参与蘑菇形成的调节子的制作方法

专利名称：参与蘑菇形成的调节子的制作方法
技术领域：
本发明涉及蘑菇以及生产所述蘑菇的方法，其中，该蘑菇具有增加的多肽表达水平和/或降低的多肽表达水平，其中，该多肽由编码与选自SEQ IDNO :1-200的氨基酸序列具有至少40%同一性或相似性的蛋白和/或与选自SEQ ID NO :201-208的氨基酸序列具有至少50%同一性或相似性的蛋白的核苷酸序列所编码。
背景技术：
蘑菇的形成是高度复杂的发育过程。作为一个例子，我们描述了用于诸如 Agaricus bisporus (双孢菇)那些的伞菌子实体形成的通用方案(参见Kiies，2000 ；Umar and van Griensven, 1997) 0在淹没菌丝体的“临界质量”形成之后，菌丝脱离培养基生长到空气中。这些菌丝形成聚集体，即所谓的菌丝结或菌丝结节(hyphal nodules)。在结内， 菌丝聚集体形成最初的子实体。细胞的初步分化发生在核内。下部会发育成菌柄，而上部将形成盖。在盖内发育出不同的组织。在盖的内部，菌伞菌髓和具有子实层的菌褶是可区分的。在子实层中形成不同类型的细胞，其中有孢子台。在孢子台中发生核配合和减数分裂，最终生成担子孢子。子实体的发育是复杂的，不同组织的形成在时间上是重叠的事实也能说明。此外，细胞的直径、长度，隔膜(s印ta)、细胞核和液泡的数量以及分子组成(例如碳水化合物的储备量)在发育中的蘑菇中是不同的。孢子通过含有两种不同交配型细胞核的双孢菇(A. bisporus)形成。因此，这些孢子的萌发产生了自花能稔的异核菌丝，包括可变数量的双核类型。相比之下，从两个具有不同交配型位点的兼容株的交配导致大多数形成真菌的蘑菇处于可生育阶段。在交配过程中，合作伙伴交换细胞核。这些细胞核不会融合，但保持在菌丝室中。因此这些菌丝被称为异核体(在每个室含有一个一种类型的细胞核的情况，它被称为双核体)。它们可以在适当的环境和营养条件下形成子实体。交配型位点是子实体发育的主要调节子。双孢菇的交配型系统是鲜为人知的。据推测，这种真菌含有单一交配型位点。对^^^叩！^^ commune (裂褶菌)和Coprinus cinereus (灰盖鬼伞)的交配型位点和它们在发育中的作用已经进行了充分研究(其综述参见KUes，2000)。S. commune和C. cinereus都含有两个交配型位点。A位点编码了同源域蛋白。这些蛋白通过与兼容的A位点编码的同源域蛋白形成异质二聚体起作用。有些同源域蛋白似乎也形成功能性的同源二聚体。B位点编码信息素和受体。这些受体可以与B位点的其它等位基因所编码的信息素结合。A位点和B位点调节截然不同的细胞过程，该过程参与建立双核体菌丝体。然而，它们协同调节子实体的启动。显然，兼容的A和B交配型位点的存在对于子实体是不够的。例如，在C. cinereus 中，通过双核体形成的聚集体可以发育成初步的子实体或菌核。环境条件，如光线和养分供应，将决定哪个发育程序被开启。不同于蘑菇形成通常所涉及的以及特定子实体启动的交配型位点所编码的那些蛋白，对调节蛋白知之甚少。相比于双孢菇，在裂褶菌和灰盖鬼伞中至少有部分突变体和基因已经被确认。在裂褶菌中经常出现fbf突变的隐性突变，其在营养菌丝和子实体的形成中抑制了双核体的特定过程(Springerand Wessels，1989)。因此FBF基因看起来是激活剂。另一方面，裂褶菌的FRT基因抑制单核体中特异性双核体基因的表达(Horton et al.，1999)。在裂褶菌中其它突变菌株对子实体发育的影响已经被描述了，但所涉及的基因还没有被确认。这些突变体影响子实体的形态或其孢子形成(Raper and Krongelb, 1958 ；Bromberg and khwalb，1977)。最近，参与灰盖鬼伞的子实体形成的几个基因已被确认。peel基因在A调节发育中起作用并编码了一个假定的DNA结合蛋白(Murata et al., 1998)。该基因的突变导致不依赖交配型基因的性别分化的完整过程。但是，peel的功能是未知的。原基的分化涉及ichl和eln2基因(Muraguchi et al.，1998 ；2000)。这些基因的突变分别影响菌伞和菌柄的形成。显然，这些资料没有表现出分子水平调节的子实体的形成的情况。到目前为止，在蘑菇生产的调节/启动中所涉及的基因还没有被描述。这些基因控制蘑菇形成，因此是促进蘑菇生产、改善蘑菇质量、提高蘑菇生产的可预见性以及使得在不能有效生产蘑菇的培养基上能够生产蘑菇的靶标。

发明内容
我们研究了蘑菇形成的模型系统裂褶菌中假定的转录因子的表达。裂褶菌可以在世界各地找到。它是腐烂木头的担子菌，在砍伐的硬木上形成子实体，但它也可以在软木和青贮草上找到。在菌褶中形成的孢子台是分散的，可以形成单核菌丝体。不同等位基因的单核体在MATA和MATB交配型位点的融合导致在适合的环境条件下多产的双核体可以形成子实体。几天之内裂褶菌可以在简单的合成培养基上形成孢子子实体。这以及单核体可适用的事实就是裂褶菌成为子实体担子菌的模型系统的原因。裂褶菌的经典遗传学和分子遗传学都已经在裂褶菌中建立了。我们相信，裂褶菌、双孢菇和其它担子菌的调节程序是相当保守的。我们已经证明，裂褶菌的sc3和gpd基因的启动子在非相关的担子菌、朱红密孔菌 (Pycnoporus cinnabarinus)中是具有活性的(Alves et al. 2004)。蘑菇形成的时间、形态和产量所涉及基因都是可改善的(即，对于目前商业化生产的蘑菇，包括但不限于普通白蘑菇[“香蕈”]、平菇和香菇(shiitake))或能够商业化生成蘑菇(即，目前还不能商业化生产的蘑菇)的靶标。我们已经确认了裂褶菌基因组中编码假想的调节子的200个基因，其表达在蘑菇形成过程中会变化。这些基因可能参与蘑菇形成。我们已经发现，灭活这些基因中的8个会影响蘑菇的生产。如果所有的都存在，生产会被促进或降低。这些假想的调节基因的同源物可以在其它蘑菇形成真菌时找到。此处进一步描述本发明，我们将利用编码假想的转录调节子以及其表达在蘑菇形成中会变化的基因来1)能够商业化生产那些还不能商业化生产的蘑菇，2)提高蘑菇的产量，3)提高质量 (例如，形状和形态的均一性)，4)提高蘑菇形成过程的可预见性和/或能够在那些还不能用于商业化生产蘑菇的培养基上生产蘑菇。蘑菇可以被定义为肉质多的、结出孢子的真菌子实体，通常产生于土壤的地面上或其食物来源上。被命名为“蘑菇”的标准是栽培的白蘑菇、双孢菇(Agaricus bisporus), 因此蘑菇这个词最常用于那些具有茎(菌柄)、盖(菌盖)和位于盖下侧的菌褶(单个或多个菌褶(lamella))的真菌(担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes))，就像从商店买的白蘑菇。蘑菇也可能具有微孔以代替菌褶。“蘑菇”一词也可以被用于各种各样的真菌子实体，其产生具有或不具有茎的有性孢子，该术语更为普遍的用来形容一些子囊菌门(Ascomycota)的肉质子实体和一些担子菌门的木本或革质(leathery)子实体。偏离标准形态的形式通常有更具体的名称，诸如“马勃菌”、“鬼笔科菌(StinWlorn) ”和“羊肚菌(morel)”，而由于它们与伞菌属(Agaricus)或它们所属的伞菌目(Agaricales)的相似性，有菌褶的蘑菇本身通常被称为“伞菌类(agarics)”。推而广之，术语“蘑菇”也可以指培养的整体的真菌，或形成被称为蘑菇的子实体的物种的叶状体(称为菌丝体)，或该物种本身。^li在第一方面，提供疑似参与蘑菇生产调节的200种多肽。这些多肽如表1所示，并且可从公共数据库中获得(http://jgi.doe. gov/^commune)。本申请关注与选自SEQ ID NO :1-200(表1)的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的多肽，和/或与选自SEQ ID NO :201-208(表4)的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的多肽。表5将每个多肽的名称与给定的与氨基酸序列相对应的SEQ ID号进行链接。这些多肽也可命名为调节子或转录因子(TF)，因为它们已经被已知存在于TF中的基序(motif)或结构域的存在所确认，例如已知的DNA结合结构域，例如锌指结构域(更多细节参见实施例1)。TF基因优选地被确认，基于1)使用GO (基因本体论)的自动标注(Ashburner et al. ,2000),(euKaryotic Orthologous Groups)) (Koonin et al., 2004)和3) PFAM 算法(Finn et al. ,2008)。确认的假想TF优选随后针对基因组进行blast (Blast N和Blast P)，以确认假想的TF基因在自动标注中是缺失的。在第二步中，在生产蘑菇的过程中分析它们的表达。本发明的TF至少在蘑菇的部分生命周期中表达。例如，本发明的TF的表达在蘑菇的发育过程中可以变化。本文所使用的“多肽”是指任何肽、寡肽、多肽、基因产物、表达产物或蛋白。多肽由连续的氨基酸组成。术语“多肽”包括天然产生或人工合成的分子。此处描述的利用与氨基酸序列具有同一性或相似性(与SEQ ID N01-200具有至少40%的同一性或相似性；与SEQ ID NO 201-208具有至少50%的同一性或相似性)所定义的每个氨基酸序列，在进一步的优选实施方式中，与给定的多肽具有至少42%，45%， 50 %，55 %，60 %，65 %，70 %，75 %，80 %，82 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或 100%的同一性或相似性。在一个优选的实施方式中，序列的同一性或相似性通过比较本文确认的序列的整个长度来确定。此处描述的编码多肽的每个核苷酸序列可以编码真菌多肽，S卩，具有与真菌或蘑菇有机体中天然产生的多肽相同的氨基酸序列的多肽。这些多肽的功能依赖于与相应确认的SEQ ID号的氨基酸序列的相关性(同一性或相似性的百分比)。当所述的TF在蘑菇的至少部分生命周期中具有可检出的转录活性时，TF优选被称为是功能化的。优选的蘑菇是裂褶菌属(Schizophyllum)。更加优选为裂褶菌菌株 4-8(FGSC#9210) (Fungal Genetic Stock Center，Missouri，USA)。活性，优选是转录活性的存在，优选通过在所述真菌或蘑菇中灭活编码所述TF的核苷酸序列，以及分析对比对照组的蘑菇生产是否会生成蘑菇来进行评价，其中，在所述对照组中，所述核苷酸序列没有被激活。如果没有生成蘑菇或者生成更少或更多的蘑菇，所述TF被称为显示出活性，优选是转录活性，因此是功能性的。本文稍后定义更少或更多的蘑菇。另一方面或与前面实施方式相结合，本发明的多肽可能是天然的多肽，也可能是非天然生成的多肽。非天然生成的多肽可能是由例如利用定点突变或易错PCR突变的核酸序列所编码的多肽。核酸构津体在另一方面，提供一种含有编码多肽的核苷酸序列的核酸构建体，所述多肽含有由选自下列的核苷酸序列所编码的氨基酸序列(a)编码与选自SEQ ID NO 1-200的氨基酸序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的核苷酸序列；以及，(b)编码与选自SEQ ID NO :201-208的氨基酸序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列任选地与能够驱动所述核苷酸序列在真菌和/或蘑菇中表达的启动子操作性连接。核酸构建体被定义为核酸分子，其从天然生成的基因中分离或被修饰为含有以本来不存在于自然界的方式结合或并置的核酸的片段。以核苷酸序列来代表核酸分子。任选地，存在于核酸构建体中的核苷酸序列可操作地与一个或多个控制序列连接，其指导所述多肽在真菌中产生。可操作地连接在本文中被定义为一种结构，在该结构中，控制序列位于相对于编码本发明的所述多肽的核酸序列的恰当的位置，因此该控制序列指导本发明的所述多肽在真菌细胞和/或蘑菇中生成。表达将被理解为包括参与产生多肽的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、 翻译、翻译后修饰和分泌。本文所定义的控制序列包括所有对于多肽的表达必要的或有益的组分。在最低限度，所述控制序列包括启动子和转录的和翻译的终止信号。本文所使用的术语“启动子”是指核酸片段，其功能为控制一个或多个基因或核酸的转录，位于基因的转录起始位点的转录方向的上游，并且与DNA依赖的RNA聚合酶的结合位点的存在所确认的结合位点、转录起始位点和任何其它的DNA序列相关，包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和激活子蛋白结合位点以及任何其它本领域技术人员已知的直接或间接地调节启动子的转录量的核苷酸序列。在本发明的范围内，启动子优选在转录起始位点(TSS)的-1位核苷酸结束。启动子优选能够驱动核苷酸序列在真菌和/或蘑菇中表达。优选的启动子包括 组成型表达的，例如裂褶菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)的启动子(Harmsen et al., 1992) (SEQ ID NO :209)。本发明也涉及含有本发明的核酸构建体的表达载体。优选地，表达载体含有本发明的核苷酸序列，其可操作地连接一个或多个控制序列，该控制序列指导所编码的多肽在真菌细胞和/或蘑菇中产生。表达载体可以被视为重组表达载体。表达载体可以是可方便地经受DNA重组过程并能将编码本发明的多肽的核苷酸序列在真菌和/或蘑菇中表达的任
7意载体。依赖于所述表达载体所要导入的真菌/蘑菇的确认以及本发明的核苷酸序列的起始，本领域的技术人员知道如何选择最适合的表达载体和控制序列。核酸构建体的单个或多个拷贝可被引入真菌细胞和/或蘑菇中。核酸构建体可以保持游离而因此含有自主复制序列，例如ARS序列。合适的游离核酸构建体可以，例如基于酵母2μ或pKDl质粒(Fleer et al.，1991)。可选地，核酸构建体以一个或多个拷贝整合进入真菌细胞和/或蘑菇的基因组。整合到真菌细胞和/或蘑菇的基因组可以通过在目标整合位点的非常规重组或同源重组而随机发生。优选地，核酸构建体整合到真菌和/或蘑菇的基因组中。这种类型的核酸构建体可以含有细菌克隆载体、编码TF和选择标记物的核苷酸序列。选择标记物可赋予抗生素耐药性或为营养缺陷型标记物。这些标记物是本领域技术人员已知的。含有细菌克隆载体和选择标记物的核酸构建体作为实例et al(1994)和Munoz-Rivas et al (1986)中被公开。可选地，这种类型的核酸构建体可以是合成的，例如使用PCR技术。如果把编码所述多肽的核苷酸序列引入到表达构建体中，本发明的多肽表达水平将上升。如果把编码所述多肽的核苷酸序列引入到失活构建体(inactivation construct) 中，本发明的多肽表达水平将下降。这些失活构建体是本领域技术人员已知的。这些构建体可含有编码突变的多肽的核苷酸序列或含有编码所述多肽的核苷酸序列的侧翼序列的核苷酸序列。这样的构建体将整合到所述多肽的内源性基因座中以替换该内源性基因并使其失活。可选地，所述失活构建体可以含有诱导RNAi的序列。RNAi技术是本领域技术人员已知的(De Jong et al，2006)。所述多肽的失活可能是由于响应基因或核苷酸序列的失活。在类似RNAi失活的情况下，mRNA的水平会降低。所述失活构建体也可能会导致mRNA的水平与在野生型中所观察到的类似。在这种情况下，所述编码的突变多肽具有降低的活性，其中，所述降低的活性通过比较所述多肽的活性与引起的或衍生的突变多肽的活性来评价。多肽的活性可以使用本领域技术人员已知的测试来评价。这些测试可以包括将所述突变多肽引入到真菌中， 比较表达的所述突变多肽的活性和突变多肽所源自的所述多肽的相应活性。突变多肽的活性可以与对照多肽的活性相比较。如果真菌是裂褶菌属，对照多肽的对照活性可以是裂褶菌菌株4-8(reSC#9210)的菌株表现出的活性。优选地，突变多肽没有可检测的活性。活性与本文中较早定义的转录活性或是功能性的具有相同的含义。合适的转化真菌的过程是本领域技术人员公知的。例如，蘑菇形成真菌可以使用原生质体进行转化，例如使用van Peer et al (2009)的过程。真菌细胞/蘑菇在另一方面，本发明提供具有增加的多肽表达水平和/或降低的多肽表达水平的真菌和/或蘑菇，其中，所述多肽由与选自SEQ ID NO :1-200的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，和/或与选自SEQ IDNO =201-208序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列所编码。在一个优选的实施方式中，真菌和/或蘑菇含有前文中所定义的本发明的核酸构建体或表达载体。真菌和/或蘑菇的选择将在很大程度上取决于本发明的核酸序列的来源。根据真菌的同一性，本领域技术人员知道如何将本发明的所述构建体或载体转化它。在一个优选的实施方式中，本发明提供一种多肽表达水平增加而另一种多肽表达水平降低的真菌和/或蘑菇。在另一个优选的实施方式中，本发明提供至少一种本发明的多肽表达水平增加和/或至少另一种本发明的多肽表达水平降低的真菌和/或蘑菇。在真菌和/或蘑菇中表达的本发明的多肽，如上所述，可以是接下来进一步定义的异源性多肽或内源性多肽。优选地，例如当本发明的多肽用于改进食用菌的生产时，在真菌和/或蘑菇中表达的本发明的多肽是异源性多肽。此处所述的具有“增加的多肽表达水平”的真菌和/或蘑菇，其包括异源性多肽的表达，即使所定义的异源性多肽在真菌和/或蘑菇中不是天然表达的。然而，在这种情况下，所述“增加的”表达水平被解释为具有可检测的异源性多肽的表达而对照真菌和/或蘑菇不具有可检测的异源性多肽的表达。表达水平降低的多肽，如上所述，是内源性的多肽。之前所确认的增加的和/或降低的表达并不需要在蘑菇/真菌的整个生命周期中都发生。根据所述多肽的同一性，它的表达可以是增加的，而在所述蘑菇/真菌的部分生命周期中则是降低的。真菌可以是任意真菌。优选的真菌是其中编码本文之前所确认的多肽的核苷酸是参与所述真菌的生产的真菌。真菌优选是生产蘑菇的真菌。更优选的蘑菇是其生产具有吸引力的或被怀疑能够生产感兴趣的物质的蘑菇。这可以是由于商业上的原因。 在一个实施方式中，真菌是担子菌纲(basidiomycete)或子囊菌纲(Ascomycete)，优选是担子菌纲，优选是伞菌目，更优选的是裂褶菌科(Schizophyllaceae)以及更优选的是裂褶菌属。更优选的是裂褶菌。更加优选的是裂褶菌菌株4-8(reSC#9210)。优选的伞菌目的例子是双孢菇，平菇(Pleurotus ostreatus)禾口香菇(Lentius edodus)。根据优选实施方式，真菌和/或蘑菇具有表达水平已增加的多肽，即，产生高于正常量的或具有增加的生产水平的本发明所述的多肽，和/或在相同的培养和/或测试条件下，比衍生出该真菌/蘑菇的亲本真菌/蘑菇显示出更高的所述多肽的活性。“产生高于正常量的或具有增加的生产水平的所述多肽”在本文中定义为，当两种细胞(亲本的和转化的细胞)在相同的条件下培养时，比衍生出该转化的真菌/蘑菇的亲本真菌/蘑菇产生更多的本发明的多肽。该增加可以发生在真菌/或蘑菇的部分生命周期中和/或所述真菌/蘑菇生命周期的特定阶段。优选地，当两种细胞(亲本的和转化的细胞)在相同的条件下培养时，本发明的真菌/蘑菇产生的多肽比衍生出该转化的真菌/蘑菇的亲本真菌/蘑菇高至少3^^6^^10%或15%。产生比亲本的真菌/蘑菇高至少20%、 30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 % UOO % ,150 % ,500 %, 1000 %、10000 % 或更多的所述多肽的真菌也是优选的。根据另一个优选实施方式，将本发明的真菌/蘑菇的多肽的生产水平与对照菌株中相同多肽的生产水平进行比较。根据更加优选的实施方式，当本发明的真菌/蘑菇是裂褶菌属菌株时，将本发明的所述真菌/蘑菇的多肽的生产水平与作为对照的裂褶菌菌株4-8(reSC#9210)的生产水平进行比较。所述多肽的生产水平的评价可以使用Northern印迹或阵列分析在mRNA水平进行，和/或使用Western印迹在多肽水平进行。所有这些方法都是本领域技术人员公知的。“显示更高或增加的多肽活性”在本文中定义为，在使用特定针对所述多肽的活性的测试中，比衍生出该转化的真菌/蘑菇的亲本真菌/蘑菇显示出更高的多肽活性。优选地，当使用特定针对所述多肽活性的方法进行测试时，本发明的所述真菌/蘑菇显示出比衍生出该转化的真菌/蘑菇的亲本真菌/蘑菇显示出的活性高至少3<%、6%、10%或15% 的活性。显示出比亲本的真菌/蘑菇高至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100 %、150 %、500 %、1000 %、10000 %或更多的所述活性的真菌/蘑菇也是优选的。根据另一个优选的实施方式，将本发明的所述真菌/蘑菇的所述多肽的活性水平与作为对照的裂褶菌菌株4-8 (FGSC#9210)菌株产生的相应活性水平进行比较。本领域技术人员知道针对每种多肽可以使用何种活性。在优选的实施方式中，所述活性是转录活性，其可以通过本文之前所定义的进行评价。过表达或表达的增加或上调可以通过本领域已知的传统方法来实现，例如相比于天然存在的，引入更多的编码多肽的核苷酸拷贝到真菌/蘑菇中，其在载体或染色体上。可选地，可以通过将编码所述多肽的核苷酸融合到在选定的真菌/蘑菇中高表达或适合高水平蛋白表达的强启动子或两者的组合而实现过表达。根据真菌/蘑菇的同一性，本领域的技术人员知道哪个强启动子是最适合的。在本文中，强启动子优选意味着相比于可操作地连接到核苷酸序列的内源性启动子上的该核苷酸序列的表达，其能够诱导可操作地连接到该强启动子上的该核苷酸序列更高的表达。过表达也可以通过其它方法来实现，例如通过增加mRNA的稳定性或通过引入内含子。根据优选实施方式，真菌/蘑菇具有已降低的多肽表达水平，S卩，产生低于正常量的或具有降低的生产水平的本发明的所述多肽，和/或在相同的培养和/或测试条件下，比衍生出该真菌/蘑菇的亲本真菌/蘑菇显示更低的所述多肽的活性。“产生低于正常量的或具有降低的生产水平的所述多肽”在本文中定义为，当两种细胞(亲本的和转化的细胞)在相同的条件下培养时，比衍生出该转化的真菌/蘑菇的亲本真菌/蘑菇产生更少的本发明的多肽。优选地，当两种细胞(亲本的和转化的细胞)在相同的条件下培养时，本发明的真菌/蘑菇产生比衍生出该转化的真菌/蘑菇的亲本真菌/ 蘑菇低至少3<%、6%、10%或15%的本发明的所述多肽。产生相比于亲本的真菌/蘑菇低至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或 150% 的所述多肽的真菌 / 蘑菇也是优选的。本发明也包括没有所述多肽的表达被检出。优选地，所述表达在至少部分所述真菌/蘑菇的生命周期中是无法检出的。根据另一个优选实施方式，将本发明的所述真菌/蘑菇中的所述多肽的生产水平与对照菌株中的相同多肽的生产水平进行比较。根据更加优选的实施方式，当本发明的所述真菌/蘑菇是裂褶菌属菌株时，将本发明的所述真菌/ 蘑菇中的所述多肽的生产水平与作为对照的裂褶菌菌株4-8(reSC#9210)中的生产水平进行比较。所述多肽的生产水平的评价可以使用Northern印迹或阵列分析在mRNA水平进行，和/或使用Western印迹在多肽水平进行。所有这些方法都是本领域技术人员公知的。“显示更低或降低的多肽活性”在本文中定义为，在使用特定针对所述多肽的活性的测试中，比衍生出该转化的真菌/蘑菇的亲本真菌/蘑菇显示出更低的多肽活性。优选地，当使用特定针对所述多肽活性的方法进行测试时，本发明的所述真菌/蘑菇显示出比衍生出该转化的真菌/蘑菇的亲本真菌/蘑菇显示出的活性低至少3<%、6%、10%或15% 的活性。显示出比亲本的真菌/蘑菇低至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100%或150%的所述活性的真菌/蘑菇也是优选的。根据另一个优选的实施方式，将本发明的所述真菌/蘑菇的所述多肽的活性水平与作为对照的裂褶菌菌株4-8 (FGSC#9210)菌株产生的相应活性水平进行比较。此处多肽的活性也优选是指本文之前定义的所述多肽的转录活性。
根据更加优选的实施方式，真菌/蘑菇不产生任何可检出量的本发明的所述多肽和/或不显示出任何可检出的所述多肽的活性。优选地，真菌/蘑菇不产生或实质上不产生本发明的多肽。本发明的所述多肽的表达水平的降低和/或其活性的降低可以通过本领域已知的传统方法来实现，例如通过失活或下调或降低编码所述真菌/蘑菇的所述多肽的内源性核苷酸的表达水平。核酸或多肽分子所使用的术语“内源性”是指真菌/蘑菇(优选是野生状态下的) 天然表达的核酸或多肽。术语“异源性”被用作“内源性”的反义词。核酸或多肽分子所使用的术语“异源性”是指源于异体真菌/蘑菇的核酸或多肽，其不会天然产生而作为给定真菌/蘑菇的一部分(所述真菌的基因组或DNA或RNA)，或在真菌/蘑菇中或在基因组或DNA或RNA序列的位点中发现的不同于在自然界中发现的。异源性核酸或蛋白对于引入它们的真菌/蘑菇不是内源性的，而是从其它真菌/蘑菇得到的或是合成或重组产生的。一般来说，虽然不一定，在该DNA转录或表达的真菌中通常都不会生成这些核酸编码的蛋白或多肽，类似的，存在外源性RNA的真菌/蘑菇中通常不会表达编码蛋白的外源性RNA。此外，已知异源性蛋白或多肽可以包括在所转化的真菌/蘑菇中以不寻常的顺序和/或方向排列的同源性元件， 艮口，编码所述蛋白或多肽的核苷酸序列源自同一物种，但通过蓄意的人为干预对天然形式的成分和/或基因组位点进行实质性修饰。异源性的核酸和蛋白也可以是指异体核酸或蛋白。本文中的术语异源性的核酸或蛋白包括本领域技术人员承认对表达它的真菌/蘑菇而言作为异源性的或是异体的任何核酸或蛋白。术语异源性也指核酸或氨基酸序列的非天然组合，即，至少两个序列的组合对每一个来说都是异体的组合。这种失活或下调可以通过删除编码基因中的一个或多个核苷酸来实现。可选地， 它可以是通过类似于RNAi的机理所导致的。在另一个实施方式中，本发明涉及在其基因或编码所述多肽的核苷酸中具有突变的真菌/蘑菇。优选地，制备替换或失活载体以及随后通过转化将其引入到真菌/蘑菇中来构建具有失活的编码所述多肽的核苷酸的真菌/蘑菇。本领域技术人员知道如何构建这样的载体。例如，这种载体可包括编码多肽的核苷酸的侧翼区以及存在于所述侧翼区之间的选择标记基因。可选地或与编码所述多肽的失活的内源性核苷酸相结合，编码所述多肽的所述核苷酸可以通过将其融合到适合在选定的真菌有机体/选定的蘑菇中低水平蛋白表达的弱启动子来调低表达。在本文中，弱启动子被定义为相比于可操作地连接到核苷酸序列的内源性启动子上的该核苷酸序列的表达，能够诱导可操作地连接到该启动子上的核苷酸序列更低的表达的启动子。可选地或与任何提到的获得本发明的真菌/蘑菇的方法相结合，可以通过具有不同程度的目标基因(即本文中所确认的编码多肽的核苷酸)的表达的真菌/蘑菇的天然分离物，或可能会通过突变、基因改造或通过诸如使用化学或物理刺激的其它方法来改变这些基因的表达。改变这些多肽的表达的一个方法是对真菌进行经典诱变并筛选具有所期望的本文所确认的所述多肽的表达水平的真菌/蘑菇。在一个优选的实施方式中，提供一种真菌/蘑菇，其中，含有与选自SEQID N0:29 ； 177 ；20 ；56 ；4组成的组中的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性；和/或与选自SEQID NO 204 ；207 ；208 ；202 ；201组成的组中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的多肽的表达水平是增加的，以及其中，含有与选自SEQ ID NO 55 ；21力4组成的组中的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性；和/或与选自SEQ ID NO :206 ；205 ； 203组成的组中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的多肽的表达水平是降低的。200个确认的基因示于表1。为了知道表1中给定基因/核苷酸的表达是增加还是降低，本领域的技术人员可以在给定的真菌或蘑菇中降低，优选是灭活该基因。优选的蘑菇是裂褶菌属。更加优选的是裂褶菌菌株4-8(reSC#9210)。随后，与未灭活所述核苷酸序列的对照蘑菇的蘑菇生产相比较，分析是否会产生蘑菇。本文中已经描述了灭活基因的方式。如果不产生蘑菇或者产生的蘑菇少，包含在本发明的真菌/蘑菇中的所述基因/ 核苷酸序列的表达水平或相应的编码的多肽的活性表达水平优选增加。反之，如果产生蘑菇或者产生的蘑菇多，包含在本发明的真菌/蘑菇中的所述基因/核苷酸序列的表达水平或相应的编码的多肽的活性表达水平优选降低。然而，只要可以避免蘑菇团簇，包含在本发明的真菌/蘑菇中的编码的多肽的活性表达水平优选是增加的。例如，当期望蘑菇的发育不受其它可能更小、在其附近且没有完全发育的蘑菇阻碍时。 例如，发明人发现SEQ IDN0:21、M、55的失活导致更多蘑菇的生产。因此，为了生产更多的蘑菇，优选降低含有与本文其它地方进一步定义的、与SEQ ID NO :2154或55具有同一性或相似性的氨基酸序列的多肽的表达。然而，当期望生产更少但更大的蘑菇时，优选过表达含有与SEQ ID NO :21、讨或55具有同一性或相似性的氨基酸序列的多肽。更少的蘑菇意味着，当两种细胞(亲本的和转化的细胞)在相同的条件下培养时， 产生的蘑菇比衍生出该转化蘑菇的亲本蘑菇低至少3<%、6%、10%或15%。产生相比于亲本蘑菇低至少 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%^； 150% 的所述蘑菇也是优选的。本发明也包括没有蘑菇被检出。更多的蘑菇意味着，当两种细胞(亲本的和转化的细胞)在相同的条件下培养时， 产生的蘑菇比衍生出该转化蘑菇的亲本蘑菇高至少l^d^j^UO^或15%。产生相比于亲本蘑菇高至少 20 %,30 %,40 % ,50 %,60 %,70 %,80 %,90 % UOO % ,150 % ,500 %, 1000 %、10000 %或更多的所述蘑菇也是优选的。蘑菇的检测优选是可视化的，例如确定具有培养基的培养皿、容器中或蘑菇床中蘑菇的数量。在实验部分，表1中所确认的一些基因已经被灭活了。结果列于表3中。从这些结果，我们得出结论，在优选的实施方式中，提供了一种真菌/蘑菇，其中，含有与选自 SEQ ID NO :204、207、208、202 和 201 组成的组中的序列具有至少 50% ,55%,60%,65%, 70%,75%,80%,82%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的所述多肽的表达水平是增加的，以及，其中，含有与选自SEQ ID NO 206、205 和 203 组成的组中的序列具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的所述多肽表达水平是降低的。SEQ ID NO :204、207、208、202 和 201 分别编码部分 fst4、hom2、wc2、c2h2、bril。对应的蛋白通过表1中的下列ID确认66861 ；257987，13988，114363，255701 (分别是SEQ ID NO 29 ；177 ；20 ；56 ；4)。 SEQ ID NO =206,205和203分别编码部分homl、gatl和fst3。对应的蛋白通过表 1 中的下列 ID 确认:257652，255004，257422(分别是 SEQ IDNO 55 ；21 ；54)
这些真菌/蘑菇是有吸引力的，可被用于许多不同的应用中。这些过程可以改进/使蘑菇生产成为可能。改进或使蘑菇生产商业化可能是由于-在尚不能用于生长商业化蘑菇的培养基上生长-在时间和空间上控制蘑菇的形成-增加生产水平-增加质量(例如尺寸和生长物(outgrowth)更加均一)在另一个实施方式中，我们的发明可以改进商业环境中蘑菇的生长，或允许尚不能生产的品种进行商业化生产，从而为以便宜的方式生产食用菌或为生产(或提高生产) 农业、食品、饲料或非食品或者非饲料应用中感兴趣的药品或蛋白创造机会。这些蛋白可以是或不是源于蘑菇形成真菌。下面列出了本发明真菌一些可能的应用。牛产方法在另一方面，本发明提供一种前文中所确认的真菌/蘑菇的生产方法。本领域的技术人员知道如何进行这些方法，例如Mamets和Chilton(198 和vanGriensven(1988) 所描述的。这种生产包括培养基(带或不带覆土层(casinglayer))的侵染，以及随后的子实体生产阶段。该生产可以以具有最佳产量和/或质量水平(尺寸和生长物更加均一)的商业规模进行。本发明也涉及使用本发明的真菌/蘑菇生产感兴趣的物质的方法。在该方法中， 为了能够生产所述物质，真菌/蘑菇可能已被修饰。感兴趣的物质可以是真菌/蘑菇可以生产的任何物质。这些物质包括蛋白、多肽、代谢物。本文中的蛋白或多肽可以是药用蛋白或多肽和/或食品、饲料或非食品或者非饲料应用中感兴趣的蛋白或多肽。这些物质对真菌/蘑菇可以是或者不是内源性的。优选地，该方法的步骤包括在有利于生成所述感兴趣的物质的环境下培养能够生产感兴趣的物质的本发明的真菌/蘑菇；以及任选地回收感兴趣的物质。在一个实施方式中，真菌/蘑菇含有核酸构建体，该核酸构建体含有编码所生产的蛋白/多肽的核苷酸。在这种情况下，感兴趣的物质可以是这些蛋白/多肽。可选地，所述蛋白/多肽可能涉及这些感兴趣的物质的生产或合成。本文之前已经定义了所述核酸构建体的每个特性。本发明也包括使用真菌/蘑菇，该真菌/蘑菇已通过增加/降低蛋白/ 多肽的表达水平进一步被修饰，已知所述蛋白/多肽参与生产所述物质的方法。确认方法监测这些基因或编码所述多肽的核苷酸的表达水平可以允许确认在生产蘑菇的方法中所涉及的刺激因素。因此，在另一方面，本发明提供一种确认能够影响蘑菇生产的刺激因素的方法，该方法的步骤包括(a)提供真菌/蘑菇；
(b)对所述真菌/蘑菇应用所述刺激因素；(c)确定步骤b)中真菌/蘑菇的核苷酸序列的表达水平或对应的编码的多肽的活性或稳定状态水平，其中，所述多肽含有或组成为与选自SEQ IDNO :1-200组成的组中的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO :201-208组成的组中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列。(d)将没有使用所述刺激因素的真菌/蘑菇中的所述核苷酸序列或多肽的表达、 活性或稳定状态水平与(C)中所确定的表达、活性或稳定状态水平进行比较；以及(e)确认在使用所述刺激因素的真菌/蘑菇以及没有使用所述刺激因素的真菌 /蘑菇之间产生所述核苷酸序列或多肽的表达水平、活性或稳定状态水平的差异的刺激因
ο刺激因素可以是任意类型的刺激因素。它可以是物理刺激，诸如增加/降低温度、 增加/降低光照强度、改变光照波长，通过例如光或机械方式创造一定程度的损伤。它可能是物质或死的或活的有机体的存在。在一个优选的方法中，将多于一个核苷酸序列或多于一个多肽的表达水平、活性或稳定状态水平进行对比。本文已经确定了优选的多肽和编码的核苷酸序列。在本发明的一方面还涉及采用所述方法确认的物质、处理或死的或活的有机体。本文已经解释了该方法的每个特征。“产生所述核苷酸序列或多肽的表达水平、活性或稳定状态水平的差别”的含义与 “增加的多肽的表达水平和/或降低的多肽的表达水平”相同。在另一方面，我们将使用对(确认的)调节基因有应答性的启动子元件以(i)确认影响蘑菇形成(例如但不限于蘑菇的数量或蘑菇的尺寸)的(下游)基因；(ii)基于当前的或未来的商业蘑菇品种生成生物模型，其将允许A.对特定的(一些)调节基因或编码种特异性相关的结构蛋白的基因的确认、表征和应用；B.对当前最先进的用于养殖蘑菇的调节器的表征或改进应用；C.对带有改进的或新特征的当前最先进的用于养殖蘑菇的调节器的衍生物的生成或确认；D.对能够改进蘑菇养殖、或使目前还不能商业化生产的蘑菇能够商业化养殖的新化合物的生成或确认。序列同一性本文中的“序列同一性”被定义为通过对比序列所确定的两种或多种氨基酸(多肽或蛋白)或两种或多种核酸(核苷酸或多聚核苷酸)之间的关系。在本领域，“同一性”也意味着氨基酸或核酸序列之间的序列关联度，视情况，可以通过这些序列串之间的匹配来确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过比较氨基酸序列以及其一个多肽到第二个多肽序列的保守氨基酸替代来确定的。“同一性”和“相似性”可以通过已知的方法很容易地计算得到，包括但不限于描述在(Computational Molecular Biology，Lesk， Α. Μ. , ed. , OxfordUniversity Press, New York,1988 ；Biocomputing Informatics and GenomeProjects,Smith,D. W. ,ed. ,Academic Press,New York, 1993 ；Computer Analysisof
14Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. , and Griffin, H. G. , eds. , Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G. , Academic Press, 1987 ；and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. andDevereux, J. , eds. , M Stockton Press,New York,1991 ；and Carillo,H. ,andLipman,D. ,SIAM J. Applied Math., 48 :1073(1988))中的那些。优选的确定同一性的方法旨在给出测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法是编纂的公开可用的计算机程序。优选的确定两个序列之间的同一性和相似性的计算机程序方法包括，例如 GCG 程序包(Devereux etal.，1984)。BestFit、BLASTP、BLASTN 和 FASTA(Altschul，et al.，1990)。BLAST X 程序是可从 NCBI 或其它来源(BLAST Manual, Altschul, S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)公开获得的。公知的 Smith Waterman算法也可以用于确定同一性。用于多肽序列比较的优选参数包括如下算法=Needleman and Wunsch (1970)；比较矩阵来自 Hentikoff 和 Hentikoff 的 BL0SSUM62 (1992)；间隙罚分(Penalty) :12;以及间隙长度罚分4。具有这些参数的有用的程序作为“Ogap”程序可以从Genetics Computer Group公开获得，其位于麦迪逊威斯康辛洲(Madison，WI)。上述参数是氨基酸比较的默认参数(没有末端间隙罚分)。用于核酸比较的优选参数包括如下算法Needleman和mmsch，J. Mol. Biol. 48 443-453(1970)；比较矩阵匹配=+10，不匹配=O ；间隙罚分50 ；间隙长度罚分3。Gap 程序可以从Genetics Computer Group获得，其位于麦迪逊威斯康辛洲。上面给出的是用于核酸比较的默认参数。任选地，在确定氨基酸相似度时，本领域技术人员也可以考虑到所谓的“保守”氨基酸替换，本领域技术人员将会很清楚。保守的氨基酸替换是指具有类似侧链残基的互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含有酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；以及一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸替换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文所公开的氨基酸序列的替换变异体是在所公开的序列中至少一个残基被删除而不同的残基插入到该位置的那些。优选地，所述氨基酸的改变是保守的。对于每个天然产生的氨基酸的优选保守替换如下:Ala 至Ij ser ；Arg 至Ij Iys ；Asn 至Ij gin 或 his ；Asp 至Ij glu ；Cys 至Ij ser 或 ala ；Gln 至Ij asn ； Glu 至Ij asp ；Gly 至Ij pro ；His 至Ij asn 或 gin ；Ile 至Ij Ieu 或 val ；Leu 至Ij ile 或 val ；Lys 至Ij arg> gin 或 glu ；Met 至Ij Ieu 或 iIe ；Phe 至Ij met、Ieu 或 tyr ；Ser 至Ij thr ；Thr 至Ij ser ；Trp 至Ij tyr ； Tyr 到 trp 或 phe ；以及 Val 到 ile 或 leu。在本文以及权利要求中，动词“包括”以及它的变形形式以其非限定的意义来使用
的，意味着包括跟随该词的项目，但不排除没有具体提到的项目。此外，动词“由......组
成”可以被“基本上由......组成”所替代，意味着本文所定义的产品或组合物可以包括具
体指明的物质之外的额外组分，所述额外组分不改变本发明独特的特征。此外，除非文字明确要求有一个以及只有一个要素，要素的不定冠词“a”或“an”不排除存在一个以上的要素的可能性。因此，不定冠词“a”或“an”通常意味着“至少有一个”。本文中引用的所有专利和文献在此都通过参考的方式整体引入。接下来的实施例仅仅是出于举例的目的提供，其不以任何方式限定本发明的范围。


图1 野牛型双核体(A，D)中的子实体形成，以及双核体中fst3(B，E)和fst4(C， F)基因已被灭活。D-F是A-C中所显示的部分菌落的放大图。条代表5mm(D-F)。图2 裂褶菌(蛋白ID 13988)、L. bicolor (二色蜡蘑)(蛋白ID 306097)和灰盖鬼伞(蛋白ID CC1G_01095)的WC2蛋白序列的比对。序列同一性使用星号㈩而相似性使用冒号()在比对的上方标示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 进行比对。SA^裂褶菌(蛋白ID 114363)、二色蜡蘑(蛋白ID 310874)和灰盖鬼伞(蛋白 ID CC1G_08877)的C2H2蛋白序列的比对。序列同一性使用星号㈩而相似性使用冒号()在比对的上方标示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 进行比对。图4 裂褶菌(蛋白ID 257422)、二色蜡蘑(蛋白ID 307309)和灰盖鬼伞(蛋白 ID CC1G_02690)的Fst3蛋白序列的比对。序列同一性使用星号㈩而相似性使用冒号()在比对的上方标示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 进行比对。图5 裂褶菌(蛋白ID 66861)、二色蜡蘑(蛋白ID 308722)和灰盖鬼伞(蛋白ID CC1G_05035)的Fst4蛋白序列的比对。序列同一性使用星号㈩而相似性使用冒号()在比对的上方标示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 进行比对。图6 裂褶菌(蛋白ID 255004)、二色蜡蘑(蛋白ID 292733)和灰盖鬼伞(蛋白 ID CC1G_01461)的Gatl蛋白序列的比对。序列同一性使用星号㈩而相似性使用冒号()在比对的上方标示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 进行比对。图7 裂褶菌(蛋白ID 257652)、二色蜡蘑(蛋白ID 324166)和灰盖鬼伞(蛋白 ID CC1G_01991)的Homl蛋白序列的比对。序列同一性使用星号㈩而相似性使用冒号()在比对的上方标示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 进行比对。图8 裂褶菌(蛋白ID 257987)、二色蜡蘑(蛋白ID 293988)和灰盖鬼伞(蛋白 ID CC1G_01962)的Hom2蛋白序列的比对。序列同一性使用星号㈩而相似性使用冒号()在比对的上方标示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 进行比对。图9 裂褶菌(蛋白ID 255701)、二色蜡蘑(蛋白ID 300797)和灰盖鬼伞(蛋白 ID CC1G_03649)的Bril蛋白序列的比对。序列同一性使用星号㈩而相似性使用冒号()在比对的上方标示。采用CLUSTAL 2. 0. 12 进行比对。
具体实施例方式实施例棚列1鋼縣綠附白爐人通过Toint Genome hstitute自动调用裂褶菌菌株4-8 (FGSC#9210)基因组 (8. 29X 覆盖)的基因得到了 13181 个预测基因(参见 http //jgi. doe. gov/Scommune) 0 ^ 用 GO (Gene Ontology) (Ashburner et al. ,2000)>KOG (euKaryotic Orthologous Groups) (Koonin et al.，2004)和PFAM算法(Finn et al.，2008)对这些基因自动注释。该自动标注作为起始点来确认转录因子(TFs)·基于已知的DNA结合域，将190个基因放置在GO的输入项“转录因子活性 (Transcription FactorActivity)，，中(GO :0003700)。·Κ06注释算法预测了 569个通常参与转录(功能ID:“K”)的基因。这些中，205 个转录因子被手动确认了。 基于PFAM域PF00096/IPR007087(锌指结构，C2H2型)的存在，一共确定了 151
个多肽。所有假想的TF被手动检查，基因模型或注释在必要时进行调整。列表中的重复条目被删除。为了确认在自动注释中错过的TF，将确认的TF用于BLASTp (预测蛋白的数据库)和BLASTn (染色体数据库)分析。手动检查命中结果并将新确认的TF添加到所述列表中。这些过程导致在裂褶菌基因组中确认了 472个假想的TF。假想转录因子的表达曲线为了确定在子实体发育过程中的假想TF的表达曲线，我们使用了 MPSS (大规模平行测序)技术。从单核体菌株4-40 (CBS 340. 81)和4-40与4-39 (CBS 341. 81)杂交得到的双核体中分离总RNA。在黑暗环境和30°C下，固体匪上生长7天的菌落在200mL匪中使用Waring混合器以低速均质1分钟。2ml均质后的菌丝散布到置于固化MM上方的聚碳酸酯膜上。增殖性单核体菌丝体在光线下生长4天。所述双核体在光线下分别生长2天和 4天以分离I期聚集体和II期原基菌丝体。从在光线下生长了 8天的双核体培养物中采摘 3天期的成熟蘑菇。根据van Peer et al.，2009的描述分离RNA。除了 DpnII消化之后使用MmeI生成20bp标签之外，基本上根据Brenner et al. ,2000的描述来进行MPSS。使用克隆单分子阵列技术(Illumina，Hayward, CA, US)对标签测序。使用Python程序语言开发的程序来分析数据。针对每百万分之一转录物(TPM)对标签数进行标准化。从数据集中删除最大值< 4TPM的标签。来源于相同转录物的标签的TPM值进行相加，以评价它们的表达水平。如果假想的TF的基因不含有已知的5，或3，UTR，那么，将200bp染色体组DNA添加到各自基因编码序列的末端。MPSS表达分析与在过去已经进行的表达的研究一致(参见综述 Wosten, H. A. B. &ffessels, 2006)。感兴趣的表达曲线的确认在发育的一个周期，当TF相对于无菌的单核体为向上或向下调节时，该TF被认为是潜在参与子实体形成的调节。有75个TF为至少2倍的上调，以及155个为至少2倍的下调。更有趣的是，其中四个为至少4倍的上调以及77个为至少4倍的下调。更有趣的表1A:相比于子实体形成的某些阶段的单核体，上调至少2倍的转录因子基因(第一 表达通过MPSS来评价，其是在每百万标签中的表达。L. bicolour和灰盖鬼伞中的转录因亏在最后两列中表示。
权利要求
1.具有增加的多肽表达水平和/或降低的多肽表达水平的真菌或蘑菇，其中，所述多肽由与选自SEQ ID NO :56,1-55,57-200的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的核苷酸序列所编码，和/或由与选自SEQ IDNO :202、201、203-208的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的核苷酸序列所编码。
2.根据权利要求1所述的真菌或蘑菇，其中，增加的表达水平通过增加的多肽生产和/ 或在相同的培养和/或测试条件下，比衍生出该真菌/蘑菇的亲本真菌/蘑菇具有更高的所述多肽的活性来达到。
3.根据权利要求2所述的真菌或蘑菇，其中，表达水平增加的所述多肽是异源性多肽。
4.根据权利要求2所述的真菌或蘑菇，其中，表达水平增加的所述多肽是内源性多肽。
5.根据前述任意一项权利要求所述的真菌或蘑菇，其中，所述降低的表达水平通过降低的多肽生产和/或在相同的培养和/或测试条件下，比衍生出该真菌/蘑菇的亲本真菌 /蘑菇具有更低的所述多肽的活性来达到。
6.根据前述任意一项权利要求所述的真菌或蘑菇，其中，表达水平增加的所述多肽含有与选自SEQ ID NO 29 ；177 ；20 ；56 ；4的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列；以及其中，表达水平降低的所述多肽含有与选自SEQ ID NO 55 ；21力4的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的真菌或蘑菇，其中，表达水平增加的所述多肽含有与选自SEQ ID NO 204 ；207 ；208 ；202和201组成的组中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，以及其中，表达水平降低的所述多肽含有与选自SEQ ID N0:206;205和203 组成的组中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列。
8.根据前述任意一项权利要求所述的真菌或蘑菇，其中，所述真菌/蘑菇是子囊菌纲或担子菌纲，优选是担子菌纲，优选是伞菌目。
9.生产权利要求1至8中任意一项所定义的蘑菇的方法。
10.使用权利要求1至8中任意一项所定义的蘑菇生产感兴趣物质的方法。
11.包含编码多肽的核苷酸序列的核酸构建体，该多肽含有以下氨基酸序列(a)与选自SEQID NO :1-200中的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列；和/或，(b)与选自SEQID NO :201-208中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列；其中，所述核苷酸序列任选地与能够驱动所述核苷酸序列在真菌或蘑菇中表达的启动子操作性地连接。
12.确认能够影响蘑菇生产的刺激因素的方法，该方法的步骤包括(a)提供真菌或蘑菇；(b)对所述真菌/蘑菇应用所述刺激因素；(c)确定步骤b)中真菌/蘑菇的核苷酸序列的表达水平或对应的编码的多肽的活性或稳定状态水平，其中，所述多肽含有与选自SEQ ID NO :1-200组成的组中的序列具有至少 40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，和/或与选自SEQ ID NO :201-208组成的组中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，(d)将没有使用所述刺激因素的真菌/蘑菇中的所述核苷酸序列或多肽的表达、活性或稳定状态水平与(C)中所确定的表达、活性或稳定状态水平进行比较；以及(e)确认在使用所述刺激因素的真菌/蘑菇以及没有使用所述刺激因素的真菌/蘑菇之间产生所述核苷酸序列或多肽的表达水平、活性或稳定状态水平的差异的刺激因素。
13.根据权利要求12的方法，以此将多于一个核苷酸序列或多于一个多肽的表达水平、活性或稳定状态水平进行对比。
全文摘要
本发明涉及一种真菌或蘑菇以及生产它的方法，其中，所述真菌/蘑菇具有增加的多肽表达水平和/或降低的多肽表达水平，其中，所述多肽含有与选自SEQ ID NO1-200的序列具有至少40％氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，和/或与选自SEQ ID NO201-208的序列具有至少50％氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列。
文档编号C07K14/375GK102459318SQ201080024402
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月20日 优先权日2009年4月20日
发明者H·A·B·沃斯顿, J·F·迪琼, L·G·卢格尼斯, R·A·奥姆 申请人:乌特勒支大学, 德国科学技术基金会