专利名称：改良的抗体分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有抗IL-6受体抗体作为有效成分的药物组合物及其制备方法等。
技术背景
抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因此作为药品而受到关注。其中，有多种 IgG型抗体药物已上市，目前还有多种抗体药物正在开发中(非专利文献1、非专利文献2)。 IL-6是与各种自身免疫疾病、炎症性疾病、恶性肿瘤等有关的细胞因子(非专利文献3)， 作为人源化抗IL-6受体IgGl抗体的T0CILIZUMAB(卜'> 'J ^ W)与IL-6受体进行特异性结合。由于T0CILIZUMAB中和IL-6的生物学作用，因此认为T0CILIZUMAB可以用作类风湿性关节炎等与IL-6有关的疾病的治疗药(专利文献1、2、3、非专利文献4)，在日本 T0CILIZUMAB被承认作为卡斯尔曼病(Castleman’s disease)和类风湿性关节炎的治疗药 (非专利文献5)。
T0CILIZUMAB这样的人源化抗体是第I代抗体药物，将第I代抗体药物改良使药效、便利性、成本得到改善的第2代抗体药物目前正在开发中。作为可适用于第2代抗体药物的技术，人们开发了各种技术，有人报道了提高效应子功能、抗原结合能力、药物动力学、 稳定性的技术或降低免疫原性风险的技术等。作为增强药效或者减少给药量的方法，有人报道了通过取代IgG抗体Fe区的氨基酸来增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC活性)或补体依赖性细胞毒性(CDC活性)的技术(非专利文献6)。另外，作为增强抗原结合能力、抗原中和能力的技术，有人报道了亲和力成熟技术(非专利文献7)，通过向可变区的互补性决定区(O)R ;complementarity determining region)等的氨基酸中导入突变，可以增强与抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力，可以提高在体外的生物活性、或者减少给药量， 还可以进一步提高在体内的药效(非专利文献8)。目前，发挥优于抗RSV抗体的第一代药物、即帕利珠单抗(Palivizumab)的效果的莫维珠单抗(Motavizumab)(利用亲和力成熟技术制作)的临床试验正在进行(非专利文献9)。在抗IL-6受体抗体中，有人报道了比 T0CILIZUMAB的亲和力强的、亲和力为约0.05nM的抗体(专利文献4)，但具有强于0.05nM 的亲和力的人抗体或人源化抗体或嵌合抗体未见报道。
目前的抗体药物所面临的问题有:给药蛋白量非常多所导致的高制造成本。就人源化抗IL-6受体IgGl抗体、即T0CILIZUMAB而言，给药量也设定为8mg/kg/月左右的静脉内注射(非专利文献4)。关于给药方式，当为慢性自身免疫疾病时，优选皮下给药制剂。通常皮下给药制剂必需是高浓度制剂，当为IgG型抗体制剂时，从稳定性等方面考虑，通常认为100mg/mL左右的制剂是极限(非专利文献10)。为了能够发挥持续的治疗效果，通过延长抗体的血浆中半衰期来减少给药蛋白量、赋予高稳定性，从而可以以长给药间隔进行皮下给药，可以提供成本低且便利性高的 第2代抗体药物。
在抗体的药物动力学方面，FcRn参与较多，关于抗体同种型间的血浆中半衰期的不同，已知IgGl和IgG2的血浆中半衰期最优异，而IgG3和IgG4比它们差(非专利文献 11)。作为进一步提高血浆中半衰期优异的IgGl和IgG2抗体的血浆中半衰期的方法，有人报道了增强与FcRn的结合的恒定区的氨基酸取代(非专利文献12、13)。另外，从免疫原性的角度考虑，与恒定区相比，更希望通过可变区的氨基酸取代来进一步提高血浆中半衰期 (专利文献5)，但迄今为止未见通过修饰可变区来提高IL-6受体抗体的血浆中半衰期的报道。
开发生物药品时，最重要的一个问题是免疫原性。通常，小鼠抗体通过人源化而使免疫原性降低。通过在人源化时的模板构架中使用种系(9 ' 一 K 7 -11 germline)序列，可以进一步降低免疫原性的风险(非专利文献14)。但即使是作为完全人抗TNF抗体的阿达木单抗(Adalimumab),也显现高频率(13 17% )免疫原性,在显现出免疫原性的患者中发现治疗效果下降(非专利文献15、16)。即使是人抗体，也有可能在CDR中存在T细胞表位，CDR上的T细胞表位有可能成为免疫原性的原因。有人报道了在计算机芯片上或者在体外预测T细胞表位的方法(非专利文献17、18)，认为通过除去采用上述方法预测的 T细胞表位，可以降低免疫原性风险(非专利文献19)。
作为人源化抗IL-6受体IgGl抗体的T0CILIZUMAB是将小鼠PMl抗体人源化得到的IgGl抗体。H链、L链分别使用人NEW、人REI的序列作为模板构架进行CDR嫁接，但作为对保持活性重要的氨基酸，有5个氨基酸作为小鼠序列残留在构架中(非专利文献20)。迄今为止尚无在不使作为人源化抗体的T0CILIZUMAB的构架中残留的小鼠序列活性降低的情况下进行完全人源化的报道。另外，T0CILIZUMAB的⑶R序列是小鼠序列，与阿达木单抗一样，在CDR中有可能存在T细胞表位，不能否定免疫原性的风险。在T0CILIZUMAB的临床试验中，在8mg/kg的药效用量时没有确认到抗T0CILIZUMAB抗体的出现，但在4mg/kg和2mg/ kg时确认到了该抗体(专利文献6)。由此认为:在T0CILIZUMAB的免疫原性上还存在改善的空间。但迄今为止尚无有关通过氨基酸取代使免疫原性风险得到改善的T0CILIZUMAB的报道。
TOCILIZUMAB的同种型是IgGl，但同种型的不同即为恒定区序列的不同，认为恒定区的序列对效应子功能、药物动力学、理化性质等有很大影响，所以恒定区序列的选择对抗体药物的开发极为重要(非专利文献11)。近年来，人们非常重视抗体药物的安全性，认为在TGN1412的I期临床试验中发现的重大副作用的原因之一是抗体的Fe部分与Fe Y受体的相互作用(效应子功能)(非专利文献21)。在以中和抗原的生物学作用为目的的抗体药物中，不必与对ADCC等的效应子功能重要的Fe Y受体结合，从副作用方面考虑，认为可能也宁可不优选与Fe Y受体的结合。作为降低与Fe Y受体结合的方法，有将IgG抗体的同种型由IgGl变为IgG2或IgG4的方法(非专利文献22)，但从与Fe Y受体I的结合和药物动力学方面考虑，与IgG4相比更优选IgG2(非专利文献11)。T0CILIZUMAB的同种型是 IgGl、即IL-6受体中和抗体，所以在不需要ADCC等的效应子功能、而考虑副作用的可能性时，认为同种型还有可能优选IgG2。
另一方面，在开发抗体作为药品时，其蛋白质的理化性质、其中均匀性和稳定性极为重要，有报道称:IgG2同种型其来自铰链区的二硫键的异质性(he terogeneity)非常多 (非专利文献23)。在维持来源于此的目标物质/相关物质的异质性的制造间差的同时作为药品进行大量制造并不容易，考虑到成本增加的关系，优选尽可能是单一物质。并且作为抗体H链C末端序列的异质性，有人报道了:由C末端氨基酸的赖氨酸残基的缺失、和C末端的2个氨基酸的甘氨酸、赖氨酸的缺失引起的C末端羧基的酰胺化(非专利文献24)，开发IgG2同种型的抗体作为药品时，希望在维持高稳定性的同时降低上述异质性。为了制作便利性优异的、稳定的高浓度皮下给药制剂，希望不仅稳定性高、而且血浆中半衰期也较 T0CILIZUMAB的同种型、即IgGl优异。但迄今为止尚无与IgG2同种型的恒定区的抗体有关的异质性下降、具有高稳定性、具有优于IgGl同种型的恒定区抗体的血浆中半衰期的恒定区序列的报道。
本发明的在先技术文献如下。
专利文献1:W092/19759
专利文献2:W096/11020
专利文献3:W096/12503
专利文献4:W02007/143168
专利文献5:W02007/114319
专利文献6:W02004/096273
非专利文献1: Janice M Reichert，Clark J Rosensweig, Laura B Faden&Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic，Nature Biotechnology 23， 1073-1078(2005).
非专利文献2:Pavlou AKiBelsey MJ.,The therapeutic antibodies market to 2008.，Eur J Pharm Biopharm.2005 Apr ；59 (3):389-96.
非专利文献3 ；Nishimoto N，Kishimoto T.，Interleukin 6:from bench to bedside.，Nat Clin Pract Rheumatol.2006 Nov ；2 (11):619-26.
非专利文献4:Maini RN, Taylor PC, Szechinski J，Pavelka K，Broil J，Balint G，Emery P，Raemen F，Petersen J，Smolen J，Thomson D，Kishimoto T ；CHARISMA Study Group.， Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist,TociIizumab, in European patients with rheumatoid arth`ritis who had an incomplete response to methotrexate.，Arthritis Rheum.2006 Sep ； 54(9):2817-29.
非专利文献5 ；Nishimoto N，Kanakura Y，Aozasa K，Johkoh T，Nakamura M， Nakano S，Nakano N， Ikeda Y，Sasaki T，Nishioka K，Hara M，Taguchi H，Kimura Y，Kato Y， Asaoku H， Kumagai S， Kodama F， Nakahara H， Hagihara K， Yoshizaki K， Kishimoto T.Humanized ant1-1nterleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease.Blood.2005 Oct 15 ； 106 (8):2627-32.
非专利文献6:Kim SJ, Park Y，Hong HJ.，Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies.，Mol Cells.2005Aug 31 ；20 (I):17-29.Review.
非专利文献7 ；Rothe A，Hosse RJ，Power B E.Ribosome display for improved biotherapeutic molecules.Expert Opin Biol Ther.2006 Feb ；6 (2):177-87.
非专利文献8:Rajpal A，Beyaz N，Haber L, Cappuccilli G，Yee H，Bhatt RR,
权利要求
1.下述(ar(f)中任一项所述的多肽:(a)多肽，该多肽包含具有SEQID NO:1的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO: 2的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO: 3 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO:1 为 VH4-M73 的 CDRUSEQ ID NO: 2 为 VH4-M73 的 CDR2、SEQ ID NO: 3 为 VH4-M73 的 CDR3 ；(b)多肽，该多肽包含具有SEQID NO: 4的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO: 5的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO: 6 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO: 4 为 VH3-M73 的 CDR1、SEQ ID NO: 5 为 VH3-M73 的 CDR2、SEQ ID NO: 6 为 VH3-M73 的 CDR3 ；(c)多肽，该多肽包含具有SEQID NO: 7的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO: 8的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO: 9 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO: 7 为 VH5-M83 的 CDRUSEQ ID NO: 8 为 VH5-M83 的 CDR2、SEQ ID NO: 9 为 VH5-M83 的 CDR3 ；(d)多肽，该多肽包含具有SEQID NO: 10的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO: 11的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO: 12 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO: 10 为 VLl 的 CDRUSEQ ID NO: 11 为 VLl 的 CDR2、SEQ ID NO: 12 为 VLl 的 CDR3 ；(e)多肽，该多肽包含具有SEQID NO: 13的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO: 14的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO: 15 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO: 13 为 VL3 的 CDRUSEQ ID NO: 14 为 VL3 的 CDR2、SEQ ID NO: 15 为 VL3 的 CDR3 ；(f)多肽，该多肽包含具有SEQID NO: 16的序列的CDRl、具有SEQ ID NO: 17的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO: 18 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO: 16 为 VL5 的 CDRl、SEQ ID NO: 17 为 VL5 的 CDR2、SEQ ID NO: 18 为 VL5 的 CDR3。
2.下述任一项所述的抗体:(a)抗体，该抗体包含重链可变区及轻链可变区，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:1的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO: 2的序列的⑶R2和具有SEQ ID NO: 3的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO:1 为 VH4-M73 的 CDRl、SEQ ID NO: 2 为 VH4-M73 的 CDR2、SEQ ID NO: 3 % VH4-M73 的 CDR3 ；所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO: 10的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO: 11的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO: 12 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO: 10 为 VLl 的 CDRl、SEQ ID NO: 11 为 VLl 的 CDR2、SEQ ID NO: 12 为 VLl 的 CDR3 ；(c)抗体，该抗体包含重链可变区及轻链可变区，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO: 7的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO: 8的序列的⑶R2和具有SEQ ID NO: 9的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO: 7 为 VH5-M83 的 CDRl、SEQ ID NO: 8 为 VH5-M83 的 CDR2、SEQ ID NO: 9 % VH5-M83 的 CDR3 ；所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO: 16的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO: 17的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO: 18 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO: 16 为 VL5 的 CDR1、SEQ ID NO: 17 为 VL5 的 CDR2、SEQ ID NO: 18 为 VL5 的 CDR3。
3.下述(ar(f)中任一项所述的可变区:(a)重链可变区， 其中具有SEQID NO: 19的序列，其中SEQ ID NO: 19为VH4-M73的可变区；(b)重链可变区，其中具有SEQID NO: 20的序列，其中SEQ ID NO: 20为VH3-M73的可变区；(c)重链可变区，其中具有SEQID NO: 21的序列，其中SEQ ID NO: 21为VH5-M83的可变区；(d)轻链可变区，其中具有SEQID NO: 22的序列，其中SEQ ID NO: 22为VLl的可变区；(e)轻链可变区，其中具有SEQID NO: 23的序列，其中SEQ ID NO: 23为VL3的可变区；(f)轻链可变区，其中具有SEQID NO: 24的序列，其中SEQ ID NO: 24为VL5的可变区。
4.下述任一项所述的抗体:(a)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO: 19 的序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO: 22的序列，其中，SEQ ID NO: 19为VH4-M73的可变区、SEQ ID NO: 22为VLl的可变区；(c)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO: 21 的序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO: 24的序列，其中，SEQ ID NO: 21为VH5-M83的可变区、SEQ ID NO: 24为VL5的可变区。
5.下述(ar(f)中任一项所述的重链或轻链:(a)重链，i亥重链具有SEQIDNO25的序列，其中SEQIDNO25 为 VH4-M73(b)重链，i亥重链具有SEQIDNO26的序列，其中SEQIDNO26 为 VH3-M73(C)重链，i亥重链具有SEQIDNO27的序列，其中SEQIDNO27 为 VH5-M83(d)轻链，i亥轻链具有SEQIDNO28的序列，其中SEQIDNO28 为 VLl ；(e)轻链，i亥轻链具有SEQIDNO29的序列，其中SEQIDNO29 为 VL3 ；(f)轻链，i亥轻链具有SEQIDNO30的序列，其中SEQIDNO30 为 VL5。
6.下述任一项所述的抗体:(a)抗体，该抗体包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO: 25的序列，所述轻链具有 SEQ ID NO: 28 的序列，其中，SEQ ID NO: 25 为 VH4-M73、SEQ ID NO: 28 为 VLl ;(c)抗体，该抗体包含重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO: 27的序列，所述轻链具有 SEQ ID NO: 30 的序列，其中，SEQ ID NO: 27 为 VH5-M83、SEQ ID NO: 30 为 VL5。`
7.基因，该基因编码权利要求Γ6中任一项所述的多肽。
8.载体，该载体包含权利要求7所述的基因。
9.宿主细胞,该宿主细胞保有权利要求8所述的载体。
10.通过培养权利要求9的宿主细胞来制备权利要求f6中任一项所述的多肽的方法。
11.药物组合物，其中含有权利要求1飞中任一项所述的多肽或按照权利要求10所述的方法制备的多肽。
全文摘要
本发明提供包含优于TOCILIZUMAB的第2代分子的药物组合物以及上述药物组合物的制备方法，所述优于TOCILIZUMAB的第2代分子是指通过修饰人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的氨基酸序列，使抗原中和能力增强、同时提高药物动力学，从而减少给药频率、持续发挥治疗效果，并且使免疫原性、安全性、理化性质(稳定性和均匀性)得到改善。
文档编号A61P29/00GK103254310SQ201310127358
公开日2013年8月21日 申请日期2009年9月25日 优先权日2008年9月26日
发明者井川智之, 石井慎也, 前田敦彦, 樱井实香, 小岛哲郎, 橘达彦, 白岩宙丈, 角田浩行, 樋口义信 申请人:中外制药株式会社