专利名称：一种固载了敌草隆抗体免疫分离材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物材料，具体地说是一种固载了敌草隆抗体的免疫分离材料的制备方法。
背景技术：
敌草隆是一种广谱性的苯脲类除草剂。除农田外，还广泛用于除去城市公路和铁路的杂草，以及作为船用防藻涂料的添加剂(Chemosphere，2004，56，1021-1032)。研究已表明其对水生动物有毒性，对人类有致癌性，因此敌草隆被美国EPA列为“潜在污染物”(the Candidation CompoundList)(Anal.Chem.2003，75，2831-2857)，被European Communication列为“首要污染物”(Priority Substances)(Off.J.Eur.Commun.2000，L327，1)。由于其化学降解和生物降解较慢，在农作物、土壤及各种环境水中均有痕量的残留。因此需要具有高选择性地富集分离材料对样品进行预处理，才能满足分析要求。
将目标化合物的抗体固载后制成的免疫分离材料，利用抗原抗体之间的特异反应，能从样品中选择性地将目标化合物提取出来，从而完成痕量化合物的选择性富集(Anal.Chem.2001，73，5669-5676.)。目前还没有文献关于固载了敌草隆抗体的免疫吸附材料的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单的固载了敌草隆抗体免疫分离材料的制备方法。该材料的制备条件温和，操作简便，对敌草隆具有高选择性和高亲和性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种固载了敌草隆抗体免疫分离材料的制备方法，采用溶胶凝胶法将敌草隆抗体固载在多孔网状结构的硅胶基质中。
溶胶凝胶过程中，以四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷做为溶胶凝胶的前驱体，交联剂为甘油或聚乙二醇(PEG)系列高聚物，四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷与水的体积比为10∶1-1∶10，四甲基硅氧烷与交联剂的体积比为200∶1-50∶1。
溶胶过程中，进行超声或加入助溶剂促进溶胶的形成，助溶剂为甲醇或乙醇，甲醇或乙醇与四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷的体积比不大于1∶10；以盐酸为催化剂，调溶液PH＝1-6.5；溶胶过程中，若使用超声，反应时间为10-60min，若加入助溶剂，反应时间5-30min。
凝胶过程中，混合反应后，冷却，加入PBS缓冲溶液，调溶液PH＝7-8，随即加入抗体溶液，振荡，形成凝胶；抗体的加入量从20微克到5毫克不等。
所述固载的抗体为抗敌草隆单克隆、多克隆抗体或抗体片段。所制备的免疫材料经研磨，装于玻璃柱，在水中对敌草隆具有高的亲和性和选择性。
本发明具有如下优点1.材料制备过程简单，工艺路线短，制备安全，操作易掌握。
2.免疫分离材料对敌草隆和草不隆具有高亲和性和高选择性，为选择性富集样品中敌草隆和草不隆提供了物质基础。
3.固载的抗体为单克隆抗体，对敌草隆的结合力不受抗体生产批次的影响，因此所制的免疫分离材料具有很好的批次稳定性。
图1为免疫分离材料对敌草隆的选择性。
具体实施例方式
实施例向盛有850微升四甲基硅氧烷的5毫升玻璃试管中分别加入50微升甲醇、150微升50％甘油水溶液(v/v)、125微升水和50微升0.04摩尔/升盐酸水溶液。混合溶液涡旋震荡20分钟，间或置于冰水浴中冷却；取0.5毫升上述溶胶，加入等体积PBS，随即加入78.9微升(300微克)抗体溶液，轻微振荡，凝胶在2分钟内形成；将称重后的凝胶静置于4℃空气中。当其失重至55％，研磨，即得到对敌草隆和草不隆具有高亲和性和高选择的免疫分离材料。
上例中四甲基硅氧烷和水的摩尔比为1∶2.4，催化剂盐酸摩尔用量为四甲基硅氧烷的1％。
所制备的免疫分离材料对敌草隆的亲和性和选择性评价将研磨后的聚合物微粒(大约0.4克)装于玻璃柱中(5毫升)，对25毫升含有65种农药(每个农药50纳克)的混合水样进行浓缩富集，洗脱液中的各农药含量由LC-MS确定，各化合物的回收率为洗脱液中的含量与上样量(50纳克)的比值。
对图1的说明该图纵坐标为化合物的回收率(％)，横坐标为化合物，除敌草隆(diuron)、草不隆(neburon)、利谷隆(liuron)，其他化合物的非极性逐渐增强。图示中为回收率小于1％或在质谱中没有检测到的化合物的名称。该图说明敌草隆(diuron)的回收率远远高于其他化合物，从而证明了该溶胶凝胶免疫亲和柱可以用于选择性富集样品中的敌草隆。
权利要求
1.一种固载了敌草隆抗体免疫分离材料的制备方法，其特征在于采用溶胶凝胶法将敌草隆抗体固载在多孔网状结构的硅胶基质中。
2.按照权利要求1所述制备方法，其特征在于溶胶凝胶过程中，以四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷做为溶胶凝胶的前驱体，交联剂为甘油或聚乙二醇(PEG)系列高聚物，四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷与水的体积比为10∶1-1∶10，四甲基硅氧烷与交联剂的体积比为200∶1-50∶1。
3.按照权利要求2所述制备方法，其特征在于溶胶过程中，进行超声或加入助溶剂促进溶胶的形成，助溶剂为甲醇或乙醇，甲醇或乙醇与四甲基硅氧烷或四乙基硅氧烷的体积比不大于1∶10。
4.按照权利要求3所述制备方法，其特征在于溶胶过程中，以盐酸为催化剂，调溶液PH＝1-6.5。
5.按照权利要求4所述制备方法，其特征在于溶胶过程中，若使用超声，反应时间为10-60min，若加入助溶剂，反应时间5-30min。
6.按照权利要求5所述制备方法，其特征在于凝胶过程中，混合反应后，冷却，加入PBS缓冲溶液，调溶液PH＝7-8，随即加入抗体溶液，振荡，形成凝胶；抗体的加入量从20微克到5毫克不等。
7.按照权利要求1所述制备方法，其特征在于所述固载的抗体为抗敌草隆单克隆、多克隆抗体或抗体片段。
全文摘要
本发明涉及一种固载了敌草隆抗体的免疫分离材料，其采用溶胶凝胶法将敌草隆抗体固载在多孔网状结构中的硅胶基质中。该材料的制备条件温和，操作简便，对敌草隆具有高选择性和高亲和性。
文档编号B01J20/291GK101036875SQ20061004605
公开日2007年9月19日 申请日期2006年3月15日 优先权日2006年3月15日
发明者张秀莉, 章飞芳, 薛兴亚, 徐青, 梁鑫淼 申请人:中国科学院大连化学物理研究所