针对il－13的人抗体分子的制作方法

专利名称：针对il－13的人抗体分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性结合成员，具体而言是人抗-IL-13抗体分子，尤其是那些可中和IL-13活性的人抗体分子。本发明进一步涉及在包括哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化、炎症性肠病和何杰金氏淋巴瘤在内的IL-13相关失调的诊断或治疗中利用抗-IL-13抗体分子的方法。
本发明的优选实施方案应用了在本文中被称为BAK502G9的抗体分子以及本文所定义的BAK502G9谱系和BAK278D6谱系中的其它抗体分子的抗体VH和/或VL结构域。进一步的优选实施方案应用了BAK278D6谱系，和优选的BAK502G9的互补性决定区(CDRs)，尤其是在其它抗体构架区内的VH CDR3。本发明进一步的方面提供了含有本发明所述特异性结合成员的组合物，以及它们在抑制或中和IL-13方法中的应用，所述方法包括通过特定疗法治疗人或动物体的方法。
正如本文包括的实验方法和进一步由支持性技术文献资料所指出的，本发明提供了在结合和中和IL-13方面具有特定意义的抗体分子，及其在多种治疗方案中的应用。
白细胞介素(IL)-13是具有114个氨基酸的细胞因子，其未经修饰的分子量约为12kDa[1，2]。IL-13与IL-4最为紧密相关，它们在氨基酸水平上具有30％的序列相似性。人IL-13基因位于与IL-4基因相邻的染色体5q31上[1][2]。染色体5q中的该区域含有用于其它的Th2淋巴细胞衍生细胞因子，包括GM-CSF和IL-5的基因序列，业已证实这些细胞因子与IL-4的水平与哮喘病患者和变应性炎症鼠模型的疾病严重程度相关[3][4][5][6][7][8]。
尽管IL-13最初被鉴定为Th2 CD4+淋巴细胞衍生的细胞因子，但其还可由Th1 CD4+T-细胞、CD8+T淋巴细胞、NK细胞，以及诸如肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和呼吸道平滑肌细胞的非T-细胞群体生成。
据报道，IL-13是通过包括本身可结合IL-4而不结合IL-13的IL-4受体α链(IL-4Rα)，以及至少两种其它的细胞表面蛋白IL-13Rα1和IL-13Rα2在内的受体系统介导自身的作用[9][10]。IL-13Rα1可与IL-13低亲和力结合，接着募集IL-4Rα，形成可发出信号的高亲和力功能性受体[11][12]。Genbank资料库提供了IL-13Rα1的氨基酸序列和核酸序列，分别为NP_001551和Y10659。对STAT6(信号转导和转录激活物6)缺陷型小鼠的研究表明IL-13是以与IL-4类似的方式通过利用JAK-STAT6途径发出信号[13][14]。在氨基酸水平上，IL-13Rα2与IL-13Rα1的序列同一性为37％，并可与IL-13高亲和力结合[15][16]。不过，IL-13Rα2所具有的胞质尾区较短，缺乏已知的信号基序。IL-13Rα2的表达细胞即使在IL-4Rα存在条件下也不反应IL-13[17]。由此假设IL-13Rα2充当了可调节IL-13而不调节IL-4功能的诱引受体。该假设在对IL-13Rα2缺陷型小鼠的研究中得到了证实，这种小鼠的表型与对IL-13而言增强的反应性相符[18][19]。Genbank资料库提供了IL-13Rα2的氨基酸序列和核酸序列，分别为NP_000631和Y08768。
所述信号IL-13Rα1/IL-4Rα受体复合体被表达在人B细胞、肥大细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、呼吸道上皮细胞和呼吸道平滑肌细胞上。
支气管哮喘是常见的肺部持续性炎症疾病，其特征在于呼吸道高反应性、粘液超量产生、纤维化和血清IgE水平升高。呼吸道高反应性(AHR)指呼吸道因为诸如冷空气的非特异性刺激而产生的过度收缩。AHR和粘液超量产生均被认为是造成可变呼吸道梗阻的原因，而可变呼吸道梗阻可导致哮喘发作(加重)的呼吸短促特征，是造成与该病有关的死亡率的原因(在英国的死亡率约为2000例/年)。
近年来，哮喘连同其它变应性疾病的发病率显著提高[20][21]。例如，目前英国(UK)约有10％的人口被诊断患有哮喘。
最近，英国胸科协会(BTS)和全球哮喘防治创议(GINA)指导方针提出了治疗哮喘的逐步方法[22][23]。轻微到中度哮喘通常可通过利用吸入性皮质类固醇，并结合β-增效剂或白细胞三烯抑制剂而得以控制。不过，由于有资料表明皮质类固醇具有副作用，患者不愿遵照治疗方案，从而降低了治疗效果[24-26]。
对患有更严重疾病的患者，即通过吸入或口服哮喘指导方针所推荐的较高剂量皮质类固醇所获效果通常非常有限的患者而言，迫切需要新的疗法。长期口服皮质类固醇的治疗会导致诸如骨质疏松、降低儿童的生长速率、糖尿病和口腔白假丝酵母病的副作用[88]。由于皮质类固醇的有利和不利效果均由相同受体介导，治疗是在安全和效能之间实现平衡。约占英国哮喘人口6％的患者因病情加重而接受的住院治疗占保健机构因哮喘所承担巨大经济负担中的大部分[89]。
哮喘的病因被认为是由于免疫系统对无害抗原的不当反应所产生的进行性Th2淋巴细胞介导炎症。越来越多的证据显示，在已确定的呼吸道疾病的发病机理中，关键介体是IL-13，而不是传统的Th2衍生细胞因子IL-4。
将重组IL-13施用于被首次用于实验的非敏化鼠的呼吸道，导致出现了哮喘表型的很多方面，包括呼吸道炎症、粘液产生和AHR[27][28][29][30]。在肺部特异性超量表达IL-13的转基因小鼠中观测到类似表型。在该模型中，更长期地接触IL-13还导致了纤维化[31]。
此外，在变应性疾病的鼠模型中，哮喘表型的很多方面均与IL-13有关。业已证实有效的IL-13中和剂，即可溶性鼠IL-13Rα2可抑制该鼠模型具有的几项特征，即AHR、粘液超量分泌和炎症细胞内向通量[27][28][30]。在补充研究中，已缺失IL-13基因的小鼠未出现变应原诱导的AHR。通过施用重组IL-13，可使这些IL-13缺陷型小鼠再次出现AHR。与之相比，IL-4缺陷型小鼠则出现了该模型中的呼吸道疾病[32][33]。
Taube等人利用长期变应原诱导的肺炎症模型证实了可溶性鼠IL-13Rα2在治疗已确定的呼吸道痰病方面的效能[34]。可溶性鼠IL-13Rα2抑制了AHR、粘液超量产生并缓解了呼吸道炎症程度。与之相比，可结合并拮抗IL-4的可溶性IL-4Rα则对该系统的AHR或呼吸道炎症几乎无效[35]。Blease等人研发出了哮喘的慢性真菌模型，从而证实了上述发现，在该慢性真菌模型中，可抗IL-13而不抗IL-4的多克隆抗体能够减少粘液超量产生、AHR和上皮下的纤维化[36]。
IL-13基因中的许多遗传多态性也与变应性痰病有关。具体而言，因130号氨基酸位的精氨酸残基被取代为谷氨酰胺(Q130R)而获的IL-13基因变体与支气管哮喘、特应性皮炎和血清IgE水平升高有关[37][38][39][40]。将含有20个氨基酸的信号序列排除出该氨基酸计数的某些研究小组还将该特殊IL-13变体称为Q110R变体(110号氨基酸位的精氨酸残基被取代为谷氨酰胺)。Arima等人[41]报道该变体与血清中的IL-13水平升高有关。WO 01/62933论述了该IL-13变体(Q130R)及其抗体。可改变IL-13生成量的IL-13启动子多态性也与变应性哮喘有关[42]。
人们还在哮喘、遗传过敏性鼻炎(枯草热)、过敏性皮炎(湿疹)和慢性窦炎人类患者体内发现IL-13水平升高。例如，与对照患者相比，由哮喘患者所获支气管活组织检查标本、痰和支气管肺泡灌洗(BAL)细胞中的IL-13水平较高[43][44][45][46]。此外，在被变应原激发的哮喘患者中，BAL样品的IL-13水平升高了[47][48]。业已进一步证实CD4(+)T细胞生成IL-13的能力是可用于判断新生儿并发变应性疾病风险的有效标记[49]。
最近，Li等人[114]报道了中和抗鼠IL-13抗体在慢性鼠哮喘模型中的作用。在OVA敏化小鼠体内诱导了类慢性哮喘反应(诸如AHR、严重呼吸道炎症、粘液超量生成)。Li等人报道，在每次OVA激发时施用IL-13抗体可抑制AHR、嗜酸性粒细胞浸润、血清IgE水平、促炎细胞因子/趋化因子水平和呼吸道重构[14]。
概括而言，上述资料均指出IL-13比IL-4更适合作为靶，被用于治疗人变应性疾病。
IL-13在炎症性肠病的发病机理中具有一定作用。据Heller等人[116]报道，通过施用可溶性IL-13Rα2中和IL-13，缓解了人溃疡性结肠炎鼠模型的结肠炎症[116]。相应地，与对照相比，溃疡性结肠炎患者来源的直肠活组织检查标本中的IL-13表达较高[117]。
除哮喘外，IL-13还与其它纤维化病症有关。在系统性硬皮病患者的血清[50]和感染其它形式的肺部纤维化的患者来源的BAL样品[51]中均检测到升高的IL-13水平，高达至比IL-4高1000倍。相应地，小鼠肺部的IL-13超量表达导致了显著的纤维化，而IL-4则无此效果[52][53]。业已在寄生虫诱导的肝纤维化鼠模型中广泛研究了IL-13对除肺以外的其它组织纤维化的作用。通过施用可溶性IL-13Rα2或破坏IL-13基因，但不消除IL-4生成而对IL-13的特异性抑制阻止了肝的纤维发生[54][55][56]。
慢性梗阻性肺病(COPD)包括患有不同程度的慢性支气管炎、小呼吸道疾病和气肿的患者群体，其特征在于进行性不可逆的肺功能衰退，采用目前通用基于哮喘的疗法收效甚微[90]。近年来，COPD发病率显著上升，成为全世界第四大死因(世界卫生组织)。因此，COPD引发了一个巨大的尚未解决的医学需要。
COPD的潜在病因尚不清楚。“Dutch假设”认为COPD和哮喘具有共同的易感性，因而可能是类似机制对这两种失调的发病机理起作用[57]。
Zheng等人[58]证实IL-13在小鼠肺内的超量表达导致了气肿、粘液生成和炎症增加，表现了人COPD的若干方面。此外，业已证实变应性炎症鼠模型的一种IL-13依赖性反应，即AHR对吸烟者的肺功能衰退具有预报性[59]。IL-13启动子多态性与导致COPD的易感性之间的联系也已确定[60]。
因此，有迹象表明IL-13在COPD的发病机理，尤其是在具有包括AHR和嗜酸性粒细胞增多在内的类哮喘特征的患者中具有重要作用。业已证实，与未被报告患有肺病的患者来源的肺样本相比，IL-13在具有COPD病史的患者来源尸体剖检组织样本中的mRNA水平较高(J.Elias于2002年的美国胸科协会年会上所作的口头报告)。另一项研究则通过在COPD患者来源的外周肺切片中进行的免疫组织化学证实了IL-13水平的升高[91]。
何杰金氏病是一种常见类型的淋巴瘤，在美国每年约发生7,500例。何杰金氏病在具有下述特征的恶性肿瘤中不常见，即在这些恶性肿瘤中，通常由B细胞衍生的赘生性Reed-Sternberg细胞仅包括小部分的临床可检测物质。何杰金氏病来源的细胞系和初级Reed-Sternberg细胞常表达IL-13及其受体[61]。由于IL-13可促进正常B细胞的细胞存活和增殖，IL-13因而被认为可充当Reed-Sternberg细胞的生长因子。Skinnider等人证实抗IL-13的中和抗体可抑制何杰金氏病来源细胞系的体外生长[62]。该发现表明Reed-Sternberg细胞可能通过IL-13自分泌和旁分泌细胞因子环而提高了自身的存活。与上述假设相符的是，和正常对照相比，在若干位何杰金氏病患者的血清中检测到升高的IL-13水平[63]。因此，IL-13抑制物可能通过抑制恶性Reed-Sternberg细胞的增殖以阻止疾病的进展。
许多人癌症细胞可表达免疫原性肿瘤特异性抗原。不过，尽管许多肿瘤可自发退化，但大部分肿瘤是通过抑制T细胞介导的免疫性而回避了免疫系统(免疫监视)。Terabe等人[64]证实了IL-13在特定小鼠模型的免疫抑制方面的作用，其中所述小鼠模型的肿瘤在最初生长后可自发退化并继而复发。用可溶性IL-13Rα2特异性抑制IL-13可使这些小鼠的肿瘤不再复发。Terabe等人[64]继续证实IL-13可抑制介导了抗肿瘤免疫反应的肿瘤特异性CD8+细胞毒性淋巴细胞的分化。
因此，可在治疗中采用IL-13抑制物阻止肿瘤复发或转移。对IL-13的抑制已被证实可在动物模型中使抗病毒疫苗加强，并且可能有助于治疗HIV及其它传染病[65]。
应当指出的是，除非另外指明，本文涉及的白细胞介素-13或IL-13通常指人IL-13。在本文的若干处还指“抗原”。本发明提供了抗人IL-13的抗体，具体而言是与包括猕猴和恒河猴IL-13在内的非人灵长类动物IL-13具有交叉反应性的人抗体。本发明若干实施方案所述的抗体可识别因130号氨基酸位的精氨酸残基被取代为谷氨酰胺后而获得的IL-13变体。本发明的另一些方面和实施方案提供了抗鼠IL-13，尤其是抗小鼠IL-13的特异性结合成员。
附图简述

图1所示为BAK167A11(实心方框)及其衍生物BAK615E3(空心方框)在TF-1细胞增殖试验中作为scFv抗25ng/ml人IL-13的中和效价(％抑制)。三角形代表无关scFv。数据如相同试验三次测定结果的平均值和标准误条带所示。
图2所示为BAK278D6(实心方框)及其衍生物BAK502G9(空心方框)在TF-1细胞增殖试验中作为scFv抗25ng/ml人IL-13的中和效价(％抑制)。三角形代表无关scFv。数据如相同试验三次测定结果的平均值和标准误条带所示。
图3所示为BAK209B11(实心方框)在TF-1细胞增殖试验中作为scFv抗25ng/ml鼠IL-13的中和效价(％抑制)。三角形代表无关scFv。数据如相同试验三次测定结果的平均值和标准误条带所示。
图4所示为BAK278D6(实心方框)在TF-1细胞增殖试验中作为scFv抗IL-13的中和效价(％抑制)。三角形代表无关scFv。数据如相同试验三次测定结果的平均值和标准误条带所示。
图4A所示为抗25ng/ml人IL-13的效价。
图4B所示为抗25ng/ml人变异IL-13的效价。
图4C所示为抗50ng/ml非人灵长类动物IL-13的效能。
图5所示为若干种抗人IL-13抗体在TF-1增殖试验中的效价比较。数据如5-7次抗25ng/ml人IL-13试验的平均中和效价和标准误条带所示。相对于商业可提供抗体B-B13的性能是通过进行单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与B-B13相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
图6所示为BAK502G9(实心方框)、BAK1167F2(实心三角形)和BAK1183H4(实心倒三角形)在TF-1细胞增殖试验中作为人IgG4抗标记IL-13的中和效价(％抑制)。空心三角形代表无关IgG4。数据如三次不同试验的平均值和标准误条带所示。
图6A所示为抗25ng/ml人IL-13的效价。
图6B所示为抗25ng/ml人变异IL-13的效价。
图6C所示为抗50ng/ml非人灵长类动物IL-13的效价。
图7所示为在天然IL-13依赖性HDLM-2细胞增殖试验中，BAK502G9(实心方框)、BAK1167F2(实心三角形)、BAK1183H4(实心倒三角形)作为人IgG4的中和效价(％抑制)，和商品抗人IL-13抗体(B-B13-空心方框；JES10-5A2-空心倒三角形)的中和效价(％抑制)。空心三角形代表无关scFv。数据如相同试验三次测定结果的平均值和标准误条带所示。
图8所示为若干种抗人IL-13抗体在NHLF试验中的效价比较。数据如NHLF嗜酸性粒细胞趋化因子释放试验中所进行的4-5次抗10ng/ml人IL-13试验的平均中和效价(IC50pM)和标准误条带所示。相对于商业可提供抗体B-B13的性能是通过单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与B-B13相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
图9所示为BAK502G9(实心方框)、BAK1167F2(实心三角形)、BAK1183H4(实心倒三角形)作为人IgG4在反应10ng/ml人IL-13的HUVEC表面上抗VCAM-1正调节的中和效价(％抑制)。空心三角形代表无关IgG4。数据如相同试验三次测定结果的平均值和标准误条带所示。
图10所示为BAK502G9(实心方框)、BAK1167F2(实心三角形)、BAK1183H4(实心倒三角形)作为人IgG4在反应1ng/ml人IL-4(图10A)或0.5ng/ml人IL-1β(图10B)的HUVEC表面上抗VCAM-1正调节所导致的嗜酸性粒细胞趋化因子释放的中和效价(％抑制)。空心三角形代表无关IgG4。数据如相同试验三次测定结果的平均值和标准误条带所示。
图11所示为BAK209B11(方框)在因子依赖性B9细胞增殖试验中抗1ng/ml鼠IL-13的中和效价(％抑制)。空心三角形代表无关IgG4。数据如相同试验三次测定结果的平均值和标准误条带所示。
图12所示为在急性肺变应性炎症鼠模型中，激发后敏化(s)(右侧柱)和非敏化(ns)(左侧柱)小鼠来源的肺匀浆中IL-13的相对水平。敏化效果是通过利用IL-13的数量数据进行斯氏t检验而得以统计评估的。与非敏化对照动物(n＝5-6只小鼠)相比，*＜0.05，**＜0.01。数据如平均值和标准误条带所示。
图13图解了静脉施用不同量BAK209B11作为人IgG4在卵清蛋白敏化小鼠体内对卵清蛋白诱导的肺部白细胞募集的影响，并与同种型匹配IgG4无关对照抗体进行对比。白细胞数如图所示(×104)。抗体治疗效果是通过利用细胞分类计数数据进行单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与卵清蛋白激发的PBS对照动物(＝0％抑制；n＝5-8只小鼠)相比，*＜0.05，**＜0.01。数据如平均值和标准误条带所示。
图14图解了静脉施用不同量BAK209B11作为人IgG4在卵清蛋白敏化小鼠体内对卵清蛋白诱导的肺部嗜酸性粒细胞募集的影响，并与同种型匹配IgG4无关对照抗体进行对比。嗜酸性粒细胞数如图所示(×104)。抗体治疗效果是通过利用细胞分类计数数据进行单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与卵清蛋白激发的PBS对照动物(＝0％抑制；n＝5-8只小鼠)相比，*＜0.05，**＜0.01。数据如平均值和标准误条带所示。
图15图解了静脉施用不同量BAK209B11作为人IgG4在卵清蛋白敏化小鼠体内对卵清蛋白诱导的肺部嗜中性粒细胞募集的影响，并与同种型匹配IgG4无关对照抗体进行对比。嗜中性粒细胞数如图所示(×104)。抗体治疗效果是通过利用细胞分类计数数据进行单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与卵清蛋白激发的PBS对照动物(＝0％抑制；n＝5-8只小鼠)相比，*＜0.05，**＜0.01。数据如平均值和标准误条带所示。
图16图解了静脉施用不同量BAK209B11作为人IgG4在卵清蛋白敏化小鼠体内对卵清蛋白诱导的肺部淋巴细胞募集的影响，并与同种型匹配IgG4无关对照抗体进行对比。BAK209B11以剂量依赖性方式抑制淋巴细胞的诱导，可造成最大抑制的BAK209B11剂量为3μg/ml。抗体治疗效果是通过利用细胞分类计数数据进行单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与卵清蛋白激发的PBS对照动物(＝0％抑制；n＝5-8只小鼠)相比，*＜0.05，**＜0.01。数据如平均值和标准误条带所示。
图17图解了静脉施用不同量BAK209B11作为人IgG4在卵清蛋白敏化小鼠体内对卵清蛋白诱导的肺部单核细胞/巨噬细胞募集的影响，并与同种型匹配IgG4无关对照抗体进行对比。与对照动物相比，敏化动物的单核细胞/巨噬细胞水平并未显著升高。但在敏化动物体内，≥36μg/ml BAK209B11可降低这些细胞的自然背景值。抗体治疗效果是通过利用细胞分类计数数据进行单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与卵清蛋白激发的PBS对照动物(＝0％抑制；n＝5-8只小鼠)相比，*＜0.05，**＜0.01。数据如平均值和标准误条带所示。
图18所示为市售抗-IL-13中和抗体JES10-5A2对进入因施用细菌来源重组人IL-13所造成的鼠气囊内的细胞内向通量(白细胞数如图所示(×104))的影响。抗体治疗效果是通过利用细胞分类计数数据进行单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与CMC对照动物(＝0％抑制；n＝11-13只小鼠)相比，*＜0.05，**＜0.01。数据如平均值和标准误条带所示。
图19所示为猕猴IL-13与人IL-13氨基酸序列的比对。人IL-13与猕猴IL-13不同的7个氨基酸残基如阴影部分所示。恒河猴IL-13和猕猴IL-13的氨基酸序列相同。
图20图解了单次静脉施用集合药团剂量为10mg/kg的BAK502G9作为人IgG4在29天内对4只具有变应性但未被激发的猕猴灵长类动物(2只雄性/2只雌性)的血清IgE水平的影响。给药后第4和第5天，血清IgE浓度由100％(初始剂量)显著降低至对照值的66±10％(p＜0.05)。第22天，该血清IgE浓度的降低恢复至对照水平的88±8％。与初始剂量IgE水平相比，重复测定ANOVA后，通过Dunnett多重比较检验可得*＝p＜0.05(n＝4只动物)。
图20B所示为单次静脉内施用剂量为10mg/kg的BAK502G9后，雄性和雌性猕猴灵长类动物的相对血清IgE水平与时间的关系曲线。相对血清IgE数据被表示为算术平均值±基线值的SEM百分比。
图21图解了腹膜内施用不同量(H＝237μg/天、M＝23.7μg/天和L＝2.37μg/天)BAK209B11对卵清蛋白敏化和激发小鼠肺功能的影响，并与同种型匹配IgG1无关对照抗体进行对比。图21A以PC50s的对数(使基线PenH提高50％所需乙酰甲胆碱浓度的对数值)形式显示了在所有治疗之前(第0天)和敏化、激发和药物治疗后(第25天)的肺功能。图21A所示为被用于计算图21B所示研究终点(ΔlogPC50)的原始数据。数据如平均值和标准误条带所示，n＝8。
在图21B中，可变肺功能如个体小鼠PC50对数值的变化(ΔlogPC50)所示。Δlog PC50的定义是个体小鼠第25天与第0天的log PC50之差。数据如组Δlog PC50平均值(由接受治疗的实验组内的个体变化平均所得)和标准误条带所示。抗体治疗效果是通过利用Δlog PC50数据进行单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与卵清蛋白敏化和激发的对照动物(n＝8只小鼠)相比，**p＜0.01。
图22图解了局部(气囊内)和系统(静脉内)施用不同量BAK502G9作为人IgG4对进入BALB/C小鼠气囊内的白细胞总募集量(图22A)和嗜酸性粒细胞总募集量(图22B)的影响，并与同种型匹配IgG4无关对照抗体进行对比。数据如平均值和标准误条带所示，n＝10。抗体治疗效果是通过利用变换数据对数值进行单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与huIL-13激发小鼠(n＝10)相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
图23图解了腹膜内施用BAK502G9作为人IgG4对小鼠呼吸道在气管内施用人IL-13后所出现的AHR的影响，并与同种型匹配IgG4无关对照抗体进行对比。抗体治疗效果是通过利用PC200乙酰甲胆碱数据进行单向ANOVA和Dunnett检验而得以统计评估的。与人IL-13阳性对照组(n＝6-8只小鼠)相比，*＜0.05，**＜0.01。数据如平均值和标准误条带所示。
图24所示为BAK502G9(实心方框)作为IgG4在人B细胞IgE生成试验中抗30ng/ml IL-13的中和效价(％最大反应)。空心方框代表无关IgG4。数据如利用6个供体进行不同试验所获数据的平均值和标准误条带所示。
图25所示为BAK502G9对支气管平滑肌细胞内由IL-13诱导的增效剂诱导性Ca2+信号增强的影响。测定了各抗体+/-IL-13预处理条件下由反应组胺产生的Ca2+信号所标绘的曲线下方的面积(AUC)。利用无关抗体CAT-001(a)和BAK502G9(b)进行三次独立试验所获的组合数据均被显示为与未经处理细胞AUC±SD(ns＝不显著(p＞0.05)，*p＜0.05，**p＜0.01)的差值百分比。利用单向方差分析(ANOVA)和Bonferroni多重对比后检验统计评估结果。
图26所示为II期施用BAK502G9的作用。
图26A所示为根据组胺剂量反应曲线下方面积的变化所测对AHR的影响(n＝14)。
图26B所示为根据PC30的变化所测对AHR的影响(n＝18)。
图26C所示为对抗原引发的影响(n＝20)。
图26D所示为对BAL炎症的影响(n＝21)。
图27所示为BAK502G9对IL-13诱导的CD23表达的影响。数据被显示为与仅对IL-13(100％)的反应的百分比，被表达为由6个独立供体进行6个独立试验(各平行进行三次)所获数据的平均值±对照的SEM％。
图28所示为BAK502G9和无关IgG4对IL-13和/或IL-4诱导的PBMC CD23表达的影响。数据被显示为与仅对IL-4(100％)的反应的百分比，被表达为由4个独立供体进行4个独立试验(各平行进行三次)所获数据的平均值±对照的SEM％。
图29A所示为BAK502G9对通过用含有IL-13/TNF-α/TGF-β1的培养基进行48小时培养所诱导的NHLF嗜酸性粒细胞趋化因子-1生成的影响。数据被显示为通过在该研究中用所述培养基诱导白细胞形状的变化，并平行进行三次测定所获数据的平均值±SEM。
图29B所示为BAK502G9对由条件培养基的1∶16稀释液所诱导的人嗜酸性粒细胞形状变化的影响。数据点被显示为通过用4个独立供体进行独立试验所获数据的平均值±用空白培养基所获形状变化的SEM％。
图30所示为人IL-13与鼠IL13的比对，突出部分所示为被导入人IL-13并可生成第一个图框所示IL-13嵌合体的突变。方框内突出显示了4个α螺旋，环1和环3被标记了。5种嵌合蛋白是通过用鼠序列取代螺旋B、C和D，以及环1和环3而生成的。生成另外4种嵌合蛋白，并根据人前蛋白中的氨基酸对其编号(而不是根据上述多重比对的编号)，其中30号位残基的精氨酸(上述34号位)被突变、33和34号位残基(上述37和38号位)被突变、37和38号位残基(VH)被突变(上述41和42号位)，以及40和41号位残基(TQ)被突变(上述44和45号位)。
图31所示人IL-13与鼠IL13的比对，突出部分所示为被导入人IL-13并可生成第二个图框所示IL-13嵌合体的突变。通过用人残基取代鼠残基(如方框部分突出所示)，可生成6种嵌合体。通过使58号残基的亮氨酸(上图的62号位残基)突变、119号残基的亮氨酸(上图的123号位残基)突变、123号残基的赖氨酸(上图的127号位残基)突变，以及127号残基的精氨酸(上图的132号位残基)突变(上图的132号位残基)，可生成另外4种嵌合蛋白(根据人前蛋白的氨基酸位置编号)。
图32所示为对人IL-13的突变。深灰色部分所示突变减弱了与BAK502G9的结合、浅灰色部分所示突变不改变该结合。具有突变残基的前人IL-13的线型序列如图所示。
本发明的多个方面和实施方案提供了下文所包括权利要求的主旨。
本发明提供了针对IL-13，尤其是人和/或灵长类动物IL-13和/或变异IL-13(Q130R)，以及鼠IL-13的特异性结合成员。本发明的优选实施方案是抗体分子，而无论完整抗体(例如IgG，诸如IgG4)或抗体片段(例如scFv、Fab、dAb)。所提供的抗体抗原结合区为抗体VH和VL结构域。VH和VL结构域内可含有若干互补决定区CDR，这些互补决定区可被包括在不同构架区FR内，并根据情况形成VH或VL结构域。抗原结合位点可由抗体VH结构域和/或VL结构域组成。
通过使CDR定位于诸如纤连蛋白或细胞色素B等非抗体蛋白支架结构上，可获得抗原结合位点[115、116]。Nygren等人详细论述了可用于设计蛋白质内新结合位点的支架结构[116]。WO/0034784公开了用于抗体模拟物的蛋白质支架结构，其发明者在其中描述了包括具有至少一个随机化环的纤连蛋白IH型结构域的蛋白质(抗体模拟物)。可导入一个或多个CDR，例如一组HCRR的合适支架结构可由免疫球蛋白基因超家族的任意结构域部分提供。
本发明的若干优选实施方案在本文被称为“BAK278D6谱系”。其定义与含有一组如下所列6个CDR序列的BAK278D6有关HCDR1(SEQ ID NO1)、HCDR2(SEQ ID NO2)、HCDR3(SEQ ID NO3)、LCDR1(SEQ ID NO4)、LCDR2(SEQ ID NO5)和LCDR3(SEQID NO6)。本发明的一个方面提供了针对人IL-13的特异性结合成员，具有由人抗体VH结构域和人抗体VL结构域组成并包括一组CDR的抗体抗原结合位点，其中VH结构域包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，VL结构域包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1具有SEQ IDNO1所示氨基酸序列、HCDR2具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列、HCDR3具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列、LCDR1具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列、LCDR2具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列、LCDR3具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列；或者其中的CDR组与下述CDR组，即具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的LCDR1、具有SEQID NO5所示氨基酸序列的LCDR2、具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的LCDR3相比，含有一处或两处氨基酸取代。
其中HCDR1具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列、HCDR2具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列、HCDR3具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列、LCDR1具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列、LCDR2具有SEQID NO5所示氨基酸序列、LCDR3具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的CDR组在本文中被称为“BAK278D6 CDR组”。BAK278D6 CDR组内的HCDR1、HCDR2和HCDR3被称为“BAK278D6 HCDR组”，BAK278D6 CDR组内的LCDR1、LCDDR2和LCDR3被称为“BAK278D6 LCDR组”。具有BAK278D6 CDR组、BAK278D6 HCDR组或BAK278D6 LCDR组，或具有一处或两处取代的CDR组均被认为属于BAK278D6谱系。
如上所述，本发明的一个方面提供了针对人IL-13的特异性结合成员，具有由人抗体VH结构域和人抗体VL结构域组成并包括一组CDR的抗体抗原结合位点，其中所述CDR组为BAK278D6 CDR组或与其相比含有一处或两处取代的CDR组。
在优选实施方案中，所述一处或两处取代位于VH和/或VL结构域所含CDR内下列残基位中的一处或两处，编号采用Kabat标准编号法[107]。
HCDR1中的31、32、34号位HCDR2中的52、52A、53、54、56、58、60、61、62、64、65号位HCDR3中的96、97、98、99、101号位LCDR1中的26、27、28、30、31号位LCDR2中的56号位LCDR3中的95A、97号位与上述BAK278D6 CDR组相比，优选实施方案在HCDR3的99号残基和LCDR1的27号残基处具有两处取代。这些实施方案中的优选方案是将HCDR3的99号残基上的N取代为S，和/或将LCDR1的27号残基上的N取代为I。还要进一步的实施方案具有位于HCDR3的99号残基并选自S、A、I、R、P和K的取代，和/或位于LCDR1的27号残基并选自I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H和G的取代。
在优选实施方案中，所述一处或两处取代位于BAK278D6 CDR组内的下列残基位中的一处或两处，并选自下列已确定的可能取代残基取代位置 取代残基选自HCDR1中的31号位Q、D、L、G和EHCDR1中的32号位THCDR1中的34号位V、I和FHCDR2中的52号位D、N、A、R、G和EHCDR2中的52A号位 D、G、T、P、N和YHCDR2中的53号位D、L、A、P、T、S、I和RHCDR2中的54号位S、T、D、G、K和IHCDR2中的56号位T、E、Q、L、Y、N、V、A、M和GHCDR2中的58号位I、L、Q、S、M、H、D和KHCDR2中的60号位R
HCDR2中的61号位 RHCDR2中的62号位 K和GHCDR2中的64号位 RHCDR2中的65号位 KHCDR3中的96号位 R和DHCDR3中的97号位 N、D、T和PHCDR3中的98号位 RHCDR3中的99号位 S、A、I、R、P和KHCDR3中的101号位 YLCDR1中的26号位 D和SLCDR1中的27号位 I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H和GLCDR1中的28号位 VLCDR1中的30号位 GLCDR1中的31号位 RLCDR2中的56号位 TLCDR3中的95A号位 NLCDR3中的97号位 I优选实施方案具有BAK278D6 CDR组，其中HCDR3的99号残基上的N被取代为S，LCDR1的27号残基上的N被取代为I。因此，对CDR组的定义如下HCDR1-SEQ ID NO7；HCDR2-SEQ IDNO8；HCDR3-SEQ ID NO9；LCDR1-SEQ ID NO10；LCDR2-SEQ ID NO11；LCDR3-SEQ ID NO12。本文将该CDR组称为“BAK502G9 CDR组”。
进一步的优选实施方案具有含一处或两处取代的BAK278D6 CDR组，条件是排除了将HCDR3的99号残基上的N取代为S和将LCDR1的27号残基上的N取代为I的取代组合。
一些优选实施方案如下BAK1166G2HCDR1-SEQ ID NO67、HCDR2--SEQ ID NO68、HCDR3--SEQ ID NO69、LCDR1--SEQ IDNO70、LCDR2--SEQ ID NO71、LCDR3--SEQ ID NO72。
BAK1167F2HCDR1--SEQ ID NO61、HCDR2--SEQ ID NO62、HCDR3--SEQ ID NO63、LCDR1--SEQ ID NO64、LCDR2--SEQ IDNO65、LCDR3--SEQ ID NO66。
BAK1184C8HCDR1-SEQ ID NO73、HCDR2--SEQ ID NO74、HCDR3--SEQ ID NO75、LCDR1--SEQ ID NO76、LCDR2--SEQ IDNO77、LCDR3--SEQ ID NO78。
BAK1185E1HCDR1-SEQ ID NO79、HCDR2--SEQ ID NO80、HCDR3--SEQ ID NO81、LCDR1--SEQ ID NO82、LCDR2--SEQ IDNO83、LCDR3--SEQ ID NO84。
BAK1167F4HCDR1-SEQ ID NO85、HCDR2--SEQ ID NO86、HCDR3--SEQ ID NO87、LCDR1--SEQ ID NO88、LCDR2--SEQ IDNO89、LCDR3--SEQ ID NO90。
BAK1111D10HCDR1-SEQ ID NO91、HCDR2--SEQ IDNO92、HCDR3--SEQ ID NO93、LCDR1--SEQ ID NO94、LCDR2--SEQ ID NO95、LCDR3--SEQ ID NO96。
BAK1183H4HCDR1-SEQ ID NO97、HCDR2--SEQ IDNO98、HCDR3--SEQ ID NO99、LCDR1--SEQ ID NO100、LCDR2--SEQ ID NO101、LCDR3--SEQ ID NO102。
BAK1185F8HCDR1-SEQ ID NO103、HCDR2--SEQ IDNO104、HCDR3--SEQ ID NO105、LCDR1--SEQ ID NO106、LCDR2--SEQ ID NO107、LCDR3--SEQ ID NO108。这些CDR组均是通过重链CDR1和CDR2随机化而来源于BAK502G9，因而属于BAK502G9谱系。
具有包括特定CDR组，即HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH结构域的所有克隆如表1所示。本发明提供了表1，该表另外包括其所示克隆具有的包括特定CDR组，即LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL结构域。所述VH结构域优选地与所述VL结构域配对，该VH和VL结构域配对最优选地与表1所示克隆中的配对情况相同。
本发明进一步提供了包括特定CDR组，即HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH结构域，其中该CDR组与表1所示所有克隆具有的CDR组相比，含有一处或两处氨基酸取代。
本发明进一步提供了包括特定CDR组，即LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL结构域，其中该CDR组与表1所示所有克隆具有的CDR组相比，含有一处或两处氨基酸取代。
本发明还提供了具有包括上述VH和/或VL结构域的抗体抗原结合结构域的特异性结合成员。
发明者通过提供具有特殊意义的抗IL-13的人抗体抗原结合结构域，从而确定了BAK278D6谱系。该谱系内的BAK502G9被认为具有特殊意义。如上所述，还确定了BAK278D6和BAK502G9的CDR组。
在计算化学率先应用多元数据分析技术分析了结构/特性-活性关系[94]后，可利用众所周知的数学方法，诸如统计回归、模式识别和分类方法，导出抗体活性-特性的定量关系[95-100]。根据抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型(例如，对可能接触的残基的分析或计算所获的物理化学特性)可导出抗体特性，且这些特性可以被单独和组合考虑。
包括VH结构域和VL结构域的抗体抗原结合位点由6个多肽环形成3个来自轻链可变结构域(VL)，3个来自重链可变结构域(VH)。对已知原子结构的抗体的分析已阐明了抗体结合位点的序列与三维结构之间的关系[101、102]。这些关系意味着，除了VH结构域内的第三个区域(环)之外，结合位点环具有少数几种主链构象规范结构中的一种。特定环内形成的规范结构已被证实可通过其大小以及在该环和构架区两处内的关键位点上所存在的某些残基而得以确定[101、102]。
对序列-结构关系的研究可被用于预测在序列已知但三维结构未知的抗体内，对维持其CDR环的三维结构和由此维持结合特异性而言具有重要作用的那些残基。通过与前导优化试验所获结果进行比较，便可证实这些预测。
在结构方法中，利用可免费获得或市售的软件包，诸如WAM[104]，便可构建抗体分子模型[103]。继而可采用蛋白质显色和分析软件包，诸如Insight II[105]或Deep View[106]，评估所述CDR内各位置处可能出现的取代。接着可利用该信息实现对活性的影响可能最小或有利的取代。
发明者分析了所含CDR组如表1所示的克隆系列的序列数据。
该分析检验了下述假设，即在已有scFv变体组来源的CDR中，所列氨基酸变异的任意二元组合均将导致出现至少具有亲本scFvBAK278D6的初始效价的scFv变体。
表1所示列表中的所有scFv变体已被选择用于提高亲和力，并已被证实可表现较高的效价。
所观测氨基酸变体对scFv BAK278D6在44nM的TF-1试验中的初始效价的影响可能有利、不利或者中性。
在任意两种氨基酸变异之间均未观测到联系，说明任意两种选定氨基酸变异之间不存在“正”或“负”协同作用。
有4种情况是所述二元组合可使上述假设成立，有3种情况是该假设无法成立。协同的氨基酸变体未被考虑在内，因为未观测到它们之间的联系。
所述假设成立的情况是A1突变1有利，突变2有利A2突变1有利，突变2中性A3突变1中性，突变2中性A4突变1有利，突变2不利(突变1的影响在重要性上胜过突变2的影响)。
所述假设不成立的情况是B1突变1不利，突变2中性B2突变1不利，突变2不利B3突变1有利，突变2不利(突变2的影响在重要性上胜过突变1的影响)。
如果A4可能，突变1必须高度有利于平衡突变2对效价所造成的不利影响。由于这种高度有利的突变应存在于被用于筛选的变体文库中，因而可将其选出并使其频繁出现在变体列表中。由于可排除协同作用，这种突变在所有类型的序列中均是有利的，因此应该再次出现在不同的scFv变体中。这种常见氨基酸变化的实例是出现在轻链CDR1Asn27Ile中的变化。但该突变本身(在克隆BAK531E2中)对效价仅具有普通的2倍影响(最终IC50为23.2nM)。该突变本身将不会使A4所述情况发生，因为其并非高度有利的突变。这表明(表1)所列具有轻链CDR1 Asn27Ile变化以及1处或2处其它突变的IL-13结合克隆组内的每一种克隆至少与具有单个轻链CDR1 Asn27Ile突变的变体一样有效。其它突变则具有中性或有利影响，而不具有不利或有害的影响。
进一步的实例出现在重链CDR3 Asn99Ser中(参见表1)。由于未发现具有该特定单个氨基酸变异的克隆，通过下述理论估计这种克隆的效价约为12.0nMBAK278D6效价为44nM。改造VL CDR1N27I+VH CDR3 N99S可获得效价为8nM的BAK502G9，即提高了5.5倍。
BAK278D6效价为44nM。改造VL CDR1 N27I可获得效价为23nM的BAK531E2，即提高了1.9倍。
BAK278D6效价为44nM。改造VH CDR3 N99S可能获得效价为12.2nM的克隆，即提高了2.9倍(5.5/1.9＝2.9)。
重链CDR3 Asn99Ser与轻链CDR1 Asn27Ile的二元组合可获得效价为8nM的scFv BAK502G9。由于排除了协同作用，所以重链CDR3Asn99Ser变化在BAK502G9中的作用是迭加的。
因此，(表1)所列具有重链CDR3 AsnH99Ser变化以及一处或多处其它突变的IL-13结合克隆组内的每一种克隆将具有至少为12nM或更高的效价，在n＝1-2的许可性试验窗口范围内，即2.5倍。
因此，发明者指出尚未观测到可被优选的高度有利的氨基酸变异。如上所述，经过分析发现在表1所列scFv变体中主要存在的两种变异较接近。表1所列具有这两种变异之一以及一处或多处其它突变的所有scFv变体显示的效价至少比含有亲本BAK278D6中的2种单个氨基酸变异之一的克隆所显示的效价高。因此，尚无证据表明表1列表中存在可使A4所述情况发生的高度有利的氨基酸变异。
发明者根据该观测结果所获结论如下，即该scFv变体组中不存在不利突变。这意味着A4和B1-B3所述情况无关，且所述假设成立。
如上所述，本发明相应提供了包括上文所定义的CDR组，尤其是BAK278D6的CDR组，和BAK278D6谱系中具有一处或两处取代的CDR组，例如BAK502G9 CDR组的特异性结合成员。
相关CDR组被包括在抗体构架区或其它蛋白质支架内，例如纤连蛋白或细胞色素B[115、116]。优选应用抗体构架区，且当如此应用时，这些抗体构架区优选为种系，更优选的是，用于重链的抗体构架区可以是VH1家族来源的DP14。用于轻链的优选构架区可以是λ3-3H。对BAK502G9 CDR组而言，优选的抗体构架区为VH FR1 SEQ IDNO27、VH FR2 SEQ ID NO28、VH FR3 SEQ ID NO29、轻链FR1 SEQID NO30、轻链FR2 SEQ ID NO31、轻链FR3 SEQ ID NO32。在一种高度优选的实施方案中，VH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO15所示，被称为“BAK502G9 VH结构域”。在一种进一步的高度优选实施方案中，VL结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO16所示，被称为“BAK502G9 VL结构域”。本发明提供的高度优选抗体抗原结合位点包括BAK502G9 VH结构域SEQ ID NO15和BAK502G9 VL结构域SEQ ID NO16。正如本文其它部分所论述的，该抗体抗原结合位点可被包括在任意的目标抗体分子形式内，例如scFv、Fab、IgG、IgG4、dAb等。
在一种进一步的高度优选实施方案中，本发明提供了包括BAK502G9 VH结构域SEQ ID NO15和BAK502G9 VL结构域SEQ IDNO16的IgG4抗体分子。本文将其称为“BAK502G9 IgG4”。
本发明还提供了包括BAK502G9 VH结构域SEQ ID NO15和/或BAK502G9 VL结构域SEQ ID NO16的其它IgG4或其它抗体分子，以及抗体VH结构域内含有BAK502G9 HCDR组(SEQ ID NO7、8和9)，和/或抗体VL结构域内含有BAK502G9 LCDR组(SEQ IDNO10、11和12)的其它抗体分子。
此处应指出的是，本文所用“和/或”应被理解为对两种特定特征或组成之一单独出现或与另一种特征或组成一起出现的特定描述。例如“A和/或B”应被理解为对(i)A、(ii)B和(iii)A和B这三种情况之一的特定描述，就如同本文将这三种情况单独列出而已。
如上所述，本发明提供了可结合人IL-13并包括BAK502G9 VH结构域(SEQ ID NO15)和/或BAK502G9 VL结构域(SEQ ID NO16)的特异性结合成员。
VH结构域通常与VL结构域配对，可获得抗体抗原结合位点，但正如下文进一步论述的，VH结构域本身就可被用于结合抗原。在一种优选实施方案中，BAK502G9 VH结构域(SEQ ID NO15)与BAK502G9VL结构域(SEQ ID NO16)配对，从而形成了同时包括上述BAK502G9VH和VL结构域的抗体抗原结合位点。在另一些实施方案中，BAK502G9 VH是与除BAK502G9 VL之外的其它VL结构域配对。轻链混杂是本领域熟知的。
同样，BAK278D6谱系的所有HCDR组均可被包括在被单独用作特异性结合成员或与VL结构域一起组合用作特异性结合成员的VH结构域内。VH结构域可具有BAK278D6谱系抗体的一组HCDR，例如，如表1所示，并且如果这种VH结构域与VL结构域配对，则该VL结构域可具有BAK278D6谱系抗体的一组LCDR，例如，如表1所示。HCDR组与LCDR组的配对可能如表1所示，可生成包括表1所示CDR组在内的抗体抗原结合位点。所述VH和/或VL结构域的构架区可能是种系构架。重链结构域的构架区可选自VH-1家族，且优选VH-1构架为DP-14构架。轻链的构架区可选自λ3家族，且其优选构架为λ33H。
可由BAK502G9 VH或VL结构域中取出一个或多个CDR，并将它们整合进合适的构架内。本文对该内容进行了进一步的论述。BAK502G9 HCDR 1、2和3分别如SEQ ID NO7、8和9所示。BAK502G9 LCDR 1、2和3分别如SEQ ID NO10、11和12所示。
对其它BAK278D6谱系CDR和CDR组而言的相同应用如表1所示。
本发明进一步的实施方案涉及包括所述VH和/或VL结构域的特异性结合成员，或包括本文所公开抗体分子，诸如167A11(VHSEQID NO23和VLSEQ ID NO24)及其衍生物615E3(VHSEQ IDNO33和VLSEQ ID NO34)BAK582F7(VH CDR’s SEQ ID’s141-143)和BAK612B5(VH CDR’s SEQ ID’s 147-149)的VH和/或VL结构域所含CDRs的抗原结合位点。上述抗体均可识别人IL-13。167A11通过VH CDR3随机化生成的衍生物是有效的scFv分子(5-6nM)。正如本文针对其它分子所述，167A11谱系可被应用在本发明的任意方面和实施方案中，例如，使抗原结合位点突变和筛选效价提高的抗原结合位点的方法。
本发明所述VH和VL结构域和CDRs的变体包括本文提供了氨基酸序列的那些变体和可被应用在针对IL-13的特异性结合成员中的那些变体，均可通过序列变更或突变和筛选方法获得。本发明也提供了这些方法。
正如本文所论述的，序列已被本文具体公开的任意VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体均可被应用在本发明中。特殊变体可能包括一处或多处氨基酸序列变更(添加、缺失、取代和/或插入氨基酸残基)，可能具有少于大约20处的变更、少于大约15处的变更、少于大约10处的变更或少于大约5处的变更、4处、3处、2处或1处变更。可对一个或多个构架区和/或一个或多个CDR’s进行改造。
本发明进一步的方面提供了可与特定的特异性结合成员竞争结合抗原的特异性结合成员，所述特定的特异性结合成员可结合所述抗原，并且包括本文所公开的特异性结合成员、VH和/或VL结构域，或本文公开的HCDR3，或它们的变体。结合成员之间的竞争可通过体外试验轻松确定，例如，利用ELISA和/或通过用特异性报道分子标记其中一个可在其它未标记结合成员存在条件下被检出的结合成员，以鉴定可结合相同表位或重叠表位的特异性结合成员。
因此，本发明的一个进一步的方面提供了具有人抗体抗原结合位点的特异性结合成员，可与BAK502G9抗体分子，尤其是BAK502G9scFv和/或IgG4竞争结合IL-13。本发明进一步的方面提供了具有可与特定抗体抗原结合位点竞争结合IL-13的人抗体抗原结合位点的特异性结合成员，其中所述特定抗体抗原结合位点包括VH结构域和VL结构域，而其中所述VH和VL结构域则包括BAK278D6谱系的CDR组。
本领域可应用多种方法获得可与BAK502G9抗体分子、具有BAK502G9 CDR组的抗体分子，或具有BAK278D6谱系的CDR组的抗体分子竞争结合IL-13的抗IL-13抗体。
在一个进一步的方面中，本发明提供了可获得一种或多种能够与所述抗原结合的特异性结合成员的方法，该方法包括使本发明所述特异性结合成员的文库与所述抗原接触，并筛选该文库内能够结合该抗原的一个或多个特异性结合成员。
该文库可被展示在噬菌体粒子表面上，其中所述噬菌体粒子均含有编码其表面所展示抗体VH可变结构域的核酸，任选地当其表面还展示VL结构域时，便还含有编码该VL结构域的核酸。筛选出能够结合所述抗原并可被展示在噬菌体粒子上的特异性结合成员之后，便可从展示了筛选所获特异性结合成员的噬菌体粒子中获得核酸。这种核酸可被用于继续生成特异性结合成员或抗体VH可变结构域(任选地生成抗体VL可变结构域)，即通过表达具有特定核酸序列的核酸，该核酸序列获自可展示上述筛选所获特异性结合成员的噬菌体粒子中。
具有上述筛选所获特异性结合成员的抗体VH可变结构域氨基酸序列的抗体VH可变结构域可能以分离形式出现，包括这种VH结构域的特异性结合成员也可能以分离形式出现。可进一步检验其结合IL-13的能力及其与BAK502G9竞争结合IL-13的能力(例如，以scFv形式和/或IgG形式，例如IgG4)。正如下文进一步论述的，还可检验其中和IL-13的能力。
本发明所述特异性结合成员可以BAK502G9抗体分子，例如scFv，或优选BAK502G9 IgG4的亲和力，或更佳的亲和力与IL-13结合。
本发明所述特异性结合成员可以BAK502G9抗体分子，例如scFv，或优选BAK502G9 IgG4的效价，或更佳的效价中和IL-13。
本发明所述特异性结合成员可以BAK502G9抗体分子，例如scFv，或优选BAK502G9 IgG4的效价，或更佳的效价中和天然存在的IL-13。
可在合适条件下比较不同特异性结合成员的结合亲和力和中和效价。
本发明所述抗体具有优于现有市售抗-IL-13抗体，尤其是三种市售鼠抗人IL-13抗体，即JES10-5A2(BioSource)、B-B13(Euroclone)和克隆321166(R&D Systems)的许多优势。将本发明所述抗体的效价与市售抗体JES10-A2和B-B13相比。未评估克隆321166是因为之前有试验表明该克隆的效价远低于其它已知的市售抗体。
上述市售鼠IL-13抗体在人体内的效能和用途很可能是有限的，因为它们诱导免疫原性反应的可能提高了，并因此将更快速地被肌体清除。对本发明所述抗体在非人灵长类动物体内的动力学分析表明这些抗体的清除率近似于其它已知的人或人源化抗体的清除率。
本发明多种实施方案提供的抗体可识别非人灵长类动物IL-13，包括恒河猴和猕猴IL-13。对抗体在非人灵长类动物体内的效能和安全分布图的确定极为重要，因为这可以提供预测该抗体在人体内的安全、药物代谢动力学和药物动力学分布图的方法。
此外，本发明多种实施方案中的抗体还可进一步识别与哮喘相关的人IL-13变体Q130R。与变异IL-13的交叉反应性使本发明所述抗体和包括本发明所述抗体在内的组合物可以被用于治疗具有野生型和变异IL-13的患者。
本发明的一种优选实施方案包括可以等同于或高于由BAK502G9VH结构域(SEQ ID NO15)和BAK502G9VL结构域(SEQ ID NO16)所形成IL-13抗原结合位点的效价的效价中和自然存在的IL-13的抗体。例如，发明者已证实诸如BAK502G9、1167F2和1183H4的代表性克隆抗自然存在的IL-13的效价显著地高于已知的市售抗体(图7)。
本发明所述特异性结合成员除包括抗体序列外，还可包括其它氨基酸，例如，形成肽或多肽，诸如折叠结构域，或者赋予该分子以抗原结合能力之外的其它功能特征。本发明所述特异性结合成员可携带可检测标记，或者可与毒素或导向部分或酶结合(例如，通过肽键或接头)。
在进一步的方面中，本发明提供了包括编码本发明所述特异性结合成员、VH结构域和/或VL结构域的序列的分离核酸，以及制备本发明所述特异性结合成员、VH结构域和/或VL结构域的方法，该方法包括使上述核酸在特定条件下表达，以生成上述特异性结合成员、VH结构域和/或VL结构域，并将其回收。
本发明所述特异性结合成员可被应用在治疗或诊断人或动物体的方法中，诸如治疗人类患者的疾病或失调的方法(可能包括预防性治疗)，该方法包括对所述患者施用有效量的本发明所述特异性结合成员。根据本发明可治疗的病症包括有IL-13在其中发挥作用的痰病，尤其是哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化、慢性梗阻性肺病、硬皮病、炎症性肠病和何杰金氏淋巴瘤。此外，本发明所述抗体还可被用于治疗肿瘤和病毒感染，因为这些抗体均可抑制IL-13介导的免疫抑制[64、65]。
本发明的一个进一步的方面提供了通常为分离形式的编码本文所公开抗体VH可变结构域和/或VL可变结构域的核酸。
本发明的另一个方面提供了通常为分离形式的编码本文所公开VH CDR或VL CDR序列，尤其是选自SEQ IDNO7、8和9的VH CDR或选自SEQ ID NO10、11和12的VL CDR，最优选为BAK502G9 VHCDR3(SEQ ID NO9)的核酸。本发明还提供了编码BAK502G9 CDR组的核酸、编码BAK502G9 HCDR组的核酸和编码BAK502G9 LCDR组的核酸，以及编码BAK278D6谱系的单个CDR、HCDR、LCDR以及CDR组、HCDR组、LCDR组的核酸。
一个进一步的方面提供了由本发明所述核酸转化的宿主细胞。
另一个进一步的方面提供了生成抗体VH可变结构域的方法，该方法包括使编码核酸实现表达。这种方法可包括在特定条件下培养宿主细胞，以生成所述抗体VH可变结构域。
本发明进一步的方面提供了生成VL可变结构域和具有VH和/或VL结构域的特异性结合成员的类似方法。
生成方法可包括分离和/或纯化上述产物的步骤。
生成方法可包括将上述产物配制于包括至少一种其它组分，诸如制药学可接受赋形剂的组合物中。
下文进一步具体描述了本发明的上述及其它方面。
术语特异性结合成员该术语描述了一对彼此均具有结合特异性的分子的成员。该特异性结合对的成员可来源于自然或者全部或部分地通过合成法生成。该分子对其中一个成员的表面具有一个可与该分子对另一个成员的特定空间和极性组构特异性结合并从而互补的区域，或一个空间。因此，该分子对的成员具有彼此特异性结合的特性。特异性结合对的类型实例有抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明涉及抗原-抗体型反应。
抗体分子该术语描述的是免疫球蛋白，而无论其是天然免疫球蛋白还是部分或全部通过合成方法获得的免疫球蛋白。该术语还包括具有抗体结合结构域的所有多肽或蛋白质。具有抗体结合结构域的抗体片段是诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd的分子，以及双功能抗体。
利用单克隆及其它抗体和重组DNA技术生成保留了原始抗体的特异性的其它抗体或嵌合分子是可能的。这种技术可包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDRs)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区外加构架区。参见例如，EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400以及下述文献资料的内容。可使可生成抗体的杂交瘤或其它细胞发生可能或不可能改变所生成抗体的结合特异性的遗传突变或其它变化。
由于可通过许多方法修饰抗体，术语“抗体分子”应被认为包括了所有具有特定抗体抗原结合结构域的特异性结合成员或物质，其中所述特定抗体抗原结合结构域具有必要的特异性。因此，该术语涵盖了抗体片段和衍生物，包括所有具有免疫球蛋白结合结构域的多肽，而无论其是天然多肽还是全部或部分合成的多肽。该术语因而还包括具有免疫球蛋白结合结构域或等同物以及与其融合的另一个多肽的嵌合分子。EP-A-0120694和EP-A-0125023以及下述文献有大量内容描述了嵌合抗体的克隆和表达。
抗体工程领域可利用的其它技术使人和人源化抗体的分离成为可能。例如，可如Kontermann等人所述方法制备人杂交瘤[107]。许多已公开文献，诸如Kontermann等人的报道[107]和WO92/01047(具体论述参见下文)具体描述了另一种可生成特异性结合成员的确定技术，即噬菌体展示。可利用特定的转基因小鼠分离抗人抗原的人抗体，其中所述转基因小鼠的小鼠抗体基因已失活，并被功能取代为人抗体基因，同时完整保留了小鼠免疫系统的其它组成[108]。
合成抗体分子可通过特定方法所生成基因的表达而得以形成，所述特定方法即在合适的表达载体内合成和组装寡核苷酸，实例参见Knappik et al.J.Mol.Biol.(2000)296，57-86或Krebs et al.Journal ofImmunological Methods 254 2001 67-84所述。
业已证实完整抗体的片段可实现结合抗原的功能。结合片段的实例即(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward，E.S.et al.，Nature 341，544-546(1989)，McCafferty et al(1990)Nature，348，552-554)；(v)分离的CDR区；(vi)包括两个连接的Fab片段的二价片段F(ab’)2片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域是通过可使这两个结构域相连形成抗原结合位点的肽接头而得以连接(Bird et al.，Science，242，423-426，1988；Huston et al.，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)通过基因融合构建的“双功能抗体”、多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993)。Fv、scFv或双功能抗体分子可通过整合可将VH和VL结构域连接在一起的二硫键而得以稳定化(Y.Reiteret al，Nature Biotech，14，1239-1245，1996)。还可制备含有scFv和与之结合的CH3结构域的微型抗体(S.Hu et al.，Cancer Res.，56，3055-3061，1996)。
在利用双特异性抗体的情况中，这些双特异性抗体可能是可通过多种方法生成的常规双特异性抗体(Holliger，P.和Winter G.CurrentOpinion Biotechnol.4，446-449(1993))，例如，通过化学方法或由杂合杂交瘤制备的双特异性抗体，或者可能是上述任意一种双特异性抗体片段。双特异性抗体的实例包括BiTETM技术所涉及的那些双特异性抗体，其中该技术可利用具有不同特异性的两种抗体的结合结构域并通过短柔性肽将这两个结合结构域直接连接。这将两种抗体组合在了一条短的多肽单链上。仅利用可变结构域，可构建不含Fc区的双功能抗体和scFv，从而潜在地减少抗独特型反应的影响。
与双特异性完整抗体相对的双特异性双功能抗体也非常有用，因其易于在大肠杆菌内被构建并表达。利用噬菌体展示可容易地从文库中筛选出具有合适的结合特异性的双功能抗体(以及其它许多多肽，诸如抗体片段)(WO94/13804)。如果该双功能抗体的一个臂，例如，具有直接抗IL-13的特异性的臂保持恒定，便可获得一个文库，在其中改变另一个臂并筛选具有合适特异性的抗体。双特异性的完整抗体可通过knobs-into-holes工程而得以制备(J.B.B.Ridgeway et al.，ProteinEng.，9，616-621，1996)。
抗原结合结构域该术语描述了具有可与完整抗原或其部分特异性结合和互补的区域的抗体分子的一部分。当抗原较大时，抗体可能仅结合该抗原的特定部分，该部分被称为表位。抗原结合结构域可由一个或多个抗体可变结构域提供(例如由VH结构域组成的Fd抗体片段)。抗原结合结构域优选地包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
特异性地该术语可被用于指下述情况，即特异性结合对的一个成员显示与除其特异性结合配偶体之外的其它分子没有任何显著的结合。该术语还可应用于下述情况，即例如，抗原结合结构域对许多抗原均具有的特定表位具有特异性，在该情况中，具有所述抗原结合结构域的特异性结合成员能够与具有上述表位的多种抗原结合。
包括该术语通常以包括之意应用，即允许存在一种或多种特征或组成。
分离的该术语指下述情况，即本发明的特异性结合成员或编码该结合成员的核酸通常与本发明一致。分离部分或分离核酸不含或基本上不含其自然结合的物质，诸如与其一起被发现存在于它们的自然环境，或者当通过体外或体内实现的重组DNA技术制备该分离部分或分离核酸时与其一起被发现存在于该制备环境(例如细胞培养物)中的其它多肽或核酸。特异性结合成员和核酸可与稀释剂或佐剂配制在一起，并仍适用于其分离状态时的实际用途—例如，如果该特异性结合成员被用于包被免疫测定所用的微量滴定板，则通常将其与明胶或其它载体混合，或者当其被应用在诊断或治疗中时，则将其与制药学可接受载体或稀释剂混合。特异性结合成员可能自然地或被异源真核细胞(例如CHO或NS0(ECACC 85110503)细胞)的系统糖基化、或者可能(例如当其通过在原核细胞内的表达而得以生成时)是未糖基化的。
天然存在的IL-13该术语通常指所述IL-13蛋白或其片段可能出现的状态。天然存在的IL-13指由未经重组技术预先导入编码核酸的细胞所天然生成的IL-13蛋白。因此，天然存在的IL-13可能由例如CD4+T细胞自然生成和/或从哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、诸如大鼠或小鼠的啮齿动物体内分离获得。
重组IL-13该术语指所述IL-13蛋白或其片段可能出现的状态。重组IL-13指由异源宿主内的重组DNA生成的IL-13蛋白或其片段。重组IL-13可能通过糖基化而不同于天然存在的IL-13。
被表达在原核细菌表达系统内的重组蛋白未糖基化，而被表达在诸如哺乳动物或昆虫细胞的真核系统内的重组蛋白是糖基化的。但被表达在昆虫细胞内的蛋白质与被表达在哺乳动物细胞内的蛋白质的糖基化不同。
“基本上如本文所公开的”指本发明所述相关CDR或VH或VL结构域与序列已被本文公开的特定区域一致或高度相似。“高度相似”意指可在所述CDR和/或VH或VL结构域内进行1-5处，优选1-4处，诸如1-3处或1或2、或3或4处氨基酸取代。
用于支持本发明所述CDR或CDR组的结构通常属于抗体重或轻链序列或其主要部分，其中所述CDR或CDR组位于与重排免疫球蛋白基因所编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组对应的位置上。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可参考现已公开在因特网上(http://immuno.bme.nwu.edu或利用任意搜索引擎查找“Kabat”)的由US Department of Health and Human Services 1987年出版Kabat，E.A.等人编辑的第四版Sequences of Proteins ofImmunological Interest及其修正版而得以确定。
诸如纤连蛋白或细胞色素B的其它支架结构也可具有CDR[115、116]。
基本上如本文公开的CDR氨基酸序列优选地作为CDR被包括在人可变结构域或其主要部分内。基本上如本文所公开的HCDR3序列体现了本发明的优选实施方案，且这些序列优选地作为HCDR3被包括在人重链可变结构域或其主要部分内。
本发明所应用的可变结构域可从任意种系或重排人可变结构域中获得，或者可以是以已知人可变结构域的共有序列为基础所合成的合成可变结构域。利用重组DNA技术可将本发明所述CDR序列(例如CDR3)导入缺乏CDR(例如CDR3)的可变结构域的所有组成成分内。
例如，Marks等人(Bio/Technology，1992，10779-783)描述了可获得抗体可变结构域的所有组成成分的方法，其中组合应用了直接位于所述可变结构域5’末端或与之相邻的共有引物和针对人VH基因的第三个构架区的共有引物，得以获得缺乏CDR3的VH可变结构域的所有组成成分。Marks等人进一步描述了如何将该所有组成成分与特定抗体的CDR3组合的方法。利用类似技术，可用缺乏CDR3的VH或VL结构域的所有组成成分改组本发明所述的CDR3衍生序列，并将改组所获完整VH或VL结构域与关连VL或VH结构域组合，便可获得本发明所述的特异性结合成员。接着可将上述所有组成成分展示在合适的宿主系统内，诸如WO92/01047或下述任意一份参考文献所述的噬菌体展示系统，包括Kay，B.K.，Winter，J.和McCafferty，J.(1996)Phage Display of Peptides and ProteinsA Laboratory Manual，San DiegoAcademic Press，从而得以筛选合适的特异性结合成员。所有组成成分可由选自104个以上的独立成员，例如106-108或1010个成员组成。其它合适的宿主系统包括酵母展示、细菌展示、T7展示、核糖体展示等系统。与核糖体展示相关的论述可参见Lowe D和JermutusL，2004，Curr.Pharm，Biotech，517-27以及WO92/01047。
Stemmer也公开了类似的改组或组合技术(Nature，1994，370389-391)，其描述的是一种与β-内酰胺酶基因相关的技术，却发现该方法可被用于生成抗体。
进一步的可选方法是通过随机诱变一个或多个特定VH和/或VL基因，以使所述完整可变结构域内产生突变，从而生成具有本发明所述CDR衍生序列的新VH或VL区。Gram等人描述了这种技术(1992，Proc.Natl.Acad. Sci，USA，893576-3580)，他们采用了易错PCR法。优选实施方案是在一组HCDR和/或LCDR内产生一处或两处氨基酸取代。
可被采用的另一种方法是直接诱变VH或VL基因的CDR区。该技术由Barbas等人(1994，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，913809-3813)和Schier等人(1996，J.Mol.Biol.263551-567)公开。
上述所有技术同样是本领域已知的，它们本身不构成本发明的一部分。技术人员应能够利用这些技术和本领域的常规方法获得本发明所述的特异性结合成员。
本发明的一个进一步的方面提供了获得对IL-13抗原具有特异性的抗体抗原结合结构域的方法，该方法包括通过在本文所公开VH结构域的氨基酸序列内添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸，从而获得具有该VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，任选地将这样获得的VH结构域与一种或多种VL结构域组合，并对该VH结构域或一种或多种VH/VL组合进行测试，以鉴定对IL-13抗原具有特异性并任选地具有一种或多种优选特性，优选中和IL-13活性的能力的特异性结合成员或抗体抗原结合结构域。上述VL结构域的氨基酸序列可能基本上与本文所公开的一致。
可采用的类似方法是将本文所公开VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合。
在一种优选实施方案中，可使BAK502G9 VH结构域(SEQ IDNO15)和/或BAK502G9 VL(SEQ ID NO16)发生突变，从而获得一个或多个VH和/或VL结构域氨基酸序列变体。
本发明的一个进一步的方面提供了制备对IL-13抗原具有特异性的特异性结合成员的方法，该方法包括(a)提供特定VH结构域的编码核酸的初始所有组成成分，所述特定VH结构域或者含有待取代的CDR3或者缺乏CDR3编码区；(b)将上述初始所有组成成分与基本上如本文所公开的VHCDR3氨基酸序列的供体编码核酸组合，使该供体核酸插入上述所有组成成分的CDR3区，从而获得VH结构域的编码核酸的最终所有组成成分；(c)使该最终所有组成成分的核酸表达；(d)筛选对IL-13具有特异性的特异性结合成员；并(e)回收该特异性结合成员或其编码核酸。
另一种可采用的类似方法是将本发明所述VL CDR3与特定VL结构域的编码核酸的所有组成成分组合，所述特定VL结构域或者含有待取代的CDR3或者缺乏CDR3编码区。
同样，可将一个或多个或全部三个CDR导入VH或VL结构域的所有组成成分内，并接着筛选对IL-13具有特异性的一个或若干个特异性结合成员。
在一种优选实施方案中，可应用选自BAK502G9 HCDR1(SEQ IDNO7)、HCDR2(SEQ ID NO8)和HCDR3(SEQ ID NO9)或BAK502G9 HCDR组的一种或多种HCDR，和/或选自BAK502G9LCDR1(SEQ ID NO10)、LCDR2(SEQ ID NO11)或BAK502G9LCDR组的一种或多种LCDR。
免疫球蛋白可变结构域的主要部分至少包括上述三个CDR区，以及它们的间插构架区。该部分优选地还至少包括第一和第四构架区二者或其中之一的大约50％，该50％即第一构架区的C-末端50％和第四构架区的N-末端50％。位于可变结构域主要部分的N-末端或C-末端的其它残基可以是通常与天然存在的可变结构域不相关的那些残基。例如，对通过重组DNA技术制备的本发明所述特异性结合成员的构建可能导入由特定接头编码的N-或C-末端残基，该接头被导入后将有助于进行克隆或其它操作步骤。其它操作步骤包括导入接头，以使本发明所述可变结构域与包括免疫球蛋白重链、本文其它部分更具体论述的其它可变结构域(例如在制备双功能抗体时)或蛋白质标记在内的其它蛋白序列相连。
尽管本发明的一个优选方面优选具有一对VH和VL结构域的特异性结合成员，但基于VH或VL结构域序列的单个结合结构域也构成了本发明进一步的方面。已知单个免疫球蛋白结构域，尤其是VH结构域能够以特异性方式结合靶抗原。
在任意一种单特异性结合结构域的情况中，这些结构域均可被用于筛选能够形成可结合IL-13的双结构域特异性结合成员的互补结构域。
这可通过利用WO92/01047所公开的被称为等级双重组合法的噬菌体展示筛选法实现，其中含有H或L链克隆的单菌落被用于感染编码另一条链(L或H)的克隆的完整文库，并根据噬菌体展示技术，诸如参考文献所述的那些方法筛选由上所获的双链特异性结合成员。上述Marks等人的报道也公开了该技术。
本发明所述特异性结合成员可进一步包括抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可在其C-末端与包括人Cκ或Cλ链，优选Cλ链的抗体轻链恒定结构域相连。同样，基于VH结构域的特异性结合成员可在其C-末端与任意抗体同种型，例如IgG、IgA、IgE和IgM和任意同种型亚类，尤其是IgG1和IgG4来源的完整免疫球蛋白重链或其部分(例如CH1结构域)相连。IgG4是优选的。其优选原因是其不结合补体，因而不产生效应子功能。具有上述特性并可使可变区稳定的所有合成或其它恒定区变体也被优选应用在本发明的实施方案中。
本发明所述特异性结合成员可被标记上可检测或功能标记。可检测标记包括可通过抗体成象领域已知的常规化学方法与本发明所述抗体相连的放射性标记，诸如131I或99Tc。标记还包括诸如辣根过氧化物酶的酶标记。标记进一步包括化学部分，诸如可通过与特异性关连可检测部分，例如标记的抗生物素蛋白结合而得以检出的生物素。
本发明所述特异性结合成员被设计应用在诊断或治疗人或动物患者，优选人患者的方法中。
本发明进一步的方面相应提供了治疗方法，包括施用本发明所述特异性结合成员、含有该特异性结合成员的药物组合物，以及该特异性结合成员在生产施用药物方面的用途，例如在制备药物或药物组合物的方法中，该方法包括将本发明所述特异性结合成员与制药可接受赋形剂一起配制。
可利用抗-IL-13抗体提供治疗效果的临床适应症包括哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化、慢性梗阻性肺病、炎症性肠病、硬皮病和何杰金氏淋巴瘤。正如上文所述，抗IL-13治疗对这些痰病均有效。
抗IL-13治疗可通过口服、注射(例如皮下、静脉内、腹膜内或肌内)、吸入或局部施用(例如眼内、鼻内、直肠、创伤内、皮肤上)而得以实现。施用途径可根据治疗的物理化学特征、对疾病的特殊考虑因素或使效能最优化或使副作用最小化的必要条件而得以确定。
根据设想，抗IL-13治疗将不仅限于临床应用。因此，利用无针装置的皮下注射也是优选的。
联合治疗可被用于提供显著的协同效果，尤其是抗IL-13特异性结合成员与一种或多种其它药物的组合。本发明所述特异性结合成员可与短或长效β增效剂、皮质类固醇、色甘酸盐、白细胞三烯(受体)拮抗剂、甲基黄嘌呤及其衍生物、IL-4抑制剂、毒碱受体拮抗剂、IgE抑制剂、组胺抑制剂、IL-5抑制剂、嗜酸性粒细胞趋化因子-CCR3抑制剂、PDE4抑制剂、TGF-β拮抗剂、干扰素-γ、perfenidone、化疗剂和免疫治疗剂组合或加成。
与一种或多种短或长效β增效剂、皮质类固醇、色甘酸盐、白细胞三烯(受体)拮抗剂、黄嘌呤、IgE抑制剂、IL-4抑制剂、IL-5抑制剂、嗜酸性粒细胞趋化因子-CCR3抑制剂、PDE4抑制剂的联合治疗可被用于治疗哮喘。本发明所述抗体还可与皮质类固醇、抗代谢物、TGF-β及其下游信号途径的的拮抗剂组合用于治疗纤维化。这些抗体与PDE4抑制剂、黄嘌呤及其衍生物、毒碱受体拮抗剂、短或长效β增效剂的联合治疗有助于治疗慢性梗阻性肺病。对抗IL-13治疗在特应性皮炎、过敏性鼻炎、慢性梗阻性肺病、炎症性肠病、硬皮病和何杰金氏淋巴瘤方面的应用而言也可考虑类似的组合。
根据本发明获得的组合物可被施用于个体。给药量优选足以显示对患者具有益处的“治疗有效量”。该益处可能是至少改善了至少一种症状。实际施用量以及施用速率和时程安排取决于待治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如对剂量的选择等属于普通医师及其它医学医师的职责。抗体的合适剂量是本领域熟知的；参见Ledermann J.A.et al.(1991)Int.J.Cancer 47659-664；Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4915-922。
精确剂量取决于许多因素，包括该抗体是用于诊断还是治疗、待治疗位点的大小和位置、该抗体的准确性质(例如完整抗体、片段或双功能抗体)以及与该抗体相连的任意可检测标记或其它分子的性质。系统性应用的典型抗体剂量范围是100μg-1gm，对局部应用而言，该范围是1μg-1gm。该抗体典型地应为完整抗体，优选IgG4同种型。上述剂量范围是单次治疗成年患者所需的剂量，可经过适当调整后用于儿童和婴儿，也可根据分子量将其调整为其它抗体形式。治疗可根据医师的判断以每日一次、每周两次、每周一次或每月一次的时间间隔重复进行。在本发明的优选实施方案中，治疗是周期性的，且两次给药的时间间隔约为两周或更长时间，优选大约三周或更长时间，更优选大约四周或更长时间，或者大约每月一次。
本发明所述特异性结合成员通常以特定的药物组合物形式被施用，该药物组合物除包括该特异性结合成员外还包括至少一种组分。
因此，本发明所述将根据本发明应用的药物组合物可能除含有有效成分外，还包括制药可接受赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。这些物质应无毒性，并且不应干扰所述有效成分的效能。所述载体或其它物质的确切性质取决于可能为口服或注射，例如静脉内注射的施用途径。
用于口服的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或液体形式。片剂可包括诸如明胶或佐剂的固体载体。液体药物组合物通常包括诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油的液体载体。也可包括生理盐溶液、葡萄糖或其它糖溶液或诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的乙二醇。
对静脉内注射或位于不适位点的注射而言，所述有效成分的形式应为无热原并具有合适pH、等渗性和稳定性的肠胃外方式可接受水溶液。本领域的相关技术人员是善于利用例如，诸如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸化林格注射液的等渗载体制备合适溶液的。如需要，还可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。
组合物可单独施用，或者根据待治疗病症与其它治疗同时或序贯地联合应用。
根据本发明所述特异性结合成员分子的物理化学特性和施用途径，可将其配制成液体或固体形式。配方可包括赋形剂或赋形剂组合，例如糖、氨基酸和表面活性剂。液体配方可包括广泛的抗体浓度和pH。固体配方可通过冻干、喷雾干燥或通过例如，超临界流体技术实现的干燥法而得以制备。抗IL-13的配制取决于预定的施用途径例如，肺部施用配方可由具有特定物理特性的粒子组成，该物理特性可确保粒子被吸入时渗透进入肺部深处；局部配方可包括粘度改良剂以延长使药物停留在作用位点上的时间。
本发明提供了一种包括导致或允许本文所述特异性结合成员与IL-13结合的方法。如上所述，这种结合可能发生在体内，例如施用特异性结合成员或其编码核酸之后，或者可能发生在体外，例如在ELISA、蛋白质印迹法、免疫细胞化学、免疫沉淀、亲和层析法或以细胞为基础的试验，诸如TF-1试验中。
特异性结合成员与IL-13的结合量可以测定。定量可能与试样中可能具有诊断意义的抗原量相关。
本文还以包括了本发明任意方面或实施方案所述特异性结合成员或抗体分子的试剂盒作为本发明的一个方面。本发明所述试剂盒中的特异性结合成员或抗体分子可以被标记，以便于确定其在样品中的反应性，例如正如下文进一步所述。试剂盒的组分通常无菌并被包含在密封小瓶或其它容器内。试剂盒可应用于诊断分析或采用抗体分子将有助于其实现的其它方法。试剂盒可含有针对特定方法，例如本发明所述方法所涉及组分的用途的说明书。本发明所述试剂盒内还可包括有助于或使所述方法能够实现的辅助物质。
样品中抗体的反应性可通过任意适当方法确定。放射免疫测定法(RIA)是一种可能的方法。将放射性标记抗原与未标记抗原混合(试样)，并使其结合所述抗体。将结合抗原与未结合抗原物理分离，并测定与该抗体结合的放射性抗原量。试样所含抗原越多，可结合抗体的放射性抗原越少。还可利用抗原或与报道分子连接的类似物，以及非放射性抗原进行竞争性结合试验。所述报道分子可能是荧光染料、磷光体或具有光谱分离吸收或发射特征的激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和德克萨斯红。合适的显色染料包括二氨基联苯胺。
其它报道分子包括大分子胶粒或颗粒物质，诸如着色、具有磁性或顺磁性的胶乳珠，以及可直接或间接地使可检测信号能够被目测、电子检测或通过其它方式记录的具有生物学或化学活性的试剂。这些分子可能是可催化反应，即例如，使颜色显示或改变或导致电特性改变的酶。它们可能具有分子可兴奋性，所以能态之间的电子跃迁可导致出现特征光谱吸收或发射。它们可能包括可与生物传感器结合应用的化学实体。可应用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉抗生物素和碱性磷酸酶检测系统。
由独立抗体/报道分子偶联物产生的信号可被用于推导样品(正常和试样)中相关抗体结合的可定量绝对或相对数值。
本发明还提供了上述特异性结合成员在测定竞争性试验中的抗原水平方面的用途，即通过在竞争性试验中应用本发明所提供的特异性结合成员以测定样品中的抗原水平的方法。这可能是不需要物理分离已结合和未结合抗原的情况。一种可能性是报道分子与所述特异性结合成员的连接导致发生以结合为基础的物理或光学变化。该报道分子可能直接或间接地生成可检测，和优选可测定的信号。报道分子的连接可能是直接或间接、共价地，例如通过肽键，或非共价地。经由肽键的连接可能是编码抗体和报道分子的基因融合重组表达的结果。
本发明还提供了通过，例如在生物传感器系统内，应用本发明所述特异性结合成员，以直接测定抗原水平的方法。
确定结合的模式并非本发明的特征，且本领域技术人员均能够根据自己的偏好和常识选择合适的模式。
正如上文所指出的，本发明的多个方面和实施方案提供了可与本文所定义的任意特异性结合成员竞争结合IL-13的特异性结合成员，例如BAK502G9 IgG4。两个结合成员之间的竞争可通过特定方法在体外快速测定，例如用特异性报道分子标记其中一个结合成员，使其可以在另一个未标记结合成员存在条件下被检出，以鉴定可与所述相同表位或重叠表位结合的特异性结合成员。
竞争可通过例如，ELISA法确定，其中将IL-13固定在平板上，而将第一种标记结合成员连同一种或多种其它的未标记结合成员加入该平板。通过标记结合成员所发射信号的减量发现存在可与标记结合成员竞争的未标记结合成员。
为检测竞争，可应用所述抗原的肽片段，尤其是包括目标表位的肽。可采用具有该表位序列且其任一末端还外加一个或多个氨基酸的肽。这种肽可以被描述为是由该特定序列“基本组成的”。本发明所述特异性结合成员可能存在下述情况，即具有或包括上述特定序列的肽抑制它们与抗原的结合。为检验该情况，可采用具有该特定序列并外加一个或多个氨基酸的肽。
通过用特异性肽进行淘选，可从例如，噬菌体展示文库中分离出可与该特异性肽结合的特异性结合成员。
本发明进一步提供了编码本发明所述特异性结合成员的分离核酸。核酸可包括DNA和/或RNA。本发明的一个优选方面提供了编码上文所定义的本发明CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子，例如scFv或IgG4的核酸。
本发明还提供了形式为包括上述至少一种多核苷酸的质粒、载体、转录或表达组件的构建体。
本发明还提供了可包括上述一种或多种构建体的重组宿主细胞。编码上述任意CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子，例如scFv或IgG4的核酸本身以及生成其编码产物的方法构成了本发明的两个方面，其中所述方法包括使上述编码核酸进行表达。表达可通过在合适的条件下培养含有该核酸的重组宿主细胞而得以方便地实现。通过表达实现生产后，可利用任意一种合适的技术分离和或纯化VH或VL结构域，或特异性结合成员，并接着根据情况适当应用。
本发明所述特异性结合成员、VH和/或VL结构域，以及编码核酸分子和载体可以基本上纯或均一的形式从例如，它们的自然环境中分离和/或纯化获得，或者在核酸情况中，则是不含或基本上不含与编码具有必需功能的多肽的序列不同的核酸或基因起点。本发明所述核酸可包括DNA或RNA，并且可能是全部或部分合成的。本文所提供的核苷酸序列的参照包括具有特定序列的DNA分子，也包括具有特定序列的RNA分子，其中上下文如无另外要求，U被用于取代T。
适用于克隆和表达多种不同宿主细胞内的多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母和杆状病毒系统和转基因植物和动物。本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、小仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠黑素瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞及其它许多细胞系。常用的优选细菌宿主是大肠杆菌。
抗体和抗体片段在原核细胞，诸如大肠杆菌内的表达是本领域熟知的。相关论述参见例如，Plückthun，A.Bio/Technology 9545-551(1991)。在培养中的真核细胞内的表达也是本领域技术人员可用于生成特异性结合成员的选择方案，例如Chadd HE和Chamow SM(2001)110Current Opinion in Biotechnology 12188-194，Andersen DC andKrummen L(2002)Current Opinion in Biotechnology 13117，LarrickJW and Thomas DW(2001)Current Opinion in Biotechnology 12411-418。
可以选择或构建含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因及其它合适序列的合适载体。根据需要，载体可能是质粒、病毒的例如噬菌体或噬菌粒。进一步的具体论述参见例如由Cold Spring Harbor Laboratory Press2001年出版Sambrook和Russell编辑的第3版Molecular CloningaLaboratory Manual。由John Wiley & Sons 1988年出版Ausubel等人编辑的第2版Current Protocols in Molecular Biology和由John Wiley &Sons 1999年出版Ausubel等人编辑的第4版Short Protocols inMolecular BiologyA Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology具体描述了操纵核酸，例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达，以及分析蛋白质方面适用的许多已知技术和方案。Sambrook等人和Ausubel等人的公开文献(均)被引入本文作为参考。
因此，本发明的一个进一步的方面提供了含有本文所公开核酸的宿主细胞。这种宿主细胞可能在体外和可能处于培养中。这种宿主细胞也可能在体内。该宿主细胞存在于体内时可使本发明所述特异性结合成员以“内抗体”或胞内抗体的形式在细胞内表达。内抗体则可被用于基因治疗[112]。
另一个进一步的方面提供了包括将上述核酸导入宿主细胞内的方法。该导入可应用任意一种有效的技术。对真核细胞而言的合适技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导转染和利用逆转录病毒或其它病毒，例如牛痘或对昆虫细胞而言的杆状病毒进行的转导。将核酸导入宿主细胞，尤其是真核细胞内可利用以病毒或质粒为基础的系统。质粒系统可以保持为游离体形式或者可以被整合进所述宿主细胞或人工染色体内[110、111]。整合可通过在单个或多个位点随机或导向整合一个或多个拷贝而得以实现。对细菌细胞而言的合适技术可包括氯化钙转化、电穿孔和利用噬菌体进行的转染。
实现上述导入后，可通过例如，在适合上述基因表达的条件下培养宿主细胞，使或允许上述核酸表达。
一种实施方案中，本发明所述核酸被整合进所述宿主细胞的基因组(例如染色体)内。通过根据标准技术将可促进与该基因组重组的序列包括在内，便可促进该整合。
本发明还提供了包括在表达系统内应用上文所提及的构建体以表达上述特异性结合成员或多肽的方法。
至此，本文将通过与下述实验相关的实施例说明本发明的若干方面和实施方案。
实施例1抗IL-13 scFv的分离scFv抗体的所有组成成分采用来源于20位供体的脾淋巴细胞并被克隆进噬菌粒载体的大单链Fv(scFv)人抗体文库进行筛选[66]。
scFv的筛选通过采用基本上如[67]所述的方法对重组细菌来源的人或鼠IL-13(Peprotech)进行一系列重复筛选循环，从噬菌体展示文库中分离出可识别IL-13的scFv。简言之，用该文库温育后，通过磁分离法回收预先与顺磁珠偶联的固定抗原和已结合的噬菌体，同时洗涤除去未结合噬菌体。接着通过Vaughan等人所述的方法[67]和重复上述筛选过程拯救已结合的噬菌体。在不同的筛选循环中采用不同的固相表面和捕捉方法，以减少非特异性结合。抗原或者与珠(Dynabeads M-270羧酸)共价偶联或者是在根据生产商所提供方法(Dynal)被链霉抗生物素蛋白包被珠(Dynabeads M-280)次级捕捉之前经过生物素化修饰。如Vaughan等人[67]和Osbourn等人[70]所述的方法对上述筛选循环所获产物中占代表性比例的克隆进行DNA测序。对独特的克隆评估其作为纯化scFv制剂在IL-13依赖性细胞增殖试验中中和IL-13的能力。
采用基本上如Hanes等人所述的方法[113]构建核糖体展示文库并筛选可特异性识别重组、细菌来源人或鼠IL-13(Peprotech)的scFv。首先将最初筛选的BAK278D6前导克隆转化为核糖体展示形式，并随后将该模板用于构建文库。基于该DNA水平，将T7启动子添加在其5’末端，以有效转录为mRNA。基于该mRNA水平的构建体含有原核核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列)。将所述单链3’末端的终止密码子除去，并加入一部分gIII(基因III)充当间隔区[113]。
通过诱变抗体互补决定区(CDRs)构建BAK278D6来源的核糖体展示文库，其中PCR反应是利用非校正Taq聚合酶进行的。由此进行以亲和力为基础的筛选，即用该文库温育后，由链霉抗生物素蛋白包被的顺磁珠(Dynal M280)捕捉生物素化人IL-13，并通过磁分离法回收已结合的三重复合体(mRNA-核糖体-scFv-IL-13)，同时洗涤除去未结合的复合体。接着通过如Hanes等人所述的RT-PCR[113]和通过逐渐降低筛选期间存在的生物素化人IL-13的浓度(在5个循环内由100nM降至100pM)重复进行的筛选过程，回收编码已结合scFvs的mRNA。
还采用了易错PCR以进一步扩大文库。该筛选方案进行期间应用了三种强度的差错(如生产商提供的方案(Clontech)所述，在标准PCR反应后，每1,000bp有2.0、3.5和7.2个突变)。最初的易错PCR反应发生在于100nM处开始的第一轮筛选之前。后续的易错PCR循环则是在于10nM生物素化人IL-13处开始三轮筛选之前进行。如上所述，如Vaughan等人[67]和Osbourn等人[70]所述的方法对上述筛选循环所获产物中占代表性比例的克隆进行DNA测序。对独特的克隆评估其作为纯化scFv制剂在IL-13依赖性细胞增殖试验中中和IL-13的能力。
实施例2抗IL-13在IL-13依赖性TF-1细胞增殖试验中的中和效价纯化scFv制剂抗人和鼠IL-13生物活性的中和效价是通过TF-1细胞增殖试验评估的。纯化scFv制剂的制备方法如WO01/66754的实施例3所述。纯化scFv制剂的蛋白质浓度利用BCA法(Pierce)测定。TF-1是从红白血病患者体内建立的人成髓细胞系[68]。TF-1细胞系的存活和增殖具有因子依赖性。就这一点而言，TF-1细胞对人或鼠IL-13有反应[69]，并可被维持在含有人GM-CSF(4ng/ml，R&D Systems)的培养基中。对IL-13依赖性增殖的抑制是通过测定掺入分裂细胞新合成DNA内的氘标记胸苷的减量而得以确定的。
TF-1细胞试验方案由R&D Systems获得TF-1细胞并根据其提供的方案维持该细胞系。试验培养基包括含有GLUTAMAX I的RPMI-1640(Invitrogen)，并含5％胎牛血清(JRH)和1％丙酮酸钠(Sigma)。每次试验之前，通过300xg离心5分钟，使TF-1细胞沉淀，吸除培养基并使细胞重悬浮于试验培养基中。重复该过程两次，使重悬浮于试验培养基中的细胞的最终浓度为105个细胞/毫升。用试验培养基将抗体试液(一式三份)稀释至预期浓度。以不直接抗IL-13的无关抗体作为阴性对照。将重组细菌来源的人或鼠IL-13(Peprotech)与合适的试验抗体混合，终浓度为50ng/ml，并以100μl/孔的总体积加入96孔培养板各孔内。该试验所用的IL-13浓度被选择作为可充当最终试验浓度产生相当于最大增殖反应的大约80％的增殖反应的剂量。室温温育所有样品30分钟。接着将100μl重悬浮细胞加至各试验点，所获总试验体积为200μl/孔。于37℃和5％CO2条件下，温育试验培养板72小时。接着将25μl氘标记胸苷(10μCi/ml，NEN)加至各试验点，并将试验培养板再次放入培养箱内继续温育4小时。利用细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤板(Perkin Elmer)上。胸苷掺入利用Packard TopCount微量滴定板液体闪烁计数器测定。数据用Graphpad Prism软件分析。
结果即使改变人和鼠抗原之间的筛选循环，仍未获得交叉反应性中和抗体。通过筛选获得两种不同的抗人IL-13中和scFvs和一种抗鼠IL-13中和scFv。BAK278D6(VH SEQ ID NO13；VL SEQ ID NO14)和BAK167A11(VH SEQ ID NO23；VL SEQ ID NO24)可识别人IL-13，而BAK209B11(VH SEQ ID NO25；VL SEQ ID NO26)则可识别鼠IL-13。BAK278D6(图2)和BAK167A11(图1)作为scFv中和25ng/ml人IL-13的IC50分别为44nM和111nM。BAK209B11(图3)作为scFv中和25ng/ml鼠IL-13的IC50为185nM。
实施例3导向优化亲本克隆重链CDR3所获的前导克隆在IL-13依赖性TF-1细胞增殖试验中的中和效价Osbourn等人[70]证实导向诱变重链CDR3内的残基可显著提高抗体亲和力。如实施例1所述方法对scFv的所有组成成分进行筛选，其中BAK278D6(SEQ ID NO6)、BAK167A11(SEQ ID NO57)重链CDR3内的残基已通过诱变而随机化。通过DNA测序鉴定该筛选所获产物中的独特克隆，并如实施例2所述方法评估其作为scFv在TF-1细胞增殖试验中的中和效价。
结果上述两个谱系的效价均有显著提高。BAK167A11谱系中最有效的克隆为BAK615E3、BAK612B5和BAK582F7，三者作为scFv在TF-1细胞增殖试验中抗25ng/ml人IL-13的IC50分别为3nM(图1)、6.6nM、6.65nM。BAK278D6谱系中最有效的克隆为BAK502G9，其作为scFv在TF-1细胞增殖试验中抗25ng/ml人IL-13的IC50为8nM(图2)。
实施例4BAK167A11和BAK278D6谱系在TF-1因子依赖性细胞增殖试验中抗非人灵长类动物IL-13和哮喘相关IL-13变体的中和效价BAK167A11和BAK278D6人IL-13中和谱系均与鼠IL-13不具有交叉反应性。因此，发明者基于下述标准决定对所选谱系进行进一步优化和临床发展应优先与非人灵长类动物IL-13具有交叉反应性，并应识别因130号氨基酸位的精氨酸被取代为谷氨酰胺(Q130R)后所生成的IL-13变体。该变体在遗传上与哮喘及其它变应性疾病相关[37、39、41、71]。交叉反应性是根据表面等离子共振技术(BIAcore)分析纯化scFv制剂与非人灵长类动物IL-13和IL-13变体结合的能力而得以确定的。功能性活性利用TF-1细胞增殖试验测定。
野生型、变异和非人灵长类动物IL-13的生成野生型人IL-13的cDNA获自InvivoGen，通过定点诱变(Stratagene Quikchange试剂盒)将其修饰后可获得编码变异IL-13的cDNA。通过采用基因组DNA模板和以上述人IL-13序列为基础的简并引物进行PCR，获得与恒河猴和猕猴IL-13均对应的编码序列。这两种非人灵长类动物(恒河猴和猕猴)序列彼此一致，但与人IL-13有7个氨基酸的差异(图19)。利用杆状病毒表达系统(Invitrogen)相继表达重组野生型、变异和非人灵长类动物IL-13。表达构建体将羧基末端亲和力标记加至被表达蛋白上，可使昆虫细胞条件培养基来源的纯化产物接近均匀。
利用BIAcore进行的定性结合试验纯化scFv制剂与非人灵长类动物、变异和野生型IL-13的结合亲和力是通过利用Karlsson等人所述的BIAcore 2000生物传感器(BIAcore AB)进行的表面等离子共振技术[72]而得以确定的。简言之，利用胺偶联试剂盒(BLAcore)使IL-13与CM5传感器芯片偶联，表面密度约为200Ru，在HBS-EP缓冲液中形成的三个浓度的试验scFv(约为350nm、175nM和88nM)通过该传感器芯片表面。利用BIA评估3.1软件评估由上所获的传感器记录，获得相对结合数据。
TF-1试验方案该试验基本上如实施例2所述方法进行，但进行了下述修改所用非人灵长类动物IL-13、人变异IL-13(Q130R)和野生型人IL-13的浓度分别为50ng/ml、25ng/ml和25ng/ml。
结果BIAcore结合试验数据表明BAK278D6谱系具有进一步治疗性研发所必需的交叉反应性分布图，而BAK167A11谱系则无(表2)。该发现可通过生物试验数据得以证实，即BAK278D6(图4)和BAK502G9(图6)均能够在TF-1细胞增殖试验中以近乎相同的效价中和人IL-13、人IL-13(Q130R)变体和非人灵长类动物IL-13。与之相比，尽管BAK615E3(VH SEQ ID NO33；VL SEQ ID NO34)在TF-1细胞增殖试验中抗人IL-13的效价显著高于其亲本BAK167A11(VASEQ ID NO23；VL SEQ ID NO24)(图1)，但它们在BIAcore结合试验中均无与非人灵长类动物IL-13或变异IL-13结合的克隆。
BAK278D6和BAK502G9的种系化构架区将BAK278D6 VH(SEQ ID NO13)和VL(SEQ ID NO14)的衍生氨基酸序列与VBASE数据库[73]中已知的人种系序列进行对比，并根据序列相似性确定最接近的种系。与BAK278D6(SEQ ID NO14)及其衍生物的VH结构域最接近的种系为DP14，属于VH1家族成员。BAK278D6 VH与DP14种系在构架区内存在9处差异。与BAK278D6的VL最接近的种系为Vλ33h。BAK278D6 VL结构域(SEQID NO14)与该种系在构架区内仅存在5处差异。通过定点诱变(Stratagene Quikchange试剂盒)将BAK278D6及其衍生物的构架区恢复至种系，同样与天然人抗体匹配。
实施例5导向优化BAK502G9重链CDR1和重链CDR2序列所获的前导克隆在人IL-13依赖性TF-1细胞增殖试验中的中和效价第二阶段的最优化是以具有种系化构架区的BAK502G9序列为模板进行的。基本上如实施例1所述方法对scFv的所有组成成分进行筛选，其中BAK502G9的重链CDR1或重链CDR2的残基已通过诱变而随机化。通过DNA测序鉴定该筛选所获产物中的独特克隆，并如实施例2所述评估其作为纯化scFv制剂在TF-1细胞增殖试验中的中和效价。根据Persic等人所述的方法(1997 Gene 187；9-18)并进行少许修改，构建用于最有效的scFv克隆的载体，使该克隆能够以完整人IgG4抗体的形式再表达。该载体包括oriP片段，有助于与HEK-EBNA 293细胞一起应用，并有助于实现游离型复制。将所述VH可变结构域克隆进位于表达载体pEU8.1(+)的分泌前导序列与人γ4恒定结构域之间的多位点接头内。将所述VL可变结构域克隆进位于表达载体pEU4.1(-)的分泌前导序列与人λ恒定结构域之间的多位点接头内。
通过A蛋白亲和层析(Amersham Pharmacia)从经由可表达重和轻链的构建体共转染过的EBNA-293细胞的条件培养基中纯化完整抗体。无菌过滤纯化抗体制剂，并在评估前将其4℃保存在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。通过BCA法(Pierce)测定280nm波长的吸收以确定蛋白质浓度。通过如实施例2所述的TF-1增殖试验，对重构的人IgG4完整抗体和商业可提供抗人IL-13抗体进行比较。
结果如图5所示，市售抗体B-B13(小鼠IgG1-Euroclone 5)在抗人IL-13方面显然比市售抗体JES10-5A2(大鼠IgG1-Biosource)更有效，二者的IC50分别为1021pM和471pM。由所含重链CDR1或CDR2已被导向的BAK502G9衍生的8个克隆，即BAK1111D10、BAK1166G02、BAK1167F02、BAK1167F04、BAK1183H4、BAK1184C8、BAK1185E1、BAK1185F8(也被称为“BAK502G9谱系”)作为scFv的效价均显示高于上述市售抗体。将它们转化为完整抗体人IgG4时仍保持了这些改良。在上述权利要求中，所述VH和VL结构域独立出现或以各自的配对形式出现的情况，和包括它们当中的一个或多个结构域并针对IL-13的特异性结合成员，以及包括BAK502G9谱系克隆来源的一个或多个CDR的特异性结合成员，优选包括BAK502G9谱系HCDR组的VH结构域和/或包括BAK502G9谱系LCDR组的VL结构域，均体现了本发明的一个方面或实施方案。正如本文其它部分所公开的，这些情况可被应用在本发明的任意和所有方面中。BAK502G9的衍生物作为完整抗体(IgG4)的IC50范围是244pM-283pM。BAK502G9作为完整抗体IgG4的IC50是384pM。概括而言，效能方面的主要改善可通过导向BAK502G9的重链CDR1(SEQ ID NO7)或CDR2(SEQ ID NO8)实现。与B-B13的统计学比较是相继利用ANOVA和Dunnett后检验分析(InStat软件)进行的。
进一步表征对从BAK278D6谱系筛选获得的抗人抗体进一步表征，以确定它们的特异性。这些抗体包括BAK502G9(VHSEQ ID NO15；VL SEQID NO16)及其衍生物BAK1167F2(VHSEQ ID NO35；VL SEQID NO；36)和BAK1183H4(VH SEQ ID NO37；VL SEQ ID NO38)，后两种抗体分别是对BAK502G9的重链CDR1和重链CDR2修饰后所获克隆的代表性实例。
实施例6导向优化BAK502G9重链CDR1和重链CDR2序列所获的前导克隆在TF-1因子依赖性细胞增殖试验中抗非人灵长类动物IL-13和哮喘相关IL-13变体的中和效价如实施例4所述，根据抗人IL-13抗体抑制非人灵长类动物IL-13和IL-13变体介导的TF-1细胞增殖的能力，确定其交叉反应性。
结果优化的抗人IL-13抗体BAK1167F2(VH SEQ ID NO35；VL SEQID NO36)和BAK1183H4(VH SEQ ID NO37；VL SEQ ID NO38)保留了它们的亲本BAK502G9(VH SEQ ID NO15；VL SEQ IDNO16)的特异性(图6)。抗野生型IL-13的效价增量是通过它们以基本上均等的效价中和非人灵长类动物IL-13和IL-13变体的能力而得以反映的。BAK502G9抗人IL-13、人变异IL-13和非人灵长类动物IL-13的IC50分别为1.4nM、1.9nM和2.0nM。BAK1167F2抗人IL-13、人变异IL-13和非人灵长类动物IL-13的IC50分别为1.0nM、1.1nM和1.3nM。BAK1183H4抗人IL-13、人变异IL-13和非人灵长类动物IL-13的IC50分别为0.9nM、1.0nM和1.6nM。这些克隆均适用于治疗用途。
实施例7前导抗人IL-13抗体在HDLM-2细胞增殖试验中抗天然人IL-13的中和效价人IL-13序列具有4个潜在的N-糖基化位点。发明者已证实了BAK278D6及其衍生物中和细菌或杆状病毒表达系统所表达重组IL-13的能力。尽管有证据表明已知在哺乳动物系统内发生的许多加工现象也出现在昆虫中，但在蛋白质糖基化，尤其是N-糖基化方面仍存在关键差异[74]。
发明者研究了BAK278D6衍生物中和人细胞所释放的天然IL-13的能力。
HDLM-2细胞由Drexler等人[75]分离自何杰金氏病患者。Skinnider等人[76]证实HDLM-2细胞增殖部分地依赖于IL-13的自分泌和旁分泌释放。并评估了前导抗人IL-13抗体抑制由天然(或自然存在的)IL-13的释放所介导的HDLM-2细胞增殖的能力。
HDLM-2细胞试验方案由Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)获得HDLM-2细胞，并根据DSMZ所提供的方案维持该细胞。试验培养基包括含Glutamax I的RPI-1640(Invitrogen)，并含有20％胎牛血清。每次试验之前先通过300xg离心5分钟，使细胞沉淀，吸除培养基，并使细胞重悬浮于新鲜培养基中。重复该过程三次，并将细胞最终重悬浮于试验培养基中，终浓度为2×105个细胞/毫升。将50μl重悬浮细胞加至96孔培养板的各试验点内。用试验培养基将抗体试液(一式三份)稀释至要求浓度。以不直接抗IL-13的无关同种型抗体为阴性对照。将合适的试验抗体以50μl/孔的总体积与培养板各孔内的细胞混合，各实验点的总试验体积为100μl/孔。于37℃和5％CO2条件下温育试验培养板72小时。接着将25μl氘标记胸苷(10μCi/ml，NEN)加至各试验点内，并将试验培养板再次放入培养箱中继续温育4小时。利用细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤板(PerkinElmer)上。胸苷掺入利用Packard TopCount微量滴定板液体闪烁计数器测定。数据用Graphpad Prism软件分析。
结果如图7所示，BAK502G9(VH SEQ ID NO15；VL SEQ ID NO16)及其衍生物BAK1183H4(VH SEQ ID NO37；VL SEQ ID NO38)和BAK1167F2(VH SEQ ID NO35；VL SEQ ID NO36)对细胞增殖均可产生剂量依赖性抑制，且相对效价与在其它生物试验中观测到的结果近似。BAK502G9、BAK1183H4、BAK1167F2作为人IgG4的IC50分别为4.6nM、3.5nM和1.1nM。市售抗体JES10-5A2和B-B13的IC50分别为10.7nM和16.7nM。
实施例8前导抗人IL-13抗体在疾病相关初级细胞中抗IL-13依赖性反应的中和效价第二类生物试验是利用与呼吸道疾病更为相关的初级细胞和读数进行的。这包括正常人肺成纤维细胞(NHLF)的嗜酸性粒细胞趋化因子释放和在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表面的血管粘着分子1(VCAM-1)正调节。两种IL-13依赖性反应均有助于嗜酸性粒细胞的募集，而这是哮喘表型的一个特征[92]。
NHLF试验方案业已证实IL-13可使肺成纤维细胞释放嗜酸性粒细胞趋化因子[77][78][79]。通过ELISA确定NHLF的因子依赖性嗜酸性粒细胞趋化因子释放。
由Biowhittaker获得NHLF，并根据其提供的方案维持该细胞。试验培养基为FGM-2(Biowhittaker)。用试验培养基将抗体试液(一式三份)稀释至要求浓度。以不直接抗IL-13的无关抗体为阴性对照。接着将重组细菌来源的人IL-13(Peprotech)加至合适的试验抗体中，其终浓度为10ng/ml，二者混合的总体积为200μl。该试验所用的IL-13浓度被选择作为可产生约相当于最大反应的80％的反应的剂量。室温温育所有样品30分钟。接着将试验样品与已被接种至96孔培养板各孔内且密度为1×104个细胞/孔的NHLF混合。于37℃和5％CO2条件下温育培养板16-24小时。以300xg离心培养板5分钟，使脱离的细胞沉淀。通过ELISA并采用生产商(R&D Systems)推荐的试剂和方法确定上清液中的嗜酸性粒细胞趋化因子水平。数据用GraphpadPrism软件分析。
结果BAK278D6谱系克隆能够抑制NHLF的人IL-13依赖性嗜酸性粒细胞趋化因子释放。相对效价与在TF-1细胞增殖试验中所观测的结果近似(图8)。BAK502G9(VH SEQ ID NO15；VL SEQ ID NO16)、BAK1183H4(VH SEQ ID NO37；VL SEQ ID NO38)、BAK1167F2(VH SEQ ID NO35；VL SEQ ID NO36)抗10ng/ml人IL-13的IC50分别为207pM、118pM和69pM。市售抗体JES10-5A2和B-B13的IC50分别为623pM和219pM。
HUVEC试验方案业已证实IL-13可正调节HUVECs细胞表面上的VCAM-1表达[80、81]。因子依赖性VCAM-1表达是通过利用时间分辨荧光读数检测VCAM-1受体细胞表达的正调节而得以确定的。
由Biowhittaker获得HUVEC，并根据其提供的方案维持该细胞。试验培养基为EGM-2(Biowhittaker)。用试验培养基将抗体试液(一式三份)稀释至要求浓度。以不直接抗IL-13的无关抗体为阴性对照。将重组细菌来源的人IL-13(Peprotech)加至合适的试验抗体中，终浓度为10ng/ml，二者混合的总体积为200μL。该试验所用的IL-13浓度被选择作为可产生约相当于最大反应的80％的反应的剂量。室温温育所有样品30分钟。接着将试验样品与已被接种至96孔培养板各孔内且密度为4×104个细胞/孔的HUVEC混合。于37℃和5％CO2条件下温育培养板16-20小时。接着吸除试验培养基，取代以封闭液(含4％干Marvel奶粉的PBS)。室温温育培养板1小时。用PBST Tween洗涤各孔3次后，在各孔内加入100μl(用PBST/1％Marvel以1∶500的比例稀释)生物素化抗VCAM-1抗体(Serotec)。室温温育培养板1小时。用Delfia洗涤缓冲液(Perkin Elmer)洗涤各孔3次后，在各孔内加入100μl铕标记的链霉抗生物素蛋白或抗鼠IgG1(用Delfia试验缓冲液以1∶1000的比例稀释，Perkin Elmer)。接着于室温温育培养板1小时。用Delfia洗涤缓冲液(Perkin Elmer)洗涤各孔7次。最后，将100μl增强液(Perkin Elmer)加入各孔并利用Wallac 1420 VICTOR2读板仪(标准铕方案)测定荧光强度。数据用Graphpad Prism软件分析。
结果BAK502G9(VH SEQ ID NO15；VL SEQ ID NO16)、BAK1183H4(VH SEQ ID NO37；VL SEQ ID NO38)、BAK1167F2(VH SEQID NO35；VL SEQ ID NO36)作为完整抗体人IgG4的典型数据如图9所示。相对效价与在TF-1细胞增殖试验中观测到的结果近似。BAK502G9、BAK1183H4和BAK1167F2抗10ng/ml人IL-13的IC50分别为235pM、58pM和55pM。
实施例9抗IL-13抗体抗IL-1β和IL-4依赖性VCAM-1正调节的中和效价利用HUVEC生物试验的改良方法评估克隆中BAK278D6谱系的特异性。业已证实IL-4和IL-1β连同IL-13一起可正调节HUVECs细胞表面上的VCAM-1表达[80、81]。
HUVEC试验方案该试验基本上如实施例5所述方法进行，但存在下述改动。采用重组人IL-1β和IL-4(R&D Systems)分别代替0.5ng/ml和1ng/ml的人IL-13，并以这两个浓度代表可提供约为最大反应的80％的反应的剂量。
结果从BAK278D6谱系角度评估时，没有克隆在反应人IL-1β或IL-4时中和VCAM-1正调节，从而证实对IL-13具有特异性(图10)。IL-4与IL-13最接近相关，在氨基酸水平上具有30％的序列同一性[82]。
实施例10BAK209B11作为人IgG4在鼠IL-13依赖性鼠B9细胞增殖试验中的中和效价如实施例5所述方法，将通过实施例1所述方法被鉴定为是可作为scFv的抗鼠IL-13中和克隆，即BAK209B11重构成完整抗体人IgG4，并通过鼠IL-13依赖性B9细胞增殖试验评估其效价。B9是鼠B-细胞杂交瘤细胞系[83]。B9的存活和增殖具有因子依赖性。就这一点而言，B细胞对鼠IL-13有反应，并可被维持在含有人IL-6(50pg/ml，R&D Systems)的培养基中。对鼠IL-13依赖性增殖的抑制是通过测定掺入分裂细胞新合成DNA内的氘标记胸苷的减量而得以确定的。
B9细胞试验方案由European Collection of Animal Cell Culture ECACC获得B9细胞，并根据其提供的方案维持该细胞。基本上如实施例2针对TF-1试验所述的方法进行该试验，但存在下述改动。试验培养基包括含GLUTAMAX I的RPMI-1640(Invitrogen)，并含5％胎牛血清(Hyclone)和50μM 2-巯基乙醇(Invitrogen)。并以重组细菌来源的鼠IL-13(Peprotech)取代人IL-13，最终试验浓度为1ng/ml。
结果BAK209B11(VH SEQ ID NO25；VL SEQ ID NO26)在B9试验中作为人IgG4中和1ng/ml鼠IL-13的IC50为776pM(图11)。由此说明BAK209B11有助于研究IL-13在疾病鼠模型中的作用。这一点在实施例12得到明确证实，该实施例证实了BAK209B11在急性肺炎症鼠模型中的效能。
实施例11通过BLAcore分析对抗IL-13抗体亲和力的确定基本上如[72]所述方法通过利用BIAcore 2000 Biosensor(BIAcoreAB)进行的表面等离子共振技术测定BAK502G9(VH SEQ ID NO15；VL SEQ ID NO16)、BAK1167F2(VH SEQ ID NO35；VL SEQID NO36)和BAK1183H4(VH SEQ ID NO37；VL SEQ ID NO38)作为人IgG4与人IL-13的亲和力，以及BAK209B11(VH SEQ IDNO25；VL SEQ ID NO26)作为人IgG4与鼠IL-13的亲和力。简言之，利用胺偶联试剂盒(BIAcore)使抗体与CM5传感器芯片偶联，表面密度约为500Ru，用HBS-EP缓冲液系列稀释IL-13所获的系列稀释液(50nM-0.78nM)通过该传感器芯片表面。利用BIA评估3.1软件评估由上所获传感器记录，获得动力学数据。
结果BAK502G9、BAK1167F2和BAK1183H4 IgG4分别以Kd为178pM、136pM和81pM的高亲和力结合人IL-13，与它们在以细胞为基础的试验中的相对效价相对应。BAK209B11则以5.1nM的亲和力结合鼠IL-13(表3)。
实施例12BAK209B11在急性变应性肺炎症鼠模型中的效能急性变应性肺炎症鼠模型在急性变应性肺炎症患鼠中研究BAK209B11(VH SEQ ID NO25；VL SEQ ID NO26)这种抗鼠IL-13中和人IgG4抗体的作用。基本上如Riffo-Vasquez等人所述的方法[84]构建该模型，其最终特征在于支气管肺泡灌洗(BAL)IL-13增多(图12)、细胞浸润进入肺和BAL(图13)、血清IgE水平升高和呼吸道高反应性(AHR)。
建模方案用抗鼠IL-13抗体BAK209B11(以12、36、119或357μg剂量)或同种型匹配对照抗体(357μg剂量)处理雌性Balb/C小鼠(CharlesRiver UK)。第0和第7天，通过腹膜内注射10μg溶解于0.2ml载体(含2％Al2O3(Rehydragel)作为佐剂的盐溶液)中的卵清蛋白(Ova)，使各组小鼠敏化。未敏化小鼠对照组单独接受等量的上述载体。第14、15和16天用卵清蛋白激发小鼠。使卵清蛋白雾化前先用无菌盐水将其稀释至1％(w/v)。所有吸入激发均在Plexiglas暴露室内进行。以1小时间隔进行一组3次的暴露，每次20分钟，用deVilbiss Ultraneb 2000喷雾器(Sunrise Medical)使卵清蛋白雾化。
第一次激发前1天以及之后的每次激发前2小时静脉内施用BAK209B11或无关人IgG4(共计4个剂量)。第17天，即最终激发后24小时终止建模。收集血液(血清)和BAL。测定血清中的总IgE。通过注射3等份盐水(0.3ml、0.3ml和0.4ml)和混合样品获得BAL。从BAL细胞中获得总的白细胞和分类细胞计数。
结果与未敏化但被激发的动物相比，对敏化小鼠的卵清蛋白激发导致总BAL细胞募集显著(p＜0.05)提高。BAK209B11以剂量依赖性方式抑制该募集；BAK209B11≥36μg时可观测到显著(p＜0.05)抑制，而对照抗体则无(图13)。BAK209B11剂量最小为36μg时，也可发现其同样显著(p＜0.05)抑制了嗜酸性粒细胞(图14)和嗜中性粒细胞(图15)的细胞内向通量。未发现对照抗体具有该抑制作用。被激发后，敏化小鼠体内还诱导产生了淋巴细胞，而未敏化小鼠体内则无。BAK209B11以剂量依赖性方式抑制该诱导，BAK209B11为36μg时可观测到最大抑制。对照抗体则不起作用(图16)。与未敏化动物相比，尽管未在敏化动物体内诱导产生单核细胞/巨噬细胞，但BAK209B11≥36μg时可降低自然背景值，对照抗体则不能(图17)。与未敏化动物相比，敏化动物激发后的血清IgE水平显著(p＜0.05)升高。用36μg BAK209B11治疗后可使该升高的水平降低，对照抗体则不能。
概括而言，在变应性炎症鼠模型中，系统性施用鼠IL-13中和抗体BAK209B11可抑制炎症细胞内向通量以及敏化和后续卵清蛋白激发对血清IgE水平的正调节，而对照抗体则不行。
实施例13-20为预示性实例。
实施例13BAK209B11在急性肺炎症Lloyd鼠模型中的效能急性变应性肺炎症鼠模型在第二种急性变应性肺炎症鼠模型中研究了抗鼠IL-13中和抗体BAK209B11(VH SEQ ID NO25；VL SEQ ID NO26)的作用。基本上如McMillan等人所述的方法[85]构建该模型，其最终特征在于BAL和肺组织IL-13增多、细胞浸润进入肺和BAL、血清IgE水平升高和呼吸道高反应性(AHR)。
建模方案如下所述，对雌性Balb/C小鼠(Charles River UK)施用不同剂量的抗鼠IL-13抗体BAK209B11或同种型匹配对照抗体。第0和第12天，通过腹膜内注射10μg溶解于0.2ml载体(含有2mg Al(OH)3作为佐剂的盐溶液[计算如实施例12所述])中的卵清蛋白(Ova)，使各组小鼠敏化(SN)。未敏化小鼠对照组(NS)单独接受等量的上述载体。第19、20、21、22、23和24天用卵清蛋白激发小鼠20分钟。使卵清蛋白雾化前先用盐水将其稀释至5％(w/v)。所有吸入激发均在Plexiglas暴露室内进行。利用deVilbiss Ultraneb 2000喷雾器(SunriseMedical)使卵清蛋白雾化。第18、19、20、21、22、23和24天，对小鼠腹膜内施用不同剂量(237μg、23.7μg或2.37μg；如图21中的H、M和L所示)的抗鼠IL-13抗体BAK209B11 muIgG1或同种型匹配对照抗体(237μg)。第0和25天，通过增强乙酰甲胆碱激发并用意识体积描记器(Buxco)监控，评估呼吸道功能。根据与乙酰甲胆碱剂量-反应曲线拟合并有4个参数不固定的曲线，估计个体小鼠第0和第25天的PC50(将基线PenH提高50％所必需的乙酰甲胆碱浓度)。
第25天，即最终激发后24小时终止建模。收集血液、血清、BAL和肺组织。
结果评估了个体动物第0(处理前)和第25天(激发后)的肺功能，并通过计算PC50值(将基线PenH提高50％所必需的乙酰甲胆碱浓度)定量(图21A)。根据第25天相对于第0天的logPC50变化(第25天的logPC50-第0天的log PC50)确定个体的呼吸道高反应性(AHR)。该logPC50是该研究的初步终点；将PC50数据对数转化的原因是终点ANOVA的需要。将各组内的个体变化平均后可获得组平均logPC50(如图21B所示)。
与未敏化但被激发的小鼠相比，卵清蛋白对敏化小鼠的激发导致了显著的AHR(p＜0.01)。BAK209B11以剂量依赖性方式明显缓解了AHR，而对照抗体则无该作用。
实施例14BAK209B11在急性肺炎症Gerard鼠模型中的效能在第三种急性变应性肺炎症鼠模型中研究了抗鼠IL-13中和人IgG4抗体BAK209B11(VH SEQ ID NO25；VL SEQ ID NO26)的作用。基本上如Humbles等人所述的方法[86]构建该模型，其最终特征在于BAL和肺组织IL-13增多、细胞浸润进入肺和BAL、血清IgE水平升高和呼吸道高反应性(AHR)。
建模方案对雌性Balb/C小鼠(Charles River UK)施用不同剂量的抗鼠IL-13抗体BAK209B11或同种型匹配对照抗体。第0、7和14天，通过腹膜内注射10μg溶解于0.2ml载体(含有1.125mg Al(OH)3作为佐剂的盐溶液[计算如实施例12所述])中的卵清蛋白(Ova)，使各组小鼠敏化(SN)。未敏化小鼠对照组(NS)单独接受等量的上述载体。第21、22、23和24天，用卵清蛋白激发小鼠20分钟。使卵清蛋白雾化前先用盐水将其稀释至5％(w/v)。所有吸入激发均在Plexiglas暴露室内进行。利用deVilbiss Ultraneb 2000喷雾器(Sunrise Medical)使卵清蛋白雾化。
第25天，即激发后24小时终止建模。收集血液、血清、BAL和肺组织。
实施例15BAK209B11在肺炎症Lloyd慢性模型中的效能慢性变应性肺炎症鼠模型在慢性变应性肺炎症模型中研究了抗鼠IL-13中和人IgG4抗体BAK209B11(VH SEQ ID NO25；VL SEQ ID NO26)的作用。基本上如Temelkovski等人所述的方法[87]构建该模型，其最终特征在于细胞浸润进入肺和BAL、血清IgE水平升高和呼吸道高反应性(AHR)。
建模方案对雌性Balb/C小鼠(Charles River UK)施用不同剂量的抗鼠IL-13抗体BAK209B11或同种型匹配对照抗体。第0和11天，通过腹膜内注射10μg溶解于0.2ml载体(含有2mg Al(OH)3作为佐剂的盐溶液[计算如实施例12所述])中的卵清蛋白(Ova)，使各组小鼠敏化(SN)。未敏化小鼠对照组(NS)单独接受等量的上述载体。第18、19、20、21、22、23、28、30、32、35、37、39、42、44、46、49和51天，用卵清蛋白激发小鼠20分钟。使卵清蛋白雾化前先用盐水将其稀释至5％(w/v)。所有吸入激发均在Plexiglas暴露室内进行。利用deVilbissUltraneb 2000喷雾器(Sunrise Medical)使卵清蛋白雾化。
第52天，即激发后24小时终止建模。收集血液、血清、BAL和肺组织。
实施例16抗人IL-13抗体抗鼠气囊模型所施用外源人IL-13的效能在基础鼠模型中研究了抗人IL-13抗体对人IL-13促炎作用的影响。基本上如Edwards等人所述的方法[93]构建该模型，其最终特征在于细胞浸润进入所述气囊。
建模方案通过第0天皮下注射2.5ml无菌空气，使雌性Balb/C小鼠背部形成气囊。第3天用另外2.5ml无菌空气使该气囊再次膨胀。第6天将溶解在0.75％CMC中的2μg huIL-13直接注射进该气囊。24小时后，处死小鼠，并用1mL肝素化盐水冲洗该气囊。用huIL-13(进入该气囊)或系统性进行抗体治疗。
结果与接受载体(将在盐水中形成的0.75％羧甲基纤维素(CMC)注射进气囊)处理的小鼠相比，被注射进气囊(i.po.)的人IL-13在小鼠激发后24小时使总的白细胞(p＜0.01)和嗜酸性粒细胞(p＜0.01)浸润显著增加。
局部施用的BAK502G9(200mg、20mg或2mg气囊内)以剂量依赖性方式显著抑制了总的白细胞(p＜0.01)和嗜酸性粒细胞(p＜0.01)浸润进入因0.75％CMC所含2μg huIL-13造成的气囊。
系统性施用的BAK209B11(30mg/kg、10mg/kg和1mg/kg)也以剂量依赖性方式显著抑制了总的白细胞(p＜0.01)和嗜酸性粒细胞(p＜0.01)浸润进入因0.75％CMC所含2μg huIL-13造成的气囊。
实施例17用于评估抗人IL-13抗体在肺变应性炎症模型中的效能的人IL-13加入/鼠IL-13剔除转基因小鼠的产生发明者通过基因导向获得了可表达人IL-13而不表达鼠IL-13的小鼠。所述小鼠IL-13基因从起始到终止密码子均被取代为人IL-13基因的相关部分。该小鼠品系与野生型小鼠反应相同刺激物时，表达的是人IL-13而不是小鼠IL-13，但内源IL-13启动子和IL-13pA尾部保持不变。业已证实人IL-13可与小鼠IL-13受体结合并通过其发信号，可与由小鼠IL-13连接的小鼠IL-13受体所导致的信号一样产生相同的生理学结果。例如，内源人IL-13导致炎症细胞募集进小鼠气囊(图18)。这些转基因动物使我们可以评估非鼠交叉反应性抗人IL-13抗体在已确定的疾病鼠模型中的作用。
该小鼠已被应用在急性变应性呼吸道炎症模型(如实施例18和19所述)和慢性变应性呼吸道炎症模型(如实施例20所述)中，协助评估了抗人IL-13抗体在变应性呼吸道疾病中的药理学。
实施例l8
抗人IL-13抗体在急性肺炎症huIL-13-转基因Lloyd鼠模型中的效能急性变应性肺炎症鼠模型利用实施例17所获得的转基因小鼠研究了抗人IL-13中和人IgG4抗体在急性变应性肺炎症鼠模型中的作用。基本上如McMillan等人所述的方法[85]和实施例13构建该模型。其最终特征在于BAL和肺组织IL-13增加、细胞浸润进入肺和BAL、血清IgE水平升高和呼吸道高反应性(AHR)。
建模方案该建模方案如实施例13所述，但所施用的是抗人IL-13抗体，而不是BAK209B11。
实施例19抗人IL-13抗体在急性肺炎症huIL-13-转基因Gerard鼠模型中的效能急性变应性肺炎症鼠模型利用实施例17所获得的转基因小鼠研究了抗人IL-13中和人IgG4抗体在另一种急性变应性肺炎症鼠模型中的作用。基本上如Humbles等人所述的方法[86]和实施例14构建该模型。其最终特征在于BAL和肺组织IL-13增加、细胞浸润进入肺和BAL、血清IgE水平升高和呼吸道高反应性(AHR)。
建模方案该建模方案如实施例14所述，但所施用的是抗人IL-13抗体，而不是BAK209B11。
实施例20抗人IL-13抗体在慢性肺炎症huIL-13-转基因Lloyd鼠模型中的效能利用实施例17所获得的转基因小鼠研究了抗人IL-13中和人IgG4抗体在慢性变应性肺炎症鼠模型中的作用。基本上如Temelkovski等人所述的方法[87]和实施例15构建该模型。其最终特征在于细胞浸润进入肺和BAL、血清IgE水平升高和呼吸道高反应性(AHR)。
建模方案该建模方案如实施例15所述，但所施用的是抗人IL-13抗体，而不是BAK209B11。
实施例21抗人IL-13抗体在猪蛔虫-变应性猕猴体内的药物代谢动力学和药物动力学评估了BAK502G9在4只具有变应性但未被激发的猕猴属灵长类动物(2雄/2雌)单次静脉施用剂量为10mg/kg的集合药团后的药物代谢动力学和药物动力学。该试验进行29天。抗体的药物代谢动力学参数根据血清-药物浓度几何平均值曲线而定，详见下表4。
在同一研究中还利用人IgE ELISA试剂盒(Bethyl laboratories，USA)追踪了血清IgE浓度。
结果单次静脉内施用集合药团剂量为10mg/kg的BAK502G9后第4和5天，血清IgE浓度由100％对照水平(初始剂量)显著降至对照值的66±10％(p＜0.05)。第22天，该血清IgE浓度恢复至对照水平的88±8％(参见图20)。通过将每只动物的血清IgE浓度归一化为初始剂量水平，其中所述初始剂量浓度为100％，并接着对由4只试验动物获得的曲线进行平均，便可再次导出这些数据。
两只雄性猕猴具有相对低的初始剂量总血清IgE(60ng/ml和67ng/ml)。它们的IgE水平未变化，勉强说明BAK502G9适用于治疗(图20B)。两只雌性猕猴具有相对高的初始剂量总血清IgE(1209ng/ml和449ng/ml)。接受BAK502G9治疗后，它们的IgE水平于第7天降幅最大，为60％，并于给药后28天大约恢复至初始剂量水平(图20B)。上述数据说明BAK502G9降低了动物的血清IgE浓度，循环IgE在IgE中所占比例相对较高。
实施例22抗人IL-13抗体在皮肤变应反应猕猴模型中的效能在急性变应性皮肤炎症的灵长类动物模型中研究了抗人IL-13中和人IgG4抗体的效能。通过对猕猴皮内注射人IL-13和猪蛔虫抗原，可构建该模型。24-96小时后，取得皮肤活组织检查标本和血清样品。该模型的最终特征在于细胞浸润进入皮肤。
实施例23抗人IL-13抗体在肺变应反应猕猴模型中的效能在急性变应性肺炎症的灵长类动物模型中研究了抗人IL-13中和人IgG4抗体的作用。通过使猪蛔虫-变应性猕猴接触雾状猪蛔虫抗原，使其产生变应性反应，而得以构建该模型。该变应反应的最终特征在于细胞浸润进入肺和BAL、血清IgE水平升高和呼吸道高反应性。
还利用流式细胞法体外评估了药物动力学。CD23是高亲和力IgE受体，可被表达在外周人血单核细胞上。根据表达CD23的细胞数量以及每个细胞表达多少CD23，可用IL-13和IL-4诱导CD23表达。IL-13介导的反应可被抗人IL-13抗体抑制，而IL-4介导的反应则不受其抑制。
基于之前通过雾状抗原(猪蛔虫提取物)激发而得以建立的AHR，预先筛选可进入2期研究的动物。I期研究的第1和11天在静脉内组胺激发期间评估了呼吸道功能。PC30，即使肺抵抗力(RL)高于基线30％所需的组胺剂量是根据各组胺剂量反应曲线确定的。第9和10天，以之前显示可使RL升高40％并使动态应变性(CDYN)下降35％的雾化抗原调整剂量分别激发每只动物。根据过去对该模型的研究，用特定变应原剂量第二次激发后观测到的RL高于第一次激发所获RL；这是抗原引发。正如根据组胺剂量反应曲线下方增加的面积和/或PC30的下降所测定的，两次抗原激发均导致了AHR，以及BAL，与第1天相比，第11天还出现了嗜曙红细胞增多。选择表现了AHR表型的动物进入II期研究。
II期研究与I期完全一样，只是所有动物于第1、5和9天灌输的是30mg/kg BAK502G9。通过比较个体动物I期变化和II期变化，评估BAK502G9的作用。
收集血液、血清、BAL和肺组织。通过ELISA监控血清IgE水平。从经过BAK502G9治疗的猕猴所获得的血清显示抑制了IL-13诱导的人外周血单核细胞上的CD23表达，而不是IL-4诱导的CD23表达。该抑制的量级与通过PK ELISA预测的血清BAK502G9水平相符。
结果根据RL AUC所测定的结果，BAK502G9显著抑制了AHR(p＜0.05)(图26A；表7)。根据PC30测定的BAK502G9对AHR的抑制作用可观测到，但不具有统计显著性(图26B；表7)。BAK502G9还显著抑制了两次抗原引发(p＜0.01)(图26C；表7)和BAL炎症。BAK502G9显著抑制了进入BAL的总细胞(p＜0.05)和嗜酸性粒细胞(p＜0.05)的内向通量，而未抑制进入BAL的巨噬细胞、淋巴细胞或肥大细胞的内向通量(图26D；表7)。
实施例24抗人IL-13抗体对小鼠肺施用人IL-13后所出现的哮喘表型的效能呼吸道高反应性鼠模型该实施例研究了抗人IL-13中和抗体BAK502G9对小鼠肺施用人IL-13后所出现的呼吸道高反应性(AHR)的效能。基本上如Yang等人所述的方法[119]构建该模型，但采用人IL-13取代鼠IL-13。
建模方案通过使雄性BALB/c小鼠以48小时的时间间隔分别两次暴露于人IL-13，以出现所述表型。简言之，静脉内注射100μl saffan溶液(1∶4稀释于水中)使小鼠麻痹。将22号导管针插入小鼠体内，以滴注人重组IL-13(25μg溶解于20μl磷酸缓冲盐溶液(PBS)中)或载体对照(PBS)。通过增强乙酰甲胆碱激发并用意识体积描记器(Buxco)监控，评估最终施用IL-13后24小时的呼吸道功能。根据与乙酰甲胆碱剂量-反应曲线拟合并有4个参数不固定的曲线测定PC200(将基线penH提高200％所必需的乙酰甲胆碱浓度)。每次施用IL-13之前24小时通过腹膜内注射进行抗体治疗。
结果根据PC200乙酰甲胆碱浓度所测定的结果，与对照动物相比，将人IL-13气管内滴注进首次用于试验的野生型小鼠，导致其出现了显著(p＜0.05)的呼吸道高反应性。系统性施用BAK502G9(1mg/kg)显著(p＜0.01)抑制了AHR的出现，而无关对照抗体则无该作用(图23)。
实施例25BAK502G9作为人lgG4对人B细胞的人IL-13依赖性IgE释放的中和效价B细胞转换试验方案业已证实IL-13可诱导体外人B细胞内的IgE合成[120]。通过ELISA确定人B细胞的因子依赖性IgE释放。评估了BAK502G9作为人IgG4对人B细胞的人IL-13依赖性IgE释放的中和效价。
通过1.077g/l密度梯度离心从人血沉棕黄层(Blood TransfusionService)中纯化出外周血单核细胞(PBMC)。利用B细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)并采用生产商所述试剂和方法，从PBMC中纯化出B细胞。试验培养基包括Iscoves改良dulbeccos培养基(LifeTechnologies)，并含10％胎牛血清和20μg/ml人转铁蛋白(SerologicalsProteins Inc.)。纯化后，将B细胞重悬浮在试验培养基中，最终浓度为106个细胞/ml。将50μl重悬浮细胞加入96孔培养板的各实验点中。
根据需要，将50μl4μg/ml抗CD40抗体EA5(Biosource)加入各孔内。用试验培养基将抗体试液(一式六份)稀释至要求浓度。以不直接抗IL-13的无关抗体作为阴性对照。以50μl/孔的量将合适的试验抗体加入各孔内。再将重组细菌来源的人IL-13(Peprotech)加入孔内，其最终浓度为30ng/ml，所获总试验体积为200μl/孔。该试验所用IL-13浓度被选择用于实现最大反应。于37℃和5％CO2条件下温育试验培养板14天。通过ELISA并采用生产商(BD Biosciences，BethylLaboratories)提供的试剂和方案测定上清液中的IgE水平。数据用Graphpad prism软件分析。
结果如图24所示，BAK502G9(VH SEQ ID NO15；VL SEQ ID NO16)能够抑制人B细胞以依赖于人IL-13的方式生成IgE。BAK502G9作为人IgG4抗30ng/ml人IL-13的IC50为1.8nM。
实施例26BAK502G9对初级人支气管平滑肌细胞中IL-13介导的组胺诱导性Ca2+信号增强的效能业已证实IL-13可直接调节呼吸道平滑肌的收缩性[121、122]。平滑肌收缩的前提是胞内钙转移。最近的研究显示IL-13改变平滑肌收缩性的能力是部分地通过调节收缩增效剂所诱导的Ca2+信号而得以介导的[123、124]。
在Ca2+信号试验中研究了抗人IL-13抗体BAK502G9以IgG4形式对IL-13介导的初级人支气管平滑肌细胞(BSMC)信号改变的效能，其中所述初级人支气管平滑肌细胞信号是反应收缩增效剂组胺而产生的。
BSMC Ca2+信号试验方案人初级BSMC、平滑肌生长培养基-2(SmGM-2)和平滑肌基础培养基(SmBM)获自Bio Whittaker。根据提供方的推荐在SmGM-2中维持BSMC。以2×104个细胞/孔的量将BSMC接种在96孔微量滴定细胞培养板中，并使其附着24小时，接着再次饲养并继续温育24小时。进行Ca2+信号试验之前，用最终浓度为50ng/ml的IL-13(Peprotech)连同或不连同抗体一起刺激BSMC，并温育18-24小时。评估最终浓度为10μg/ml的BAK502G9和同种型匹配无关对照单克隆抗体CAT-001。通过利用Ca2+灵敏染料Fluo-4(Molecular Probes)和96孔荧光成象读板仪(FLIPR)(Molecular Devices)进行的标准技术测定胞内Ca2+浓度反应从20μM开始滴定的组胺(Calbiochem)时的变化。针对各细胞预处理条件测定Ca2+信号的组胺反应曲线下方的面积(AUC)。数据分析利用适用于Windows的GraphPad Prism version4(GraphPad Software)进行。
结果用IL-13预先温育BSMC显著增强了Ca2+反应组胺时所产生的信号。用BAK502G9和IL-13一起(而不是无关同种型对照抗体(图25A))预先温育BSMC(图25B)则显著抑制了反应组胺时Ca2+信号的增强(图25)。
实施例27抗IL-13抗体在人IL-13依赖性PBMC CD23表达试验中的中和效价在人IL-13依赖性外周血单核细胞(PBMC)CD23表达试验中评估了代表性IL-13抗体的效价。PBMC可通过提高细胞表面的CD23表达而对IL-13和IL-4均有反应[120]。CD23(FceRII)是IgE的低亲和力受体，被表达在包括单核细胞在内的多种炎症细胞上。通过利用流式细胞仪测定荧光标记的CD23单克隆抗体与PBMC结合的减量，可确定人IL-13依赖性CD23表达正调节的抑制。
试验方案由Blood Transfusion Service获得人血，通过40分钟的葡聚糖-T500(Pharmacia)沉降(0.6％最终浓度)除去红细胞。接着通过采用3mL 64％和5mL 80％的不连续Percoll梯度(100％指9份Percoll和1份10×PBS)进行20分钟1137g离心，分离富含白细胞和血小板的部分。从64％层的上部收集PBMC，洗涤并将其重悬浮在试验缓冲液(Invitrogen RPMI 1640，10％FCS，200IU/mL青霉素，100μg/mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺)中。该试验在24孔培养板中进行，每孔含2×106个细胞、±80pM重组人IL-13(Peprotech)或21pM重组人IL-4(R&D Systems)、±BAK502G9或无关IgG4，终体积为500mcL。37℃培养细胞48小时后，收获并于4℃用CD23-PE(BD Pharmingen)染色20分钟。最后，用流式细胞仪对细胞读数。根据CD23‘评分’，即以染色“亮度”乘CD23阳性细胞百分比所获结果(荧光几何平均值)确定CD23表达。将无刺激物的CD23‘评分’减去并将该数据表示为仅反应IL-13的百分比(100％)。将由利用4-6名个体供体的细胞以各点重复三次的方式进行的4-6次独立试验所获的数据表达为平均值±SEM的形式。
结果用80pM IL-13或21pM IL-4温育PBMC 48小时导致出现明显的CD23表达(图27和图28)。BAK502G9以剂量依赖性方式抑制IL-13诱导的CD23表达，几何平均值为120.2pM(图27)。与之相比，BAK502G9不能抑制21.4pM IL-4诱导的CD23表达(n＝4来自个体供体，图28)。无关IgG4不抑制PBMC上的IL-13或IL-4依赖性CD23表达(图27和图28)。80pM IL-13和21.4pM IL-4共同刺激PBMC产生了加性CD23反应。BAK502G9将CD23表达水平降低至仅用IL-4刺激时所观测到的水平，而CAT-001不行(图28)。
实施例28人IL-13抗体在人IL-13依赖性嗜酸性粒细胞形状改变试验中的中和效价该研究的目的在于评估IL-13抗体对NHLF受哮喘患者肺内存在的因子，诸如IL-13[125、126]、TNF-α[127]、TGF-β1[128]刺激后所释放介体诱导的嗜酸性粒细胞形状改变的影响。IL-13与TNF-α[129]或TGF-β1[130]协同作用，可诱导成纤维细胞生成可接着产生作用直接化学吸引嗜酸性粒细胞的嗜酸性粒细胞趋化因子-1。白细胞形状变化反应是通过细胞支架的重排而得以介导的，并且对白细胞从微循环迁移进入炎症位点的过程而言是必要的。通过ELISA测定嗜酸性粒细胞趋化因子-1分泌的减量和利用流式细胞仪测定嗜酸性粒细胞形状变化的减量，可确定对NHLF释放IL-13依赖性形状变化诱导因子的抑制。
试验方案仅用培养基或含刺激物(9.6nM IL-13、285.7pM TNF-α(R&DSystems)和160pM TGF-β1(R&D Systems))的培养基在BAK502G9(浓度范围875nM-6.84nM)缺乏或存在条件下共培养NHLF细胞。接着于37℃继续培养细胞48小时后，吸取培养所获的条件培养基并于-80℃保存。利用R&D systems的Duoset ELISA系统(R&D Systems)评估条件培养基中的嗜酸性粒细胞趋化因子-1浓度。
由Blood Transfusion Service获得人血，通过40分钟葡聚糖-T500(Pharmacia)沉降(0.6％最终浓度)除去红细胞。接着通过采用3mL64％和5mL 80％的不连续Percoll梯度(100％指9份Percoll和1份10×PBS)进行20分钟1137g离心，分离富含白细胞和血小板的部分。从64％80％界面收集粒细胞，洗涤并将其重悬浮在试验缓冲液(SigmaPBS，1mM CaCl2，1mM MgCl2，10mM HEPES，10mM D-葡萄糖，0.1％Sigma BSA，pH7.3)中。该试验在FACS管中进行，每管含5×105个细胞、±3nM重组人嗜酸性粒细胞趋化因子-1(R&D Systems)或条件培养基，终体积为400μL。37℃温育细胞8.5分钟后，转移至4℃，用固定剂(CellFix，BD Biosciences)固定，最后用流式细胞仪读数。根据嗜酸性粒细胞的FL-2自身荧光和前向散射(FSC)参数读数鉴定嗜酸性粒细胞。根据嗜酸性粒细胞同时反应嗜酸性粒细胞趋化因子-1和条件培养基时产生的FSC变化，便可衡量其形状变化。以高流速从试管中取样，并于1000个嗜酸性粒细胞通过或1分钟后终止采集，而无论哪一种情况较快。以占仅由形状变化缓冲液导致的FSC的百分比形式计算形状变化(100％为空白形状变化)。将4次独立试验所获数据表达为空白形状变化％平均值±SEM。各试验均采用个体血沉棕黄层(由个体供体提供)中的细胞，各试验点重复进行两次。
结果用9.6nM IL-13、285.7pM TNF-α和160pM TGF-β1协同刺激NHLF细胞并培养48小时后，该细胞分泌进入培养基中的嗜酸性粒细胞趋化因子-1为9.6nM。与之相比，仅用维持液培养NHLF细胞时，该细胞分泌进入培养基的嗜酸性粒细胞趋化因子-1为0.1nM。该嗜酸性粒细胞趋化因子-1的生成依赖于IL-13，因为IL-13/TNF-α/TGF-β1协同刺激NHLF细胞所导致的嗜酸性粒细胞趋化因子-1生成受BAK502G9的剂量依赖性方式抑制，IC50为32.4nM(图29A)。
该部分研究的主要目的在于检验嗜酸性粒细胞的形状变化。嗜酸性粒细胞反应3nM嗜酸性粒细胞趋化因子(阳性对照)时形状变化的量级为122.2±2.1％(n＝4)。100nM抗嗜酸性粒细胞趋化因子抗体CAT-213可完全抑制嗜酸性粒细胞趋化因子-1诱导的形状变化，平均的形状变化为101.0±1.0％(n＝4)。
用9.6nM II-13、285.7pM TNF-α和160pM TGF-β1协同刺激NHLF细胞并培养48小时后所获的培养基(条件培养基)可诱导产生明显的嗜酸性粒细胞形状变化(图29B)。与之相比，仅在NHLF维持液中培养NHLF 48小时后所获的培养基不能诱导嗜酸性粒细胞的形状变化(图29B)。
在培养NHLF之前向经过协同刺激的培养基中加入抗IL-13抗体BAK502G9，导致产生了对嗜酸性粒细胞形状变化的剂量依赖性抑制，以1∶16稀释度进行测定时所获IC50的几何平均值为16.8nM(图29B)。
试验还研究了刺激物(IL-13、TNF-α和TGF-β1)未与NHLF细胞一起培养时诱导嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞形状变化的能力。9.6nM IL-13、285.7pM TNF-α和160pM TGF-β1未诱导产生明显的嗜酸性粒细胞形状变化。这说明将上述刺激物与NHLF细胞一起培养期间所获的条件培养基在使嗜酸性粒细胞形状变化方面的能力并非这些刺激物中的任意一种单独作用或组合作用的结果(图29B)。
实施例29抗IL-13抗体在人IL-13上的定位利用分子方法和标准肽切除法对代表性IL-13抗体BAK502G9进行表位定位。
分子方法设计IL-13嵌合体，将人IL-13序列部分取代为鼠序列。这些嵌合体与代表性IL-13抗体一起被应用在结合研究中，有助于鉴定特异性表位。
获得两组IL-13嵌合体。第一组含有9种嵌合体(图30)，被用于定位所述表位的大体位置。第二组含有10种嵌合体(图31)，被用于准确定位表位。
通过PCR组装上述嵌合IL-13序列，并将它们克隆进Gateway进入载体中，接着使这些序列与目标载体pDEST8重组(修饰后的编码有助于检测，且该重组蛋白C末端具有亲和标记物)。这些表达载体被用于转化DH10BacTM化学感受态大肠杆菌，可使标记嵌合IL-13发生位点特异性转座，进入杆状病毒穿梭载体(杆粒)中。分离与各IL-13嵌合体对应的重组杆粒DNA，并利用Cellfectin试剂将其转染进Sf9(草地夜蛾)昆虫细胞中。转染后72小时收获重组杆状病毒，并使其通过Sf9昆虫细胞两次以上。
利用亲和柱纯化昆虫2000-500ml培养上清液，并将洗脱部分从16ml浓缩至1ml后，加样在尺寸排阻Superdex 200 HR10/300GL柱上，进行最终的润饰和缓冲液交换。
开发了一种利用生物素化人IL-13、链霉抗生物素化-anthophyocynate和铕标记BAK502G9进行的同源竞争试验。该试验流程如下Eu-BAK502G9与生物素化人IL-13结合，该复合物接着被链霉抗生物素化APC结合物识别，当应用闪光时，能量由APC标记转移至邻近的铕，便可测定时间分辨荧光。借助于未标记的人IL-13(作为对照)和嵌合构建体导入对该结合的竞争。对该竞争定量可计算IL-13突变体对IL-13抗体的相对亲和力，以实现可改变待鉴定结合的突变。
结果发现嵌合构建体IL13-螺旋D(表5)是与生物素化人IL-13竞争结合BAK502G9时最弱的竞争者，说明该IL-13分子内的螺旋D参与了BAK502G9表位结合(表5)。还发现因亲本序列中40、41和33、34号位的残基变化而获得的4041和3334突变体的活性降低，说明螺旋A潜在参与了对BAK502G9的识别。环3活性的降低不被重视的原因在于，与人IL-13分子相比，该环所含突变体中的氨基酸数目减少了，并且可能改变所述蛋白的整体结构。嵌合IL-13分子在竞争BAK502G9结合的能力方面的其它降低被认为对这种氨基酸变化而言是不显著的。
接着测试了螺旋D内一组更具有针对性的突变(图26)。结果如表6所示，如下结果显示嵌合构建体116117TK(116号位赖氨酸被取代为苏氨酸，117号位天冬氨酸被取代为赖氨酸)、123KA(123号位赖氨酸被取代)和127RA(127号位精氨酸被取代)至少能够竞争结合BAK502G9(123KA和127RA为1μM时不竞争结合)。由于在该竞争试验中的效率降低而被认为参与了结合BAK502G9的其它残基包括螺旋D的124Q残基(该处的赖氨酸被取代为谷氨酰胺)和120121SY(亮氨酸组胺对被更换为丝氨酸酪氨酸对)。58L号位赖氨酸的突变也使结合减少，对3D结构的分析表明该残基的定位与螺旋D相反并可能与BAK502G9直接接触，或者可能影响螺旋D的排列。
上述试验证实螺旋D内的残基对BAK502G9与IL-13的结合具有关键作用。123号位的赖氨酸和127号位的精氨酸对该结合尤为关键，二者任意之一的突变均会破坏BAK502G9的结合。
表位切除还采用标准肽切除方法对BAK502G9进行了表位定位。该方法是将IgG固定在固相上并使其捕捉IL-13配体。接着对由上所形成的复合体进行特异性蛋白水解消化，期间裂解了可及肽键，而被IgG:配体界面保护的那些肽键仍保持完整。因此，含有所述表位的肽仍与IgG结合。接着可使二者解附，收集并通过质谱法(ms)进行鉴定。
应用了两种互补技术，第一种技术利用了Ciphergen ProteinChipReader MALDI-TOF质谱仪，可能使IgG与质谱仪芯片共价连接并继续进行消化和原位提取。第二种技术利用了生物素化BAK502G9和与之相连的链霉抗生物素化包被珠，可通过串联质谱计(ms/ms)收集足够的肽用以证实序列。
上述两种方法的具体细节和规模尽管存在差异，但基本上包括相同步骤，即偶联IgG、封闭未反应的结合位点、洗涤、捕捉配体、除去未结合配体、消化和最终的洗涤步骤。
MALDI-TOF质谱法利用了经由羰基二咪唑活化的专利质谱芯片，羰基二咪唑可与游离伯胺基团结合，而PBS中所含1-2mg/ml的IgG则可在4℃过夜条件下与该伯胺基团偶联。接着室温下用乙醇胺溶液封闭该芯片1小时后，用PBS或HBS外加合适的洗涤剂进行大量洗涤。
随后使1皮摩尔IL-13等分试样在PBS或HBS中与上述芯片接触，使其室温下与化学固定的IgG结合2小时。接着用含有和不含洗涤剂的PBS或HBS进行进一步洗涤，以除去所有非特异性结合的IL-13。接着对IgG:配体复合体应用由胰蛋白酶在PBS或HBS中形成的浓度为200～3.1μg/ml的溶液，室温下进行30分钟消化后，相继用PBS或HBS外加洗涤剂、PBS或HBS和最终用水洗涤芯片。应用合适的MALDI-TPF质谱基质后，将芯片直接置入质谱仪内进行分析。
以珠为基础的方法首先是利用NHS生物素化合物使IgG生物素化，摩尔比例为1个IgG4个生物素分子。接着通过凝胶过滤除去未结合的生物素和反应副产物。使生物素化IgG与中性抗生物素蛋白包被的琼脂糖珠结合，以尝试最大程度地捕捉IgG。接着将等分试样的IgG包被珠分配进入浓缩器旋转柱内，用Dulbecco的PBS+0.05％Tween20洗涤后将其重悬浮于Dulbecco的PBS+0.05％Tween 20中。用脉冲输送IL-13，使其与重悬浮IgG珠接触，进行10分钟结合后，通过离心除去液相，用Dulbecco的PBS+0.05％Tween 20洗涤珠后，将其重悬浮于Dulbecco的PBS+0.05％Tween 20中。接着通过用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶于室温或37℃温育，使该珠:IgG:配体复合体蛋白水解。接着再次用Dulbecco的PBS+0.05％Tween 20洗涤珠，再用Dulbecco的不含洗涤剂的PBS进一步洗涤。然后将珠重悬浮于水、乙腈、三氟乙酸混合液中，回收上清液。通过MALDI-TOF质谱或逆相HPLC质谱法，以不同方式进行分析，包括利用ThermoQuest LCQ EST离子阱质谱仪进行串联(ms/ms)片段化。接着尝试使由上所获的片段化样品与人IL-13序列和BAK502G9IgG的独立重和轻链序列匹配。
该试验性测序期间，应用了许多对照，主要是空白表面、单独的IgG和同种型对照，以证实所鉴定的肽特异性地来源自IgG所捕捉的IL-13，而不是消化BAK502G9或非特异性结合IL-13的产物。
结果该试验系列的每次消化均一致地提供了单个IL-13特异性肽。由LCQ离子阱设备获得的数据表明胰蛋白酶解片段的单一同位素质量为3258Da(MH+)，胰凝乳蛋白酶解片段的单一同位素质量为3937Da(MH+)。
将上述质量与计算机模拟消化人IL-13所获正确的单一同位素质量进行比较的结果说明这些酶解片段与该IL-13分子C-末端部分中的相关肽接近匹配。
与胰蛋白酶肽质量3258Da的匹配耐量为1000ppm时，3258Da与从106号位天冬氨酸到132号位C-末端天冬酰胺的序列匹配。该耐量情况下无其它匹配。该区域在下列前体形式的人IL-13的序列中由黑体着重显示。
MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN与胰凝乳蛋白酶肽质量3937Da的匹配耐量为1000ppm时，3937Da与从99号位丝氨酸到132号位C-末端天冬酰胺的序列匹配。该区域在下列前体形式的人IL-13的序列中由黑体着重显示。
MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN上述两种匹配均显示BAK502G9 IgG在所述抗体配体复合体蛋白水解期间仍保留了IL-13分子的C末端部分。
通过ms/ms成功证实了对上述两种肽的鉴定，二者均未显示存在任何可与BAK502G9比拟的显著序列。被调整用于鉴定Y或B离子的ms/ms片段图谱与胰蛋白酶肽中可能存在的104个带一个电荷的离子中的26个匹配，与胰凝乳蛋白酶肽中可能存在的128离子中的19个匹配。对所有电荷状态的观察显示鉴定了胰蛋白酶片段所含27个氨基酸残基中的23个，和胰凝乳蛋白酶片段所含33个残基中的29个。这足以证实同一性。
该试验性测序大体鉴定了位于人IL-13上的部分BAK502G9表位，即属于27个C末端氨基酸残基的部分。这些结果证实了利用上文详述的分子方法时的发现。
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表1
表1(续)
表2抗人IL-13抗体的结合特异性
表3a对抗人IL-13抗体的动力学分析
表3b对抗鼠IL-13抗体的动力学分析
表4BAK502G9在4只单次接受静脉内施用剂量为10mg/kg的集合药团29天后具有变应性但未被激发的猕猴(2雄/2雌)体内的药物代谢动力学。血清中的BAK502G9水平通过ELISA测定(平均值)。
Vdinf＝0-无限长时间内的分配体积，根据外推AUC计算。
Clinf＝0-无限长时间内的清除率，根据外推AUC计算。
AUCinf＝0-无限长时间内的曲线(总药物接触的量)下方面积，包括以清除速率常数(k)和最后观测到的血清药物浓度为基础的外推范围。
AUCext＝外推总AUC的百分比。
T0.5＝清除期末期的药物半衰期。
表5第一组嵌合构建体
表6第二组嵌合构建体
表7BAK502G9对不同预定终点的影响
对I期表现了AHR(PC30)的21只动物和另外一只具有抗原引发表型的动物进行H期测试(共22只)。同时根据AUC和PC30的测定结果可知并非所有动物均有AHR。AHR结果仅包括了在I期表现了AHR并且其AHR在I期和II期均获得评估的动物。统计学测试利用InStat进行。测试是针对虚假设进行的双向斯氏t-检验，即终点包括0(即与I期相比，II期无变化)；*p＜0.05，*p＜0.01。数据被表示为算术平均值±SEM(n＝14-21)。
a5只动物被AUC分析排除的原因是未在I期表现AHR(AUC加剧)。
另外3只动物被排除的原因是II期呼吸道功能数据采集方面出现了技术错误。
b3只动物被PC30分析排除的原因是II期呼吸道功能数据采集方面出现了技术错误(与a中所述动物相同)。另外一只具有抗原引发表型的动物被排除的原因是未在I期表现PC30AHR。
c2只动物被抗原引发分析排除的原因是I期呼吸道功能数据采集方面出现了技术错误。
d1只动物被BAL分析排除的原因是在研究开始时出现了显著的BAL炎症。
BAK278D6重链CDR1-SEQ ID NO 1NYGLSCDR2-SEQ ID NO 2WISANGDTNYGQEFQGCDR3-SEQ ID NO 3DSSSNWARWFFDLBAK278D6轻链CDR1-SEQ ID NO 4GGNNIGSKLVHCDR2-SEQ ID NO 5DDGDRPSCDR3-SEQ ID NO 6QVWDTGSDPVVBAK502G9重链CDR1-SEQ ID NO 7NYGLSCDR2-SEQ ID NO 8WISANGDTNYGQEFQGCDR3-SEQ ID NO 9DSSSSWARWFFDL轻链CDR1-SEQ ID NO 10GGNIIGSKLVHCDR2-SEQ ID NO 11DDGDRPSCDR3-SEQ ID NO 12QVWDTGSDPVVBAK278D6重链结构域SEQ ID NO 13EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFRNYGLSWVRQAPGQGLEWMGWISANNGDTNYGQEFQGRITMTTETSTNTAHMELRSLRSDDTAVYYCVRDSSSNWARWFFDLWGKGTMVTVSSBAK278D6轻链结构域SEQ ID NO 14SYVLTQPPSVSVAPGQTARIPCGGNNIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDGDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRIDAGDEADYYCQVWDTGSDPVVFGGGTKLTVL
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序列表<110>Cambridge Antibody Technology LimitedMonk，Phillip DJermutus，LutzMinter，Ralph RShorroc k，Celia P<120>针对IL-13的人抗体分子<130>SMWCP6234918<140>PCT/GB2004/003059<141>2004-07-15<150>US 60/487,512<151>2003-07-15<150>US 60/558,216<151>2004-03-31<150>GB 0407315.1<151>2004-03-31<150>US 60/573,791<151>2004-05-24<160>249
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Gly<210>143<211>11<212>PRT<213>人<400>143Val Gly Ala Ala Gly Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr1 5 10<210>144<211>13<212>PRT<213>人<400>144Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Glu1 5 10<210>145<211>7<212>PRT<213>人<400>145Asp Asp Asn Gln Arg Pro Ser1 5<210>146<211>9<212>PRT
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<221>MISC_FEATURE
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<220>
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<221>MISC_FEATURE
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<223>HCDR3式<220>
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<220>
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<223>LCDR1式<220>
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<223>LCDR2式<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>Xaa选自Ser和Thr<400>180Asp Asp Gly Asp Arg Pro Xaa1 5<210>181<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>LCDR3式
<220>
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Gly<210>214<211>17<212>PRT<213>人<400>214Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe Gln1 5 10 15Lys<210>215<211>13<212>PRT<213>人<400>215Asp Ser Asp Ser Ser Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu1 5 10<210>216<211>13<212>PRT<213>人<400>216Asp Ser Thr Ser Ala Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu1 5 10<210>217
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<213>人<400>224Asp Arg Asp Ser Ser Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu1 5 10<210>225<211>11<212>PRT<213>人<400>225Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>226<211>11<212>PRT<213>人<400>226Gly Gly Asn Met Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>227<211>11<212>PRT<213>人<400>227Gly Gly Asn Cys Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10
<210>228<211>11<212>PRT<213>人<400>228Gly Gly Asn Val Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>229<211>11<212>PRT<213>人<400>229Gly Gly Asn Lys Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>230<211>11<212>PRT<213>人<400>230Gly Gly Asn Tyr Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>231<211>11<212>PRT<213>人
<400>231Gly Gly Asn Phe Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>232<211>11<212>PRT<213>人<400>232Gly Gly Asn Arg Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>233<211>11<212>PRT<213>人<400>233Gly Gly Asn Thr Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>234<211>11<212>PRT<213>人<400>234Gly Gly Asn Asn Ile Gly Gly Lys Leu Val His1 5 10<210>235<211>11
<212>PRT<213>人<400>235Gly Gly Asn Ser Ile Gly Ser Arg Leu Val His1 5 10<210>236<211>11<212>PRT<213>人<400>236Gly Gly Asp Asn Ile Gly Gly Lys Leu Val His1 5 10<210>237<211>11<212>PRT<213>人<400>237Gly Gly Asn Ser Ile Gly Gly Lys Leu Val His1 5 10<210>238<211>11<212>PRT<213>人<400>238Gly Gly Asn Ala Ile Gly Ser Lys Leu Val His
1 5 10<210>239<211>11<212>PRT<213>人<400>239Gly Gly Asn Ser Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>240<211>11<212>PRT<213>人<400>240Gly Gly Asn His Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>241<211>11<212>PRT<213>人<400>241Gly Gly Asn Gly Ile Gly Ser Lys Leu Val His1 5 10<210>242<211>11<212>PRT<213>人
<400>242Gly Gly Ser Asn Ile Gly Gly Lys Leu Val His1 5 10<210>243<211>11<212>PRT<213>人<400>243Gly Gly Asn Asn Val Gly Gly Lys Leu Val His1 5 10<210>244<211>11<212>PRT<213>人<400>244Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Arg Leu Val His1 5 10<210>245<211>7<212>PRT<213>人<400>245Asp Asp Gly Asp Arg Pro Thr1 5<210>246
<211>11<212>PRT<213>人<400>246Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Asn Pro Val Val1 5 10<210>247<211>11<212>PRT<213>人<400>247Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Asp Pro Val Ile1 5 10<210>248<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人IL-3和猕猴IL-3之间的共有序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(21，30，62，87，103，120，130)<223>Xaa＝无共有序列<400>248Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly
1 5 10 15Phe Ala Ser Pro Xaa Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Xaa Glu Leu20 25 30Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys35 40 45Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Xaa Tyr Cys50 55 60Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu65 70 75 80Lys Thr Gln Arg Met Leu Xaa Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala85 90 95Gly Gln Phe Ser Ser Leu Xaa Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala100 105 110Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Xaa His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu115 120 125Gly Xaa Phe Asn130<210>249<211>136<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人IL-3和鼠IL-3之间的共有序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4，5，7，9，12，17，19，25，27..32，34，41，46，48)<223>Xaa＝无共有序列
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(49，60，61，63，66，67，69，72，75，77，79，81，84)<223>Xaa＝无共有序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(85，89，91，93，95，96，98..103，107..109，117)<223>Xaa＝无共有序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(119..121，124..126，128，132，134，136)<223>Xaa＝无共有序列<400>249Met Ala Leu Xaa Xaa Thr Xaa Val Xaa Ala Leu Xaa Cys Leu Gly Gly1 5 10 15Xaa Ala Xaa Pro Gly Pro Val Pro Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Leu Xaa Glu Leu Ile Glu Glu Leu Xaa Asn Ile Thr Gln Xaa Gln Xaa35 40 45Xaa Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Xaa Xaa Leu Xaa Ala50 55 60Gly Xaa Xaa Cys Xaa Ala Leu Xaa Ser Leu Xaa Asn Xaa Ser Xaa Cys65 70 75 80Xaa Ala Ile Xaa Xaa Thr Gln Arg Xaa Leu Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa85 90 95Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ser Leu Xaa Xaa Xaa Asp Thr Lys100 105 110Ile Glu Val Ala Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Lys Xaa
115 120 125Leu Phe Arg Xaa Gly Xaa Phe Xaa130 13权利要求
1.针对人IL-13的分离的特异性结合成员，包括由人抗体VH结构域和人抗体VL结构域构成的抗体抗原结合位点，该位点包括一组CDR，即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中VH结构域包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，VL结构域包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR由选自下列的一组CDR组成BAK278D6 CDR组，定义为其中HCDR1具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，HCDR2具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，HCDR3具有如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，LCDR1具有如SEQID NO4所示的氨基酸序列，LCDR2具有如SEQ ID NO5所示的氨基酸序列，LCDR3具有如SEQ ID NO6所示的氨基酸序列，与BAK278D6 CDR组相比含有一处或两处氨基酸取代的CDR组，以及如表1所示各克隆的每个CDR组。
2.权利要求1所述分离的特异性结合成员，其中所述一处或两处取代位于所述CDR内下列残基中的一个或两个上，编号方法采用标准Kabat编号，HCDR1中的31、32、34号位HCDR2中的52、52A、53、54、56、58、60、61、62、64、65号位HCDR3中的96、97、98、99、101号位LCDR1中的26、27、28、30、31号位LCDR2中的56号位LCDR3中的95A、97号位。
3.权利要求2所述分离的特异性结合成员，其中所述一处或两处取代位于下列位置处，并选自下列与各位置对应的已确定的可能取代残基组取代位置 取代残基选自HCDR1中的31号位Q、D、L、G和EHCDR1中的32号位THCDR1中的34号位V、I和FHCDR2中的52号位 D、N、A、R、G和EHCDR2中的52A号位D、G、T、P、N和YHCDR2中的53号位 D、L、A、P、T、S、I和RHCDR2中的54号位 S、T、D、G、K和IHCDR2中的56号位 T、E、Q、L、Y、N、V、A、M和GHCDR2中的58号位 I、L、Q、S、M、H、D和KHCDR2中的60号位 RHCDR2中的61号位 RHCDR2中的62号位 K和GHCDR2中的64号位 RHCDR2中的65号位 KHCDR3中的96号位 R和DHCDR3中的97号位 N、D、T和PHCDR3中的98号位 RHCDR3中的99号位 S、A、I、R、P和KHCDR3中的101号位YLCDR1中的26号位 D和SLCDR1中的27号位 I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H和GLCDR1中的28号位 VLCDR1中的30号位 GLCDR1中的31号位 RLCDR2中的56号位 TLCDR3中的95A号位NLCDR3中的97号位 I。
4.权利要求3所述分离的特异性结合成员，其中相对于BAK278D6CDR组而言的两处取代位于HCDR3的99号残基和LCDR1的27号残基。
5.权利要求4所述分离的特异性结合成员，包括在HCDR3的99号残基和/或在LCDR1的27号残基上存在取代的BAK278D6 CDR组，位于HCDR3 99号残基的取代选自S、A、I、R、P和K，位于LCDR127号残基的取代选自I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H和G。
6.权利要求4所述分离的特异性结合成员，包括在HCDR3 99号残基的N被取代为S和/或LCDR127号残基的N被取代为I的BAK278D6 CDR组。
7.权利要求1-6中任意一项所述分离的特异性结合成员，其中VH结构域的HCDR1、HCDR2和HCDR3位于种系构架内和/或VL结构域的LCDR1、LCDR2和LCDR3位于种系构架内。
8.权利要求7所述分离的特异性结合成员，其中VH结构域的HCDR1、HCDR2和HCDR3位于种系构架VH1 DP14内。
9.权利要求7或8所述分离的特异性结合成员，其中VH结构域的HCDR1、HCDR2和HCDR3位于种系构架VL Vλ33h内。
10.权利要求1-9中任意一项所述分离的特异性结合成员，其结合人IL-13变体，该变体中130号位的精氨酸被取代为谷氨酰胺。
11.权利要求1-10中任意一项所述分离的特异性结合成员，其结合非人灵长类动物IL-13。
12.权利要求11所述分离的特异性结合成员，其中所述非人灵长类IL-13为恒河猴或猕猴IL-13。
13.权利要求8-12中任意一项所述的特异性结合成员，包括BAK502G9 VH结构域(SEQ ID NO15)。
14.权利要求8-13中任意一项所述的特异性结合成员，包括BAK502G9 VL结构域(SEQ ID NO16)。
15.权利要求1-14中任意一项所述的特异性结合成员，与IL-13结合的亲和力等同或高于由BAK502G9 VH结构域(SEQ ID NO15)和BAK502G9 VL结构域(SEQ ID NO16)构成的IL-13抗原结合位点的亲和力，该特异性结合成员的亲和力和抗原结合位点的亲和力的测定条件相同。
16.权利要求1-15中任意一项所述的特异性结合成员，其中和人IL-13。
17.权利要求16所述的特异性结合成员，其中和人IL-13的效价等同或高于由BAK502G9 VH结构域(SEQ ID NO15)和BAK502G9VL结构域(SEQ ID NO16)构成的IL-13抗原结合位点的效价，该特异性结合成员的效价和抗原结合位点的效价的测定条件相同。
18.权利要求1-17中任意一项所述的特异性结合成员，其包括scFv抗体分子。
19.权利要求1-17中任意一项所述的特异性结合成员，其包括抗体恒定区。
20.权利要求19所述的特异性结合成员，包括完整抗体。
21.权利要求20所述的特异性结合成员，其中所述完整抗体为IgG4。
22.权利要求1-21中任意一项所述特异性结合成员的分离的抗体VH结构域。
23.权利要求1-21中任意一项所述特异性结合成员的分离的抗体VL结构域。
24.一种组合物，包括权利要求1-23中任意一项所述的特异性结合成员、抗体VH结构域或抗体VL结构域，以及至少一种附加组分。
25.权利要求24所述的组合物，包括制药可接受赋形剂、媒介物或载体。
26.一种分离的核酸，包括编码权利要求1-23中任意一项所述特异性结合成员或其抗体VH或VL结构域的核苷酸序列。
27.由权利要求26所述核酸体外转化的宿主细胞。
28.制备特异性结合成员或抗体VH或VL结构域的方法，该方法包括在适合生成该特异性结合成员或抗体VH或VL结构域的条件下培养权利要求27所述宿主细胞。
29.权利要求28所述的方法，进一步包括分离和/或纯化所述特异性结合成员或抗体VH或VL可变结构域。
30.权利要求28或29所述的方法，进一步包括将所述特异性结合成员或抗体VH或VL可变结构域配制于包括至少一种附加组分的组合物中。
31.制备对人IL-13具有特异性的抗体抗原结合结构域的方法，该方法包括通过在包括HCDR1、HCDR2和HCDR3的亲本VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸，获得作为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，并任选地将如此所获的VH结构域与一种或多种VL结构域组合，以获得一个或多个VH/VL组合；其中所述亲本VH结构域HCDR1、HCDR2和HCDR3为BAK278D6 HCDR组，其定义为其中HCDR1具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，HCDR2具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，HCDR3具有如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，或者为BAK502G9HCDR组，其定义为其中HCDR1具有如SEQ ID NO7所示的氨基酸序列，HCDR2具有如SEQ ID NO8所示的氨基酸序列，HCDR3具有如SEQ ID NO9所示的氨基酸序列；并对所述作为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，或一种或多种VH/VL组合进行测试，以确定对人IL-13具有特异性的抗体抗原结合结构域。
32.权利要求31所述的方法，其中所述亲本VH结构域氨基酸序列选自SEQ ID NO13和SEQ ID NO15。
33.权利要求31或32所述的方法，其中所述一种或多种VL结构域是通过在包括LCDR1、LCDR2和LCDR3的亲本VL结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸而获得，其中所述亲本VL结构域LCDR1、LCDR2和LCDR3为BAK278D6 LCDR组，其定义为其中的LCDR1具有如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，LCDR2具有如SEQ ID NO5所示的氨基酸序列，LCDR3具有如SEQID NO6所示的氨基酸序列，或者为BAK502G9 LCDR组，其定义为其中LCDR1具有如SEQ ID NO10所示的氨基酸序列，LCDR2具有如SEQ ID NO11所示的氨基酸序列，LCDR3具有如SEQ ID NO12所示的氨基酸序列，所述亲本VL结构域产生一种或多种VL结构域，其中每一种都是亲本VL结构域的氨基酸序列变体。
34.权利要求33所述的方法，其中所述亲本VL结构域氨基酸序列选自SEQ ID NO14和SEQ ID NO16。
35.制备对人IL-13具有特异性的抗体抗原结合结构域的方法，该方法包括通过在包括HCDR1、HCDR2和HCDR3的亲本VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸，获得作为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，并任选地将如此所获的VH结构域与一种或多种VL结构域组合，以获得一种或多种VH/VL组合；其中所述亲本VH结构域HCDR1、HCDR2和HCDR3为BAK167A11 HCDR组，其定义为其中HCDR1具有如SEQ ID NO55所示的氨基酸序列，HCDR2具有如SEQ ID NO56所示的氨基酸序列，HCDR3具有如SEQ ID NO57所示的氨基酸序列，或者为BAK615E3 HCDR组，其定义为其中HCDR1具有如SEQ ID NO153所示的氨基酸序列，HCDR2具有如SEQ ID NO154所示的氨基酸序列，HCDR3具有如SEQ ID NO155所示的氨基酸序列，或者为BAK582F7 HCDR组，其定义为其中HCDR1具有如SEQ ID NO141所示的氨基酸序列，HCDR2具有如SEQ ID NO142所示的氨基酸序列，HCDR3具有如SEQ ID NO143所示的氨基酸序列，或者为BAK612B5 HCDR组，其定义为其中HCDR1具有如SEQ ID NO147所示的氨基酸序列，HCDR2具有如SEQ ID NO148所示的氨基酸序列，HCDR3具有如SEQ ID NO149所示的氨基酸序列；并对上述作为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，或一种或多种VH/VL组合进行测试，以确定对人IL-13具有特异性的抗体抗原结合结构域。
36.权利要求35所述的方法，其中所述亲本VH结构域氨基酸序列选自SEQ ID NO55和SEQ ID NO33。
37.权利要求35或36所述的方法，其中所述一种或多种VL结构域是通过在包括LCDR1、LCDR2和LCDR3的亲本VL结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸而获得，其中所述亲本VL结构域LCDR1、LCDR2和LCDR3为BAK167A11 LCDR组，其定义为其中的LCDR1具有如SEQ ID NO58所示的氨基酸序列，LCDR2具有如SEQ ID NO59所示的氨基酸序列，LCDR3具有如SEQ ID NO60所示的氨基酸序列，或者为BAK615E3 LCDR组，其定义为其中LCDR1具有如SEQ ID NO156所示的氨基酸序列，LCDR2具有如SEQ ID NO157所示的氨基酸序列，LCDR3具有如SEQ ID NO158所示的氨基酸序列，或者为BAK582F7 LCDR组，其定义为其中LCDR1具有如SEQ ID NO144所示的氨基酸序列，LCDR2具有如SEQ ID NO145所示的氨基酸序列，LCDR3具有如SEQ ID NO146所示的氨基酸序列，或者为BAK612B5 LCDR组，其定义为其中LCDR1具有如SEQ ID NO150所示的氨基酸序列，LCDR2具有如SEQ ID NO151所示的氨基酸序列，LCDR3具有如SEQ ID NO152所示的氨基酸序列，所述亲本VL结构域产生一种或多种VL结构域，其中每一种都是亲本VL结构域的氨基酸序列变体。
38.权利要求37所述的方法，其中所述亲本VL结构域氨基酸序列选自SEQ ID NO24和SEQ ID NO34。
39.权利要求31-34中任意一项所述的方法，其中所述作为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域是通过CDR诱变而得以获得。
40.权利要求35-38中任意一项所述的方法，其中所述作为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域是通过CDR诱变而得以获得。
41.权利要求31-40中任意一项所述的方法，进一步包括使IgG、scFv或Fab抗体分子内含有所述抗体抗原结合位点。
42.制备结合人IL-13的特异性结合成员的方法，该方法包括提供编码VH结构域的初始核酸或核酸中各个编码VH结构域的初始所有组成成分，其中所述一个或多个VH结构域含有待取代的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3或者缺乏HCDR1、HCDR2和/或HCDR3编码区；将该初始核酸或初始所有组成成分与编码HCDR1(SEQ ID NO1)或HCDR1(SEQ ID NO7)、HCDR2(SEQ ID NO2)或HCDR2(SEQ ID NO8)和/或HCDR3(SEQ ID NO3)或HCDR3(SEQ IDNO9)的氨基酸序列或通过所述氨基酸序列突变所生成的供体核酸组合，使该供体核酸被插入初始核酸或初始所有组成成分的CDR1、CDR2和/或CDR3区内，从而获得编码VH结构域的核酸的产物所有组成成分；使该产物所有组成成分的核酸表达，以获得产物VH结构域；任选地将该产物VH结构域与一种或多种VL结构域组合；筛选对人IL-13具有特异性的特异性结合成员，该特异性结合成员包括了产物VH结构域并任选包括VL结构域；并回收该特异性结合成员或其编码核酸。
43.权利要求42所述的方法，其中所述供体核酸是通过所述HCDR1和/或HCDR2的突变而得以生成。
44.权利要求42所述的方法，其中所述供体核酸是通过HCDR3的突变而得以生成。
45.权利要求44所述的方法，包括通过使编码HCDR3(SEQ IDNO3)或HCDR3(SEQ ID NO9)的氨基酸序列的核酸突变以获得所述供体核酸。
46.权利要求42所述的方法，包括通过核酸的随机突变以获得供体核酸。
47.权利要求42-46中任意一项所述的方法，进一步包括使被回收的特异性结合成员内所包括的产物VH结构域与抗体恒定区相连。
48.权利要求42-46中任意一项所述的方法，包括提供含有上述产物VH结构域和VL结构域的IgG、scFv或Fab抗体分子。
49.权利要求31-48中任意一项所述的方法，进一步包括测试结合人IL-13的抗体抗原结合结构域或特异性结合成员中和人IL-13的能力。
50.权利要求49所述的方法，其中获得了含有结合并中和人IL-13的抗体片段的特异性结合成员。
51.权利要求50所述的方法，其中所述抗体片段为scFv抗体分子。
52.权利要求50所述的方法，其中所述抗体片段为Fab抗体分子。
53.权利要求51或52所述的方法，进一步包括使完整抗体含有上述抗体片段的VH结构域和/或VL结构域。
54.权利要求31-53中任意一项所述的方法，进一步包括将结合IL-13的特异性结合成员、抗体抗原结合位点，或者结合IL-13的特异性结合成员或抗体抗原结合位点的抗体VH或VL可变结构域配制于包括至少一种附加组分的组合物中。
55.权利要求31-54中任意一项所述的方法，进一步包括使结合人IL-13的特异性结合成员与IL-13或IL-13的片段结合。
56.一种方法，包括使权利要求1-21中任意一项所述的结合IL-13的特异性结合成员与人IL-13或IL-13的片段结合。
57.权利要求55或56所述的方法，其中所述结合发生在体外。
58.权利要求55-57中任意一项所述的方法，包括确定特异性结合成员与IL-13或IL-13的片段的结合量。
59.权利要求31-58中任意一项所述的方法，进一步包括所述特异性结合成员在制备用于治疗选自哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化、炎症性肠病和何杰金氏淋巴瘤的疾病或失调的药物中的用途。
60.权利要求1-21中任意一项所述特异性结合成员在制备用于治疗选自哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化、炎症性肠病和何杰金氏淋巴瘤的疾病或失调的药物中的用途。
61.治疗选自哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化和何杰金氏淋巴瘤的疾病或失调的方法，该方法包括对患有该疾病或失调或存在出现该疾病或失调危险的患者施用权利要求1-21中任意一项所述的特异性结合成员。
62.针对人IL-13的分离的特异性结合成员，包括由人抗体VH结构域和人抗体VL结构域构成的抗体抗原结合结构域位点，该位点包括一组CDR，即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中VH结构域包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，VL结构域包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列具有下式HX1HX2GHX3S其中HX1选自N、Q、D、L、G和E，HX2选自Y和T，HX3选自V、I、F和L，HCDR2的氨基酸序列具有下式W I HX4HX5HX6HX7G HX8T HX9Y HX10HX11HX12F HX13HX14其中HX4选自S、D、N、A、R、G和E，HX5选自A、D、G、T、P、N和Y，HX6选自N、D、L、A、P、T、S、I和R，HX7选自N、S、T、D、G、K和I，HX8选自D、T、E、Q、L、Y、N、V、A、M和G，HX9选自N、I、L、Q、S、M、H、D和K，HX10选自G和R，HX11选自Q和R，HX12选自E、K和G，HX13选自Q和R，HX14选自G和K，HCDR3的氨基酸序列具有下式D HX15HX16HX17HX18W A R W HX19F HX20L其中HX15选自S、R和D，HX16选自S、N、D、T和P，HX17选自S和R，HX18选自S、N、A、I、R、P和K，HX19选自F和Y，HX20选自D和Y，LCDR1的氨基酸序列具有下式G G LX1LX2LX3G LX4LX5L V H其中LX1选自N、D和S，LX2选自N、I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H和G，LX3选自I和V，LX4选自S和G，LX5选自K和R，LCDR2的氨基酸序列具有下式D D G D R P LX6其中LX6选自S和T，LCDR3的氨基酸序列具有下式Q V W D T G S LX7P V LX8其中LX7选自D和N，LX8选自V和I。
63.权利要求62所述分离的特异性结合成员，其中HX1选自D和N，HX2为Y，HX3为L，HX4选自S和G，HX5选自T和A，HX6为N，HX7选自N和I，HX8为D，HX9选自N、D和K，HX10为G，HX12选自E和G，HX13为Q，HX19为F，LX1选自N和S，LX2选自N、Y、T、S和I，LX6为S，LX7为D。
64.权利要求62所述分离的特异性结合成员，其中HX1选自N和D，HX2为Y，HX3为L，HX4选自S和G，HX5选自A和T，HX6为N，HX7为N，HX8选自D和G，HX9选自I、S、N和D，HX11为Q，HX12为E和K，HX14为G，HX15为S，HX16选自S和N，HX17为S，HX18选自S和N，HX19为F，HX20为D，LX1选自N和D，LX3为I，LX8为V。
65.权利要求62所述分离的特异性结合成员，其中HX7选自N、S、T、D、G和K，HX8选自D、T、E、Q、L、Y、N、V、A、M，HX9选自N、I、L、Q、S、M和H，HX10为G，HX11为Q，HX12为F，HX13为Q，HX14为G，HX15为S，HX16选自N和S，HX17为S，HX18选自N和S，HX19为F，HX20为D，LX1为N，LX2选自N和I，LX3为I，LX4为S，LX5为K，LX6为S，LX7为D，LX8为V。
66.权利要求65所述分离的特异性结合成员，其中HX1选自N、Q和D，HX3选自L、V和I，HX4选自S、N、A和R，HX5选自A、D、T、G、N和Y，HX6选自N、A、P、S、D和I，HX7选自N、T、D和G，HX8选自D、Q、Y和N，HX9选自N、Q、S和I。
67.权利要求62-66中任意一项所述的特异性结合成员，其中和人IL-13。
68.权利要求67所述特异性结合成员，其中和人IL-13的效价等同或高于由BAK502G9 VH结构域(SEQ ID NO15)和BAK502G9 VL结构域(SEQ ID NO16)构成的IL-13抗原结合位点的效价，该特异性结合成员的效价和抗原结合位点的效价的测定条件相同。
69.权利要求62-68中任意一项所述的特异性结合成员，其包括scFv抗体分子。
70.权利要求62-68中任意一项所述的特异性结合成员，其包括抗体恒定区。
71.权利要求70所述的特异性结合成员，其包括完整抗体。
72.权利要求71所述的特异性结合成员，其中所述完整抗体为IgG4。
73.权利要求62-72中任意一项所述分离的特异性结合成员，其结合人IL-13变体，该变体中130号位的精氨酸被取代为谷氨酰胺。
74.权利要求62-72中任意一项所述分离的特异性结合成员，其结合非人灵长类动物IL-13。
75.权利要求74所述分离的特异性结合成员，其中所述非人灵长类动物IL-13为恒河猴或猕猴IL-13。
76.权利要求62-75中任意一项所述特异性结合成员的分离的抗体VH结构域。
77.权利要求62-75中任意一项所述特异性结合成员的分离的抗体VL结构域。
78.一种包括权利要求62-77中任意一项所述特异性结合成员、抗体VH结构域或抗体VL结构域，以及至少一种附加组分的组合物。
79.权利要求78所述的组合物，包括制药可接受赋形剂、媒介物或载体。
80.一种分离的核酸，包括编码权利要求62-77中任意一项所述特异性结合成员或其抗体VH或VL结构域的核苷酸序列。
81.由权利要求80所述核酸体外转化的宿主细胞。
82.制备特异性结合成员或抗体VH或VL结构域的方法，该方法包括在适合生成该特异性结合成员或抗体VH或VL结构域的条件下培养权利要求81所述宿主细胞。
83.权利要求82所述的方法，进一步包括分离和/或纯化所述特异性结合成员或抗体VH或VL可变结构域。
84.权利要求82或83所述的方法，进一步包括将所述特异性结合成员或抗体VH或VL可变结构域配制于包括至少一种附加组分的组合物中。
85.权利要求82-84中任意一项所述的方法，进一步包括使结合人IL-13的特异性结合成员与IL-13或其片段结合。
86.一种方法，包括使权利要求62-75中任意一项所述结合IL-13的特异性结合成员与人IL-13或其片段结合。
87.权利要求85或86所述的方法，其中所述结合发生在体外。
88.权利要求85-87中任意一项所述的方法，包括确定特异性结合成员与IL-13或IL-13的片段的结合量。
89.权利要求82-84中任意一项所述的方法，进一步包括所述特异性结合成员在制备用于治疗选自哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化、炎症性肠病和何杰金氏淋巴瘤的疾病或失调的药物中的用途。
90.权利要求62-75中任意一项所述特异性结合成员在制备用于治疗选自哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化、炎症性肠病和何杰金氏淋巴瘤的疾病或失调的药物中的用途。
91.治疗选自哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化和何杰金氏淋巴瘤的疾病或失调的方法，该方法包括对患有该疾病或失调或存在出现该疾病或失调危险的患者施用权利要求62-75中任意一项所述的特异性结合成员。
全文摘要
特异性结合成员，具体而言，是人抗－IL－13抗体分子，尤其是那些可中和IL－13活性的人抗体分子。在包括哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、纤维化、炎症性肠病和何杰金氏淋巴瘤在内的IL－13相关失调的诊断或治疗中利用抗－IL－13抗体分子的方法。
文档编号A61P19/04GK1852923SQ200480026557
公开日2006年10月25日 申请日期2004年7月15日 优先权日2003年7月15日
发明者P·D·蒙克, L·耶尔穆图斯, R·R·明特, C·P·索罗克 申请人:剑桥抗体科技有限公司