟 4小时，更优选反应30分钟 2 小时。需要说明的是，当生物学样品为血清等时，虽不局限于此，可以将上述细胞破碎粗提取液稀释10倍 10000倍，优选100倍 1000倍，更优选100倍 500倍后使用。添加牛物素结合件蛋白本发明人发现更优选在使生物学样品与担载体接触时，与细胞破碎提取液一起， 使生物素结合性蛋白同时存在。因此，在本发明的一个优选实施方式中，在工序3)中，将(a)生物学样品；以及 (b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，所述细胞破碎提取液由与用于表达工序1)或2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备，或(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)或 2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；混合后添加至由工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体中。在本发明的方法中，通过在生物学样品中添加生物素结合性蛋白，能够有效地抑制背景信号。这样的生物素结合性蛋白可以是上述生物素结合性蛋白中的任一种，没有特别限制。此外，可以是野生型也可以是变体，与野生型相比，生物素结合能力可以是相同的，也可以更高，或可以更低。此外，作为添加的方式，可以直接添加生物素结合性蛋白(可以是天然来源的，也可以是通过基因工程表达的蛋白质)的粉末，也可以溶解在适当的液体中然后添加。此外， 也可以为如下方式例如，不将生物素结合性蛋白直接添加到样品中，而是借助固定有生物素结合性蛋白的担载体(例如过色谱柱)来处理样品和细胞破碎提取液的混合物。(工序 b-i)。生物素结合性蛋白的浓度以最终浓度计为lyg/ml 500yg/ml、优选为10yg/ml ΙΟΟμ g/ml。在通过基因工程在该细胞中表达生物素结合性蛋白的情况下，生物素结合性蛋白的浓度也可以为同样的浓度，但不局限于此。或者，也可以使用细胞提取液，该细胞提取液是将编码生物素结合性蛋白的基因导入宿主细胞中并表达后，并破碎该宿主细胞得到的包含生物素结合性蛋白的细胞提取液 (工序b-ii)。此时，在所期望的宿主中，生物素结合性蛋白可以通过本领域技术人员公知的方法来表达，但通过基因工程表达工序1)或2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和 /或生物素结合性蛋白时，优选是与其宿主是相同种的。此外，与通过基因工程表达SITH-I 蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主不同时，虽不局限于此，在生物学样品中添加并使其反应的细胞提取液可以使用来源于双方的宿主细胞的细胞提取液。当宿主为大肠杆菌时，将编码生物素结合性蛋白的基因重组到表达载体中，并将该表达载体导入大肠杆菌，在诱导蛋白质表达的同时，进行大肠杆菌的培养。表达载体、宿主大肠杆菌株、培养基成分、IPTG浓度、培养温度等诱导条件，可以适当选择。向担载体上添加牛物学样品等可以利用任意方法向担载体中添加生物学样品、细胞破碎提取液以及生物素结合性蛋白质。但是，在生物学样品与担载体接触的同时或接触之前，生物学样品必须与细胞破碎提取液以及生物素结合性蛋白质接触。即，只要使生物学样品在与担载体接触的同时，或在接触之前，与细胞破碎提取液以及生物素结合性蛋白质充分接触即可，不是必须最终将细胞破碎提取液来源的成分和生物学样品一起添加到担载体中。例如，可以制作结合有细胞破碎提取液成分的担载体，并向其使用经处理的生物学样品。具体来说，可以举出使生物学样品在与担载体接触之前，通过细胞破碎提取液成分色谱柱等的实施方式。需要说明的是，在添加后，虽没有特别限制，将生物学样品和细胞破碎提取液与担载体在10°C至30°C、优选20°C至30°C下，反应10分钟至4小时、优选反应30分至2小时。5. SITH-I蛋白抗体的检测方法本发明的检测方法，在工序3)中进行SITH-I蛋白抗体的检测。对SITH-I蛋白抗体进行检测的方法，本领域技术人员而可以适当选择。作为优选的方法，可以列举酶结合免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)等免疫分析法、 表面等离子共振法等这样的分析法。使通过抗生物素蛋白-生物素结合固定化的SITH-I 蛋白抗体，与生物学样品反应后，对该SITH-I蛋白抗体进行检测。在免疫分析中，将作为抗原的SITH-I蛋白固定化、使其与存在于生物学样品中的 SITH-I蛋白抗体发生反应，利用本领域技术人员公知的方法进行检测。例如，相对于结合有SITH-I蛋白的SITH-I蛋白抗体，使用识别并结合人抗体的例如抗人抗体作为第二抗体来。此时，通过预先用荧光、酶、或放射性同位素进行标记该抗人抗体，可以通过测定最终的荧光量、酶活性、或放射性量，来间接地对抗体的量进行测定、定量。上述标记可以通过本领域技术人员所公知的方法进行，此外也可以使用市售的、 由荧光、酶标记的抗人抗体等。作为荧光标记，还可以考虑例如通过荧光素及罗丹明等标记、GFP(绿色荧光蛋白)等荧光蛋白进行标记。作为酶标记，可以利用过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶、葡萄糖氧化酶等，但并不限于上述这些酶。用于通过这些酶测定的基质是市售的，例如为过氧化物酶时，可以使用TBA、化学发光法用的基质。此外，作为放射性同位素，可以举出例如碘(1251、1211)、碳(14C)、硫(%)、以及氣(3H),为核酸时，可以举出磷(32P)寸。生物学样品(sample)中存在的抗体的量，可以使用例如直线回归计算机算法，通过与标准的制备物(例如为临床样本时，健康人的标准样品或者典型患者的标准样品)中存在的量进行比较可以简单地算出。用于检测抗体的这样的分析法，例如，关于ELISAjn Iacobelli 等人，Breast Cancer Research and Treatment 11:19-30(1988)中所记载。或者，例如，当SITH-I蛋白的抗体效价低时，由于非特异性结合导致的背景信号的影响增大。此时，如实施例所示，通过从测定值中适当地减去没有固相化抗原的区域的测定值，能更正确地求出抗体的量。例如，当生物学样品中的SITH-I蛋白的抗体少时(抗体效价低时)、或血清等的生物学样品中的非特异性结合多时，非特异性结合对背景信号的影响变大。为此，通过从测定值中适当地减去背景信号，可以更为正确地对想要检测的物质进行测定。本领域技术人员能够根据实验体系适当地判断所减去的背景。例如实施例2至4中所记载的，下述实施方式也是有效的从固定化有SITH-I抗原的担载体的测定值，减去没有固定化SITH-I抗原的区域(但与固定化有SITH-I抗原的区域一样，进行了 BSA等的封闭操作，并且添加了含抗SITH-I抗体的血清(生物学样品)) 的测定值。或优选，通过减去固定化有人类不具有抗体的任意蛋白质(可以列举GFP等，但不局限于此)的区域的测定值，能更正确地求出抗体的量。固定化的方法没有特别限制，优选将对象的蛋白质生物素化，通过生物素-生物素结合性蛋白之间的结合而固定化在结合有生物素结合性蛋白的担载体上。本发明的检测方法，能够对血清中的抗体效价低的SITH-I蛋白抗体进行特异性检测。II.结合有SITH-I蛋白的担载体本发明还提供一种用于检测生物学样品中的SITH-I蛋白抗体的担载体。本发明的担载体是结合有SITH-I蛋白的担载体，作为结合方法，如上所述，可以列举疏水结合、共价结合、抗生物素蛋白-生物素结合等的方法、使用各种各样的标签的方法等。本发明的担载体，更优选为其特征在于=SITH-I蛋白与担载体通过生物素-生物素结合性蛋白之间的结合而结合在一起。本发明的担载体，优选为是以如下方法所制备的1)准备结合有生物素结合性蛋白的担载体，以及生物素化SITH-I蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，使工序1)中准备的担载体与生物素化SITH-I蛋白结合。其中，1)的生物素结合性蛋白，可以直接与担载体结合，也可以藉由生物素与担载体结合。III.试剂盒本发明还提供一种用于检测生物学样品中的SITH-I蛋白抗体的试剂盒。本发明的试剂盒，包括A)结合有所述SITH-I蛋白的担载体；以及，
B)用于稀释生物学样品的试剂，其含有由与用于表达A)的SITH-I蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液。关于“结合有所述SITH-I蛋白的担载体”，同上所述。用于稀释生物学样品的试剂，可以是细胞破碎提取液(以及生物素结合性蛋白) 本身，或者是将细胞破碎提取液与生物学样品一起进一步稀释的试剂，也可以含有适当的缓冲液、市售的细胞稀释液或血清稀释液等的溶剂。此外，本发明的试剂盒，优选为A)的担载体，是通过生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，结合有SITH-I蛋白的担载体；并且，B)的试剂，是用于稀释生物学样品的包含下述i)或ii)的试剂，i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，所述细胞破碎提取液由与用于表达A) 的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备，或ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序A)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞。关于“通过生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，结合有与SITH-I蛋白的担载体”，同上所述。此外，关于“由与用于表达A)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备的细胞破碎提取液”，“生物素结合性蛋白” “由在与用于表达工序A)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液”，同上所述。此外，本发明的试剂盒，包括A)所述 SITH-I 蛋白；B)用于固定化A)的SITH-I蛋白的担载体；以及C)用于稀释生物学样品的试剂，其含有由与用于表达A)的SITH-I蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液。关于“所述SITH-I蛋白”，当利用疏水结合、共价结合等而与担载体结合时，优选是经过纯化的。利用上述的使用各种各样的标签的方法、利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合的方法时，如同上述，优选是结合有该标签、生物素的SITH-I蛋白。“用于固定化A)的SITH-I蛋白的担载体”，可以使用上述的担载体，优选进行过用于与“所述SITH-I蛋白”结合的处理的担载体。“由与用于表达A)的SITH-I蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液” “用于稀释生物学样品的试剂”也是如同上述。所述本发明的试剂盒，优选如下所述A)的SITH-I蛋白是生物素化的；B)的担载体直接或间接地与生物素结合性蛋白结合；C)的试剂，是用于稀释生物学样品的包含下述i)或ii)的试剂，
i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，所述细胞破碎提取液由与用于表达A)或B)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备，或ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序A)或B)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞。SITH-I蛋白的生物素化的方法，与生物素结合性蛋白直接或间接地结合的担载体，如同上述。此外，“由与用于表达A)或B)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备的细胞破碎提取液”、“生物素结合性蛋白”、“由在与用于表达工序A)或B)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液。”、“用于稀释生物学样品的试剂”如同上述。实施例以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但这些实施例不是用于限定本发明的技术范围。本领域技术人员依据本说明书的记载可以容易地对本发明进行修饰/变更，这些也包含在本发明的技术范围内。在本说明书的实施例1至3中，利用大肠杆菌表达来源于人疱疹病毒6 (HHV-6)的 SITH-I蛋白和生物素化序列anvitrogen公司的Biofese标签)的融合蛋白，使由此得到的大肠杆菌粗提取液直接与tamavidin2(以下，记载为“TM2”)固定化微孔板反应，融合蛋白通过tamavidin-生物素结合与微孔板结合。在这样得到的SITH-I蛋白质结合板中，与利用大肠杆菌粗提取液稀释的人血清 (包含兔抗SITH-I抗体。因市售的人血清中不包含抗SITH-I抗体，在本试验中，作为样本， 使用了向市售的人血清中加入逐级稀释的兔抗SITH-I抗体(抗血清)而得到的血清。)反应，对人血清中包含的抗SITH-I抗体效价进行了测定。实施例1构建SITH-I与生物素化序列(Bic^ase标签)的融合蛋白的表达用载体设计编码融合蛋白的基因，该融合蛋白是在SITH-I蛋白的N末端配置有Biofese 标签的融合蛋白。该BioEase标签是包含在生物体内(此情况为大肠杆菌中)，通过生物体内的生物素化酶被生物素化的序列的肽标签。将Biofese-SITH-I融合蛋白的氨基酸序列表示在SEQ ID NO 8中，将编码的碱基序列表示在SEQ ID NO :9中。1-1.引物的设计为了构建Biofese-SITH-I融合基因，首先，设计了用于扩增SITH-1基因的引物。也就是说，设计了由编码SITH-I蛋白的N末端部位的DNA序列所构成的引物 (SITHlNtermGff-F)和逆向编码SITH-I蛋白的C末端部位的DNA序列所构成的引物 (SITHlCtermGff-R)。将用于构建SITH-I和Biofese标签的融合基因的引物表示在表1中。[表 1]SITH-I基因扩增用引物
权利要求
1.一种用于检测生物学样品中的由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质 (SITH-I)的抗体的方法，该方法包括1)准备SITH-I蛋白；2)使工序1)准备的SITH-I蛋白与担载体结合；3)使生物学样品与工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体接触，检测SITH-I蛋白抗体。
2.权利要求1所述的方法，其中，SITH-I蛋白选自以下的组(a)具有SEQID NO 1的氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQID NO :1的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；(c)具有与SEQID NO 1的氨基酸序列的同一性至少为80%的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；(d)具有由SEQID NO 2的碱基序列构成的核酸编码的氨基酸序列的蛋白质；(e)具有由SEQID NO :2的碱基序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸而得到的碱基序列构成的核酸编码的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；(f)具有由与SEQID NO :2的碱基序列的同一性至少为80%的核酸序列构成的核酸编码的氨基酸序列，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质；以及(g)由与由SEQID NO :2的碱基序列的互补碱基序列构成的核酸在严格杂交条件下杂交的核酸编码，并且具有使细胞内钙浓度上升的活性的蛋白质。
3.权利要求1或2所述的检测方法，其中，在权利要求1的工序3)中，将(a)生物学样品，以及(b)由与用于表达工序1)的SITH-I蛋白的宿主细胞同种的细胞制备的细胞破碎提取液混合后添加至由工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体中。
4.权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中，在权利要求1的工序2)中，利用生物素-生物素结合性蛋白之间的结合，使SITH-I蛋白与担载体结合。
5.权利要求4所述的检测方法，其中，在权利要求1的工序3)中，将(a)生物学样品；以及(b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，所述细胞破碎提取液由与用于表达工序 1)或2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备，或(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)或2)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；混合后添加至由工序2)制作的结合有SITH-I蛋白的担载体中。
6.权利要求3至5中任一项所述的方法，其中，在权利要求3的工序3(b)或权利要求5 的工序3 (b-i)中，添加由含任意载体的细胞提取的细胞破碎提取液作为细胞破碎提取液。
7.权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，生物素结合性蛋白质是tamavidin或其变体。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，生物学样品选自血液、血清、脑脊髓液、 唾液、咽喉拭子、汗、尿、泪、淋巴液、精液、腹水以及母乳。
9.一种用于检测生物学样品中的由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质 (SITH-I)的抗体的担载体，其是结合有所述SITH-I蛋白的担载体。
10.权利要求9所述的担载体，其中，SITH-I蛋白通过生物素-生物素结合性蛋白之间的结合而与担载体结合。
11.一种用于检测生物学样品中的由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质 (SITH-I)的抗体的试剂盒，其包括A)结合有所述SITH-I蛋白的担载体；以及，B)用于稀释生物学样品的试剂，其含有由与用于表达A)的SITH-I蛋白的宿主细胞同种的细胞制备的细胞破碎提取液。
12.权利要求11所述的试剂盒，其中，A)的担载体是通过生物素-生物素结合性蛋白之间的结合而结合有SITH-I蛋白的担载体；并且，B)的试剂是用于稀释生物学样品的包含下述i)或ii)的试剂，i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，所述细胞破碎提取液由与用于表达A)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备， 或 )由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序A)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞。
13.一种用于检测生物学样品中的由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质 (SITH-I)的抗体的试剂盒，其包括A)所述SITH-I蛋白；B)用于固定化A)的SITH-I蛋白的担载体；以及C)用于稀释生物学样品的试剂，其含有由与用于表达A)的SITH-I蛋白的宿主细胞同种的细胞制备的细胞破碎提取液。
14.权利要求13所述的试剂盒，其中，A)的SITH-I蛋白是生物素化的；B)的担载体直接或间接地与生物素结合性蛋白结合；C)的试剂是用于稀释生物学样品的包含下述i)或ii)的试剂，i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白，所述细胞破碎提取液由与用于表达A)或B) 的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞制备，或ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序A)或B)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素结合性蛋白的宿主细胞同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞。
全文摘要
本发明提供一种用于检测生物学样品中的由HHV-6潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质(Small protein encoded by the Intermediate stage Transcript of HHV-6)(SITH-1)的抗体的方法。本发明的方法包括1)准备SITH-1蛋白；2)使工序1)准备的SITH-1蛋白与担载体结合；3)使生物学样品与工序2)制作的结合有SITH-1蛋白的担载体接触，检测SITH-1蛋白抗体。
文档编号C07K14/03GK102449483SQ20108002390
公开日2012年5月9日 申请日期2010年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者冈直美, 小林伸行, 近藤一博, 高仓由光 申请人:日本烟草产业株式会社