Gitr配体和gitr配体相关分子和抗体及其应用的制作方法

专利名称：Gitr配体和gitr配体相关分子和抗体及其应用的制作方法
本申请要求2003年5月23日提交的美国临时申请系列号60/472,844和2004年2月26日提交的美国临时申请系列号60/547,975的权益，这两个申请以其全文在此引用作为参考。
本发明是在NIH内部研究项目#Z01-AI-000224下由政府支持进行的。政府在本发明中享有一定的权利。
背景技术：
发明领域本发明针对用于诊断、预测、监控由免疫系统失调(例如，自身免疫疾病、炎症、和移植排斥以及癌症和感染性疾病)引起的疾病的进展和治疗所述疾病的新方法，所述免疫系统失调涉及糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)，本发明也针对GITR相关的配体(GITRL)和涉及其的调节子。本发明进一步涉及新的治疗剂和治疗靶，和涉及筛选和估计用于干涉(治疗)和预防疾病的受试化合物的方法，所述疾病由涉及GITR和GITRL的免疫系统失调引起。
相关背景领域通常，T淋巴细胞负责细胞介导的免疫性并且通过增强或抑制其它白细胞而起调节作用。T淋巴细胞抑制免疫应答的概念是众所周知的(参见，例如，Gershon等人(1970)Immunology 18723-35)。然而，这些抑制性细胞的靶抗原和控制其功能的机制仍是研究的主题。
一群在胸腺中产生的调节性T细胞与效应T细胞在独特膜抗原的表达上明显不同。这些调节性T细胞构成共表达CD25抗原的CD4+T细胞(即，表达CD4抗原的T细胞)亚群。CD25也称为白细胞介素-2受体(IL-2R)α链。CD25+T细胞的共转移或重建在各种动物模型中涉及预防炎症损伤和自身免疫(参见，Shevach(2000)Ann.Rev.Immunol.18423-49，以及其引用的参考文献)。CD4+CD25+T细胞也涉及体外T细胞活性的抑制和共培养的CD4+CD25-T细胞的过继性抑制(Shevach，同上)。
二十多年前已证明一些自身反应的T细胞逃避了中枢免疫耐受机制并存在于外周，处于来源于胸腺的调节性T细胞的控制之下。1995年，Sakaguchi和同事证明天然地表达IL-2R(即，CD25)的α链的小群体CD4+T细胞涉及器官特异性自身反应性T细胞的控制(Sakaguchi等人(1995)J.Immunol.1551151-64)。特别地，其证明将CD4+CD25-T细胞转移至免疫缺陷宿主细胞导致一系列自身免疫疾病，所述疾病可通过CD4+CD25+T细胞的共转移进行预防(Sakaguchi等人，同上)。随后的研究已暗示CD4+CD25+调节性T细胞抑制针对病毒、细菌和原生动物感染的免疫应答(Aseffa等人(2002)J.Immunol.1693232-41；Belkaid等人(2002)Nature 420502-07；Hisaeda等人(2004)Nat.Med.1029-30；Kursar等人(2002)J.Exp.Med.1961585-92；Lundgren等人(2003)Infect.Immun.711755-62；Maloy等人(2003)J.Exp.Med.197111-19)。总的说来，这些研究提供了除去CD4+CD25+T细胞增强了免疫应答的证据。为确定这些CD4+CD25+T细胞的活化和由其产生的抑制作用已进行了许多努力。这些细胞代表了在体内和体外都显著地抑制效应T细胞功能的来源于胸腺的细胞的独特谱系。
几个体外研究显示CD4+CD25+细胞通过关闭IL-2转录来抑制对有丝分裂素和抗原作出应答的CD4+细胞的增殖(例如，Thornton和Shevach(1998)J.Exp.Med.188287-96；Takahashi等人(1998)Int.Immunol.101969-80)。在体内与CD4+T细胞一起共转移CD4+CD25+T细胞足以抑制器官特异性自身免疫的诱导和效应期(Suri-Payer等人(1999)Eur.J.Immunol.29669-77；Suri-Payer等人(1998)J.Immunol.1601212-18)。CD4+CD25+T细胞的其它特性包括在缺少外源IL-2的情况下对T细胞受体(TCR)刺激的低应答性、通过细胞-细胞相互作用的免疫抑制和对诱导其抑制性表型(然而，在其被激活后，其抑制性功能是不依赖于抗原性刺激的)的TCR信号传导的需求。已证明只表达CD25(如可通过刺激CD4+CD25-T细胞获得的)不能诱导抑制性表型。已知这些CD4+CD25+T细胞存在于人身上(Shevach(2001)J.Exp.Med.193F1-F6)。
一个研究证明为了产生调节性CD4+CD25+T细胞需要改变胸腺选择(Jordan等人(2001)Nat.Immunol.2301-06)。此外，基因敲除小鼠的研究证明为了产生这些细胞需要涉及IL-2合成和应答的分子；IL2或IL2Rβ或B7.1(CD80)和B7.2(CD86)或CD28遗传缺陷小鼠都具有严重减少的CD4+CD25+细胞，导致在这些小鼠中的一些的外周组织产生淋巴结病和过度增殖(Papiernik等人(1998)Int.Immunol.10371-78；Salomon等人(2000)Immunity 12431-40；Kumanogoh等人(2001)J.Immunol.166353-60)。
直到最近，本领域仍未确定涉及CD4+CD25+介导的免疫系统抑制的机制，例如抗原特异性、涉及抑制获得的分子和涉及抑制的效应期的细胞表面分子或短期作用细胞因子；在调节自身免疫中CD25+T细胞的靶分子仍然远未清楚。通过使用基因芯片对CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞的基因的差异表达进行检查，现已证明存在几种CD25+差异基因(McHugh等人(2002)Immunity 16311-23；也参见专利申请10/194,754，此处以其全文引用作为参考)。这些被确定优选地在CD4+CD25+T细胞中表达的基因可充当治疗性干涉的靶和用于自身免疫疾病、炎症和移植排斥以及癌症和感染性疾病的筛选方法。
值得注意的是，确定为在CD25+细胞中差异表达的其中一个基因是糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)(McHugh等人，同上)。GITR(细胞表面跨膜蛋白受体)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。GITR已被证明组成型地存在于未激活的T细胞(Gavin等人(2002)Nat.Immunol.333-41；McHugh等人，同上；Shimizu等人(2002)Nat.Immunol.3135-42)。GITR结合另一个称作GITR配体(GITRL)的跨膜蛋白。已显示GITR的激动性抗体消除CD4+CD25+T细胞的抑制性活性，证明GITR在调节这些细胞的活性(McHugh等人，同上)上的功能作用。另一个研究确证了用特异性单克隆抗体刺激GITR消除了CD4+CD25+T细胞介导的抑制作用，因此诱导了自身免疫(Shimizu等人，同上)。这些研究已导致提出GITR是CD4+CD25+T细胞更忠实的标记(Uraushihara等人(2003)J.Immunol.171708-16)；然而，单独的GITR表达不能专有地区别该亚型，因为GITR的上调也发生在CD4+CD25-T细胞活化后(McHugh等人，同上；Shimizu等人，同上)。
因为GITR已显示在CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制活性的调节上十分重要，所以非常想要鉴定和表征与GITR相互作用的新分子。此处公开了这种与GITR相互作用的新分子。此外，也提供了这些分子的调节子。
发明简述本发明提供了新的人GITRL的小鼠同源物的核苷酸和氨基酸序列。本发明也提供了针对小鼠GITRL的抗体。本发明也提供了用于通过诱导激动性GITR-GITRL结合以逆转免疫抑制和通过拮抗GITR-GITRL结合(例如，通过使用抑制GITRL活性(例如，阻止GITR和GITRL之间的相互作用)的中和抗体)来恢复或增强免疫抑制作用的方法。这种逆转或恢复/增强免疫抑制作用在各种由失调的免疫应答引起的疾病的治疗方面是有益的，所述疾病是例如自身免疫疾病、炎症和移植排斥以及癌症和感染性疾病。本发明的方法涉及GITRL和GITR的操作，包括但不限于，小鼠GITRL和GITR和其同源物；在这些同源物中特别包括的是人GITRL和GITR。
本发明提供了分离的和纯化的涉及GITR(GITRL)的新配体的多核苷酸和多肽。本发明也提供了抗GITRL的抗体以及用于治疗、诊断、预测和监控自身免疫疾病、炎症和移植排斥以及癌症和感染性疾病的进展的方法。在本发明的一个实施方案中，在治疗疾病和病症期间，所述公开的方法和分子可用于控制免疫应答的结果，所述疾病包括自身免疫疾病、炎症和移植排斥以及癌症和感染性疾病。在另一个实施方案中，公开的本发明的多核苷酸和多肽可用于恢复或增强免疫系统的抑制作用，所述多核苷酸和多肽通过例如下调GITRL的表达或活性或通过结合GITRL(但不诱导GITR信号传导)从而阻止或抑制GITR和GITRL之间的相互作用。在另一个实施方案中，通过小分子可阻止或抑制GITR和GITRL之间的相互作用。本领域技术人员意识到这些类型的调节(即，这些实施方案)在治疗自身免疫疾病和一些炎症和类似或相关的疾病以及在治疗移植排斥方面是最有益的。在另一个实施方案中，本发明公开的的多核苷酸和多肽可用于逆转、阻断或消除免疫系统的抑制，所述多核苷酸和多肽通过例如上调GITRL的表达或活性或通过促进与GITR结合来诱导GITR信号传导。在另一个实施方案中，GITR和GITRL之间的相互作用可被小分子增强或模拟。本领域技术人员意识到这些类型的调节在治疗癌症和类似疾病以及感染性疾病方面是最有益的。本领域技术人员也意识到将这些新治疗法与已建立的和其它治疗法结合的可能益处。
在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO1或SFQ IDNO3的核苷酸序列的分离核酸分子。在另一个实施方案中，所述核酸分子有效地连接至少一个表达控制序列。在另一个实施方案中，提供了用所述核酸分子转化或转染的宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的SEQ ID NO1或SEQID NO3的等位基因。在另一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ IDNO3的核苷酸序列的分离的基因。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，所述核酸分子在高严紧条件下特异性地与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中所示核苷酸序列或其互补序列杂交。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白的核酸分子或其编码所述蛋白活性片段的片段。在另一个实施方案中，所述核酸分子或其片段有效地连接至少一个表达控制序列。在另一个实施方案中，提供了用所述分离的有效地连接至少一个表达控制序列的核酸分子或其片段转化或转染的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了非人转基因动物，在所述转基因动物中体细胞和生殖细胞包含所述分离的核酸分子或其片段。在另一个实施方案中，本发明提供了非人转基因动物，在所述转基因动物中体细胞和生殖细胞包含含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核苷酸序列的DNA。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含由分离的核酸编码的氨基酸序列的分离蛋白，所述分离的核酸在高严紧条件下特异性地与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示核苷酸序列或其互补序列杂交。在另一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的分离蛋白或其活性片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含核苷酸序列的分离核酸分子，所述核苷酸序列与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核苷酸序列或其片段互补，其中在细胞中所述核酸分子的表达导致降低的GITRL产量。在另一个实施方案中，所述核酸分子或其片段有效地连接至少一个表达控制序列。在另一个实施方案中，提供了用所述分离的有效地连接至少一个表达控制序列的核酸分子或其片段转化或转染的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了非人转基因动物，在所述转基因动物中体细胞和生殖细胞包含所述分离的核酸分子或其片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了与对应于包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或其片段的核苷酸序列的mRNA互补的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸抑制GITRL的表达。在另一个实施方案中，本发明提供对应于包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或其片段的核苷酸序列的核酸分子的siRNA分子，其中所述siRNA分子抑制GITRL的表达。
在另一个实施方案中，本发明提供了能够特异性地结合包含氨基酸序列的分离蛋白的分离抗体，所述氨基酸序列由在高严紧条件下特异性地与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示核苷酸序列或其互补序列杂交的分离核酸编码。在另一个实施方案中，抗体中和GITRL活性。在另一个实施方案中，所述抗体是具有ATCC号PTA-5336的5F1、或具有ATCC号PTA-5337的10F12。在另一个实施方案中，所述抗体包含5F1或10F12的抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明提供了能够特异性结合包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其活性片段的分离蛋白的分离抗体。在另一个实施方案中，所述抗体中和GITRL的活性。在另一个实施方案中，所述抗体是具有ATCC号PTA-5336的5F1、或具有ATCC号PTA-5337的10F12。在另一个实施方案中，所述抗体包含5F1或10F12的抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了筛选能够抑制或阻止GITRL与GITR相互作用的受试化合物的方法，所述方法包括将包含GITRL和GITR的样品与受试化物接触，并确定相对于没有与所述化合物接触的样品中的GITRL与GITR的相互作用，样品中GITRL与GITR的相互作用是否降低，由此与所述化合物接触的样品中的GITRL与GITR的相互作用的减弱证明所述化合物是抑制或阻止GITRL和GITR相互作用的化合物。在另一个实施方案中，所述经鉴定的化合物用于治疗经诊断具有或处于自身免疫疾病、炎症或移植排斥风险的受试者的方法中，所述方法包括从所述受试者身上分离T细胞，用所述经鉴定的化合物处理所述分离的T细胞和将所述处理的T细胞转移回所述受试者的步骤。在另一个实施方案中，所述经鉴定的化合物用于治疗经诊断具有或处于自身免疫疾病、炎症或移植排斥风险的受试者的方法中，所述方法包括给所述受试者施用所述经鉴定的化合物的步骤。在另一个实施方案中，本发明提供用于估计经鉴定的化合物在受试者中的功效的方法，所述方法包括在给所述受试者施用所述化合物之前检测来自受试者的效应T细胞的第一数目，在给所述受试者施用所述化合物后检测效应T细胞的第二数目，和比较第一和第二数目，由此在与第一数目相比，第二数目中效应T细胞数目的显著减少表明所述化合物在所述受试者中治疗自身免疫、炎症或移植排斥上是有效的。在另一个实施方案中，所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了筛选能够增强或模拟GITRL与GITR相互作用的受试化合物的方法，所述方法包括将包含GITRL和GITR的样品与受试化合物接触，并确定相对于没有与所述化合物接触的样品中的GITRL与GITR的相互作用，样品中GITRL与GITR的相互作用是否增加，由此与所述化合物接触的样品中的GITRL与GITR的相互作用的增加证明了所述化合物是增加或模拟GITRL和GITR相互作用的化合物。在另一个实施方案中，所述经鉴定的化合物用于治疗经诊断具有或处于癌症或感染性疾病的风险的受试者的方法中，所述方法包括从所述受试者中分离T细胞，用所述经鉴定的化合物处理所述分离的T细胞和将所述经处理的T细胞转回所述受试者的步骤。在另一个实施方案中，所述经鉴定的化合物用于治疗经诊断具有或处于癌症或感染性疾病风险的受试者的方法中，所述方法包括将所述经鉴定的化合物给所述受试者施用。在另一个实施方案中，本发明提供了估计所述经鉴定的化合物在受试者中的功效的方法，所述方法包括步骤在给受试者施用所述化合物之前检测来自所述受试者的效应T细胞的第一数目，在给所述受试者施用所述化合物之后，检测来自所述受试者的效应T细胞的第二数目，比较所述第一和第二数目，由此与第一数目相比，在第二数目中T细胞的数目显著增加表明所述化合物在所述受试者中治疗癌症或感染性疾病上是有效的。在另一个实施方案中，所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断受试者自身免疫疾病、炎症或移植排斥的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的GITRL基因产物的受试量，并将所述受试量与来自对照样品的GITRL基因产物的正常量比较，由此受试量显著高于所述正常量在自身免疫疾病、炎症或移植排斥的诊断上提供了阳性标志。在另一个实施方案，本发明提供了用于在受试者中诊断癌症或感染性疾病的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中GITRL基因产物的受试量，并将所述受试量与对照样品GITRL基因产物的正常量进行比较，由此受试量显著低于所述正常量在癌症或感染性疾病的诊断上提供了阳性标志。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗经诊断具有或处于自身免疫疾病、炎症或移植排斥风险的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用GITR拮抗剂。在另一个实施方案中，所述方法包括施用GITR拮抗剂以保持所述受试者中效应T细胞对CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的敏感性(例如，以保持这种敏感性的有效量)。在另一个实施方案中，所述GITR拮抗剂选自中和抗GITRL抗体，中和抗GITR抗体，包含GITR的融合蛋白，包含GITR的活性片段的融合蛋白，拮抗小分子，反义GITRL核酸分子和siRNA GITRL核酸分子。在另一个实施方案中，自身免疫疾病或炎症选自类风湿性关节炎、脑脊髓炎、骨关节炎、多发性硬化、自身免疫性胃炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣和其它炎性皮肤病、I型糖尿病、哮喘、过敏和炎性肠疾病包括克罗恩氏疾病和溃疡性结肠炎。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗经诊断具有或处于癌症或感染性疾病风险的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用GITR激动剂。在另一个实施方案中，所述方法包括施用所述GITR激动剂以使GITR激动剂在所述受试者中提供针对效应T细胞的共刺激信号并使其在所述受试者中不易受CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用(例如，以提供这样的信号的有效量)。在另一个实施方案中，所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、包含GITRL的融合蛋白、包含GITRL活性片段的融合蛋白和激动性GITR抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了诱导含有效应T细胞的细胞群体增殖的方法，所述方法包括给所述细胞群体施用GITR激动剂。在另一个实施方案中，所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、含有GITRL的融合蛋白、含有GITRL活性片段的融合蛋白和激动性GITR抗体。在另一个实施方案中，所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制含有效应T细胞的细胞群体的增殖的方法，所述方法包括给所述细胞群体施用GITR拮抗剂。在另一个实施方案中，所述GITR拮抗剂选自中和抗GITRL抗体、中和抗GITR抗体、含有GITR的融合蛋白、含有GITR活性片段的融合蛋白、拮抗性小分子、反义GITRL核酸分子和siRNA GITRL核酸分子。在另一个实施方案中，所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在另一个实施方案中，所述GITR拮抗剂是5F1或10F12。
在另一个实施方案中，本发明提供了在CD4+CD25+调节性T细胞存在的情况下抑制或阻止对含有效应T细胞的细胞群体的抑制的方法，所述方法包括给所述细胞群体施用GITR激动剂。在另一个实施方案中，所述方法包括施用所述GITR激动剂以使所述GITR激动剂给所述效应T细胞提供共刺激信号并使其不易受CD4+CD25+调节性T细胞的抑制(例如，以有效提供这种信号的量)。在另一个实施方案中，所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、含有GITRL的融合蛋白、含有GITRL活性片段的融合蛋白和激动性GITR抗体。在另一个实施方案中，所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了在CD4+CD25+调节性T细胞存在的情况下抑制含有效应T细胞的细胞群体的方法，所述方法包括给所述细胞群体施用GITR拮抗剂。在另一个实施方案中，所述方法包括施用GITR拮抗剂以维持所述效应T细胞对由所述CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的敏感性(例如，以有效地维持这种敏感性的量)。在另一个实施方案中，所述GITR拮抗剂选自中和抗GITRL抗体、中和抗GITR抗体、含有GITR的融合蛋白、含有GITR活性片段的融合蛋白、拮抗性小分子、反义GITRL核酸分子和siRNA GITRL核酸分子。在另一个实施方案中，所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在另一个实施方案中，所述GITR拮抗剂是5F1或10F12。
在另一个实施方案中，本发明提供了在细胞群体中抑制GITRL表达的方法，所述方法包括用分离的核酸分子处理所述细胞群体，所述核酸分子包含与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其片段，其中在所述细胞中所述核酸分子的表达导致GITRL产量减少。在另一个实施方案中，本发明提供了在细胞群体中抑制GITRL表达的方法，所述方法包括用反义寡核苷酸处理所述细胞群体，所述反义寡核苷酸与对应于包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或其片段的核苷酸序列的mRNA互补，其中所述寡核苷酸抑制GITRL的表达。
在另一个实施方案中，本发明提供了在细胞群体中抑制GITRL表达的方法，所述方法包括用靶向mRNA的siRNA处理所述细胞群体，所述mRNA对应于包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核苷酸序列的分离核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供了在细胞群体中抑制GITRL表达的方法，所述方法包括用靶向mRNA的siRNA处理所述细胞群体，所述mRNA对应于包含与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核苷酸序列互补的核苷酸序列的分离核酸分子。
在另一个实施方案中，本发明提供了在细胞群体中抑制GITRL表达的方法，所述方法包括用针对编码GITRL的核酸分子的反义寡核苷酸处理所述细胞群体。在另一个实施方案中，本发明提供了在细胞中抑制GITRL表达的方法，所述方法包括用靶向编码GITRL的mRNA的siRNA处理所述细胞群体。
在另一个实施方案中，本发明提供了在细胞群体中诱导GITRL表达的方法，所述方法包括通过用分离的核酸分子转化或转染所述细胞群体来处理所述细胞群体，所述分离核酸分子包含SEQ ID NOI或SEQID NO3的核苷酸序列或编码包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白，或用其编码所述蛋白的活性片段的片段转化或转染所述细胞群体，其中所述核酸分子有效地连接至少一个表达控制序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了已在体外或离体状态与GITR激动剂接触的效应T细胞群体。在另一个实施方案中，所述GITR激动剂选自GITRL或GITRL活性片段、含有GITRL的融合蛋白、含有GITRL活性片段的融合蛋白、激动性小分子和激动性抗GITR抗体。在另一个实施方案中，所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗癌症或感染性疾病的方法，所述方法包括获取效应T细胞群体、用GITR激动剂处理所述群体和给患有癌症或感染性疾病的受试者施用所述经处理的群体。在另一个实施方案中，所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL活性片段、含有GITRL的融合蛋白、含有GITRL活性片段的融合蛋白、激动性小分子和激动性抗GITR抗体。在另一个实施方案中，所述受试者患有癌症并且所述经处理的群体被用作肿瘤疫苗。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含GITR激动剂和药物可接受载体的药物组合物。在另一个实施方案中，所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL活性片段、含有GITRL的融合蛋白、含有GITRL活性片段的融合蛋白、激动性小分子和激动性抗GITR抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含GITR拮抗剂和药物可接受载体的药物组合物。在另一个实施方案中，所述GITR拮抗剂选自中和抗GITRL抗体、中和抗GITR抗体、含有GITR的融合蛋白、含有GITR活性片段的融合蛋白、拮抗性小分子、反义GITRL核酸分子和siRNAGITRL核酸分子。在另一个实施方案中，所述抗体包含5F1或10F12的抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含GITR激动剂和抗原的疫苗佐剂，所述抗原选自病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、癌症抗原、肿瘤相关抗原和其片段。在另一个实施方案中，所述GITR激动剂选自GITRL或GITRL的活性片段、含有GITRL的融合蛋白、含有GITRL活性片段的融合蛋白、激动性小分子和激动性抗GITR抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含GITR拮抗剂和抗原的疫苗佐剂，所述抗原选自自身抗原、淀粉状肽蛋白、同种抗原、移植抗原、过敏原和其片段。在另一个实施方案中，所述GITR拮抗剂选自中和抗GITRL抗体、中和抗GITR抗体、含有GITR的融合蛋白、含有GITR活性片段的融合蛋白、拮抗性小分子、反义GITRL核酸分子和siRNAGITRL核酸分子。在另一实施方案中，所述抗体包含5F1或10F12的抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了筛选能够中和GITRL活性的受试化合物的方法，所述方法包括将含有GITRL和中和抗体的样品与所述化合物接触，并确定相对于在没有与所述化合物接触的样品中的GITRL与所述中和抗体的相互作用，所述样品中的GITRL与所述中和抗体的相互作用是否减弱，由此在与所述化合物接触的样品中的GITRL与中和抗体相互作用的减弱确定了所述化合物是抑制或阻止GITRL与所述中和抗体相互作用的化合物。在另一个实施方案中，所述抗体是5F1或10F12。
在另一个实施方案中，本发明提供了给包含效应T细胞的细胞群体提供共刺激信号的方法，所述方法包括施用GITR激动剂。在另一个实施方案中，所述GITR激动剂选自GITRL或GITRL活性片段、含有GITRL的融合蛋白、含有GITR活性片段的融合蛋白、和激动性抗GITR抗体。在另一个实施方案中，所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
附图简述

图1表示小鼠(m)和人(h)GITRL的氨基酸序列的比对(基于BLOSUM62氨基酸替代矩阵；参见Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-19)。
图2表示关于GITRLGITR结合对CD4+CD25+T细胞增殖的影响的实验结果。测量胸苷整合作用(cpm)作为估计细胞增殖的方法。图2A表示激动性抗GITR抗体刺激CD4+CD25+T细胞的增殖，但不刺激CD4+CD25-T细胞增殖。图2B表示表达GITRL的YB2/0细胞刺激CD4+CD25+细胞的增殖。
图3A表示由YB2/0细胞(～50,000)表达的GITRL和激动性抗GITR抗体(2μg/ml)逆转由新分离的CD4+CD25+抑制性T细胞(#抑制剂)产生的抑制作用(即，负百分比抑制作用)。图3B显示数目少于50,000(即，～3,000-25,000)的GITRL-YB2/0细胞以剂量依赖性形式能够部分地逆转抑制作用。
图4表示当用激活的CD4+CD25+T细胞取代新分离的CD4+CD25+T细胞时GITRL-YB2/0细胞(～50,000)不能逆转抑制作用；用激动性抗GITR抗体可获得类似的结果。
图5A和5B表示在抗GITRL抗体(“抗GITRL”＝5F1抗体)存在的情况下GITRL诱导的对新分离的CD4+CD25+T细胞产生的抑制作用的逆转可自行发生逆转。图5B包括另外的显示对照抗体(“对照Ig”)不能恢复抑制作用的实验。
图6表示抗GITRL抗体只能在CD4+CD25+T细胞存在的情况下增强抑制作用。图6A表示在抗GITRL抗体(5F1)存在的情况下淋巴结细胞的增殖受到抑制。图6B表示当在淋巴结细胞群体中除去CD4+CD25+T细胞时抗GITRL抗体缺乏抑制活性。
图7表示GITRL表达细胞在淋巴组织中的分布。图7A通过用抗CD4、抗CD8和抗GITRL抗体染色对用磁珠从BALB/c小鼠的脾脏中富集的CD11c+细胞进行流式细胞分析。通过比较用抗GITRL抗体(填充直方图)染色的CD4+、CD8+和CD4-CD8-亚-型(分别对应上、中、下直方图)的荧光强度和用同种型对照抗体(未填充直方图)染色的这些细胞的荧光强度来确定GITRL表达。图7B通过用抗GITRL mAb(填充直方图)或同种型对照抗体(未填充直方图)对新分离的BALB/c CD11c+脾DCs(上部直方图)和CD11clowB220+浆细胞DCs(下部直方图)染色和进行流式细胞分析来确定脾脏树突状细胞(DCs)和B-1B细胞进行的GITRL表达。图7C(上部直方图)将抗GITRL抗体染色的CD11b+B220+-型腹膜(perC)B-1B细胞(实线未填充直方图)和所有脾细胞中的B220+B细胞的荧光强度(填充直方图)与用同种型对照(虚线未填充直方图)染色的细胞的荧光强度进行比较。图7C(下部直方图)表示抗GITRL抗体染色的(填充直方图)和同种型抗体染色的(未填充直方图)perC巨噬细胞(CD11b+B220-细胞)的荧光强度比较。图7D胸腺细胞因表达CD4、CD8被用GITRL或同种型对照而染色。将抗GITRL抗体(填充直方图)染色的CD4+CD8-(左上象限)、CD4+CD8+(右上象限)和CD4-CD8+(右下象限)细胞的荧光强度与同种型对照抗体(未填充直方图)染色的这些细胞的荧光强度进行比较。图7E通过比较抗GITRL抗体(填充直方图)染色的这些细胞的荧光强度与同种型对照抗体(未填充直方图)染色的这些细胞的荧光强度来确定CD44+CD25-(R1)、CD44+CD25+(R2)、CD44-CD25+(R3)或CD44-CD25-(R4)型胸腺前体的GITRL表达。图7F用抗CD4、抗CD8、抗CD25和/或抗GITRL抗体对未经刺激的淋巴节细胞进行染色。对CD4+CD8-细胞(左上象限)而不是CD4-CD8+细胞(右下象限)就这些细胞的CD25的表达进一步进行描述。CD4+CD8-CD25-(右上直方图)、CD4+CD8-CD25+(右下方直方图)或CD4-CD8+(下部(中间)直方图)-型淋巴结细胞的GITRL表达可通过将这些用抗GITRL抗体(填充直方图)染色的细胞的荧光强度与这些用同种型对照抗体(未填充直方图)染色的细胞的荧光强度比较来确定。结果来自5个独立的实验。
图8表示经刺激后由APCs产起的GITRL的下调。图8A在用polyIC(10μg/ml)、LPS(0.5μg/ml)、CpGs(ODN 1826，1μM)、抗CD40和IL-4(分别10μg/ml和20ng/ml)和抗IgM(山羊抗IgMμ链的抗IgM F(ab′)2片段，1μg/ml)处理后确定纯化的脾B220+B细胞或总腹膜(PerC)B220+CD11b+B-1 B细胞在不同时间点的GITRL表达。展示了抗GITRL染色的经刺激的细胞(填充直方图)、抗GITRL染色的未经刺激的(培养基)细胞(实线未填充直方图)和同种型对照抗体染色的细胞(虚线未填充直方图)的荧光强度。图8B在48小时培养期过后，将存在于用抗CD3 mAb(0.5μg/ml)处理的全部脾细胞中的B220+B细胞(填充直方图)的GITRL表达与未经刺激的B220+B细胞(实线未填充直方图)和用同种型对照抗体(虚线未填充直方图)染色的B220+B的GITRL表达进行比较。图8C在用或不用LPS(0.5μg/ml)培养后在所示的时间点上纯化的CD11c+DCs的GITRL(上方填充直方图)和B7.2(即，CD86)(下方填充直方图)的表达。图8D在可溶性抗cD3 mAb(0.5μg/ml)存在或不存在的情况下在48小时培养期后，类型为CD4+或CD8+表达细胞的总脾脏细胞的GITRL表达。图表来自2至4个独立的实验；用分离自BALB/c小鼠的组织进行所有实验。
图9验证了阻止GITR/GITRL的相互作用对脾细胞增殖的抑制作用的影响。对于图9A和9B，标尺表示s.d.值。图9A在用不同浓度的可溶性抗CD3(x轴)培养72小时后来确定在CD25+细胞存在或不存在(分别为总的或Δ25)的情况下淋巴结(LN；1×105)和脾细胞(Sp；0.5×105)的增殖(y轴)。在纯化的抗GITRL mAb(10μg/ml；实心圆)或大鼠IgG2a同种型对照(10μg/ml；空心圆)存在的情况下温育细胞。结果来自三个独立的实验。图9B在5×104经辐射(3000R)的除去T细胞的APCs和5×104经辐射的(8000R)YB2/0-GITRL(空心圆)或对照YB2/0(实心圆)细胞存在的情况下培养CD4+CD25-或CD8+T细胞。用不同浓度的可溶性抗CD3 mAb(x轴)激活培养物，并且在72小时培养期后测量增殖(y轴)。图9C在经辐射(3000R)的除去T细胞的APCs存在的情况下用可溶性抗CD3(0.5μg/ml)激活后在不同的时间点确定纯化的抗GITR抗体染色的CD4+CD25-T细胞的平均荧光强度(x轴)。结果来自至少两个独立的实验。
图10验证了逆转抑制作用需要CD25-T细胞的GITR表达。图10A通过测量3H胸苷的吸收(cpm；y轴)来确定与经辐射的来自野生型小鼠的APCs(5×104)和与可溶性抗CD3(0.5μg/ml)和2μg/ml抗GITR抗体(实心圆)或同种型对照抗体(空心圆)一起温育的来自各种基因敲除小鼠的CD4+CD25-T细胞(5×104)培养物的增殖和来自各种基因敲除小鼠[(Aa)CD4+CD25-GITR+/+，CD4+CD25+GITR+/+；(Ab)CD4+CD25-GITR+/+，CD 4+CD25+GITR-/-；(Ac)CD4+CD25-GITR-/-，CD4+CD25+GITR+/+；和(Ad)CD4+CD25-GITR-/-，CD4+CD25+GITR-/-]的CD4+CD25+T细胞(x轴)的不同数目。图10B如上所述，在经辐射(3000R)的大鼠APCs存在的情况下用不同数目的小鼠CD4+CD25+T细胞(x轴)和(Ba)小鼠CD4+CD5-T细胞或(Bb)大鼠CD4+CD25-T细胞进行共培养物的增殖。用抗大鼠和小鼠抗CD3(各0.25μg/ml)的抗体的混合物刺激培养物，和用2μg/ml同种型对照(大鼠IgG；空心圆)或抗GITR(DTA-1；实心圆)抗体处理培养物。标尺表示计算自三份重复培养物的增殖的s.d.值。图10C描述了用同种型对照(大鼠IgG；左图)或抗GITR抗体(DTA-1；右图)以1∶8抑制子对效应器比例共培养的CFSE-染色的小鼠CD4+CD25+(上图)和大鼠CD4+CD25-T细胞(下图)的荧光强度(x轴)。通过用特异性抗CD4抗体染色区分小鼠和大鼠T细胞亚型。结果来自2至4个独立的实验。
图11验证了克服由内源调节性T细胞介导的抑制作用需要GITR信号。图11A用不同浓度的可溶性抗CD3 mAb(x轴)培养CFSE标记的来自B6(野生型)、GITR+/-、CD28-/-和GITR-/-小鼠的淋巴结(LN)细胞(5×104)。在外源IL-2(50U/ml)不存在(Aa)或存在(Ac)的情况下培养总LN细胞。在外源IL-2(50U/ml)不存在(Ab)或存在(Ad)的情况下培养除去CD25+细胞的LN细胞(LNΔ25)。为了清晰起见略去表示s.d.值的标尺。图11B在72小时培养后对用分离自CD28-/-、GITR-/-、GITR+/+或GITR+/-动物的CD4+和CD8+型淋巴结T细胞稀释的CFSE进行流式细胞估计。所述结果对应于0.63μg/ml浓度的可溶性抗CD3(如图11A中)。图11C对未经刺激(虚线未填充直方图)的H-2Db阳性CD4+CD25-细胞进行CD25表达的流式细胞分析，所述H-2Db阳性CD4+CD25-细胞获自GITR-/-小鼠(实线未填充直方图)或获自GITR+/+小鼠(填充直方图)。在抗CD3(0.5μg/ml)存在的情况下，和在来自BALB/c小鼠的CD4+CD25+细胞存在(左直方图)或不存在(右直方图)的情况下以1∶2的抑制子对效应器比例用来自野生型小鼠的LN APCs培养24小时后，确定获自GITR-/-或GITR+/+小鼠的CD4+CD25-细胞的CD25表达。也在50U/ml rhIL-2不存在(上方直方图)或存在(下方直方图)的情况下确定CD25的表达。上述结果来自三个独立的实验。
图12证明CD28依赖性共刺激增强GITR表达和应答。图12A用板结合的抗CD3和2μg/ml的板结合仓鼠同种型(“aCD3”)或板结合的抗CD28(“aCD3+aCD28”)培养72小时后，对纯化的CD4+CD25-或CD8+T细胞(2.5×104)的GITR表达进行流式细胞分析。图12B(左直方图)用或不用抗CD80/86(各10μg/ml)抗体的混合物对在经辐射的、除去T细胞的脾细胞和可溶性抗CD3(0.5μg/ml)存在的情况下培养72小时的CD4+CD25-T细胞进行抗GITR染色。图12B(右直方图)用或不用抗IL-2和IL-2Rα抗体的混合物对在经辐射的、除去T细胞的脾细胞和可溶性抗CD3(0.5μg/ml)存在的情况下培养的CD4+CD25-T细胞进行抗GITR染色。图12C在外加抗GITR mAb(2μg/ml；″DTA-1″)或同种型对照抗体(2μg/ml；″Rat IgG″)以及抗CD80/86 mAbs(各10μg/ml；″aB7″)存在或不存在的情况下对增殖进行估计。标尺表示s.d.值。结果来自2至3个独立的实验。
图13证明GITRL与GITR结合给效应T细胞提供了共刺激信号。图13A通过测量3H胸苷吸收(cpm；y轴)来确定在每HT-2细胞一或二个抗CD3珠存在的或不存在的情况下，单独(白色标尺)培养的或与1×104个对照YB2/0细胞(斜线标尺)或GITRL-表达YB2/0细胞(实心标尺)共培养的效应GITR+/TCR+HT-2T细胞(4×104)的增殖。图13B通过测量3H胸苷吸收(cpm；y轴)来确定与每细胞两个抗CD3小珠、1×104个表达GITRL的YB2/0细胞和抗GITRL抗体(SF1.1；实心圆)或同种型对照抗体(rIgGl；空心圆)的增加的浓度(ng/ml；x轴)共培养的4×104HT-2细胞的增殖。图13C通过测量3H胸苷吸收(cpm；y轴)来确定与每个细胞两个抗CD3小珠、1×104个表达GITRL的YB2/0细胞和4个不同抗GITRL抗体5F1.1(实心圆)、MGLT-10(实心方形)、MGTL-15(空心方形)或多克隆抗体(空心圆)的增加的浓度(ng/ml；x轴)共培养的4×104HT-2细胞的增殖。
图14证明用抗GITRL抗体阻止GITR-GITRL结合，阻止了PLP诱导的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的过继转移。估计小鼠的EAE发病率。用5×106个脾细胞注射小鼠，所述脾细胞分离自用150μg PLP肽免疫过的自雌性SLJ小鼠，并在三种不同的条件下离体再刺激3天单独的10μg/ml PLP(空心圆)、10μg/ml PLP和10μg/ml的同种型对照抗体(CK01；实心圆)或10μg/ml PLP和抗GITRL抗体(5F1.1；实心方形)。监控EAE发病率52天(x-轴)并根据0至5等级打分(y-轴)。
发明详述由于抗GITR抗体似乎产生激动性信号(所述抗GITR抗体产生抑制性活性的逆转)，可预测通过GITRL与GITR的接合应当也抑制调节性T细胞的抑制性活性。早先由于缺乏合适的试剂阻碍了在更符合生理条件下对GITR/GITRL相互作用进行详细的功能分析。现在，已鉴定GITRL的小鼠直向同源物，并且已产生了特异性地结合GITRL的小鼠直向同源物的拮抗性抗体(即，不与人GITRL交叉反应)。
通过使用这种试剂，检查了GITRL的组织分布和调节。此外，通过使用GITR-/-小鼠对GITR/GITRL相互作用调节T细胞抑制作用的能力进行考察。由于CD25-和CD25+T细胞都表达GITR，尽管程度不一，所以以前验证用激动性抗GITR抗体处理共培养物对抑制功能进行抑制的研究在关于GITR结合的细胞靶上产生了不确定的结果。现在，通过在共培养实验中使用来自野生型和GITR-/-小鼠的CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞组合，发现GITR在CD4+CD25-效应T细胞上而不是CD4+CD25+抑制性T细胞上的结合是消除抑制作用所必需的。在CD4+CD25+T细胞不存在的情况下，GITR-/-T细胞产生的增殖应答类似于野生型动物的应答，尽管在具有生理数目的CD4+CD25+T细胞存在的情况下其被完全抑制。这些结果第一次暗示GITR/GITRL结合提供了以前未确定的使效应T细胞抵抗CD4+CD25+T细胞的抑制作用的信号。因此，在响应二级炎症信号后GITRL表达的下调可促进CD4+CD25+介导的抑制和预防旺盛的效应细胞应答造成的有害后果。
该研究已清楚地说明了在GITR与其配体GITRL相互作用的背后机制，特别是关于对CD4+CD25-T细胞(所述细胞传统上被理解为抑制性活性的靶)的影响。简而言之，通过使用GITR-/-小鼠证明了抗GITRmAb(激动性抗GITR小鼠抗体)消除抑制作用的能力是由其对CD4+CD25-而不是CD4+CD25+T细胞(如以前若干研究所提出的)的作用介导的。APCs(抗原呈递细胞)组成型地表达GITRL，所述GITRL在Toll样受体信号传导后下调。尽管GITR-/-小鼠的CD4+CD25-T细胞能够产生增殖应答，但其不能在生理数目CD4+CD25+T细胞存在的情况下增殖。因此，GITRL提供了用于CD4+CD25-T细胞和其它效应T细胞(例如，CD8+T细胞)的重要信号，所述信号使其在免疫应答一开始就抵抗CD4+CD25+介导的调节。炎症刺激导致的GITRL的下调可在例如癌症或感染性攻击的过程中增加效应T细胞(例如，CD4+CD25-T细胞)对抑制剂活性的敏感性。
为此，本发明提供了人GITRL的新的小鼠同源物的核苷酸和氨基酸序列。人GITRL已被鉴定(Kwon等人(1999)J.Biol.Chem.2746056-61；Gurney等人(1999)Curr.Biol.9215-18)；此外，最近几个研究小组也报导了鼠科动物GITR配体的克隆(Kim等人，2003；Tone等人，2003；Yu等人，2003)。
在一个方面，本发明提供了人GITRL的新小鼠同源物的核苷酸序列和氨基酸序列以及其活性片段和/或融合蛋白。本发明的GITRL多核苷酸包括调节GITRL表达的多核苷酸，例如，可上调GITRL表达的包含GITRL多核苷酸的表达载体和/或下调GITRL表达的反义和/或RNAiGITRL多核苷酸。也提供了这些多核苷酸在细胞和/或动物中调节GITRL表达的用途。除了GITRL多肽以外，本发明还提供了其它激动性多肽，例如，能够模拟GITRL(即诱导在效应T细胞中的GITR活性)的GITRL的活性片段和/或GITRL融合蛋白。含有GITRL多核苷酸的转化宿主细胞和转基因动物也在本发明的范围之内。
在另一个方面，提供了特异性地结合本发明的所述新鼠科动物GITRL多肽(即不结合人GITRL)的抗体。特别地，提供了抑制GITRL活性的中和抗体(例如，阻止GITRL结合GITR的抗体)；这些抗体据说可中和GITRL的活性(即，使GITRL失效)。本发明的中和抗体包括针对GITRL的抑制GITRL活性的非人和人抗体以及抑制GITRL活性的本发明的嵌合型和/或人源化的非人抗体版本。可具有一个或多个突变的拮抗性抗体也包括在本发明范围之内，其可增加所述抗体的半寿期、稳定性或亲和力，或可修饰所述抗体的效应器功能。
本发明另一个方面提供了筛选测定法，在所述测定法中所述GITRL多核苷酸和多肽(包括但不限于其人同源物)用于鉴定能够在细胞、生物体或受试者中调节GITR活性的化合物。本发明也提供了估计经鉴定的化合物的功效的方法，其中在施用所述经鉴定的化合物之前和之后确定患者的T细胞数目。此外，本发明提供了使用所述经鉴定的化合物治疗患者或受试者的方法。
除了提供筛选能够调节GITR活性的受试化合物例如GITR激动剂或GITR拮抗剂的方法，本发明还提供了用于诊断、预测和监控涉及免疫系统失调的疾病例如自身免疫疾病、炎症和移植排斥以及癌症和感染性疾病的进展的方法。
此处也公开了使用本发明的GITRL和相关分子用于治疗涉及免疫系统失调的疾病的方法，所述分子包括激动性GITR分子(即，GITRL多核苷酸、GITRL多肽、其活性片段和/或其融合蛋白、激动性小分子和激动性GITR抗体)和拮抗性GITR分子(即，GITRL抑制性多核苷酸、中和GITR抗体、中和GITRL抗体、拮抗性小分子和GITR融合蛋白)。例如，提供了用于治疗经诊断具有或处于自身免疫疾病、移植排斥和/或其它炎症风险的受试者的方法，所述方法包括针对所述受试者施用GITR拮抗剂，例如中和抗GITRL抗体；还提供了治疗经诊断具有或处于癌症或感染性疾病风险的受试者的方法，所述方法包括施用GITR激动剂，例如GITRL或其激动性融合蛋白。可选择地，提供了通过分别施用GITR激动剂例如GITRL(包括其激动性融合蛋白)或GITR拮抗剂例如中和抗GITRL抗体或拮抗性GITR融合蛋白诱导或抑制T细胞增殖的方法。类似地，也提供了在CD4+CD25+T细胞存在的情况下阻止或增强T细胞的抑制作用的方法，所述方法包括分别施用GITR激动剂例如GITRL(包括其激动性融合蛋白)或GITR拮抗剂例如中和抗GITRL抗体。用GITRL多肽和相关分子(包括其激动性融合蛋白)处理的T细胞群体属于本发明的范围之内，并且可以在治疗癌症或感染性疾病的方法中给受试者施用。提供了其它的治疗方法，包括用降低GITR活性的拮抗性化合物治疗经诊断具有或处于自身免疫疾病、炎症或移植排斥风险的受试者的方法和用增加GITR活性的激动性化合物治疗经诊断具有或处于癌症或感染性疾病风险的受试者的方法。本发明的药物组合物例如疫苗佐剂，包括GITRL多核苷酸、多肽和相关分子(包括激动性GITRL融合蛋白和拮抗性抗GITRL抗体)，也在本发明范围之内。本发明的方法涉及GITRL和GITR，包括但不限于，小鼠GITRL和GITR和其同源物；特别地包括于这些同源物中的是人GITRL和GITR。
GITRL多核苷酸和多肽本发明提供了涉及GITR的新配体(GITRL)的新分离和纯化的多核苷酸和多肽。本发明的基因、多核苷酸、蛋白和多肽包括，但不限于小鼠GITRL和其同源物。
例如，本发明提供了编码鼠科动物GITRL的纯化和分离的多核苷酸。本发明的优选DNA序列包括基因组、cDNA和化学合成的DNA序列。
称作小鼠GITRL cDNA的编码该新配体的cDNA核苷酸序列是SEQID NO1所列序列。本发明的多核苷酸也包括在严紧条件下与SEQ IDNO1的多核苷酸或其互补序列杂交和/或编码保持全长小鼠GITRL基本生物学活性的多肽(即，活性片段)的多核苷酸。本发明的多核苷酸也包括包含至少21连续核苷酸的SEQ ID NO1所列序列的连续部分。
称作小鼠GITRL基因组DNA的编码该新配体的基因组DNA的核苷酸序列是SEQ ID NO3所列核苷酸序列。本发明的多核苷酸也包括在严紧条件下与SEQ ID NO3或其互补序列杂交和/或编码保持全长小鼠GITRL基本生物学活性的多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸也包括包含至少21个连续核苷酸的SEQ ID NO3所列序列的连续部分。
小鼠GITRL氨基酸序列是SEQ ID NO2所列序列。本发明的多肽也包括包含至少7个连续氨基酸的SEQ ID NO2所列氨基酸序列的连续部分。本发明的优选的多肽包括任何保持全长小鼠GITRL基本生物学活性的SEQ ID NO2所列序列的连续部分。除了上述小鼠来源的这些多核苷酸外，本发明的多核苷酸也包括编码SEQ ID NO2所列氨基酸序列或其连续部分的多核苷酸，以及只是因为众所周知的遗传密码简并性的原因导致与上述多核苷酸序列不同的多核苷酸。
本发明的分离多核苷酸可用作杂交探针和引物，所述杂交探针和引物用于鉴定和分离具有与编码所述公开的多核苷酸序列同一性或相似的核酸。用于鉴定和分离核酸的杂交方法包括聚合酶链式反应(PCR)、Southern杂交、原位杂交和Northern杂交，并且为本领域技术人员所熟知。
杂交反应可在不同的严紧条件下进行。杂交反应的严紧度包括任何两个核酸分子相互杂交的难度。优选地，在低严紧条件下，更优选地在严紧条件下和最优选地在高严紧条件下，各杂交多核苷酸与其对应的多核苷酸杂交。严紧条件的例子显示于下列表1中高严紧条件是至少与例如条件A-F一样严紧的条件；严紧条件是至少与例如条件G-L一样严紧的条件；和低严紧条件是至少与例如条件M-R一样严紧的条件。
表1
1杂交长度是杂交多核苷酸的杂交区域的预期长度。当将多核苷酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时，杂交长度假定为杂交多核苷酸的长度。当已知序列的多核苷酸被杂交时，杂交长度可通过比对所述多核酸的序列和确定最优化的互补序列区域来进行确定。
2SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA、pH 7.4)在杂交和清洗缓冲液中可替代SSC(1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后进行15分钟清洗。
TB*-TR*用于预期的长度少于50个碱基对的杂交体的杂交温度应当低于所述杂交体的熔解温度(Tm)5-10℃，其中Tm根据下列等式进行确定。对于长度低于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基的数目)+4(G+C碱基的数目)。对于长度在18至49个碱基对之间的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体的碱基数目，和Na+是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1×SSC，Na+＝0.165M)。
在Sambrook等人的Molecular CloningA Laboratory Manual，Chs.9&11，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，和Ausubel等人编著的Current Protocols in Molecular Biology，Sects.2.10&6.3-6.4，JohnWiley&Sons，Inc.(1995)中提供了用于多核苷酸杂交的另外的严紧条件的例子，此处引用作为参考。
本发明的分离多核苷酸可用作杂交探针和引物，所述杂交探针和引物用于鉴定和分离具有编码所述公开的多核苷酸的等位基因变体的序列的DNA。等位基因变体是天然发生的所述公开的多核苷酸的替代形式，其编码与由所述公开的多核苷酸编码的多肽同一或具有显著相似性的多肽。优选地，等位基因变体具有与所述公开的多核苷酸至少90％的序列同一性(更优选地，至少95％的同一性；最优选地，至少99％的同一性)。
本发明的分离的多核苷酸也可用作杂交探针和引物，所述杂交探针和引物用于鉴定和分离具有编码与所述公开的多肽同源的多肽的序列的DNAs。这些同源物是分离自与所述公开的多肽和多核苷酸的物种不同的物种，或分离自相同物种但具有与所述公开的核苷酸序列和多肽显著序列相似性的多核苷酸和多肽。优选地，多核苷酸同源物具有与所述公开的多核苷酸至少50％的序列同一性(更优选地，至少75％的同一性；最优选地至少90％的同一性)，其中多肽同源物具有与所述公开的多肽至少30％的序列同一性(更优选地，至少45％同一性；最优选地，至少60％的同一性)。优选地，所述公开的多核苷酸和多肽的同源物是从哺乳动物物种中分离的同源物。
本发明分离的多核苷酸也可用作杂交探针和引物，所述杂交探针和引物用于鉴定表达本发明的多肽的细胞和组织以及其表达时的条件。
此外，本发明分离的多核苷酸可用于改变(即，增强、减少或修饰)对应于本发明的多核苷酸的基因在细胞或生物体中的表达。这些对应的基因是经转录产生mRNAs的本发明的基因组DNA序列(如SEQ IDNO3)，所述mRNAs是本发明的cDNA多核苷酸(例如，SEQ ID NO1)的来源。
通过使用各种抑制性多核苷酸例如反义多核苷酸(例如，反义GITRL核酸分子)和结合和/或切割转录自本发明的基因的mRNA的核酶(参见，例如，Galderisi等人(1999)J.Cell Physiol.181251-57；Sioud(2001)Curr.Mol.Med.1575-88)可以在细胞或生物体中实现改变本发明基因(包括但不限于小鼠GITRL和其同源物)的表达。这种抑制性多核苷酸可用于预防和治疗自身免疫疾病、炎症、移植排斥和类似的或相关疾病。
本发明的反义多核苷酸或核酶可与本发明的完整的基因编码链互补或只与其部分互补。可选择地，反义多核苷酸或核酶可与本发明的基因的编码链的非编码区域互补。通过使用本领域熟知的方法使用化学合成和酶促连接反应可构建反义多核苷酸或核酶。可修饰化学合成的多核苷酸的核苷酸键以增强其抵抗核酸酶介导的降解以及增加其序列特异性。这类键修饰包括，但不限于，硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酯酰亚胺、硼烷磷酸、吗啉代和肽核酸(PNA)键(Galderisi等人，同上；Heasman(2002)Dev.Biol.243209-14；Micklefield(2001)Curr.Med.Chem.81157-79)。可选择地，通过使用表达载体可生物学地产生这些分子，本发明的多核苷酸已以反义(即，相反)方向亚克隆入所述表达载体中。
本发明的抑制性多核苷酸也包括以高度特异性和亲和力(Knauert和Glazer(2001)Hum.Mol.Genet.102243-51)结合在双螺旋DNA大沟中的形成三螺旋寡核苷酸(TFOs)。通过将互补性TFOs靶向基因的调节区域(即，启动子和/或增强子序列)以形成阻止所述基因转录的三螺旋结构来抑制本发明的基因表达。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抑制性多核苷酸是短的干涉RNA(siRNA)分子(例如，siRNA GITRL核酸分子)。这些siRNA分子是引起靶mRNA序列特异性降解的短的(优选地19-25个核苷酸；最优选地19或21个核苷酸)、双链RNA分子。这种降解称作RNA干涉(RNAi)(例如，Bass(2001)Nature 411428-29)。最初在低等生物中被鉴定，现在RNAi已有效地应用于哺乳动物细胞，近来显示在用靶向Fas mRNA的siRNA分子(Song等人(2003)Nature Med.9347-51)处理的小鼠中可预防急性肝炎。此外，近来已报导了在两种大鼠(Dorn等人(2004)Nucleic Acids Res.32(5)e49)模型(激动剂诱导的疼痛模型和神经病理疼痛模型)中鞘内递送的siRNA阻断疼痛应答。
可通过将两个单链RNA分子退火结合在一起(其中一个与靶mRNA的部分配对)(Fire等人，美国专利号6,506,559)或通过使用单个可自身折叠以形成所需要的双链部分的发夹RNA分子(Yu等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 996047-52)来产生本发明的siRNA分子。所述siRNA分子可通过化学合成(Elbashir等人(2001)Nature411494-98)或通过在体外使用单链DNA模板转录产生(Yu等人，同上)。可选择地，所述siRNA分子可通过使用包含有义和反义siRNA序列的表达载体瞬时地(Yu等人，同上；Sui等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 995515-20)或稳定地(Paddison等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 991443-48)生物学地产生。近年来，使用表达将进一步被加工成siRNAs(Arts等人(2003)Genome Res.132325-32)的发夹RNAs的腺病毒载体证明了在原代人细胞中靶mRNA水平的降低(以有效和序列特异性方式)。
基于本领域熟知的标准(例如，Elbashir等人(2001)EMBO J.206877-88)可设计靶向本发明的多核苷酸的siRNA分子。例如，靶mRNA的靶片段应当以AA(最优选的)、TA、GA或CA开始；siRNA分子的GC比例优选地应当为45-55％；siRNA分子优选地不应当包含三个连续相同的核苷酸；siRNA分子优选地不应当包含7个混合的连续G/Cs；和靶片段优选地应当在所述靶mRNA的ORF区域内和优选地应当在启始ATG后之后至少75bp和在终止密码子之前至少75bp。基于这些标准或基于其它已知的标准(例如，Reynolds等人(2004)NatureBiotechnol.22326-30)，本领域技术人员可设计靶向本发明的mRNA多核苷酸的本发明的siRNA。
通过建立非人转基因动物也可实现在生物体中改变本发明基因的表达，其中本发明的多核苷酸已导入所述非人转基因动物的基因组中。这样的转基因动物包括具有本发明的多拷贝基因(即，转基因)的动物。组织特异性调节序列可有效地连接所述转基因以指导本发明的多核苷酸在特定的细胞或特定的发育阶段表达。用于通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物特别是例如小鼠之类的动物的方法已变得常规并且在本领域众所周知(例如，Bockamp等人，Physiol.Genomics，11115-32(2002))。
通过动物的建立也可实现在生物体中改变本发明的基因的表达，其中通过外源多核苷酸序列的插入已破坏了对应于本发明所述多核苷酸的所述动物的内源基因(即，基因敲除动物)。可破坏内源基因的编码区域，从而产生了无功能蛋白。可选择地，可破坏或用不同的调控元件替代所述内源基因的上游调控区域，导致改变仍有功能的蛋白的表达。用于产生基因敲除之类的动物的方法包括同源重组，并且在本领域众所周知(例如，Wolfer等人，Trends Neurosci.，25336-40(2002))。
本发明的分离多核苷酸可有效地连接表达控制序列和/或连接入用于本发明的多肽重组生产的表达载体。表达重组蛋白的一般方法在本领域是众所周知的。这样的重组蛋白可以以用于治疗由免疫系统失调导致的疾病的可溶性形式表达；这类疾病包括，例如，癌症和感染性疾病，和自身免疫疾病和炎症以及移植排斥。自身免疫疾病和炎症包括，但不限于类风湿性关节炎、脑脊髓炎、骨关节炎、多发性硬化、自身免疫性胃炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣和其它炎性皮肤病、I型糖尿病、哮喘、过敏和炎性肠疾病包括克罗恩氏疾病和溃疡性结肠炎。
表达载体，如此处所用的，是指能够转运另一个与其相连的核酸的核酸分子。其中一种载体类型是质粒，所述质粒是指可连接另外的DNA片段的环形双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可连接入所述病毒基因组中。某些载体可在宿主细胞中自主复制，所述宿主细胞被导入了所述载体(例如，具有细菌复制超始位点的细菌载体和游离的哺乳动物载体)。通过导入宿主细胞，其它载体(例如，非游离哺乳动物载体)可整合入所述宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。这类载体在此处称为重组表达载体(或简称表达载体)。通常，在重组DNA技术中使用的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，质粒和载体可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明包括其它形式的发挥相同功能的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸用于产生GITR激动剂，例如，GITRL多肽，其活性片段和/或融合多肽，它们也包括在本发明范围内。例如，GITRL多肽或其活性片段可融合到第二部分例如免疫球蛋白或其片段(例如，其Fc结合片段)上。在一些实施方案中，所述第一多肽包括全长GITRL多肽。可选择地，所述第一多肽可包含短于全长的GITRL多肽。此外，GITRL的可溶性形式可通过“连接体”序列融合至免疫球蛋白的Fc部分。可使用其它融合蛋白，例如与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、Lex-A、硫氧还蛋白(TRX)或麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的融合蛋白。
融合蛋白可额外地包括将GITRL或GITRL片段与第二部分连接的连接体序列。这种连接体序列的使用在本领域是熟知的。例如，融合蛋白可包括肽连接体，例如长度大约在2至20个，更优选地少于10个氨基酸的肽连接体。在一个实施方案中，肽连接体在长度上可以是2个氨基酸。
在另一个实施方案中，融合蛋白在N末端包括异源信号序列(即，不存在于由GITRL核酸编码的多肽中的多肽序列)。例如，来自另一个蛋白的信号序列可与GITRL多肽(包括其活性片段和/或融合蛋白)融合。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列可增加GITRL的表达和/或分泌。
可包含于融合蛋白中的信号肽是MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQID NO11)。如果想要，可在包含GITRL部分的第一多肽部分和第二多肽部分之间额外插入一个或多个氨基酸。第二多肽优选地是可溶性的。在一些实施方案中，第二多肽增加被连接多肽的半寿期(例如，血清半寿期)。在一些实施方案中，第二多肽包含促进融合多肽与第二GITRL多肽结合的序列。在一些实施方案中，第二多肽至少包括免疫球蛋白多肽的区域。免疫球蛋白融合多肽在本领域是已知的并且描述于例如美国专利号5,516,964、5,225,538、5,428,130、5,514,582、5,714,147和5,455,165，所有这些专利此处引用作为参考。
本发明的嵌合型或融合蛋白可通过标准的重组DNA技术生产。例如，可根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段按阅读框连接起来，例如使用平端或缺口末端进行连接，限制性酶降解以提供合适末端，恰当地填充粘性末端，进行碱性磷酸酶处理以避免不想要的连接，进行酶促连接。在另一个实施方案中，用常规技术包括DNA自动合成仪可合成融合基因。可选择地，使用锚定引物可进行基因片段的PCR扩增，所述引物在两个连续基因片段之间产生互补突出端，随后退火并重新扩增产生嵌合基因序列(参见，例如，Ausubel等人(Eds.)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，1992)。此外，许多编码融合部分(例如，免疫球蛋白重链的Fc区域)的表达载体可商业购得。可将GITRL编码核酸克隆入这样的表达载体中以使所述融合部分按阅读框连接到免疫球蛋白上。在一些实施方案中，GITRL融合多肽以寡聚物例如二聚体或三聚体形式存在。
许多细胞系可用作合适的用于本发明所述多肽重组表达的宿主细胞。哺乳动物宿主细胞系包括，例如，COS细胞、CHO细胞、293T细胞、A431细胞、3T3细胞、CV-1细胞、HeLa细胞、L细胞、BHK21细胞、HL-60细胞、U937细胞、HaK细胞、Jurkat细胞以及来源于体外培养的原代组织和原代外植体的细胞系。
可选择地，可能可以在低等真核生物例如酵母或在原核生物中重组地产生本发明的所述多肽。潜在合适的酵母株系包括啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)株系和假丝酵母属(Candida)株系。潜在地合适的细菌株系包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。如果本发明的所述多肽制备于酵母或细菌，可能需要通过例如在合适的位置对其进行磷酸化或糖基化修饰以获得功能性。使用熟知的化学或酶促方法可完成这种共价连接。
在细菌中表达可导致包含重组蛋白的包函体的形成。因此，可能要求重组蛋白的重新折叠以产生有活性的或更具活性的材料。几种用于获得正确折叠的来自细菌包函体的异源蛋白的方法在本领域是已知的。这些方法通常涉及溶解来自包函体的蛋白，然后使用离液剂使所述蛋白完全变性。当半胱氨酸存在于蛋白质一级氨基酸序列中时，通常需要在允许正确形成二硫键的环境(氧化还原系统)中完成重新折叠。重新折叠的普通方法描述于Kohno(1990)的Meth.Enzymol.185187-95.EP 0433225，和专利申请美国系列号08/163,877描述了其它合适的方法。
本发明的所述多肽也可通过有效地将本发明的分离多核苷酸连接至一个或多个昆虫表达载体例如杆状病毒载体中的合适控制序列上并使用昆虫细胞表达系统而重组产生。以试剂盒(例如，the MaxBac_kit，Invitrogen，Carlsbad，CA)形式可商业购得用于杆状病毒/sf9表达系统的材料和方法。
GITR激动剂例如GITRL蛋白、其活性片段和/或融合蛋白可通过在表达想要的蛋白所需的培养条件下培养转化的宿主细胞培养物进行制备。在合适的宿主细胞表达重组蛋白后，然后可用已知的纯化方法例如凝胶过滤和离子交换层析从培养基或细胞提取物中纯化本发明的多肽。可从条件培养基中纯化GITR激动剂例如GITRL蛋白、其活性片段和/或融合蛋白的可溶性形式。可通过从表达细胞中制备总膜部分和用非离子性去垢剂例如Triton X-100提取所述膜来纯化本发明的膜结合形式蛋白例如GITRL蛋白。纯化方法也可以包括使用已知的结合本发明多肽的试剂的亲和层析。这些纯化方法也可用于纯化来自其它来源包括天然来源的本发明的多肽。如前面所述，GITR激动剂例如GITRL蛋白、其活性片段和/或融合蛋白也可作为转基因动物的产物例如转基因奶牛、山羊、猪或绵羊的奶成分进行表达，所述转基因动物的特征在于体细胞或生殖细胞含有编码所述GITR激动剂的多核苷酸序列。
可用于纯化GITR激动剂例如GITRL蛋白、其活性片段和/或融合蛋白的方法对本领域技术人员来说是已知的。例如，通过使用商业购得的蛋白浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon的超滤单位可浓缩本发明的GITRL蛋白。浓缩步骤之后，可将所述浓缩产物加到纯化基质例如凝胶过滤介质上。可选择地，可使用阴离子交换树脂，例如具有侧挂二乙基氨基乙基(DEAE)或聚乙烯亚胺(PEI)基团的基质或衬底。所述基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其它普便应用于蛋白纯化的类型。可选择地，可使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括各种不溶性的包含磺丙基或羧甲基基团的基质。磺丙基基团是优选的(例如，S-Sepharose_柱)。从培养上清液中纯化GITR激动剂例如GITRL蛋白、其活性片段和/或融合蛋白也可包括一个或多个通过亲和树脂例如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、肝素-toyopearl_或Cibacrom blue 3GA Sepharose_的柱层析、或通过使用树脂例如苯基醚、丁基醚或丙基醚的疏水相互作用层析、或通过免疫亲和层析的步骤。最后，可使用一步或多步应用疏水RP-HPLC介质例如具有侧挂甲基或其它脂肪族基团的反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化所述GITRL蛋白。依照已知的方法，也可使用包含抗所述GITRL蛋白的抗体的亲和柱进行纯化。一些或所有前述纯化步骤(以各种组合或与其它已知方法结合)也可用于提供基本纯化的分离的重组蛋白。优选地，所述分离的GITRL蛋白纯化至其基本不合其它哺乳动物蛋白。
可选择地，GITR激动剂例如GITRL蛋白、其活性片段和/或融合蛋白也可以有助于纯化的形式重组地表达。例如，所述多肽可以与蛋白例如麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或硫氧还蛋白(TRX)形成的融合蛋白表达。用于表达和纯化这些融合蛋白的试剂盒可分别从New England BioLabs(Beverly，MA)、Pharmacia(Piscataway，NJ)和Invitrogen商业购得。GITR激动剂例如GITRL蛋白、其活性片段和/或融合蛋白也可用小表位进行标记，然后使用针对所述表位的特异性抗体进行鉴定或纯化。优选的表位是可从Eastman Kodak(New Haven，CT)商业购得的FLAG表位。
也可通过已知的常规化学合成的方法产生GITR激动剂例如GITRL蛋白、其活性片段和/或融合蛋白。用于化学合成这类多肽的方法对本领域技术人员来说是熟知的。这种化学合成的多肽可具有与天然的、纯化的多肽一样的生物学活性，因而可用作替代所述天然多肽的生物学活性或免疫学性替代物。
GITR激动剂例如GITRL蛋白、其活性片段和/或融合蛋白也包括结构上不同于所述公开的多肽(例如，具有稍微改变的序列的多肽)但具有与所述公开的多肽基本相同的生物学特性(例如，只在功能上非必需的氨基酸残基上进行改变)的分子。这类分子包括含有改变、替换、取代、插入或删除的天然发生的等位基因变体和特意工程改造的变体。用于这种改变、替换、取代、插入或删除的技术对本领域技术人员来说是已知的。在一些实施方案中，所述GITRL多肽部分以在天然发生的GITRL序列(野生型)上具有突变的变体GITRL多肽形式提供，所述突变导致GITRL序列更加抵抗蛋白水解(相对于未突变序列)。
此处公开的用于产生GITR激动剂例如GITRL、其活性片段和/或融合蛋白的方法可用于产生GITR拮抗剂特别是可溶性GITR蛋白、其活性片段和/或其融合蛋白。本领域技术人员认识到为了产生GITR拮抗剂例如可溶性GITR、其活性片段和/或融合蛋白，所需要的只是GITR的核酸序列或氨基酸序列，这两者都是已知的。通过使用这些序列，如上所述，可通过使用重组DNA技术和/或化学合成产生GITR拮抗剂例如可溶性GITR、其活性片段和/或融合蛋白。
抗GITRL抗体在另一个实施方案中，本发明提供了作为抗体或其抗原结合片段的GITR拮抗剂，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合GITRL，优选地结合哺乳动物(例如，鼠)GITRL，并中和GITR活性。
本领域技术人员认识到，如此处所用的，术语“抗体”是指包含至少一个和优选地两个重(H)链可变区(此处缩写为VH)和至少一个优选地两个轻(L)链可变区(此处缩写为VL)的蛋白。所述VH和VL区可再细分为称作“互补决定区”(“CDR”)高可变区，以及散布的更保守的称为“构架区”(“FR”)的区域。所述FRs和CDRs的范畴已被精确定义(参见，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，和Chothia，C.等人(1987)J.Mol.Biol.196901-917，此处引用作为参考)。各VH和VL由三个CDRs和四个FRs构成，按下列顺序从氨基端至羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
所述抗体可进一步包括重链和轻链恒定区，从而分别形成重链和轻链免疫球蛋白链。在一个实施方案中，所述抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中所述免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链是通过例如二硫键连接的。所述重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。所述轻链恒定区包含一个结构域CL。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子包括各种免疫系统的细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。
免疫球蛋白是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽构成的蛋白。公认的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(大约25Dd，或214个氨基酸)在NH2末端(大约110个氨基酸)由可变区基因编码和在COOH端由κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(大约50Kd，或466个氨基酸)类似地由可变区基因(大约116个氨基酸)和前述恒定区基因例如γ(编码大约330个氨基酸)编码。免疫球蛋白重链恒定区基因编码抗体种类即同种型(例如，IgM或IgG1)。如此处所用的，抗体的抗原结合片段(或简称“抗体部分”或“片段”)是指一个或多个保留特异性结合抗原(例如，CD3)的能力的全长抗体的片段。包括在术语“抗原结合片段”内的抗体的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含两个在铰链区由二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341544-46)，由VH结构域构成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域即VL和VH由两个分开的基因编码，但通过使用能使其制备成单链蛋白的合成连接体，通过使用重组方法可将其连接起来，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等人(1988)Science 242423-26；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-83)。这种单链抗体也属于术语抗体的“抗原结合片段”。通过使用本领域技术人员已知的常规方法获得这些抗体片段，并且以与对完整抗体采用的相同方式筛选所述片段的用途。
本领域技术人员认识到此处公开的用于产生针对本发明多肽例如鼠科动物GITRL的抗体分子的方法也可用于产生针对其它蛋白例如GITR或人GITRL的抗体。因此，所述用于产生抗体分子的方法不仅用于公开的本发明的多肽还用于例如GITR或人GITRL。
针对本发明多肽的抗体例如抗鼠科动物GITRL(包括但不限于小鼠GITRL和其同源物)的中和抗体可用于预防或治疗自身免疫疾病、炎症、移植排斥和类似的或相关的疾病。其它抗体分子例如激动性GITR抗体，可用于本发明的用于治疗癌症、感染性疾病和类似和相关疾病的方法。可通过本领域技术人员熟知的方法产生这些抗体分子。例如，可根据已知的方法通过产生杂交瘤来生产单克隆抗体。然后使用标准的方法例如酶联免疫吸收测定法(ELISA)来筛选以这种方式形成的杂交瘤以鉴定一个或多个杂交瘤，所述杂交瘤产生特异性地与本发明的多肽结合的抗体。例如，本发明的GITRL蛋白也可用于免疫动物以获得多克隆和单克隆抗体，所述抗体可特异性地与GITRL蛋白反应和可抑制配体与受体即GITR结合。类似地，GITR蛋白也可用于获得与GITR特异性反应的多克隆和单克隆抗体。肽免疫原可额外地在羧基末端包含半胱氨酸残基和连接于半抗原例如匙孔血蓝蛋白(KLH)。可通过用硫酸化的酪氨酸残基取代酪氨酸残基产生另外的肽免疫原。用于合成这类多肽的方法在本领域是已知的，例如，如在Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.852149-54；Krstenansky等人(1987)FEBS Lett.21110中所描述的。
本发明的全长多肽可用作免疫原，或可选地，可使用所述多肽的抗原性肽片段。本发明的多肽的抗原性肽包含至少7个连续氨基酸残基，并包含表位以使产生的抗所述肽的抗体与所述多肽形成特异性免疫复合物。优选地，所述抗原性肽包含至少10个氨基酸残基、更优选地包含至少15个氨基酸残基、更优选地至少20个氨基酸残基和最优选地至少30个氨基酸残基。
可通过其它重组DNA技术领域的技术人员已知的方法产生单克隆抗体。作为制备单克隆抗体分泌型杂交瘤的替代方法，通过用本发明的多肽(例如，GITRL)或用GITR筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)从而分离出分别结合本发明多肽或GITR的免疫球蛋白文库成员，从而鉴定和分离本发明多肽的单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的技术和商业可购得试剂盒对本领域技术人员来说是熟知的。此外，可在文献中查找到特别适合用于产生和筛选抗体噬菌体展示文库的方法和试剂的例子。例如。“组合抗体展示”方法已发展用来鉴定和分离具有特定抗原特异性的片段和可用于生产单克隆抗体(关于组合抗体展示的描述，参见，例如Sastry等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865728；Huse等人(1989)Science 2461275；Orlandi等人1989 Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833))。在用上述的免疫原免疫动物之后，克隆所得到的B细胞库的抗体库。通过使用寡聚物引物的混合物和PCR获得各种免疫球蛋白分子群体的可变区的DNA序列的方法通常是已知的。例如，对应于5’前导(信号肽)序列和/或构架1(FR1)序列的混合寡核苷酸引物以及针对保守3’恒定区的引物可用于来自许多鼠科动物抗体(Larrick等人(1991)Biotechniques 11152-56)的重链和轻链可变区的PCR扩增。类似的策略也可用于扩增来自人抗体(Larrick等人(1991)MethodsCompanion to Methods in Enzymology 2106-10)的重链和轻链可变区。
通过用本发明多肽免疫合适的受试者可产生多克隆血清和抗体。通过标准技术例如使用固定的标记蛋白的ELISA在一段时间内可监控所述免疫受试者中的抗体滴度。如果想要，可从受试者或培养基中分离抗本发明多肽的抗体分子并通过熟知的技术例如蛋白A层析法进一纯化所述抗体以获得IgG部分。
通过本领域熟知的方法切割抗体可产生抗本发明多肽的抗体片段。例如，通过用酶例如胃蛋白酶处理抗体可产生具有免疫学活性的Fab和F(ab’)2片段。
此外，可通过使用标准的重组DNA技术和/或重组组合免疫球蛋白文库产生包含人和非人部分的抗本发明多肽的嵌合、人源化和单链抗体。也可通过使用转基因小鼠生产人源化的抗体，所述转基因小鼠不能够表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因但能表达人重链和轻链基因。例如，抗GITRL的人单克隆抗体(mAbs)可通过使用携带所述人免疫球蛋白基因而非鼠科动物免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。来自这些用目的抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞接着可用于产生分泌人mAbs的杂交瘤，所述人mAbs对来自人蛋白(参见，例如，Wood等人，WO 91/00906；Kucherlapati等人，WO91/10741；Lonberg等人WO 92/03918；Kay等人，WO 92/03917；Lonberg等人(1994)Nature 368856-59；Green等人(1994)Nat.Genet.713-21；Morrison等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-55；Bruggeman(1993)YearImmunol 733-40；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 903720-24；Bruggeman等人(1991)Eur.J.Immunol.211323-26)的表位具有特异性亲和力。
通过本领域已知的重组DNA技术可产生包括嵌合免疫球蛋白链的嵌合抗体。例如，用限制性酶降解编码鼠科动物(或其它物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因以除去编码鼠科Fc的区域，并用编码人Fc恒定区的基因的等同部分替代(参见，Robinson等人，国际专利公开号PCT/US86/02269；Akira等人，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，欧洲专利申请171,496；Morrison等人，欧洲专利申请173,494；Neuberger等人，WO 86/01533；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利申请125,023；Better等人(1988)Science 2401041-43；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-43；Liu等人(1987)J.Immunol.1393521-26；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-18；Nishimura等人(1987)Cancer Res.47999-1005；Wood等人(1985)Nature 314446-49；和Shaw等人(1988)J.Natl.CancerInst.801553-59)。
通过本领域已知的方法可人源化抗体或免疫球蛋白链。通过用来自人Fv可变区的等同序列替代不直接参与抗原结合的Fv可变区域的序列可产生人源化抗体，包括人源化免疫球蛋白链。由Morrison(1985)Science 2291202-07；Oi等人(1986)BioTechniques 4214；Queen等人，美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762提供用于产生人源化抗体的一般方法，此处引用所有这些文献的内容作为参考。这些方法包括分离、操作和表达核苷酸序列，所述核苷酸编码来自至少一条重链或轻链的免疫球蛋白Fv可变区的全部或部分。这些核苷酸序列的来源对本领域技术人员来说是熟知的，例如，可从产生抗预先确定的靶标的抗体的杂交瘤中获得。然后可将编码所述人源化抗体或其片段的重组DNA克隆入合适的表达载体中。
通过CDR移植或CDR替换可产生人源化的或CDR移植的抗体分子或免疫球蛋白，其中免疫球蛋白链的一个、二个或所有CDRs可被取代。参见，例如，美国专利号5,225,539；Jones等人(1986)Nature 321552-25；Verhoeyan等人(1988)Science 2391534；Beidler等人(1988)JImmunol.1414053-60；Winter，美国专利号5,225,539，此处引用所有这些文献的内容作为参考。Winter描述了可用于制备本发明的人源化抗体的CDR移植方法(UK Patent Application GB2188638A；Winter，U.S.Pat.No.5,225,539)，此处引用其全文作为参考。所有特定的人抗体的CDRs可用至少非人CDRs的部分取代，或只有一些所述CDRs可用非人CDRs取代。只需取代人源化抗体与预定抗原结合所需的CDRs。
已通过例如删除、添加或替换所述抗体的其它部分例如恒定区而修饰的单克隆、嵌合型和人源化抗体也在本发明的范围之内。例如，可如下对抗体进行修饰(i)通过删除恒定区；(ii)通过用其它恒定区例如增加抗体的半寿期、稳定性或亲和力的恒定区或来自其它物种或抗体种类的恒定区来取代恒定区；或(iii)通过修饰一个或多个恒定区上的氨基酸以改变例如糖基化位置的数目、效应细胞的功能、Fc受体(FcR)结合、互补固定(complement fixation)等。
用于改变抗体恒定区的方法在本领域是已知的。具有改变的功能例如改变的针对效应器配体(例如细胞上的FcR或补体中的C1组分)的亲和力的抗体可通过用不同残基取代抗体的恒定区部分中的至少一个氨基酸残基产生(参见，例如，EP 388,151 A1，美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，此处引用其全文作为参考)。对小鼠(或其它物种的)免疫球蛋白的相似类型的改变可用于减少或消除这些功能。这类改变在本领域是已知的。
例如，通过用在其侧链具有合适功能性的残基取代特定的残基或通过引入带电官能团例如谷氨酸或天冬氨酸，或芳香族非极性残基例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸(参见，例如，美国5,624,821)可能改变抗体(例如，IgG，例如人IgG)的Fc区域针对FcR(例如，FcγR1)或C1q结合的亲和力。
本发明的抗GITRL抗体可用于在上清液、细胞裂解物或细胞表面分离、纯化和/或检测GITRL多肽。本发明中公开的抗体可以用于在诊断上监控GITRL蛋白水平(作为临床试验过程的一部分)或用于在临床上将治疗性调节子靶向包含所述GITRL抗体的抗原的细胞和组织中。例如，可将治疗剂例如小分子或其它本发明的治疗剂连接所述GITRL抗体以将治疗剂靶向至表达GITRL的细胞和组织。结合GITRL蛋白的中和或非中和抗体(优选单克隆抗体)也可用于治疗涉及免疫系统失调的病症例如自身免疫疾病。这些中和单克隆抗体可以阻止GITRL结合GITR。本发明进一步提供包含特异性地与GITRL反应的抗体的组合物。类似地，抗GITR抗体可用于分离、纯化和/或检测GITR、在诊断上监控GITR水平或临床上将治疗性调节子靶向至包含GITR的细胞或组织。针对GITR的激动性抗体(优选地单克隆抗体)也可用于治疗涉及免疫系统失调的病症例如癌症或感染性疾病。这些激动性抗体可能能够诱导GITR的活性。因此本发明进一步提供了包含抗GITR抗体的组合物。
GITRL筛选测定本发明的多核苷酸和多肽可用于筛选测定法，所述方法用于鉴定药物试剂或能够在细胞或生物体中调节GITRL活性从而调节GITR活性的试剂的前导化合物，所述试剂从而成为免疫应答的潜在调节因子。例如，可将包含GITRL(天然的或重组的)的样品与多个受试化合物(生物学试剂或有机小分子)的一个接触，将各经处理的样品中GITRL的活性与未处理的样品中或与不同受试化合物接触的样品中的GITRL活性比较。这些比较将确定任何一个受试化合物是否导致1)显著地降低GITRL的表达水平或活性，从而表示GITRL的抑制剂(例如，可恢复或加强免疫抑制作用的化合物)，或2)显著增加GITRL的表达水平或活性，从而表示GITRL的激活剂(例如，逆转免疫抑制作用的化合物)。在一个实施方案中，通过使用高通量筛选测定法例如BIACORE_(Biacore International AB，Uppsala，Sweden)、BRET(生物发光共振能量转移)和FRET(荧光共振能量转移)测定法以及ELISA和基于细胞的测定法来进行受试化合物的鉴定，所述受试化合物能够调节GITRL活性。
小分子在遭受(或处于风险)自身免疫疾病、炎症或移植排斥的生物体(或受试者)中或来自涉及这种疾病的生物体的细胞中，也可通过使用拮抗即抑制GITR的活性的小分子(通常是有机小分子)获得降低的GITR活性。通过上述筛选方法可鉴定新的拮抗性小分子并且所述小分子可用于下述的本发明的治疗方法中。相反地，在遭受(或处于风险)癌症或感染性疾病的生物体(或受试者)中或来自涉及这类疾病的生物学体(或受试者)的细胞中，也可通过使用促进即增强GITR活性的小分子(通常为有机小分子)实现增加GITR的活性。可通过上述筛选方法鉴定新的激动性小分子并且所述小分子可用于下述本发明的治疗癌症和/或感染性疾病的方法中。
用于诊断、预测和监控自身免疫疾病和癌症的进展的方法在本领域众所周知在动物模型特别是鼠科动物模型上研究的免疫学机制可以和经常可转移至人免疫系统中。同样地，尽管此处公开的实施例说明了在动物模型中GITR在CD4+CD25+调节性细胞产生的免疫抑制作用中的作用，但所述公开的用于诊断、预测和监控涉及免疫系统失调的疾病例如自身免疫疾病、炎症和移植排斥以及癌症和感染性疾病的方法可特别用于在人中诊断、预测和监控这类疾病。在实践所述公开的方法中，本领域技术人员认识到GITR和GITRL的人同源物以及人GITR激动剂和拮抗剂可用于在人中诊断、预测和监控这类疾病的本发明的方法中。
本发明提供了方法，所述方法用于通过检测GITR活性的上调例如通过检测GITRL的上调(包括但不限于在人受试者中使用这样的方法)诊断、预测和监控受式者(例如，直接或间接涉及增加GITRL水平)中自身免疫疾病的进展。本领域技术人员认识到也可将这些方法应用于炎症和移植排斥。可通过使用预先包装的诊断试剂盒进行这些方法，所述试剂盒包含至少一个来自包含GITRL多核苷酸或其片段、GITRL多肽或其部分(包括其融合蛋白)、或针对GITRL或其衍生物的抗体、或GITRL多肽和/或此处公开的多肽的调节子的组的成分，所述成分可常规地用于例如临床上。此外，本领域技术人员认识到也可通过间接的方法例如计算免疫细胞的数目检测GITRL的上调。
“诊断的”或“诊断”是指鉴定病理状况的存在或不存在。诊断方法包括通过在来自受试者(人或非人哺乳动物)的生物样品中确定GITRL基因产物(例如，mRNA、cDNA或多肽，包括其片段)的受试量来检测GITRL的上调，和将所述GITRL基因产物的受试量与正常量或范围(即，来自已知未患有自身免疫疾病的个体的量或范围)进行比较。尽管特定的诊断方法可能没有提供自身免疫疾病的确定诊断，但如果所述方法提供了帮助诊断的阳性标志，其就足够了。
本发明也提供了通过检测GITR活性的上调例如通过测定GITRL的上调来诊断这类自身免疫疾病的方法。“预测的”或“预测”是指预测病理状况可能的发展和/或严重度。预测方法包括在来自受试者的生物学样品中确定GITRL基因产物的受试量，和将所述GITRL基因产物的受试量与预测量或范围(即，来自具有不同的自身免疫疾病严重度的个体的量或范围)进行比较。在受试样品中GITRL基因产物的各种量与自身免疫疾病的某些预测是吻合的。在特定的预测水平上GITRL基因产物量的检测提供了对受试者的预测。
通过检测GITR活性的上调例如通过检测GITRL的上调，本发明也提供了用于监控这类自身免疫疾病的进展或进程的方法。监控方法包括在生物学样品中确定GITRL基因产物的受试量，所述生物学样品在第一和第二时间上取自受试者，并比较所述量。在第一和第二时间之间GITRL基因产物量上的变化表示自身免疫疾病进程的变化，量的减少表示自身免疫疾病减轻，而量的增加表示自身免疫疾病加重。这种监控测定方法也用于估计在接受自身免疫疾病治疗的患者中特定治疗干预的有效性。
在各种生物学样品中，包括体液(例如，全血、血浆和尿液)、细胞(例如，整个细胞、细胞部分和细胞提取物)和组织，可检测上述方法中GITRL表达的增加。生物学样品也包括组织切片，例如用于组织学目的活检组织和冰冻切片。优选的生物学样品包括血液、血浆、淋巴、活检组织、尿液、CSF(脑脊髓液)、滑液(synovial)和BAL(支气管肺泡灌洗液)。应当认识到生物样品的分析不一定需要从受试者身上取出细胞或组织。例如，可将合适标记的结合GITRL基因产物的试剂(例如，抗体、核酸)给受试者施用并使用标准的成像技术(例如，CAT、NMR(MRI)和PET)观察(当结合靶标时)。
在本发明的诊断和预测测定中，对GITRL基因产物进行检测和定量以产生受试量。然后将受试量与正常量或范围对比。在自身免疫疾病的诊断中，显著高于正常量或范围的量是阳性症兆。下面描述特定的检测和定量GITRL产物的方法。
可确定任何特定的样品类型和群体的GITRL基因产物的正常量或基线水平。通常，通过在来自正常(即，健康)受试者的生物样品中测量GITRL蛋白或mRNA的量来确定GITRL蛋白或mRNA的基线(正常)水平。可选择地，可通过测量取自受试者的健康细胞或组织中的量来确定GITRL基因产物的正常值，其中染病(或可能染病)的受试细胞或组织也取自相同的所述受试者。可在每个细胞、每一总蛋白或每一体积单位上确定或表示GITRL基因产物的量(正常量或受试量)。为确定样品的细胞量，可测量在所述类型的细胞中组成型表达的基因产物的水平或其它以已知水平表达的基因产物的水平，所述细胞类型是生物样品从中获取的细胞类型。
应当认识到本发明的测定方法不一定需要测量GITRL基因产物的绝对值，因为相对值足以满足许多这些方法的应用。也要认识到除了GITRL基因产物的数量或丰度外，通过与正常基因产物和表达模式对比可鉴定异常的GITRL基因产物或变体或其表达模式(例如，突变的转录物、截短的多肽)。
本发明的诊断、预测和监控测定法涉及在生物学样品中检测和定量GITRL基因产物。GITRL基因产物包括GITRL mRNA和GITRL多肽，并且通过使用本领域技术人员熟知的方法可测量这两者。
例如，通过使用基于杂交的测定法例如Northern杂交、原位杂交、点和线印迹杂交以及寡核苷酸阵列可直接检测和定量GITRL mRNA产物。基于杂交的测定法是指将探针DNA核酸与靶核酸杂交的测定法。在某些形式中，所述靶、探针或两者是固定的。所述被固定的核酸可以是DNA、RNA或另外的寡核苷酸或多核苷酸，并且可包含天然或非天然发生的核苷酸、核苷酸类似物或主链。选择用于本发明的核酸探针序列的方法基于GITRL的核酸序列并且在本邻域众所周知。
可选择地，在检测和定量前可扩增GITRL mRNA。这种基于扩增的测定在本领域众所周知，其包括聚合酶链式反应(PCR)、反转录PCR(RT-PCR)、PCR酶联免疫吸附测定(PCR-ELISA)和连接酶链式反应(LCR)。基于GITRL的核酸序列，本领域技术人员可容易地设计和产生用于产生和检测扩增的GITRL基因产物(例如，mRNA或cDNA)的引物和探针而无需过多的实验。通过例如凝胶电泳、与探针核酸杂交、测序、荧光检测、磷光发光或放射性信号或任何已知的方法可直接分析扩增的GITRL基因产物。此外，用于增加由靶核酸序列的扩增产生的信号的方法对本领域技术人员是已知的。本领域技术人员认识到无论使用哪一个扩增方法，如果想要定量GITRL基因产物，可使用大量本领域已知的方法(例如，定量PCR)。
使用上述抗GITRL抗体通过使用各种熟知的免疫学测定可检测GITRL多肽(或其片段)。免疫学测定是指使用特异性结合GITRL多肽(或其片段)的抗体(例如，多克隆的、单克隆的、嵌合的、人源化的、scFv和其片段)的测定法。这种适合于本发明实践的公知的免疫测定法包括ELISA、放射性免疫测定法(RIA)、免疫沉淀、免疫荧光法、荧光激活细胞分选法(FACS)和Western印迹法。GITRL多肽也可使用标记的GITR进行检测。
本领域技术人员理解上述方法可用于自身免疫疾病和其它病症(例如炎症)，包括但不限于，类风湿性关节炎，骨关节炎，多发性硬化，自身免疫胃炎，系统性红斑狼疮，牛皮癣和其它炎性皮肤病，I型糖尿病，哮喘，过敏，和炎性肠疾病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。
本领域技术人员也认识到，通过检测GITR的活性下调，例如通过检测GITRL的下调(包括但不限于在人受试者中使用这些方法)，上述方法或其变化也可用于在受试者(例如，直接或间接地涉及降低GITRL水平)中诊断、预测和监控各种癌症和感染性疾病的进展。
GITRL和相关分子在治疗中的用途申请者相信其是第一个认识到通过GITRL或其它GITR激动剂将GITR结合在效应T细胞上给效应T细胞提供了共刺激信号，其中这种信号使所述效应T细胞不易受由CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的影响并且增加了效应T细胞应答抗CD3或其它激活信号时的增殖能力。尽管使用鼠科动物模型来揭示所述机制，但本领域众所周知在鼠科动物模型中研究的免疫学机制可以和经常被转移至人免疫系统中。同样，公开的使用GITRL和相关分子(即，GITR激动剂或GITR拮抗剂)治疗涉及免疫系统失调的病症例如自身免疫疾病、炎症和移植排斥以及癌症和感染性疾病的方法可特别用于在人中治疗这类病症。在实践所述公开的方法中，本领域技术人员认识到GITR和GITRL的人同源物以及人GITR激动剂和拮抗剂可用于本发明的方法，所述方法使用GITRL和GITRL相关蛋白(即，GITR激动剂和拮抗剂)在人中治疗自身免疫疾病、炎症和移植排斥以及癌症和感染性疾病。
此处公开的GITRL相关分子，即GITR激动剂和拮抗剂(包括使用上述方法鉴定的GITRL多核苷酸和/或多肽活性的调节子)，可在体外或离体使用，或整合到药物组合物中并在体内给个体施用以治疗，例如，通过施用GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、中和抗GITR抗体和/或中和抗GITRL抗体)治疗自身免疫疾病，或例如通过施用GITR激动剂(例如，GITRL多核苷酸、GITRL多肽或其融合蛋白、激动性小分子和/或激动性抗GITR抗体)治疗癌症。这种GITRL和/或相关分子(包括调节子)包括，但不限于小鼠GITRL和其同源物(和针对这类分子的抗体)，而这些同源物包括，但不限于人GITRL。几种考虑用于确定是否施用GITRL和/或GITRL相关分子的药物基因组方法对本域技术人员来说是熟知的，其包括基因组范围的相关性、候选基因途径和基因表达特征。要配制与本发明的药物组合物想要的施用途径相容的本发明的药物组合物(例如，口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体)。其它施用途径的非限定性例子包括肠胃外(例如，静脉内)、皮内、皮下、经口(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠施用。与各想要途径相容的药物组合物在本领域是众所周知的。
当与药物可接受载体组合时，GITR激动剂或拮抗剂可用作药物组合物。除了GITR激动剂或拮抗剂以及载体外，这种组合物还可包含各种稀释剂、填充剂、盐份、缓冲液、稳定剂、增溶剂和其它本领域熟知的材料。术语“药物可接受”是指不影响活性成分的生物学活性效率的无毒性材料。载体的特征依赖于施用途径。
本发明的药物组合物也可包含细胞因子、淋巴因子或其它造血因子例如M-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、G-CSF、干细胞因子和促红细胞生成素。如在下面更详细描述的，所述药物组合物也可包括抗细胞因子抗体。所述药物组合物可包含溶血栓或抗溶血栓因子例如血纤维蛋白溶酶原激活剂和因子VIII。如下面更详细描述的，所述药物组合物可进一步包含其它抗炎性试剂。这些额外的因子和/或试剂可用于药物组合物中以与GITR激动剂或拮抗剂一起产生增效作用(协同作用)，或将GITR激动剂或拮抗剂造成的副作用降到最小。相反地，GITR激动剂或拮抗剂可用于特定细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶血栓或抗溶血栓因子或抗炎试剂的制剂中以将细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶血栓或抗溶血栓因子或抗炎试剂的副作用降到最小。
本发明的药物组合物可以脂质体的形式存在，在所述脂质体中，除了其它药物可接受载体外，GITR激动剂或拮抗剂与双亲性试剂例如在水溶液中以聚集形式如微团、不溶性单分子层、液晶或多层形式存在的脂质结合。用于脂质体制剂的合适脂质包括，但不限于，单甘油酯，二甘油酯，硫苷脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂角苷，胆汁酸等。这些脂质体制剂的制备在本领域技术人员的水平之内，例如，如在美国专利号4,235,871；美国专利号4,501,728；美国专利号4,837,028和美国专利号4,737,323所公开的，所有文献在此引用作为参考。
如此处所用的，术语“治疗有效量”是指足以显示有意义的患者益处的药物组合物或方法的各活性成分的总量，所述有意义的患者益处是例如减轻这些病症的症状、治愈或增加这些病症的治愈速度。当单独地使用单一活性成分时，术语是指单独的活性成分的剂量。当用于组合时，术语表示导致治疗有效性的活性成分的组合剂量，无论是以组合、顺次施用还是同时施用。
在实践本发明的治疗或用途的方法中，给受试者例如哺乳动物(例如，人)施用治疗有效量的GITR激动剂(例如，GITRL多核苷酸或其表达的GITRL多肽)或GITR拮抗剂(例如，中和抗GITRL抗体或中和抗GITR抗体)。可根据本发明的方法单独地或与其它治疗法结合施用GITR激动剂或拮抗剂，所述其它治疗法是例如使用细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、或抗炎试剂的治疗方法。当与一种或多种试剂共施用时，可将GITR激动剂或拮抗剂与第二种试剂同时施用或依次施用。如果依次施用，那么主治医生将决定合适的施用顺序，例如GITRL多肽(或其融合蛋白)或中和抗GITRL抗体与其它试剂联用。
当治疗有效量的GITR激动剂或拮抗剂是经口施用时，那么结合剂以片剂、胶囊、粉剂、溶液或酏剂的形式存在。当以片剂形式施用时，本发明的药物组合物可额外地包含固体载体例如明胶或佐剂。所述片剂、胶囊和粉剂包含从大约5至95％的结合剂，并且优选地包含从大约25至90％的结合剂。当以液体形式施用时，可加入液体载体例如水、石油、动物或植物来源的油例如花生油、矿物油、大豆油或芝麻油或合成油。药物组合物的液体形式可进一步含有生理盐溶液、葡萄糖或其它糖类溶液、或二元醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式施用时，所述药物组合物含有按重量计算从大约0.5至90％的结合剂，和优选地按重量计算从大约1至50％的结合剂。
当通过静脉内、皮内或皮下注射施用治疗有效量的GITR激动剂或拮抗剂时，所述GITR激动剂或拮抗剂以无热原、肠胃外可接受的水溶液形式存在。这类已考虑pH、等渗性、稳定性等的肠胃外可接受蛋白溶液的制备，在本领域技术人员的掌握之内。除了GITR激动剂或拮抗剂外，优选的用于静脉内、皮内或皮下注射的药物组合物还应当包含等渗载体例如氯化钠注射液、Ringer’s注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸化的Ringer’s注射液或其它本领域已知的载体。本发明的药物组合物也可以包含稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或其它本领域技术人员已知的添加物。
GITR激动剂或拮抗剂在本发明药物组合物中的含量依赖于被治疗的病症的性质和严重程度，以及依赖于患者以前已经历的治疗的性质。最终，主治医生将决定医治各单个患者所需的GITR激动剂或拮抗剂的量。最初，主治医生施用低剂量的GITR激动剂或拮抗剂并观察患者的反应。然后可施用更大剂量的GITR激动剂或拮抗剂直至患者获得最佳的治疗效果，这时通常不再进一步增加剂量。用于实践本发明方法的各种药物组合物应当包含每Kg体重大约0.1μg至大约100mg的例如GITRL多肽或中和抗GITRL抗体。
使用本发明药物组合物进行的静脉内(i.v.)治疗的持续时间视正在接受治疗的疾病的严重程度和各单个患者的状况和特异体质而变化。每次连续静脉内施用GITR激动剂或拮抗剂的持续时间可在12至24小时范围内。也涉及使用本发明药物组合物进行的皮下(s.c.)治疗法。这些治疗可每天、每周或更优选地每两周或每月施用一次。也涉及到当所述GITR激动剂或拮抗剂是小分子时，治疗可每天一次、每天两次、每天三次等进行。最终主治医生将决定通过静脉内或皮下治疗的或用小分子治疗的合适持续时间以及使用本发明药物组合物治疗的施用时间安排。
本发明的多核苷酸和蛋白预期表现一种或多种下面确定的用途或生物学活性(包括与此处引用的测定法相关的)。通过施用或使用这些蛋白或通过施用或使用编码这些蛋白的多核苷酸(例如，基因治疗或适合于DNA导入的载体)可提供所描述的本发明的蛋白的用途和活性。
使用GITRL和其它GITR激动剂增加免疫应答在一个方面，本发明提供了用于增加免疫细胞例如T细胞(例如，效应T细胞)增殖的方法，所述方法将免疫细胞或免疫细胞群体与GITR激动剂例如本发明的GITRL多核苷酸或多肽(例如，其融合蛋白)和/或激动性抗GITR抗体接触，它们加强或增强了GITR的活性。这些方法基于，至少部分基于下列发现激动性抗GITR抗体逆转CD4+CD25+T细胞介导的抑制CD4+CD25-T细胞增殖的作用(实施例5)。所述方法也部分基于下列发现通过例如GITRL或激动性抗GITR抗体的GITR结合诱导了效应T细胞(例如，CD4+CD25-和CD8+T细胞)(实施例9和实施例13)的增殖。申请人也显示通过GITRL的GITR结合为效应T细胞(例如CD4+和CD8+T细胞)提供了共刺激信号，因此增加了T细胞克服由CD4+CD25+调节性T细胞介导的抑制作用的能力和应答抗CD3(实施例11和13)而增殖的能力；即，通过GITR激动剂(例如，GITRL多肽、其活性片段和/或激动性抗GITR抗体)结合于效应T细胞上表达的GITR使得效应T细胞不易受由CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的影响。因此，刺激效应T细胞中的GITR活性的GITR激动剂其自身或与抗原例如佐剂(例如，疫苗佐剂)组合可用于上调体内免疫应答，例如用于治疗癌症和感染性疾病。
在一个实施方案中，GITR激动剂(例如，GITRL多核苷酸、多肽、其活性片段和/或融合蛋白、激动性小分子和/或激动性抗GITR抗体)可用于治疗各种免疫缺陷和病症(包括严重的组合免疫缺陷(SCID))，例如，在上调T细胞的生长和增殖方面。这些免疫缺陷可以是遗传的或由病毒(例如，HIV)以及细菌或真菌感染引起的，或可由自身免疫疾病造成的。更特别地，由病毒、细菌、真菌或其它感染引起的感染性疾病可使用本发明的蛋白治疗，所述感染包括由HIV、肝炎病毒、疱疹病毒、分枝杆菌(mycobacteria)、利什曼原虫属物种(Leishmaniaspp.)、malaria spp.造成的感染和各种真菌感染例如念珠菌病。当然，在这个方面，本发明的蛋白也可用于通常想要增强免疫系统的情况下，即在癌症的治疗中。
作为上调免疫应答的方式，抗原逞递细胞(APC)抗原的上调(例如，B7.1、B7.2和B7.3的上调)也可用于治疗。免疫应答的上调可以以增强已存在的免疫应答或引发原初免疫应答的形式进行。例如，通过刺激具有抗原逞递功能的树突状细胞增强免疫应答可用于病毒感染的情况下。此外，通过系统地施用抗原呈递分子的刺激形式例如树突状细胞抗原可减轻系统性病毒疾病例如流感、普通感冒和脑炎。
可选择地，通过从患者身上除去T细胞、用病毒抗原脉冲的专职APCs(例如，B细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞)和GITR激动剂(例如，GITRL多核苷酸、多肽、其活性片段和/或融合蛋白、激动性小分子和/或激动性抗GITR抗体)离体共刺激T细胞，在被感染的患者中可增强抗病毒免疫应答。GITR激动剂(例如GITRL多核苷酸、多肽、其活性片段和/或融合蛋白、和/或激动性抗GITR抗体)可以可溶性蛋白或由所述APCs表达的形式提供。另一个增强抗病毒免疫应答的方法是从患者身上分离被感染的细胞，用如此处所描述的编码本发明的GITRL蛋白的核酸转染其，以使所述细胞在其表面表达所有或部分所述蛋白，然后将经转化的细胞重新导入所述患者体内。这样所述经转染的细胞可为效应T细胞体内递送共刺激信号，即，通过所述经转染的细胞表达GITRL蛋白或其它活性片段，这些GITRL蛋白与效应T细胞上的GITR的结合可使所述T细胞不易受CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的影响。
在另一个应用中，上调或增强APC抗原功能可用于肿瘤免疫性的诱导。可将用编码至少一个本发明肽的核酸转染的肿瘤细胞(例如肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、成神经细胞瘤和癌)施用给患者以在所述患者体内克服肿瘤特异性耐受性。如果想要，可转染所述肿瘤细胞以表达肽组合。例如，可用指导GITR激动剂(例如，GITRL多肽、其活性片段和/或融合蛋白，和/或激动性抗GITR抗体)表达的表达载体离体转染获自患者的肿瘤，所述GITR激动剂可以只与具有B7.2样活性的肽一起表达或与具有B7.1样活性的肽缀合，等等。将经转染的肿瘤细胞放回患者体内以导致在所述经转染的细胞表面表达所述肽。可选地，基因治疗技术可用于在体内靶向用于转染的肿瘤细胞。
GITR激动剂(例如，GITRL多肽、其活性片段和/或融合蛋白、激动性小分子和/或激动性抗GITR抗体)和肿瘤细胞表面的具有APC抗原(例如，B7.1、B7.2等)的活性的肽的存在为T细胞提供了必需的共刺激信号，以诱导T细胞介导的抗所述经转染肿瘤细胞的免疫应答。此外，可用核酸转染肿瘤细胞从而在所述细胞表面表达I类MHC或II类MHC蛋白(或对应的HLA分子)，所述肿瘤细胞是缺少I类MHC或II类MHC分子或不能再表达足够量的I类MHC或II类MHC分子的肿瘤细胞，所述核酸是编码所有或部分(例如，细胞质结构域截短的部分)I类MHCα链蛋白和β2微球蛋白或II类MHCα链蛋白和II类MHCβ链蛋白(或对应的人HLA核酸)。合适的I类或II类MHC和GITR激动剂(例如GITRL多肽、其活性片段和/或融合蛋白、和/或激动性抗GITR抗体)和/或具有APC抗原(例如，B7.1、B7.2等)活性的肽的表达诱导了T细胞介导的抗经转染的肿瘤细胞的免疫应答。任选地，编码反义构建体例如恒定链的基因也可用于与编码GITR激动剂(例如GITRL多肽、其活性片段、其融合蛋白、和/或激动性抗GITR抗体)和/或具有APC抗原活性的肽一起共转染以提高肿瘤相关抗原的呈递和诱导肿瘤特异性免疫，所述反义构建体可阻止II类MHC相关蛋白的表达。因此，在人受试者中，诱导T细胞介导的人免疫应答可足以在所述受试者中克服肿瘤特异性耐受性。
在另一个实施方案中，本发明的GITR激动剂(例如GITRL多肽、其活性片段和/或融合蛋白、其融合蛋白、激动性小分了和/或激动性抗GITR抗体)可用作疫苗佐剂。佐剂是具有增强和/或控制抗各种抗原的免疫应答的发展和特性的免疫调节化合物，所述抗原其自身具有较弱的免疫原性。细胞因子和/或淋巴因子可用作佐剂。合适选择的佐剂可诱导良好的体液和细胞免疫应答，所述应答在缺少佐剂的情况下不能发生。特别地，佐剂在增强对疫苗中的亚单位和肽抗原的免疫应答方面具有显著功效。其刺激活性对针对蛋白抗原的抗原特异性免疫应答的发展也是有益的。对许多要求强粘膜应答、高血清滴度、CTL(细胞毒性T淋巴细胞)的诱导和强烈的细胞应答的抗原来说，佐剂和细胞因子/淋巴因子组合提供了大多数抗原制剂不能提供的刺激。
如此处所使用的，短语“疫苗佐剂”或“疫苗治疗”是指使用GITR激动剂(例如，GITRL多核苷酸、GITRL多肽、其活性片段、其融合蛋白、和/或激动性抗GITR抗体)和抗原(例如，病毒、寄生虫和细菌多肽、蛋白和肽)或其它抗原(例如，肿瘤或癌细胞多肽、蛋白或肽)或编码抗原的多核苷酸增强、抑制或调节针对所述抗原的免疫应答。在该定义的意义上，“组合”应当是指与抗原缀合使用、同时使用(组合的或非组合的)或与抗原依次使用。
术语“疫苗佐剂组合物”是指额外地以常规制备可注射液体溶液或悬浮物的方式包含免疫学可接受的稀释剂或载体。所述疫苗佐剂组合物可额外的包含进一步增强由GITR激动剂引起的免疫应答的试剂。例如，所述疫苗佐剂组合物可额外地包含3-O-去酰化单磷酰脂A(MPL_；Corixa Corporation，Seattle，WA)或单磷酰脂A和其衍生物和类似物。MPL_可以1-100μg/剂的范围使用。
用于疫苗治疗的抗原包括来源于免疫原性或非免疫原性蛋白的蛋白、肽或多肽以及下列任何一种物质糖类、蛋白、多核苷酸或寡核苷酸、或其它大分子组分或其片段。如此节所使用的，“肽”包含至少6个氨基酸的系列和包含至少一个抗原性决定簇，而“多肽”是比肽长的分子，但不构成全长蛋白。如此处所使用的，“片段”包含部分，但小于完整的糖类、蛋白、多肽或寡核苷酸、或其它大分子组分。
如此处所用的，术语“有效的佐剂量”是指此处描述的佐剂组合的剂量，所述剂量适合在脊椎动物宿主中激起增强的免疫应答。特定的剂量部分依赖于所述宿主的年龄、体重和医学状况以及所述抗原和施用的方法。
可通过各种途径将本发明的疫苗佐剂组合物给人或非人脊椎动物施用，所述途径包括但不限于鼻内、经口、阴道、直肠、胃肠外、皮内、透皮(参见，例如国际申请WO 98/20734，此处引用作为参考)、肌内、腹膜内、皮下、静脉内和动脉内。所述抗原性组合物的抗原组分的量部分地视所述抗原的性质和受试者的年龄、体重和医学状况以及施用的方法而定。同样，本领域技术人员可容易地确定合适的剂量。同时施用抗原和佐剂组合是优选的，尽管不是必需的。本领域技术人员也容易确定抗原性组合物的剂量数量和剂量方案。在一些情况下，佐剂组合的佐剂特性可减少所需的剂量数量或剂量方案的时程。
本发明的佐剂组合适合与来自各种病原性微生物的大量抗原组合使用，所述病原性微生物包括，但不限于感染人或非人脊椎动物的病毒、细菌、真菌或寄生虫微生物或来自癌细胞或肿瘤细胞(例如，肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、成神经细胞瘤和癌)。所述抗原可包含来源于蛋白的肽或多肽以及下列任何一种物质的片段糖类、蛋白、多核苷酸或寡核苷酸、癌症或肿瘤细胞、或其它大分子组分。在一些情况下，超过一种抗原包含于所述抗原性组合物。
想要的包含本发明佐剂组合的病毒疫苗包括涉及预防和/或治疗疾病的那些，所述疾病是由(不限于)人免疫缺陷病毒，猿免疫缺陷病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒1-3型，流感病毒，单纯疱疹病毒，人巨细胞病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，人乳头状瘤病毒，脊髓灰质炎病毒，轮状病毒，嵌杯状病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒，腺病毒，狂犬病病毒，犬瘟热病毒，牛瘟病毒，冠状病毒，细小病毒，传染性鼻气管炎病毒，猫白血病病毒，猫传染性腹膜炎病毒，禽传染性法氏囊病病毒，新城疫病毒，禽疱疹病毒1型，猪生殖和呼吸道综合症病毒，马动脉炎病毒和各种脑炎病毒造成的。
想要的包含本发明佐剂组合的细菌疫苗包括涉及预防和/或治疗疾病的那些，所述疾病是由(不限于)流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)(典型的和非典型的)，睡眠嗜血菌(Haemophilussomnus)，粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，粪链球菌(Streptococcus faecalis)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，志贺氏菌属，霍乱弧菌(Vibriocholerae)，白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)-胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellular)复合物，奇异变形菌(Proteus mirabilis)，普通变形菌(Proteus vulgaris)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)，布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)，溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)，多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)，大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和鸡败血枝原体(Mycoplasmagallisepticum)造成的。
想要的包含本发明佐剂组合的抗真菌病原体的疫苗包括涉及预防和/或治疗疾病的佐剂，所述疾病是由(不限于)曲霉属，芽生菌属，假丝酵母，球孢菌属，隐球酵母属和组织胞浆菌属造成的。
想要的包含本发明佐剂组合的抗寄生虫的疫苗包括涉及预防和/或治疗疾病的那些，所述疾病是由(不限于)Leishmania major，蛔虫属，鞭虫属，贾第虫属，裂体吸虫，隐孢子虫属，毛滴虫属，鼠弓浆虫(Toxoplasma gondii)和Pneumocystis carinii造成的。
想要的用于在脊椎动物中激起治疗性或预防性抗癌作用的疫苗(包含本发明佐剂组合)包括利用癌抗原或肿瘤相关抗原的疫苗，所述抗原包括但不限于前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)，MUC-1，Her2，CA-125，MAGE-3，EGFR，HELP，GCC，CD66-c，prostasin，TMPRSS3，TADG 12和TADG 15。
在HIV和SIV的情况下，所述抗原性组合物包括至少一个来自所述病毒的蛋白、多肽、肽或片段。在一些情况下，抗原性组合物包含多个HIV或SIV蛋白、多肽、肽和/或片段。
本发明的佐剂组合制剂也适合用作多核苷酸疫苗(也称作DNA疫苗)中的佐剂。这些疫苗可进一步包括促进剂例如布比卡因(参见美国专利号5,593,972，此处引用作为参考)。
下列方法是本领域已知的1)刺激抗原呈递细胞功能例如树突状细胞功能；2)从患者身上取出T细胞，对其进行离体共刺激，然后将其重新导入所述受试者；3)转染肿瘤细胞以诱导肿瘤免疫性；和4)使用疫苗佐剂(参邮，例如，Cerundolo等人(2004)Dendritic cellsa journey from laboratory to clinic.Nat.Immunol.5(1)7-10；Ko等人(2003)Immunotherapy of malignant diseases.Int.Arch.Allergy Immunol.132294-309；Valmori等人(1999)Anantigen-targeted approach to adoptive transfer therapy ofcancer.Cancer Res.592167-73)。
使用GITR拮抗剂降低免疫细胞活性在另一个方面，本发明提供用于维持效应T细胞例如CD4+和CD8+T细胞或其群体对CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制性作用的易感性的方法。所述方法包括将T细胞群体与足以抑制所述免疫细胞或群体的活性的剂量的GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、中和抗GITR抗体、和/或中和抗GITRL抗体)接触。GITR的拮抗剂也可给想要抑制其免疫应答的受试者施用。这些病症包括，例如，自身免疫疾病(例如关节炎疾病)、炎症或器官移植。
这些方法基于，至少部分基于下列发现GITR活性的降低(例如，通过使用中和抗GITRL抗体)恢复了CD4+CD25+介导的抑制作用(实施例13)，即，中和抗GITRL抗体保持了效应T细胞例如CD4+和CD8+T细胞对由CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的敏感性。此外，申请人已证实用中和抗GITRL抗体温育效应T细胞在鼠科动物实验性自身免疫脑炎(EAE)(实施例14)中减轻了疾病。因此，GITR拮抗剂即抑制GITR活性(例如，抗GITRL抗体)的分子可用于在体内保持效应T细胞对由CD4+CD25+T细胞产生的抑制作用的易感性，例如用于治疗或预防免疫细胞相关性病理学，包括移植排斥、炎症和自身免疫疾病。
使用GITR拮抗剂的方法也可用于抑制效应T细胞的活性(例如，增殖、分化、存活)并因此可用于治疗或预防各种免疫病症。可治疗或预防的病症的非限定性例子包括但不限于移植排斥、自身免疫疾病(包括，例如，糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎，骨关节炎，牛皮癣性关节炎)，多发性硬化，脑脊髓炎，重症肌无力，系统性红斑狼疮，自身免疫甲状腺炎，皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)，牛皮癣，斯耶格尼综合症，克罗恩氏疾病，口疮性溃疡，虹膜炎，结膜炎，角膜结膜炎，溃疡性结肠炎，spondyoarthropathy，强直性脊柱炎，内因性气喘，变应性哮喘，皮肤红斑狼疮，硬皮病，阴道炎，直肠炎，药物性皮炎，leprosyreversal reactions，erythema nodosum leprosum，自体免疫性葡萄膜炎，变应性脑脊髓炎，急性坏死性出血性脑病，idiopathicbilateral progressive sensorineural hearing loss，再生障碍性贫血，单纯红细胞性贫血，idiopathic thrombocytopenia，多软骨炎，韦格纳肉芽肿瘤，慢性活动性肝炎，史-约综合征，idiopathicsprue，扁平苔癣，格雷夫斯病，结节病，原发性胆汁性肝硬变，uveitis posterior，和间质性肺纤维化)，移植物抗宿主病，和变态反应例如，特应性变态反应.可使用包括施用GITR拮抗剂例如中和GITRL抗体治疗的优选的病症包括关节炎疾病(例如，类风湿性关节炎，青少年类风湿性关节炎，骨关节炎，牛皮癣性关节炎，和强直性脊柱炎(优选为类风湿性关节炎))，多发性硬化，I型糖尿病，狼疮(SLE)，IBD，克罗恩氏病，哮喘，脉管炎，变态反应，硬皮病和牛皮癣。
在另一个实施方案中，GITR拮抗剂单独地或与其它上面描述的治疗试剂(例如，TNF拮抗剂)一起可用于治疗多发性骨髓瘤和相关B淋巴细胞恶性肿瘤(Brenne，A.等人(2002)Blood 99(10)3756-62)。
通过使用GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)可能以许多方式调节免疫应答。下调可以是抑制或阻止已在进行的免疫应答，或可涉及防止免疫应答诱导。通过增加T细胞应答的抑制作用或通过在T细胞中诱导特异性耐受或同时通过这两者可抑制经激活的T细胞的功能。T细胞应答的免疫抑制作用通常是活化的非抗原特异性的过程，所述过程要求将所述T细胞连续暴露于抑制性试剂中。在T细胞中涉及诱导无应答性和无反应性的耐受性与免疫抑制性的区别在于其通常是抗原特异性的并且在不暴露于耐受试剂后继续发挥作用。有效地，可通过在耐受试剂不存在的情况下对重新暴露于特异性抗原的无T细胞应答来证实耐受性。
下调或防止一个或多个抗原呈递细胞抗原(例如，B7.1)的功能并因此预防经激活的T细胞高水平合成淋巴因子可用于组织、皮肤和器官移植的状况和移植物抗宿主疾病(GVHD)中。例如，阻止T细胞功能应当在组织移植中导致减小的组织破坏。通常，在组织移植物中，移植排斥是由于其被T细胞当作外来物质接着通过免疫反应破坏所述移植物引起的。在进行移植之前，和分子一起施用GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)可导致所述分子与免疫细胞表面的天然配体的结合而不会传递相应的共刺激信号，所述分子是抑制或阻断B7淋巴细胞抗原与其免疫细胞的天然配体(例如单独的可溶性具有B7.2活性的单体形式的肽或与具有另外的B淋巴细胞抗原(例如，B7.1)活性的单体形式的肽或阻断性抗体组合)相互作用。以这种方式阻断B7淋巴细胞抗原功能阻止了免疫细胞例如效应T细胞合成细胞因子并因此起着免疫抑制作用。此外，共刺激的缺少也足以使T细胞无反应性，因此在受试者中诱导耐受性。通过B7淋巴细胞抗原阻断性试剂诱导的长效耐受性可避免反复施用这些阻断试剂的需要。为在受试者中获得足够的免疫抑制或耐受性，阻断B淋巴细胞抗原组合的功能可能也是必需的。
可使用动物模型估计特定阻断试剂在防止器官移植排斥或GVHD中的功效，所述动物模型用于预测在人中的有效性。可使用的合适系统的例子包括大鼠中同种心脏移植和小鼠中的异种胰岛细胞移植，如在Lenschow等人(1992)science 257789-92和Turka等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911102-05中所描述的上述两者都已用于考察CTLA4Ig融合蛋白在体内的免疫抑制功效。此外，鼠科动物的GVHD模型(参见，例如Paul，ed.，Fundamental Immunology，RavenPress，New York，1989，pp.846-47)可用于确定阻断B淋巴细胞抗原功能在体内对该疾病发展的影响。
阻断APC抗原的功能也可治疗性地用于治疗自身免疫疾病。许多自身免疫疾病是T细胞不恰当活化造成的，所述T细胞对自身组织产生反应并且提高了参与疾病病理学的细胞因子和自身抗体的产量。阻止自身反应性T细胞的活性可减少或消除疾病症状。将GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)与试剂一起施用可抑制T细胞活性和预防可参与疾病过程的自身抗体或T细胞来源的细胞因子的产生，其中所述试剂通过破坏APC抗原的受体配体相互作用来阻断对T细胞的共刺激。此外，将GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)和阻断性试剂一起施用可诱导自身反应性T细胞的抗原特异性耐受性，从而可导致长期地缓解疾病。可通过使用人自身免疫疾病的良好表征的大量动物模型来确定这些试剂在预防或减轻自身免疫疾病上的功效。例子包括鼠科动物实验性自身免疫脑炎(EAE)、MRL/1pr/1pr小鼠或NZB杂交小鼠中的系统性红斑狼疮、鼠科动物自身免疫性胶原关节炎、NOD小鼠和BB大鼠中的糖尿病和鼠科动物实验性重症肌无力(参见，例如Paul，ed.，Fundamental Immunology，Raven Press，New York，1989，pp.840-56)。
在另一个实施方案中，将GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)(包括其治疗性组合物)以组合治疗方式即与其它试剂(例如治疗性试剂)一起施用，所述治疗性试剂用于治疗病理学状况或病症，例如免疫病症和炎症。术语“组合”在本文是指基本同时(同时或依次)施用试剂。如果依次施用，在开始施用第二个化合物时，二个化合物中的第一个优选地仍能在治疗部位以有效的浓度被检测到。
例如，组合治疗可包括一个或多个GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)，用另外的治疗性试剂配制所述GITR拮抗剂和/或与其一起施用，如在下面更详细描述的，所述治疗性试剂是例如一个或多个细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎因子、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性或细胞抑制剂。此外，此处描述的一个或多个GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)可与二个或更多个此处描述的治疗试一起施用。这样的组合治疗可有利地利用更低的治疗剂施用剂量，因此避免了可能的和各种单一治疗相关的毒性或并发症。此外，此处公开的治疗剂以不同于GITRL受体途径的途径起作用，因此预期增强和/或协同增强GITR拮抗剂的功效，即其中效应T细胞保持其对CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的敏感性。
优选的与GITRL拮抗剂组合使用的治疗剂是在不同阶段干涉自身免疫和随后的炎症应答的试剂。在一个实施方案中，可用一个或多个另外的试剂共配制此处描述的一个或多个GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)或与其一起施用，所述另外的试剂是例如其它细胞因子或生长因子拮抗剂(例如，可溶性受体、肽抑制剂、小分子、配体融合体)；或结合其它靶的抗体或其抗原结合片段(例如结合其它细胞因子或生长因子、其受体或其它细胞表面分子的抗体)；和抗炎性细胞因子或其激动剂。可与此处描述的GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)一起使用的试剂的非限定性例子包括，但不限于一个或多个白细胞介素或其受体的拮抗剂，例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18和IL-22的拮抗剂；细胞因子或生长因子或其受体的拮抗剂，例如肿瘤坏死因子(TNF)、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)也可与例如抗体的抑制剂一起施用，所述抗体是抗细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或其配体，包括CD154(gp39或CD40L)或LFA-1/ICAM-1和VLA-4/VCAM-1的抗体(Yusuf-Makagiansar等人(2002)Med.Res.Rev.22146-67)。优选地可用于与此处描述的GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)一起使用的拮抗剂包括IL-1、IL-12、TNFa、IL-15、IL-17、IL-18和IL-22的拮抗剂。
这些试剂的例子包括IL-12拮抗剂，例如嵌合的、人源化的、人或体外产生的抗体(或其抗原结合片段)，所述抗体能与IL-12(优选地人IL-12)结合，例如在WO 00/56772公开的抗体；IL-12受体抑制剂例如抗人IL-12受体的抗体；和IL-12受体例如人IL-12受体的可溶性片段。IL-15拮抗剂的例子包括抗IL-15或其受体的抗体(或其抗原结合片段)，例如，嵌合的、人源化的、人或体外产生的抗人IL-15或其受体、IL-15受体的可溶性片段和IL-15结合蛋白的抗体。IL-18拮抗剂的例子包括抗体，例如嵌合的、人源化的、人或体外产生的抗人IL-18，IL-18受体的可溶性片段和IL-18结合蛋白的抗体(或其抗原结合片段)(IL-18BP，Mallet等人(2001)Circ.Res.28)。IL-1拮抗剂的例子包括白细胞介素1转化酶(ICE)抑制剂，例如Vx740、IL-1拮抗剂，例如IL-1RA(Anikinra，Amgen)、sIL1RII(Immunex)和抗IL-1受体抗体(或其抗原结合片段)。
TNF拮抗剂的例子包括嵌合的、人源化的、人或体外产生的抗TNF(例如人TNFa)的抗体(或其抗原结合片段)例如D2E7(人TNFa抗体，美国6,258,562)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化的抗TNFa抗体，Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合的抗TNFa抗体；RemicadeTM，Centocor)；抗TNF抗体片段(例如，CPD870)；TNF受体可溶性片段例如p55或p75人TNF受体或其衍生物例如75kd TNFR-IgG(75kDTNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM；Immunex；参见，例如；Arthritis&Rheumatism(1994)37S295；J.Invest.Med.(1996)44235A)，p55 kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白(Lenercept))；酶拮抗剂，例如TNFa转化酶(TACE)抑制剂(例如，α磺酰羟氨酸衍生物，WO 01/55112，和N-羟甲酰胺TACE抑制剂GW 3333、-005或-022)；和TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白；参见例如Arthritis&Rheumatism(1996) 39(9)(supplement)S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)26837-42)。优选的TNF拮抗剂是TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kd TNFR-IgG和TNFa转化酶(TACE)抑制剂。
在另一个实施方案中，此处描述的GITR拮抗剂可与一种或多种下列试剂一起施用IL-13拮抗剂例如可溶性IL-13抗体(sIL-13)和/或抗IL-13抗体；IL-2拮抗剂例如DAB 486-IL-2和/或DAB389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen；参见例如，Arthritis&Rheumtism(1993)361223)和/或抗IL-2R抗体例如抗Tac(人源化抗IL-2R；Protein Design Labs，Cancer Res.(1990)50(5)1495-502)。另一个组合包括GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)与非消耗性抗CD4抑制剂(IDEC-CE9.1/SB 210396；非消耗性灵长类动物化的抗CD4抗体；IDEC/SmithKline)。另一个优选的组合包括共刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体；和p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、抗炎细胞因子例如IL-4(DNAX/Schering)、IL-10(SCH 52000；重组IL-10DNAX/Schering)；IL-13和TGF-β和其激动剂(例如，激动剂抗体)。
在另一个实施方案中，一个或多个GITR拮抗剂可与一个或多个抗炎药物、免疫抑制剂或代谢或酶抑制剂共配制和/或共施用。可与此处描述的GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)一起使用的药物或抑制剂的例子包括，但不限于一种或多种下列物质非类固醇抗炎药物(NSAIDs)例如布洛芬、替尼达普(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)39(9)(supplement)S280))、奈普生(参见例如，Neuro.Report(1996)71209-13)、美洛昔康、吡罗昔康、双氯芬酸和吲哚美辛；柳氮黄吡啶(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)39(9)(supplement)S281)；皮质类固醇例如泼尼松龙；细胞因子抑制性抗炎药物(CSAIDs)；核苷酸生物合成抑制剂例如嘌呤生物合成抑制剂、叶酸拮抗剂(例如，氨甲蝶呤(N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰]-L-谷氨酸)；和嘧啶生物合成抑制剂，例如二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂(例如，来氟米特(参见，例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S131；Inflammation Research(1996)45103-07)。用于与GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)一起使用的优选的治疗剂包括NSAIDs、CSAIDs、(DHODH)抑制剂(例如，来氟米特)和叶酸拮抗剂(例如，氨甲蝶呤)。
另外的抑制剂的例子包括一种或多种下列物质皮质类固醇(经口、吸入、局部注射)；免疫抑制剂例如环孢菌素、他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制剂例如西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如，雷帕霉素酯衍生物例如CCI-779(Elit(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(8)1249-53；Huang等人(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(2)295-304)；通过促炎细胞因子干涉信号传递的试剂，例如TNFa或IL-1(例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂例如塞来考苷、罗非考昔和其变体(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S81)；磷酸二酯酶抑制剂例如R973401(IV型磷酸二酯酶抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumtism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S282))；磷酸脂酶抑制剂，例如细胞质磷酸脂酶2抑制剂(cPLA2)(例如，三氟甲基酮类似物(美国专利号6,350,892))；脉管内皮细胞生长因子或生长因子受体的抑制剂例如VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂；和血管发生抑制剂。与GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)一起使用的优选的治疗剂是免疫抑制剂例如环孢菌素、他克莫司(FK-506)；mTOR抑制剂例如西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物例如CCI-779)；COX2抑制剂例如塞来考昔和其变体；和磷脂酶抑制剂例如细胞质磷脂酶2(cPLA2)抑制剂，例如三氟甲基酮类似物。
可与GITRL拮抗剂一起使用的治疗剂的另外的例子包括一种或多种下列物质6-巯基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤sulphasalazine；美沙拉秦；奥沙拉秦氯喹/羟化氯喹；青霉胺；aurothiomalate(肌内和经口)；硫唑嘌呤；cochicine；β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇，特步他林，沙美特罗)；黄嘌呤(茶碱，氨茶碱)；色甘酸盐；奈多罗米；酮替芬；异丙托溴铵和氧托溴铵；麦考酚酸吗乙酯；腺苷激动剂；抗血栓药剂；补体抑制剂；和肾上腺素能药物。
在下面更详尽地讨论使用此处公开的GITR拮抗剂与其它治疗剂一起用于治疗或预防特定免疫病症。
可与GITR拮抗剂一起使用以治疗和预防关节炎病症(例如类风湿性关节炎、炎性关节炎、类风湿性关节炎，青少年类风湿性关节炎、骨关节炎和牛皮癣性关节炎)的试剂的例子包括一种或多种下列此处描述的IL-12拮抗剂，NSAIDs；CSAIDs；TNFs例如TNFa，如此处所描述的拮抗剂；如此处所描述的非消耗性抗CD4抗体；如此处所描述的IL-2拮抗剂；抗炎细胞因子例如IL-4，IL-10，IL-13和TGFa或其激动剂；如此处所描述的IL-1或IL-1受体拮抗剂；如此处所描述的磷酸二酯酶抑制剂；如此处所描述的COX-2抑制剂；伊洛前列素(参见，例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S82)；氨甲蝶呤；萨利多胺(参见，例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S282)和萨利多胺相关的药物(例如，Celgen)；来氟米特；血纤蛋白溶酶原活性抑制剂例如氨甲环酸(参见，例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S284)；细胞因子抑制剂例如，T-614(参见，例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S282)；前列腺素E1(参见，例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S282)；硫唑嘌呤(参见，例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S281)；白细胞介素-1转化酶(ICE)抑制剂；zap-70和/或1ck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或1ck的抑制剂)；如此处所描述的脉管内皮细胞生长因子或脉管内皮细胞生长因子受体的抑制剂；如此处所述的血管生成抑制剂；皮质类固醇抗炎药物(例如SB203580)；TNF转化酶抑制剂；IL-11(参见，例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S296)；IL-13(参见，例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S308)；IL-17抑制剂(参见，例如，Arthritis&Rheumatism(1996)Vol.39，No.9(supplement)，S120)；金；青霉胺；氯喹；羟化氯喹；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；环孢菌素；总淋巴辐射物；抗甲状腺球蛋白；CD5-毒素；经口施用的肽和胶原蛋白；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRAs)HP228和HP466(HoughtenPharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；泼尼松；奥古蛋白；糖胺聚糖多硫酸；二甲胺四环素；抗IL2R抗体；海洋生物和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见，例如，DeLuca等人(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21759-77)；金诺芬；保泰松；甲氧芬那酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；齐留通；麦考芬酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(therafectin)；克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷)；和阿扎立平。优选的组合包括一种或多种GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)和氨甲蝶呤或来氟米特，在中度或严重类风湿性关节炎的情况下，为环孢菌素。
优选地与GITR拮抗剂一起使用以治疗关节炎病症的的抑制剂包括TNF拮抗剂(例如，嵌合的、人源化的、人或体外产生的抗体、或其结合TNF的抗原结合片段；TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM)，p55kD TNF受体-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗剂例如TNFa转化酶(TACE)抑制剂)；IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-22的拮抗剂；T细胞和B细胞清除剂(例如，抗CD4或抗CD22抗体)；小分子抑制剂例如氨甲蝶呤和来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)和其类似物，例如CCI-779；cox-2和cPLA2抑制剂；NSAIDs；p38抑制剂，TPL-2，Mk-2和NFkb抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择蛋白或PSGL-1抑制剂(例如，小分子抑制剂及其抗体，例如抗P-选择蛋白的抗体)；β雌激素受体(ERB)激动剂或ERB-NFkb拮抗剂。最优选的可与一种或多种GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)一起施用和/或配制的另外的治疗剂包括下列一种或多种TNF受体可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM)；氨甲蝶呤，来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物例如CCI-779。
可与GITR拮抗剂一起使用的治疗或预防多发性硬化的试剂的非限定性例子包括下列干扰素例如干扰素-α1a(例如，AvonexTM；Biogen)和干扰素-1b(BetaseronTM；Chiron/Berlex)；Copolymer 1(Cop-1；CopaxoneTM；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨；如此处描述的TNF拮抗剂；皮质类固醇；泼尼松龙；甲基泼尼松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶和tizanidine。
另外的可与GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)一起使用的拮抗剂包括抗人细胞因子或生长因子的抗体或这些因子的拮抗剂，所述因子是例如，TNF，LT，IL-1，IL-2，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12 IL-15，IL-16，IL-18，EMAP-11，GM-CSF，FGF和PDGF。此处描述的GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)可与抗其它细胞表面分子例如CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD30，CD40，CD45，CD69，CD80，CD86，CD90或其配体的抗体-起使用。所述GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)也可与例如下列试剂联用氨甲蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，麦考酚酸吗乙酯，来氟米特，NSAIDs例如布洛芬，皮质类固醇例如泼尼松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓药剂，补体抑制剂，肾上腺素能药物，通过此处描述的促炎细胞因子干扰信号传导的试剂、IL-Ib转化酶抑制剂(例如，Vx740)，抗P7s，PSGL，TACE抑制剂，T细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、金属loproteinase抑制剂，柳氮黄吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体和其衍生物，如此处所描述的，和抗炎细胞因子(例如IL-4，IL-10，IL-13和TGF)。
优选地与GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)一起使用的用于多发性硬化的治疗剂的例子包括干扰素-b例如IFNb-la和IFNb-lb；copaxone，皮质类固醇，IL-1抑制剂，TNF抑制剂，抗CD40配体和CD80的抗体，和IL-12拮抗剂。
可与GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)一起使用的用于治疗或预防炎性肠疾病(例如，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎)的试剂的非限定性例子包括下列budenoside；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素，柳氮黄吡啶；氨基水杨酸；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；双唑泰栓；脂氧化酶抑制剂；mesalamine；奥沙拉秦；巴沙拉嗪；抗氧化剂；凝血噁烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；此处所描述的TNF拮抗剂；IL-4，IL-10，IL-13和/或TGFb细胞因子或其激动剂(例如，激动剂抗体)；IL-11；泼尼松龙，地塞米松或budesonide的葡糖醛酸或葡聚糖缀合前体物；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核糖核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；慢速释放的美沙拉秦；氨甲蝶呤；血小板激活因子(PAF)的拮抗剂；ciprofloxacin；和利诺卡因。
在一些实施方案中，GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)可与一种或多种抗体一起使用，所述抗体靶向其它参与免疫应答调节例如移植排斥或移植物抗宿主疾病的靶。可与本发明的GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)一起用于治疗或预防免疫应答的非限定例子包括下列抗其它细胞表面分子的抗体，所述细胞表面分子包括但不限于CD25(白细胞介素-2受体α)，CD11a(LFA-1)，CD54(ICAM-1)，CD4，CD45，CD28/CTLA4，CD80(B7.1)和/或CD86(B7.2)。在另一个方案中，GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)与一种或多种普通的免疫抑制剂例如环孢菌素A或FK506一起使用。
在另一个实施方案中，GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITRL的中和抗体)可用作抗自身免疫疾病、炎症或移植排斥的疫苗佐剂。用于治疗这些类型病症的佐剂组合适合与广泛的抗原一起使用，所述抗原来自被靶向的自身抗原，即参与自身免疫的自身抗原，例如髓磷脂碱性蛋白；炎性自身抗原例如淀粉样肽蛋白或移植抗原例如同种抗原。所述抗原可包含来源于蛋白的肽或多肽以及下列任何一个的片段糖类、蛋白、多核苷酸或寡核苷酸、自身抗原、淀粉样肽蛋白、移植抗原、过敏原或其它大分子组分。在一些情况下，抗原性组合物包含超过一种抗原。
例如，想要的用于在脊椎动物宿主中减轻对过敏原应答的疫苗包括包含过敏原或其片段的那些，所述疫苗包含本发明的佐剂组合。在美国专利号5,830,877和公开的国际专利申请号WO 99/51259中描述了这类过敏原的例子，此处引用其全文作为参考，所述例子包括花粉、昆虫毒液、动物毛屑、真菌孢子和药物(例如青霉素)。所述疫苗干扰IgE抗体的产生，所述IgE抗体的产生是过敏反应的已知的原因。在另一个实施方案中，想要的包含本发明佐剂组合的用于预防或治疗疾病的疫苗包括包含淀粉样肽蛋白(APP)的疫苗，所述疾病的特征在于脊椎动物宿主中的淀粉状蛋白沉积。该疾病具有不同的名称爱尔茨海默氏病、淀粉样变性病或产生淀粉的疾病。因此，本发明疫苗包括本发明的佐剂组合和Aβ肽和Aβ肽的片段以及抗Aβ肽或其片段的抗体。
方法1)下调抗原呈递细胞的功能；和2)用于控制免疫抑制作用的组合治疗，在本领域众所周知(参见，例如，Xiao等人(2003)Dendritic cell vaccine designstrategies for elicitingperipheral tolerance therapy of autoimmune diseases.BioDrugs17103-11；Kuwana(2002)Induction of anergic and regulatoryT cells by plasmacytoid dendritic cells and other dendritic cellsubsets.Hum.Immunol.631156-63；Lu等人(2002)Manipulationof dendritic cells for tolerance induction in transplantationand autoimmune disease.Transplantation 73S19-S22；Rifle等人(2002)Dendritic cells and second signal blockadea steptoward allograft tolerance.Transplantation 73S1-S2；Mancini等人(2004)The management of immunosuppressionthe art and thescience.Crit.Care.Nurs.Q.2761-64)。
因此本发明的另一个方面涉及用于将GITR拮抗剂(例如，GITRL抑制性多核苷酸、拮抗性小分子、和/或针对GITR和/或GITRL的中和抗体)与其它治疗化合物一起施用的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种配制于药物载体中的结合剂，和至少一种试剂例如在一个或多个分开的药物制剂中正确配制的治疗剂。
通过下列涉及新小鼠cDNA(称为小鼠GITRL cDNA，编码称为小鼠GITRL的新的配体多肽)和新的抗GITRL抗体的实施例说明本发明。本领域技术人员理解所述实施例中的教导可用于小鼠GITRL的所有同源物。
实施例下列实施例用于帮助理解本发明，但并不意味着和不应当理解为以任何方式限定其范围。所述实施例不包括常规方法的详细描述，例如流式细胞术(例如，FACS)、PCR、Norhtern和原位杂交，或用于载体构、将编码多肽的基因插入这类载体和质粒、将这些载体和质粒导入宿主细胞和在宿主细胞中表达来自这些载体和质粒的多肽的方法。这些方法对本领域技术人员来说是熟知的。
实施例1GITRL DNA序列的鉴定实施例1.1小鼠GITRL cDNA和基因组序列的鉴定采用两个方法鉴定鼠科动物GITRL同源物。在一个方法中，将人GITRL的氨基酸序列(来自GenBank记录号AX077015)用于针对div1；div2；div3；div4；gbdiv_cu；Celera小鼠(cm)；和draft_mouse-dna数据库进行Tblastn查寻。基因组序列ga_69772862.cm_4被鉴定为一个被调查的可能目标。通过使用期望值(E)＝10(缺省)、100和1000，在针对未屏蔽Celera小鼠基因组集合(cm)的Tblastn查询中使用人GITRL(GenBank记录号AX077015)的氨基酸序列鉴定了缺失的氨基酸序列。基因组序列ga_x5j8b7w7wj5_041.cm_aa_2被鉴定为包含所述缺失氨基酸序列的基因组序列。
在另一个方法中，使用期望值(E)＝10(缺省)和1000，将人GITRL(GenBank记录号NM_005092)的氨基酸序列用于针对未屏蔽Celera小鼠基因组集合(cm)的Tdblastn查询中。基因序列ga_x5j8b7w7wj5_041.cm_aa_2被鉴定为包含三个高分值配对(HSP)区域的基因组序列。
基于在上述Tblastn查询中获得的三个HSP区域构建假定的小鼠cDNA序列。基于所述三个人外显子序列和三个推断的小鼠的假定外显子序列之间的比对的比较编辑该cDNA序列，所述三个人外显子序列具有对应于来自celera(ga_x2htb13vud5_66.ch_r25h_1)的人基因组序列，所述推断的小鼠的假定外显子序列具有对应于来自Celera(ga_x5j8b7w7wj5_041.cm_aa_2)的小鼠基因组序列。该编辑考虑了人序列的拼接连接。所述编辑的小鼠GITRL cDNA序列包含519bp(522bp的编码序列)的开放阅读框，对应于173个氨基酸的蛋白。
基于假定的小鼠GITRL外显子的基因组序列设计引物并通过PCR从小鼠的胸腺cDNA文库中分离出对应的物理cDNA克隆。正向(SEQ IDNO4)和反向(SEQ ID NO5)PCR引物的序列是5′ATGGAGGAAATGCCTTTGAGAG 3′(正向引物)，和5′GAATGGTAGATCAGGCATTAAGATG 3′(反向引物)。
将所得的片段亚克隆并使用标准方法确定所述DNA序列。所得的片段确定存在包含所有三个预测的外显子(参见下面)的小鼠GITRLcDNA。通过该所得cDNA克隆的PCR扩增，该片段进一步延伸以包括所述cDNA的最后的编码片段(2个氨基酸)。该步骤的正向(SEQ ID NO6)和反向PCR引物(SEQ ID NO7)序列是5′TTTAAAGTCGACCCACCATGGAGGAAATGCCTTTGAGAG 3′(正向引物)5′TTTAAAGAATTCTCATTAAGAGATGAATGGTAGATCAGGCAT 3′(反向引物)所述正向PCR引物包含SalI位点、用于翻译起始的Kozak序列和编码起始甲硫氨酸的ATG。所述反向引物包含EcoRI位点。所述SalI和EcoRI位点用于定向克隆，并进行最终cDNA克隆的序列确定。
小鼠GITRL的全长cDNA序列和其推导氨基酸序列分别列于SEQID NO1和SEQ ID NO2。人GITRL cDNA(SEQ ID NO8)和小鼠GITRLcDNA序列的比对显示69.6％的同一性。人GITRL氨基酸(SEQ ID NO9)和小鼠GITRL氨基酸序列(图1)的比对显示54.1％的同一性和60.0％的相似性。该氨基酸同一性程度类似于通常存在于人和小鼠的其它TNFR配体(Oshima等人(1998)Int.Immunol.10517-26)的同源物之间的同一性程度。
所述克隆的小鼠GITRL cDNA(SEQ ID NO1)与公共可获得的小鼠数据库的比较在小鼠GITRL的编码区域显示了单核苷酸多态性(SNP)(在外显子3中SEQ ID NO1的470核苷酸位点上存在A/C颠换，导致在SEQ ID NO2的157氨基酸位点上精氨酸向苏氨酸的转变)。
所述小鼠的GITRL cDNA序列与来自上述Celera的小鼠基因组序列(ga_x5j8b7w7wj5_041.cm_aa_2)的比较显示小鼠GITRL座位包括三个外显子和两个内含子(参见下面表2)，其中在小鼠和人GITRL之间在外显子大小和位置上存在良好的保守性。所述小鼠GITRL基因组DNA序列列于SEQ ID NO3。
表2
小鼠GITR的基因组结构(表2)与人GITRL的基因组结构(参见下面表3)的比较显示在人和小鼠的GITRL基因组DNA序列之间在外显子大小和内含子位置上存在良好的保守性。人GITRL基因组DNA序列示于SE ID NO10中。
表3
实施例1.2小鼠GITRL的疏水性特征通过TopPred(Claros和von Heijne(1994)Comput.Appl.Biosci.10685-6)确定小鼠GITRL的疏水性特征。针对小鼠GITRL(SEQ ID NO2)氨基酸残基的疏水性打分的曲线显示大致位于氨基酸25-50之间的单一假定的疏水区域，类似于人的GITRL。该疏水片段对应于预测的II型跨膜蛋白的跨膜区域。
实施例2小鼠GITRL的组织表达通过Northern杂交、原位杂交和实时PCR(例如，Heid等人(1996)Genome Res.6986-94；Mullah等人(1998)Nucleic Acids Res.261026-31；Giulietti等人(2001)Methods 25386-401)将基于小鼠GITRL cDNA序列(SEQ ID NO1)的寡核苷酸探针用于检验几种鼠科动物组织样品的GITRL表达。
尽管Northern杂交显示在心脏、脾脏、肺、淋巴结、肾脏和肝脏存在刚好可检测的转录物，但随后的原位杂交显示GITRL在心脏、脾脏、淋巴结和胸腺中表达。GITRL在这些组织中的表达通常限定在心脏的心包和心内膜、脾脏的白髓、淋巴结的皮质、副皮质和髓质区和胸腺的皮质和髓质区。
通过实时PCR分析进一步确定GITRL在胸腺、脾脏和淋巴结中的表达。GITRL在脾脏和脂多糖(LPS)刺激的脾细胞(主要是B淋巴细胞)中以最高水平表达。在胃、大脑和肾脏检测到难以察觉的低水平GITRL表达。实时PCR分析也显示在肝脏、被激活的CD25-细胞、被激活的CD25+细胞和伴刀豆球蛋白A激活的淋巴结细胞中存在GITRL转录物，尽管程度低于脾脏和LPS刺激的脾细胞(blast)。在静息的CD25-或CD25+细胞中未检测到GITRL表达。未成熟和LPS刺激的来源于骨髓的树突状细胞(DC)的实时PCR也证明未成熟DC的基线GITRL表达，该表达在用LPS刺激24小时后增加，但在LPS刺激48小时后降低到低于基线。也检测到在所有经检验的内皮细胞系(bEND3，C166，EOMA，MSI和SVEC4-10)中GITRL的表达程度是不同的，当用LPS刺激所述细胞时，证明GITRL的表达保持相对不变。相反地，在下列未经刺激的特定来源的鼠科动物细胞系中通过PCR未检测到GITRL cDNAE10 T细胞系，T2胚胎胸腺系，T10浆细胞瘤，EL4胸腺瘤，BAF3和PREBpre-B细胞系，B9 B细胞杂交瘤、DA1G单核细胞，M1单核细胞，FBMD-1胚胎骨髓瘤，P19胚胎癌，MDF肝和E14胚胎干细胞细胞系。
实施例3重组小鼠GITRL的功能性表达实施例3.1GITRL与细胞表面GITR的结合为确定在实施例1中分离的小鼠cDNA是否编码功能性GITR配体(GITRL)，将表达与FLAG表位融合的小鼠GITRL的Cos细胞(GITRL-Flag-Cos)或表达与FLAG表位融合的对照小鼠IL-21受体的Cos细胞(IL-21R-Flag-Cos)和表达小鼠GITR的293T细胞(GITR-293T)一起培养，进行不同的时间长度。使用藻红蛋白标记的抗Flag抗体(PE-FLAG)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗GITR抗体通过流式细胞仪检测细胞-细胞相互作用。甚至在GITR-293T和GITRL-Flag-Cos细胞共离心1分钟后，大约90％的GITR-293T细胞(通过FITC荧光检测的)共染了FLAG(通过PE荧光检测)，表明GITR-293T细胞与GITRL-Flag-Cos细胞结合，并且这种相互作用在整个60分钟的实验中一直保持。相反地，与IL-21R-Flag-Cos细胞共培养的GITR-293T细胞甚至在离心后60分钟都没有显著地共染上FLAG。这些数据证实在实施例1中分离的小鼠cDNA编码能够结合细胞表面GITR的功能性GITRL。
实施例3.2GITRL与可溶性GITR的结合通过将表达小鼠GITRL的Cos细胞(GITRL-Cos)或模拟被感染的Cos细胞与融合人IgG(GITR-Fc)或对照IgG(HIgG)的Fc部分的重组GITR一起温育来确定小鼠GITRL结合GITR的能力。使用缀合FITC的驴抗人抗体(FITC-Ab)通过流式细胞仪确定GITR-Fc对GITRL的结合。与GITRL-Cos细胞和对照HIgG的温育(7.9％)相比，GITRL-Cos细胞和GITR-Fc的温育导致FITC-Ab的结合(28.8％)增加3.6倍。未染色的GITRL-Cos细胞、与CTLA-4Fc融合蛋白和FITC-Ab一起温育的GITRL-Cos细胞和单独与FITC-Ab一起温育的GITRL-Cos细胞未显现荧光。处理的和未处理的模拟感染Cos细胞未显现出任何可观察的荧光。这些数据表明在实施例1中分离的小鼠cDNA编码能够结合可溶性GITR的功能性GITRL。
实施例4小鼠GITRL与GITR的结合导致CD4+CD25+细胞的增殖在不同浓度GITR结合蛋白存在或不存在的情况下，通过使用大约50,000个经辐射的除去T细胞的脾细胞和100IU/ml IL-2刺激大约50,000个鼠科动物T细胞65-72小时来确定GITRLGITR结合对细胞增殖的影响。两种GITR结合蛋白用于这些测定中激动性抗GITR抗体(参见，例如，McHugh等人(2002)Immunity 16311-23；也参见美国专利申请10/194,754)或在经修饰的大鼠YB2/0细胞(GITRL-YB2/0)的表面表达的鼠GITRL。通过在培养的最后6-12小时用1μCi3H-胸苷脉冲标记细胞，然后用闪烁计数器测量3H-胸苷的整合来测定细胞的增殖。
如图2A中所示，CD4+CD25-T细胞对任何浓度的抗GITR抗体都不产生应答。相反地，抗GITR抗体在所有受试浓度上刺激CD4+CD25+T细胞的增殖。例如，在最低受试滴度(大约0.02μg/ml)的抗GITR抗体存在的情况下培养CD4+CD25+T细胞导致3H-胸苷的整合(约15,000cpm)超过在抗GITR抗体不存在的情况下培养的细胞大约3倍。抗GITR抗体刺激CD4+CD25+T细胞增殖的能力在抗体浓度为大约0.3μg/ml时达到大约45,000cpm的平台，比在抗GITR抗体不存在的情况下培养细胞整合的3H-胸苷增加了大约9倍。
类似于用抗GITR抗体获得的结果，GITRL-YB2/0细胞没有刺激CD4+CD25-T细胞(图2B)的增殖。相反地，GITRL-YB2/0细胞显著地刺激CD4+CD25+T细胞的增殖。例如，在大约10,000 GITRL-YB2/0细胞存在的情况下培养CD4+CD25+T细胞导致比在相同数量的未修饰的YB2/0细胞存在的情况下培养的细胞增加大约4-5倍的3H-胸苷整合。将YB2/0细胞的数目增加至大约50,000导致比在相同数量的未修饰的YB2/0细胞存在的情况下培养的细胞增加大约15倍的3H-胸苷整合(图2B)。
实施例5小鼠GITRL与GITR的结合逆转CD4+CD25+T细胞介导的对CD4+CD25-T细胞的抑制作用前面已描述了用于这些实施例的T细胞抑制剂测定法(参见，例如，Thornton和Shevach(2000)J.Immunol.164183-90；McHugh等人(2002)Immunity 16311-23；两份文献在此引用作为参考)。简而言之，在50,000个轻辐射的除去T细胞的脾细胞、0.5μg/ml抗CD3抗体和各种数目的新分离的抑制性CD4+CD25+T细胞存在的情况下培养大约50,000CD4+CD25-效应T细胞。然后通过闪烁计数器测量3H-胸苷整合量来测定大约50,000经辐射的GITRL-YB2/0细胞或2μg/ml激动性抗GITR抗体逆转对CD4+CD25-增殖的抑制作用的能力。
如图3A中所示，CD4+CD25+细胞以剂量依赖方式降低CD4+CD25-细胞的增殖。抗GITR抗体和GITRL-YB2/0细胞在整个受试CD4+CD25+抑制性细胞的数目范围内都能完全地逆转对CD4+CD25-增殖的抑制作用。因此，GITRL与其受体GITR的结合就象激动性抗GITR抗体与GITR的结合那样阻断了CD4+CD25+细胞的抑制性功能。GITRL-YB2/0细胞逆转抑制作用的能力以剂量依赖方式发生，在该测定中低至大约3,000GITRL-YB2/0细胞至少部分地逆转或减少抑制作用(图3B)。未经修饰的YB2/0细胞和表达GITR的YB2/0细胞对CD4+CD25+T细胞介导的抑制作用都没有可观察到的影响(图3A)。
与用新分离的CD4+CD25+T细胞获得的结果相反，GITRLGITR结合对于通过用抗CD3抗体、除去T细胞的脾细胞和IL-2激活的CD4+CD25+T细胞介导的抑制作用具有从很小到无的影响(图4)。抗GITR抗体和大约50,000GITRL-YB2/0细胞的加入都不能逆转由25,000个经激活的CD4+CD25+T细胞介导的抑制作用。然而，当更少的经激活的CD4+CD25+T细胞加入所述测定(例如，大约1,500-12,500细胞)时，抗GITR抗体和GITRL-YB2/0细胞能够部分地降低但不能完全消除抑制作用。
实施例6抗小鼠GITRL抗体恢复由CD4+CD25+T细胞介导的抑制作用实施例6.1抗小鼠GITRL抗体的分离通过用表达小鼠GITRL cDNA的大鼠YB2/0细胞(GITRL-YB2/0)免疫大鼠产生对小鼠GITRL特异性的抗体。使用本领域熟知的方法，建立抗体杂交瘤并通过使用流式细胞仪筛选抗表达小鼠GITRL的Phoneix细胞的杂交瘤。鉴定了两种特异性地结合GITRL-Phoenix细胞但不结合模拟感染的Phoenix对照细胞的抗体5F1和10F12。2003年7月22日这些抗体杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)；ATCC保藏号PTA-5336给杂交瘤5F1和保藏号PTA-5337给杂交瘤10F12。
实施例6.2抗小鼠GITRL抗体阻断GITRL对CD4+CD25+T细胞的抑制活性的作用如上面实施例5中所描述的，在其细胞表面表达GITRL的YB2/0细胞能够逆转由新分离的CD4+CD25+T细胞介导的抑制CD4+CD25-T细胞增殖的作用。为确定抗GITRL抗体是否能恢复CD4+CD25+T细胞介导的抑制作用，在5F1或10F12抗GITRL抗体或对照抗体存在或不存在的情况下进行实施例5中的T细胞抑制测定。
如实施例5中所看到的，在GITRL-YB2/0细胞存在的情况下，CD4+CD25-效应T细胞和新分离的CD4+CD25+抑制性T细胞的培养导致对CD4+CD25-细胞增殖的抑制作用的完全逆转(图5A和5B)。向测定物中加入含有5F1抗GITRL抗体的10％杂交瘤培养上清液导致部分地(图5B)至几乎完全(图5A)恢复CD4+CD25+介导的抑制作用。加入10F12抗GITRL抗体产生类似的结果。正如预期的，在对照抗体(“对照Ig”)存在的情况下没有可观察到的对GITRL-YB2/0细胞的逆转抑制作用的能力的影响(图5B)。这些数据表明抗GITRL抗体阻断了GITRL关闭CD4+CD25+细胞的抑制活性的能力。
实施例6.3抗小鼠GITRL抗体只在CD4+CD25+T细胞存在的情况下抑制T细胞应答在除去CD4+CD25+T细胞之前(图6A)或之后(图6B)在各种浓度的激动性抗CD3抗体存在的情况下刺激淋巴结细胞培养物，然后通过闪烁计数器测量3H-胸苷整合量来确定增殖。为确定抗GITRL抗体对增殖的影响，向平行培养物中加入含有5F1抗GITRL抗体的10％杂交瘤培养上清液。
如图6A中所示，当用大约0.075μg/ml至大约0.75μg/ml抗CD3抗体刺激包含CD4+CD25+T细胞的淋巴结细胞时，抗GITRL抗体的加入抑制了所述细胞的增殖。当用1.0μg/ml抗CD3抗体刺激包含CD4+CD25+T细胞的淋巴结细胞时，在抗GITRL抗体存在的情况下没有观察到抑制作用。与用包含CD4+CD25+T细胞的淋巴结细胞获得的结果相反，抗GITRL抗体的加入通常对已除去CD4+CD25+T细胞的淋巴结细胞培养物没有抑制效应(图6B)。总的说来，这些数据暗示抗GITRL抗体阻断了在CD4+CD25+T细胞上表达的GITR和在其它细胞上表达的GITRL之间的相互作用，而该GITR/GITRL相互作用的阻断增强了CD4+CD25+T细胞恢复免疫抑制作用的调节功能。
实施例7GITRL表达细胞在淋巴组织中的分布通过流式细胞仪使用激动性抗GITRL抗体检查GITRL在小鼠组织中的表达。新分离的只表达CD4的、只表达CD8的或同时表达CD4和CD8的CD11c+脾脏树突状细胞(DC)亚类组成型地表达低水平GITRL(图7A)。然而，在CD11clowB220+浆细胞树突状细胞中表现显著更高的GITRL表面表达(Nakano等人，2001)。在图7B中，用抗GITRL mAb或同种型对照抗体对所述的从BALB/c小鼠中新分离的CD11c+脾DC的亚型进行染色。
类似地，如同腹膜B-1B细胞(perCD11 b+B220+)一样，新分离的B220+脾细胞组成型地表达GITRL(尽管以更高的水平表达)(图7C，上方)。也发现静息的腹膜巨噬细胞(perC CD11b+B220-)表达该配体(图7C，下方)。
正在进行选择的胸腺细胞亚型不表达可测定量的GITRL(图7D)。相反地，如图7E中显示的，在所有CD4-CD8-胸腺前体的亚型中检测到GITRL的表达，其中CD4+CD25+(R2)和44-25+(R3)亚型表达水平最高。
在未经刺激的淋巴结细胞中没有检测到GITRL(图7F)。在未经刺激的脾T细胞中也未检测到GITRL(数据未显示)。这些数据证明GITRL的表达是由专门的抗原呈递细胞(DCs，B细胞和巨噬细胞；图7A-7C)和胸腺CD4-CD8-前体细胞(图7E)进行的，而不是由正在选择的T细胞(图7D)或在外周的静息T细胞(未经刺激的淋巴结和脾细胞；图7F，数据未显示)进行的。这些数据与通过实施例2中所描述的Northern杂交、原位杂交和实时PCR获得的数据相关。
实施例8在TLR刺激后APCs下调GITRL在用Toll样受体(TLR)配体、或抗CD40和IL-4、或抗IgM处理后，观察B细胞活化对GITRL表达的影响。脾脏B细胞(B220+脾细胞)或腹膜B-1B细胞(B220+CD11b+PerC)的刺激导致GITRL的快速但短暂的上调，所述上调在大多数处理后4小时变得明显(图8A)。在刺激后48-60小时，表达下降至低于刺激前的水平并保持稳定。来自腹膜腔的polyIC处理的B-1B细胞是个例外，所述细胞没有在检测的时间点上表现该下调现象。正如预期的，在所有组中在整个实验过程中CD86的水平增加，表明观察到的GITRL下调不是由于细胞死亡造成的(数据未显示)。
在用抗CD40和IL-4处理后B细胞表达的GITRL减少暗示在提供T细胞帮助后表达可能受到调节。在用抗CD3抗体培养后估计在所有脾细胞中B细胞的GITRL表达。在这些培养条件下，在48小时后在B220+脾细胞上表达的GITRL也被下调(图8B)。因此，T细胞活性的生理学水平也导致脾脏B细胞GITRL的表达下降。
用磁珠富集脾CD11c+DCs并在LPS存在的条件下培养12和36小时后检查GITRL的表达。培养在培养基或LPS中的DCs在最初的12小时表达GITRL，LPC诱导中度的上调。然而，36小时后，在LPS处理的DCs和只在培养基中培养的DCs中都没有检测到GITRL的表达。图8C显示在指定的时间点上，在用或不用LPS(0.5μg/mt)培养后由纯化的CD11c+DCs表达的GITRL(上方直方图)和CD86(B7.2)(下方直方图)。如图所示的，如所预期的，CD86(B7.2)的表达上调(Banchereau和Steinman，1998)。培养在培养基中的脾DCs的GITRL表达的下降暗示“自发的”DC成熟足以下调GITRL的表达，所述成熟发生在体外培养期(Vremec和Shortman，1997)。因此，只显示LPS刺激后的结果，尽管DCs接受了与B细胞一样的处理。与另一个公开报导(Tone等人，2003)的结果类似，发现来源于骨髓的DCs组成型地表达GITRL，并且这种表达只在用各种TLR配体处理以后显著下降(未显示数据)。
在可溶性抗CD3抗体不存在(“+Med.”)或存在(“+aCD3”)时脾细胞培养48小时后，CD4和CD8T细胞表达了可测量的GITRL水平(图8D)，肯定了前面的实时PCR(也参见实施例2)。
实施例9GITR/GITRL相互作用的阻断抑制了淋巴细胞的增殖因为APCs组成型地表达GITRL，并且因为GITR/GITRL相互作用被认为消除CD4+CD25+T细胞的抑制性功能，因此检验抗GITRL抗体增强由存在于次级淋巴器官中的内源CD4+CD25+T细胞群体介导的抑制作用的能力。对总淋巴结细胞(LN)、总脾细胞(Sp)和除去CD25+细胞的LN或Sp(Δ25)的增殖应答进行比较，所述各类细胞用抗GITRL抗体(实心圆)或对照抗体(大鼠IgG；空心圆)进行培养。抗GITRL抗体的加入减少了总淋巴结细胞的增殖应答(图9A，左上方)并且以较低的程度减少总脾细胞的增殖应答(图9A，左下方)。然而，在除去CD25+细胞的培养物中抑制效应也很明显(图9A，右上方(LN)；右下方(Sp))，这样有可能GITR/GITRL相互作用为CD25-T细胞提供了共刺激信号。
为了直接检验这种可能性，在表达GITRL的YB2/0细胞和APCs存在的情况下检查纯化的CD4+CD25-和CD8+T细胞的增殖应答。在表达GITRL的细胞存在的情况下，CD4+CD25-和CD8+T细胞的增殖都得到了显著地增加(图9B)，这在低浓度的抗CD3时在CD4+CD25-T细胞中尤其明显。
有可能矛盾的是，抗GITR抗体通过与CD4+CD25-T细胞作用来介导其效应，因为静息T细胞只表达很低水平的GITR。然而，通过证明在T细胞激活后GITR的表达快速上调(图9C)并在激活后48和72小时之间达到最高水平来解决所述矛盾。这些结果支持GITR/GITRL相互作用可影响CD4+CD25-T细胞激活，而不依赖于调节性CD4+CD25+T细胞。
实施例10抑制作用的逆转要求CD25-T细胞表达GITR以前的研究暗示GITR连接到CD4+CD25+T细胞上抑制其抑制性能力(McHugh等人，2002；Shimizu等人，2002)。然而，因为经激活的T细胞也表达GITR，我们希望确定导致抑制作用消除的GITR结合的相关细胞靶。使用来自GITR+/+和GITR-/-小鼠(图10)的CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞的组合共培养物在抗GITR mAb(DTA-1)存在或不存在的情况下测量增殖。如以前报导的(Shimizu等人，2002)，当所述CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞都表达GITR时，相对于接受同种型抗体的共培养物，向共培养物中加入抗GITR mAb导致增殖应答增加(图10A，a组)。当CD4+CD25-而非CD4+CD25+T细胞在共培养物中表达GITR时，加入抗GITR抗体导致类似于当CD4+CD25+T细胞表达GITR时观察到的T细胞增殖的增加(图10A，b组)。然而，在CD4+CD25-GITR-/-和CD4+CD25+GITR+/+T细胞的共培养物中，抗GITR抗体的加入对增殖没有影响(图10A，c组)。如所预期的，向CD4+CD25-GITR-/-和CD4+CD25+GITR-/-T细胞的共培养物中加入抗GITR抗体对T细胞增殖也没有影响(图10A，d组)。用商业购得的多克隆抗mGITR抗体制剂可获得与上述结果类似的结果(数据未显示)。
在前面的使用大鼠效应和小鼠CD4+CD25+调节性T细胞(Shimizu等人，2002)组合的研究中获得支持下面假说的有力证据，所述假说是抑制作用的消除是因为CD4+CD25+T细胞表达的GITR的连接。在大鼠中产生用于这些研究的抗GITR mAb(DTA-1)，因此其不结合大鼠细胞(id.)。使用大鼠CD4+CD25-效应细胞、小鼠CD4+CD25+抑制性细胞和经辐射的大鼠APCs(图10B，b组)的共培养物进行类似于上述实验的实验。共培养的小鼠CD4+CD25+效应细胞、小鼠CD4+CD25+抑制性细胞和经辐射的大鼠APCs用作对照(图10B，a组)。与从GITR-/-小鼠中获得的数据相似，除非GITR可交联在应答CD25-群体上(图10B，a组)，否则CD4+CD25+介导的抑制作用不能消除(图10B，b组)。
通过流式细胞仪检查由共培养的大鼠CD4+CD25-和小鼠CD4+CD25+T细胞稀释的CFSE来完成大鼠/小鼠系统的进一步分析。在同种型对照抗体存在的情况下，当以1∶8的抑制性细胞对效应细胞的比例进行培养时，大鼠CD4+CD25-T细胞只是部分地被小鼠CD4+CD25+T细胞抑制(图10C，左边直方图)。然而，抗GITR抗体的加入导致小鼠CD4+CD25+T细胞额外的扩增，结果导致对大鼠T细胞抑制作用的增加(图10C，右边直方图)。在GITR连接后，通过加入阻断性抗CD25抗体可部分地抑制增加的小鼠CD4+CD25+T细胞的CFSE稀释，暗示着这种扩增也要求效应T细胞最初产生的IL-2(数据未显示)。总的说来，这些结果无可争辩地证明了需要GITR与效应CD4+CD25-T细胞的接合来克服CD4+CD25+T细胞介导的抑制作用。
实施例11调节和克服内源调节性T细胞介导的抑制作用需要GITR信号的表达因为CD28和GITR在T细胞的激活过程中似乎都提供共刺激信号，所以我们试图确定其在初级应答中是否起不同的作用。我们比较了在内源淋巴结CD4+CD25+T细胞存在和不存在的情况下以及外源IL-2(图11)存在和不存在的情况下GITR和CD28提高T细胞增殖的能力。在培养72小时后同时就CFSE稀释估计用于增殖研究中的相同样品。在外源IL-2不存在的情况下，来自GITR-/-和CD28-/-动物的CD4+和CD8+T细胞都不增殖(图11A，a组)。来自GITR+/-动物的LN细胞表现介于野生型和GITR-/-动物的表型之间的中间表型(图11A，a组)在除去CD25+T细胞后，来自野生型小鼠的T细胞的应答显著增加，表明在这些培养条件下的抑制作用由驻留在正常淋巴结中的CD25+T细胞介导(图11A，比较a和b组)。最重要的是，在CD4+CD25+T细胞不存在的条件下，如通过3H-胸苷整合(图11A，b组)和CSFE稀释(图11B，顶部组图)所估计的，来自GITR-/-小鼠的CD4+和CD8+淋巴结T细胞的应答与野生型小鼠的相当。然而，在72小时后，甚至在CD4+CD25+T细胞不存在的情况下，来自CD28-/-动物的CD4+和CD8+T细胞不进行增殖(图11A，b组)。
当外源IL-2加入到完整淋巴结细胞培养物中时，观察到非常不同的应答模式。如通过3H-胸苷吸收(图11A，c组)或通过CFSE稀释的缺少(图11B，中间组图)所测定的，在GITR不存在的情况下CD4+和CD8+T细胞增殖被完全抑制。相反地，通过3H-胸苷整合(图11A，c组)检测到来自CD28-/-动物的可测量的T细胞增殖，尽管CFSE特征表明CD8+T细胞在很大程度上负责所测量的增殖(图11B)。在IL-2(50U/ml)存在的情况下，如通过3H-胸苷整合(图11A，d组)和CFSE稀释(图11B，底部组图)所测定的，来自所有动物的除去CD4+CD25+T细胞的淋巴结展现相似的增殖水平。总的来说，这些结果表明T细胞在GITR-/-和CD28-/-小鼠中的激活缺陷是不同的。
在外源IL-2存在的情况下，存在于GITR-/-小鼠的淋巴节中的总T细胞不能增殖的能力暗示着高亲和力IL-2受体的表达可能在这些动物中受到影响。因为IL-2Rα链的表达主要受其配体诱导(Depper等人，1985；Malek和Ashwell，1985)，因此在CD4+CD25+T细胞存在或不存在以及在IL-2(图11C)存在或不存在的情况下检查来自GITR-/-小鼠的抗CD3激活的CD4+CD25-T细胞表达该链的能力。在调节性T细胞存在的情况下，向培养物中加入IL-2导致，24小时后，GITR+/+而非GITR-/-的CD4+CD25-T细胞的CD25表达增加(图11C，右下方直方图)。然而，通过除去CD4+25+T细胞可容易地恢复GITR-/-CD4+CD25-T细胞进行IL-2诱导的CD25表达的能力(图11C，左下方直图)。因此，在CD4+CD25+T细胞存在的情况下，GITR-/-T细胞的IL-2应答的减弱是由(至少部分是由)其在外源IL-2浓度足以诱导野生型细胞的CD25表达的情况下不能表达高亲和力IL-2受体的原因造成的。
实施例12CD28依赖性共刺激增强GITR表达和应答性尽管上面提供的数据暗示GITR或CD28在CD25-T细胞上的接合提供了允许效应T细胞逃避抑制作用的信号，但参与该过程的信号本质仍不清楚。在CD4+CD25+T细胞存在的情况下，IL对CD28-/-CD8+T细胞的增殖应答的部分补救暗示CD28/B7信号传导可能调节T细胞对GITR/GITRL相互作用的敏感性。此外，以前的研究已表明CD28-CD80/CD86相互作用可增强-些TNFR家族成员的表达(Gilfillan等人，1998；Rogers等人，2001)。因此，我们检查有关GITR的这种可能性。使来自CD28-/-或野生型小鼠的纯化的CD4+CD25-和CD8+T细胞保持未受刺激状态或在板结合的抗CD28抗体存在或不存在的情况下用低浓度的板结合的抗CD3抗体进行激活(图12A)。尽管单独地暴露于抗CD3的野生型T细胞轻微地上调了GITR，但由于抗CD28的加入极大地增加了CD4+CD25-和CD8+T细胞的GITR表达。
类似地，通过加入抗CD80/CD86(抗B7.1/7.2)(图12B，左直方图)显著地抑制了CD4+CD25-T细胞中GITR表达的上调。在含有抗CD80/CD86的培养物中对GITR的表达抑制作用不是由于IL-2产物减少造成的，因为在含有抗IL-2/IL-2R mAbs的培养物中CD4+CD25-T细胞的GITR上调不受阻止(图12B，右边直方图)。
由来源于CD28的共刺激信号诱导的增强的GITR表达相应地伴随着对GITR信号的增强应答(图12C)。抗GITR抗体的加入显著地增加了来自野生型小鼠的CD4+和CD8+效应T细胞的增殖(图12C，左图)。然而，当将抗CD80/CD86加入这些培养物时，存在的抗GITR抗体只是比受试的抗CD3浓度范围稍微地增加了GITR+/+CD4+CD25-T细胞(图12C，GITR+/+，左上方；GITR-/-，右上方)和GITR+/+CD8+T细胞(图12C，GITR+/+，左下方；GITR-/-，右下方)的增殖。用抗GITR处理不影响来自GITR-/-小鼠的纯化的CD4+CD25-和CD8+T细胞的应答(图12C，右图)。这些数据暗示与IL-2产生的共刺激不同，CD28介导的信号增强GITR表达和促进GITR介导的信号传导。
实施例13GITRL结合GITR为效应T细胞提供了共刺激信号在下列试剂存在和不存在的情况下培养4万个效应HT-2T辅助细胞(GITR+/TCR+)1)1∶1或1∶2比例的抗CD3包被小珠，2)1万个未经修饰以表达GITRL(YB2/0亲本细胞)或经修饰以表达GITRL(YB2/0muGITRL)的YB/2细胞，和3)浓度逐渐增加的同种型对照抗体或4个不同抗GITRL抗体(5F1、MGTL-10、MGTL-15或多克隆抗GITRL抗体)。在44小时培养期的最后5小时中通过3H-胸苷整合测量增殖。图13A表明GITRL增强了用抗CD3刺激的T细胞的增殖。此外，可用5F1抗体而不是同种型对照抗体(图13B)和商业购得的MGTL-10、MGTL-15和多克隆抗GITRL抗体(图13C)来阻止GITRL介导的T细胞增殖的增加。这些数据进一步证明GITRL提供了共刺激信号以及5F1是针对GITRL的中和抗体。
实施例14用抗GITRL抗体阻断GITR-GITRL结合阻止了PLP诱导的实验性自身免疫脑炎的过继性转移用完全弗氏佐剂中的150μgPLP肽(氨基酸139-151)[HSLGKWLGHPDKF(SEQ ID NO12)]免疫9周大小的雌性SJL小鼠。免疫十天后，收集脾细胞，并在10μg/ml抗体(抗GITRL抗体或对照抗体)不存在(未处理)或存在的情况下，用10μg/ml PLP(氨基酸139-151)离体再刺激。在再刺激后，将5×106脾细胞过继性转入10周大小的初次实验SJL小鼠，并就实验性自身免疫脑炎(EAE)监控所述小鼠52天，同时按从0至5级进行测量。在不存在任何抗体(未处理)的情况下接受脾细胞再刺激的小鼠和在对照抗体(CK01)存在的情况下接受脾细胞再刺激的小鼠中分别有40％和80％发生了EAE(图14)。此外，在接受未处理的脾细胞的动物和接受用对照抗体处理的脾细胞的动物之间在疾病的等级上不存在显著的差异。重要的是，在接受在抗GITRL抗体(5F1)存在的情况下经受再刺激的脾细胞的小鼠中没有一只产生EAE(p＝0.0023，和对照抗体处理比较)(图14)。这些数据暗示GITR/GITRL途径的阻断将限制CD25-T细胞克服抑制作用的能力，因此下调其影响自身免疫应答的能力。
实施例15实验流程实施例15.1抗体和试剂用于流式细胞术或功能性研究的所有抗体来自BD-Pharmingen，除了三色标记的aCD4(克隆CT-CD4)和aB220(克隆RA3-6B2)购自Caltag(Burlingame，CA)，和MGTL-10、MGTL-15和多克隆抗GITRL抗体购自Alexis Biochemicals(San Diego，CA)。纯化的山羊抗IgMμ-链的F(ab′)2片段购自Jackson Immunoresearch(West Grove，PA)。抗IL-2(克隆S4B6)以腹水形式使用。人重组IL-2获自theNational Cancer Institute(Frederick，MD)。IL-4、IFN-γ、IL-12和T细胞富集柱购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。Poly IC和LPS购自Sigma。CpGs购自InvivoGen(San Diego，CA)。抗GITRL(克隆5F1；和克隆10F12)和抗GITR(克隆DTA-1)和PLP肽产自“实验室内”。Anti-B220、-CD11c、-CD11b-CD8、-CD4和-PE磁珠购自Miltenyi(Auburn，CA)。
实施例15.2小鼠BALB/c和C57B1/6小鼠(6-8周大小的雌性个体)购自NCIFrederick动物房(Frederick，MD)。CD28-/-小鼠由Dr.Alfred Singer(NIH/NCI)提供。GITR+/-胚胎(Sv129×B6)由C.Ricarrdi(Perugia University Medical School，Italy)(Ronchetti等人，2002)提供。将再衍生的GITR+/-小鼠与C57BL/6小鼠回交一次，并通过PCR就突变的等位基因对所得的后代进行筛选。然后将经鉴定的GITR+/-后代互交以产生GITR-/-小鼠。在SPF(无特定病原体的)条件下将所有小鼠喂养和关在NIH/NIAID的设施中。
实施例15.3cDNA克隆和表达将人GITRL的氨基酸序列(GenBank记录号NM_005092)用于在Celera数据库中搜录mGITRL。基因组序列ga_x5j8b7w7wj5_041.cm_aa-2包含三个高分值配对(HSP)区域。基于这些区域对应于小鼠GITRL外显子的假设，设计用于PCR扩增的引物。用正向引物(5′-ATGGAGGAAATGCCTTTGAGAG-3′)(SEQ ID NO4)和反向引物(5′-GAATGGTAGATCAGGCATTAAGATG-3′)(SEQ ID NO5)扩增来自小鼠胸腺文库的cDNA克隆。将所得的片段亚克隆并确定DNA序列。随后用5′-TTTAAAGTCGACCCACCATGGAGGAAATGCCTTTGAGAG-3′(正向)(SEQ ID NO6)和5′-TTTAAAGAATTCTCATTAAGAGATGAATGGTAGATCAGGCAT-3′(反向)(SEQID NO7)引物从前述构建体中通过PCR扩增子序列全长克隆。将所得的PCR片段亚克隆GFP-RV逆转录病毒载体(Ouyang等人，1998)，并确定最终的cDNA克隆的序列。然后将该载体转染入Phoenix细胞系。将来自经转染的Phoenix细胞的上清液用于转导YB2/0细胞系。然后用FACS分选表达GFP的YB2/0细胞并保持培养。预测的mGITRL氨基酸序列与另一组中的一致(Kim等人，2003)，除了在其序列的第48个氨基酸位点上用丙氨酸替换了缬氨酸。
实施例15.4单克隆抗体的生产和纯化用CFA中的100×106YB2/0-GITRL细胞经s.q.免疫Lewis大鼠一次。两周后，用IFA中的100×106YB2/0-GITRL细胞经s.q.免疫这些大鼠。两周后用PBS中的50×106YB2/0-GITRL细胞增强免疫大鼠。4天后，如前面所描述的(Coligan等人，2003)收集脾细胞和进行细胞融合。使用Phoenix-GITRL和Phoenix细胞通过流式细胞仪筛选来自所得的杂交瘤的上清液。使用蛋白G装填的柱子从细胞培养上清液中纯化抗体，并使洗脱的抗体针对PBS进行透析。
实验15.5细胞纯化从小鼠的外周淋巴结中纯化T细胞。根据厂商实验方案用磁珠标记CD25+T细胞并在autoMACS(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)上纯化所述细胞。CD25+细胞的纯度通常在97至99％之间。然后用抗CD4或抗CD8微珠标记保留在阴性部分中的细胞并在autoMACS上使用阳性选择流程进行纯化。纯度通常为90-95％。通过使用autoMACS从红细胞裂解悬浮液中除去Thy1.2+细胞而制备除去T细胞的脾悬浮物。使用抗B220微珠(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)以类似的方式从脾细胞中纯化B220+细胞，所得制剂的纯度通常大于90％。通过用10ml冷HBSS冲洗腹膜腔(PerC)制备腹膜细胞。对于脾DCs，以类似于所描述(Vremec等人，2000)的方式制备脾细胞悬浮物。然后使用抗CD11c微珠(Miltenyi Biotech，Auburn，CS)从所述悬浮液中纯化脾DCs。所得的DC悬浮物的纯度通常是85至90％。通过使用PE-抗大鼠CD25(OX-39)抗体接着使用抗PE微珠除去大鼠脾细胞中的CD25+，从而产生大鼠CD4+CD25-细胞。在除去之后，然后使用抗大鼠CD4微珠从所述被除去的部分选出CD4+细胞。
实施例15.6体外增殖测定如(Thornton和Shevach，1998)中所描述的进行抑制作用测定。简而言之，在0.5μg/ml抗CD3 mAb(2C11)存在的情况下，在96孔平底板中，将(5×104)细胞与经辐射(3000R)的除去T细胞的脾细胞(5×104)共培养在含有FBS的RPMI 1640(Atlanta Biologicals，Atlanta，GA)中。对于一些培养物，以2μg/ml的终浓度加入特异性针对GITR的抗体或大鼠Ig同种型抗体。以0∶1、1∶2、1∶4、或1∶8的最终抑制剂比效应器的比例加入经滴定测量过数目的CD4+CD25+细胞。在72小时培养期的最后5-8小时中用1μCi的3H-胸苷脉冲标记培养物，除非另有说明进行三次重复。除了经辐射的(3000R)除去CD4的大鼠脾细胞用作APCs外，以相似的方法建立大鼠和小鼠T细胞亚型的共培养，使用抗大鼠CD3(0.25μg/ml)和抗小鼠CD3(0.25μg/ml)mAbs的混合物刺激大鼠和小鼠T细胞。
实施例15.7淋巴结细胞的体外培养和CFSE标记如上所述在autoMACS上制备除去CD25+的淋巴结细胞悬浮物。在37℃水浴中用2μM浓度的CFSE标记细胞8分钟。然后在完全RPMI1640中清洗细胞。然后在rhIL-2(50U/ml)存在和不存在的情况下将细胞(5×104/小孔)培养在96孔板中。在72小时培养的最后5-8小时中用1μCi3H-胸苷脉冲标记双份的孔或将双份的孔用于CFSE稀释分析。
实施例16讨论可从证明结果中推出GITR在CD4+CD25+T细胞的功能中所起的作用，所述证明结果是当GITR的多克隆和单克隆抗体加入共培养的CD25+和CD25-T细胞(McHugh等人，2002；Shimizu等人，2002))中时逆转了CD4+CD25+T细胞的抑制性作用。CD4+CD25+T细胞似乎是抗GITR反应物的靶标，因为刚刚外植的CD25+T细胞表达GITR的水平要比静息CD25-T细胞表达水平高，并且因为在缺少TCR信号的情况下抗GITR抗体和IL-2一起触发CD25+(而非CD25-)的增殖。此外，当Shimizu等人加入大鼠抗mGITRmAb(不与大鼠细胞反应)至共培养小鼠CD25+抑制子和大鼠效应T细胞时，观察到抑制作用的逆转。这些研究导致下列假说通过激动性抗GITR抗体(和假定通过其生理学配体)结合GITR产生了抑制CD4+CD25+T细胞的抑制活性和逆转CD25+T细胞对外源IL-2的非应答作用的信号。
通过克隆小鼠GITRL、分析其组织分布和通过使用来自野生型和GITR-/-小鼠的CD25+和CD25-T细胞的混合物明确地确定激动性抗GITR抗体的靶标来设计实验以试图扩展和证实这些研究。总地说来，所述研究证明了通过为CD25-提供独特信号(该信号提高了CD4+CD25+T细胞的抑制作用的阈值)，抗GITR抗体和GITRL消除了CD4+CD25+T细胞的抑制作用。研究表明GITRL选择性地在APC的细胞表面表达，在B-1B淋巴细胞中具有最高水平的表达；在B-2B淋巴细胞、巨噬细胞和B220+DCs中具有中等水平；在B220-DC亚型中具有较低水平。GITRL在TNF超家族成员中是独特的，因为其在静息APC中表达，并且通过触发B细胞受体、CD40或不同的Toll样受体来下调其表达。在静息APC上不能检测到TNF超家族的其它成员(4-1BB-L、OX40-L、LIGHT、CD70、CD30-L)，并且通过Toll样受体刺激激活(Croft，2003)APC来上调其表达。本发明没有解释来自细胞表面的GITRL表达的下调是否伴随可溶性GITRL的分泌，但Tone等人(2003)已报导DC、巨噬细胞和B细胞的LPS刺激导致GITRLmRNA的下调。在静息的APC中GITRL的表达强烈地暗示其在T细胞激活过程的早期发挥作用。其它细胞类型，包括内皮细胞(Gurney等人，1999；Kwon等人，1999)，激活的T细胞和某些DN胸腺细胞亚型也显示表达GITRL，并且该分子对这些后面的细胞类型的功能仍需确定。
抗GITR抗体和表达GITRL的细胞都单独地增强CD25-T细胞的激活的能力以及在CD25+T细胞不存在的情况下抗GITRL部分地抑制25-T细胞的激活的能力促进了对这些试剂的细胞靶的重新细致地检察。向来自野生型和GITR-/-小鼠的CD25+和CD25-T细胞的共培养物中加入抗GITR证明了所述抗体介导的逆转抑制性作用的靶标是CD25-T细胞。在共培养物中使用大鼠CD25-效应和小鼠CD25+抑制性T细胞的实验进一步支持该结论，所述实验决定性地证明在CD25+T细胞亚型上GITR连接不消除其抑制性功能。事实上，通过CFSE稀释的检查证明GITR连接促进了共培养物中CD25+T细胞的扩增，其最终增强了大鼠CD25-效应细胞的抑制作用。因此，由Shimizut等人(2002)报道的抗GITR处理的大鼠/小鼠共培养物中增殖的增加(假定由于大鼠T细胞造成的)可能事实上反映了小鼠CD25+抑制性细胞的增殖。这不能由单独地通过测量3H-胸苷整合来确定。
一个以前的报导暗示GITR缺陷型T细胞对TCR刺激具有超反应性(Ronchetti等人，2002)。然而从上述观察推论到本发明观察结果是非常困难的，因为该报导没有分析纯化的CD4+、CD8+T淋巴细胞的应答，也没有对CD4+CD25+T细胞的作用进行估计。在本研究中，高度纯化的来自GITR-/-小鼠的CD4+CD25-和CD8+T细胞的应答与对照的应答相当。然而，在生理学数目调节性T细胞的情况下，来自GITR-/-动物的CD4+和CD8+T细胞对CD3交联完全没有应答。这些结果清楚地证明在没有GITR/GITRL相互作用的情况下抑制作用占主导。事实上，对来自GITR-/-小鼠的CD4+CD25-T细胞的激活的抑制作用是如此之强以至通过加入高浓度外源IL-2也不能克服该抑制作用，所述外源IL-2通常消除数目高得多的CD25+T细胞对野生型CD4+CD25-T细胞的应答的抑制性作用(Takahashi等人，1998；Thornton和Shevach，1998)。通过抑制IL-2产生和CD4+CD25-GITR-/-效应群体的CD25的表达介导了CD4+CD25+的抑制性作用，其类似于前面已描述的关于CD4+CD25+T细胞对正常CD8+T细胞应答的作用(Piccirillo和Shevach，2001)。
由GITR或CD28递送的共刺激信号似乎是不同的，但是相关的。在调节性T细胞不存在的情况下，来自GITR-/-小鼠的CD4+和CD8+T细胞的应答都与来自野生型小鼠的细胞的应答相同。相反地，在用于本研究的培养条件下，来自CD28-/-小鼠的CD4+和CD28+T细胞是非应答性的。相反地，当将IL-2加入到含有调节性T细胞的培养物中时，来自GITR-/-小鼠的CD4+和CD8+T细胞的应答没有得到恢复，尽管来自CD28-/-小鼠的CD8+细胞的应答被部分地恢复。在另一方面，CD28和GITR之间显著的协同关系和共享的信号系统都由下列实证支持(1)CD4+CD25-和GD8T细胞不能在不存在CD28交联的情况下上调GITR和(2)抗CD80/CD86抗体显著地抑制GITR表达的上调和针对抗GITR抗体的应答。因此，所述结果暗示在T细胞活化过程中CD28-CD80/CD86信号途径的另外的重要功能是通过增强GITR的表达和功能以赋予T细胞对CD25+介导的抑制作用的抗性。
类似于由其它公开的研究(Shimizu等人，2002；Tone等人，2003)所暗示的结论，这些研究表明在调节性T细胞不存在的情况下，GITR在CD25-T细胞上的连接提供了某种程度的共刺激。但是，在以与CD28相同方式刺激CD25-T细胞上不要求GITR连接，因为来自GITR-/-小鼠的CD4+CD25-和CD8T细胞以与野生型T细胞类似的方式作出应答。我们支持下列观点，即，在免疫应答的过程中，在早期通过GITRL介导的GITR与CD4+CD25-和CD8+效应T细胞的接合主要起着使效应群体抵抗(例如不易受)CD4+CD25+T细胞产生的抑制性作用的影响。在所述应答过程中，炎症信号最终导致GITRL表达的下调，因而增加了所述效应细胞对CD25+介导的抑制作用的易感性。尽管可获得的关于在体内CD25+介导的针对感染性因子的免疫抑制作用何时发生的数据非常有限，但一些研究已暗示其发生应答起始期而不是结束期以防止强烈炎症引起的组织破坏(Suvas等人，2003)。应当指出在IL-2存在的情况下，GITR与CD25+T细胞的接合诱导了其扩增(McHugh等人，2002)。在免疫应答早期在效应T细胞分泌的IL-2存在的情况下，在体内通过静息APC上的GITRL介导的GITR在CD25+T细胞上的接合可能导致调节性T细胞的非特异性扩增。该非特异性扩增可能对随后产生抗原特异性抑制性细胞库是至关重要的，所述抗原抑制性细胞在应答晚期抑制效应细胞的活性。
我们前面已经提出GITR/GITRL相互作用的操作证明是在体内操作调节性T细胞功能的有效方法(McHugh和Shevach，2002)。尽管该概念基于暗示CD4+CD25+T细胞是抗GITR抗体的靶的数据，但GITR/GITRL相互作用仍然代表重要的治疗靶。因此，用激动性抗GITR抗体或激动性GITRL-Fc进行的治疗应当使效应细胞抵抗(例如不易受)CD4+CD25+T细胞产生的抑制性作用的影响，并且应当证明对治疗癌症和感染性疾病是有效的，如提高对癌症(单独地使用或与其它癌症治疗剂例如肿瘤疫苗一起使用)的免疫应答和提高对感染性病原体包括病毒、细菌等(单独地使用或与其它用于感染性病原体的治疗剂(例如用于感染性因子的弱免疫的疫苗佐剂)一起使用)的免疫应答。类似地，用GITR拮抗剂例如通过使用中和抗GITRL抗体或GITR-Fc对GITR/GITRL相互作用的抑制应当降低效应T细胞的抑制阈值，从而用于预防和/或治疗自身免疫疾病、炎症、移植排斥和移植物抗宿主病。
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<221>CDS<222>(1)..(522)<400>1atg gag gaa atg cct ttg aga gag tca agt cct caa agg gca gag agg48Met Glu Glu Met Pro Leu Arg Glu Ser Ser Pro Gln Arg Ala Glu Arg1 5 10 15
tgc aag aag tca tgg ctc ttg tgc ata gtg gct ctg tta ctg atg ctg 96Cys Lys Lys Ser Trp Leu Leu Cys Ile Val Ala Leu Leu Leu Met Leu20 25 30ctc tgt tct ttg ggt aca ctg atc tat act tca ctc aag cca act gcc 144Leu Cys Ser Leu Gly Thr Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Lys Pro Thr Ala35 40 45atc gag tcc tgc atg gtt aag ttt gaa cta tca tcc tca aaa tgg cac 192Ile Glu Ser Cys Met Val Lys Phe Glu Leu Ser Ser Ser Lys Trp His50 55 60atg aca tct ccc aaa cct cac tgt gtg aat acg aca tct gat ggg aag 240Met Thr Ser Pro Lys Pro His Cys Val Asn Thr Thr Ser Asp Gly Lys65 70 75 80ctg aag ara ctg cag agt ggc aca tat tta arc tac ggc caa gtg att 288Leu Lys Ile Leu Gln Ser Gly Thr Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ile85 90 95cct gtg gat aag aaa tac ata aaa gac aat gcc ccc ttc gta gta cag 336Pro Val Asp Lys Lys Tyr Ile Lys Asp Asn Ala Pro Phe Val Val Gln100 105 110ata tat aaa aag aat gat gtc cta caa act cta atg aat gat ttt caa 384Ile Tyr Lys Lys Asn Asp Val Leu Gln Thr Leu Met Asn Asp Phe Gln115 120 125atc ttg cct ata gga ggg gtt tat gaa ctg cat gct gga gat aac ata 432Ile Leu Pro Ile Gly Gly Val Tyr Glu Leu His Ala Gly Asp Asn Ile130 135 140tat ctg aag ttc aac tct aaa gac cat att cag aaa aat aac aca tac 480Tyr Leu Lys Phe Asn Ser Lys Asp His Ile Gln Lys Asn Asn Thr Tyr145 150 155 160tgg ggg atc atc tta atg cct gat cta cca ttc atc tct taa 522Trp Gly Ile Ile Leu Met Pro Asp Leu Pro Phe Ile Ser165 170<210>2<211>173
<212>PRT<213>Mus musculus<400>2Met Glu Glu Met Pro Leu Arg Glu Ser Ser Pro Gln Arg Ala Glu Arg1 5 10 15Cys Lys Lys Ser Trp Leu Leu Cys Ile Val Ala Leu Leu Leu Met Leu20 25 30Leu Cys Ser Leu Gly Thr Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Lys Pro Thr Ala35 40 45Ile Glu Ser Cys Met Val Lys Phe Glu Leu Ser Ser Ser Lys Trp His50 55 60Met Thr Ser Pro Lys Pro His Cys Val Asn Thr Thr Ser Asp Gly Lys65 70 75 80Leu Lys Ile Leu Gln Ser Gly Thr Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ile85 90 95Pro Val Asp Lys Lys Tyr Ile Lys Asp Asn Ala Pro Phe Val Val Gln100 105 110Ile Tyr Lys Lys Asn Asp Val Leu Gln Thr Leu Met Asn Asp Phe Gln115 120 125Ile Leu Pro Ile Gly Gly Val Tyr Glu Leu His Ala Gly Asp Asn Ile130 135 140Tyr Leu Lys Phe ASn Ser Lys Asp His Ile Gln Lys ASn Asn Thr Tyr145 150 155 160
Trp Gly Ile Ile Leu Met Pro Asp Leu Pro Phe Ile Ser165 170<210>3<211>10289<212>DNA<213>Mus musculus<400>3tcaggagaca gctataccag gctcctagct gcaagcactc acaaaccaca tgaaactcaa 60aaagtaagac caaagtgtgg atgcttcaat ccttcctaga agggtgaaca aaatacccat120ggaccaaagg aaaactccac ctcctacacc cacggggcta attactataa aacatgacat180tgcatcgttc atccatcact tgtgggtatc tgctttcccc agttctcatt ccatcagaga240acgagttcta gcctcatgga ggaaatgcct ttgagagagt caagtcctca aagggcagag300aggtgcaaga agtcatggct cttgtgcata gtggctctgt tactgatgct gctctgttct360ttgggtacac tgatctatac ttcactcaag gtaaggtggt catagagtct acagctgcta420attatatcat ataaaggtta tttatttgtt agtctggtta ttatcactgc cattcagcat480tgctagaggt agtgggaagg aagacatttg acagtacaaa cagtgtaagc aatttaagcc540ttgtaatgac atggctcttc aaatgtgttt ttattcatcg aatgttttaa gacaaaagac600actagaaaat actatatatt ctctgtaggt gtgagctaga tagaactaca tgtttaaact660gagcctttag gtgtctgtgg aagttctttt gtccttcctg ggactctact agaaccttct720tgattggcaa agaaaagacc tgaaccatgg tactaatctt cgggtaaccc cagacaagct780gtagtctcat tgggggaaga gatacaaaac agtaatgggg gacagtgaca ggaagcaact840gcatgctgag gaagggcatg gtgtcaaagt agaaaaaaag gaaatcctgg gttccagttc900tagattagcc tccccataac cagctgtgca aatttgagta agttgtatcg ttgttctgat960tctagttttt aggtctgcaa catggtgata agggaatggc tctgtttact tggcatcctg 1020
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<223>含有SalI位点的Mus musculus GITRL正向PCR引物<400>6tttaaagtcg acccaccatg gaggaaatgc ctttgagag39<210>7<211>42<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>含有EcoRI位点的Mus musculus GITRL反向PCR引物<400>7tttaaagaat tctcattaag agatgaatgg tagatcaggc at42<210>8<211>534<212>DNA<213>智人<220>
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<223>合成的PLP肽<400>12His Ser Leu G1y Lys Trp Leu G1y His Pro Asp Lys Phe1 5 10
权利要求
1.分离的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的核苷酸序列。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子有效地连接至少一个表达控制序列。
3.用权利要求2的核酸分子转化或转染的宿主细胞。
4.一种分离的核酸分子，所述核酸分子在高严紧条件下与SEQ IDNO1或SEQ ID NO3所列核苷酸序列或其互补序列杂交。
5.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或SEQ ID NO2的氨基酸序列的活性片段的蛋白。
6.权利要求5的分离的核酸分子，其中所述核酸分子有效地连接至少一个表达控制序列。
7.用权利要求6的分离的核酸分子转化或转染的宿主细胞。
8.非人转基因动物，在所述转基因动物中体细胞和生殖细胞含有包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核苷酸序列的DNA。
9.一种分离的蛋白，所述蛋白包含权利要求4的分离的核酸编码的氨基酸序列。
10.一种分离的蛋白，所述蛋白包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其活性片段。
11.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核苷酸序列或其片段互补的核苷酸序列，其中所述核酸分子在细胞中的表达导致降低的GITRL产量。
12.权利要求11的分离的核酸分子，其中所述核酸分子有效地连接至少一个表达控制序列。
13.反义寡核苷酸，所述寡核苷酸与对应于包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核苷酸序列或其片段的核酸分子的mRNA互补，其中所述寡核苷酸抑制GITRL的表达。
14.siRNA分子，所述siRNA分子对应于包含SEQ ID NO1或SEQID NO3的核苷酸序列或其片段的核酸分子，其中所述siRNA分子抑制GITRL的表达。
15.分离的抗体，所述抗体能够特异性地结合权利要求10的蛋白。
16.权利要求15的抗体，其中所述抗体中和GITRL活性。
17.权利要求16的抗体，其中所述抗体是具有ATCC保藏号PTA-5336的5F1或具有ATCC保藏号PTA-5337的10F12。
18.用于筛选受试化合物的方法，所述受试化合物能够抑制GITRL与GITR的相互作用，包括步骤将包含GITRL和GITR的样品与所述化合物接触；和确定相对于没有与所述化合物接触的样品中的GITRL与GITR的相互作用，所述样品中GITRL与GITR的相互作用是否降低，由此与所述化合物接触的样品中的GITRL与GITR的相互作用的降低表明所述化合物为抑制GITRL和GITR的相互作用的化合物。
19.筛选受试化合物的方法，所述受试化合物能够增强或模拟GITRL和GITR的相互作用，包括步骤将包含GITRL和GITR的样品与所述化合物接触；和确定相对于没有与所述化合物接触的样品中的GITRL与GITR的相互作用，所述样品中GITRL与GITR的相互作用是否增加，由此与所述化合物接触的样品中的GITRL与GITR的相互作用的增加表明所述化合物为增强或模拟GITRL和GITR的相互作用的化合物。
20.一种在受试者中诊断自身免疫疾病、炎症或移植排斥的方法，其包括步骤检测来自所述受试者的样品中GITRL基因产物的受试量；和将所述受试量与对照样品中的GITRL基因产物的正常量比较，由此显著高于正常量的受试量在自身免疫疾病、炎症或移植排斥的诊断中提供了阳性指标。
21.用于在受试者中诊断癌症或感染性疾病的方法，其包括步骤检测来自所述受试者的样品中GI TRL基因产物的受试量；和将所述受试量与对照样品中的GITRL基因产物的正常量比较，由此显著低于正常量的受试量在癌症或感染性疾病的诊断中提供了阳性指标。
22.一种用于治疗经诊断具有自身免疫疾病、炎症或移植排斥或处于上述疾病风险中的受试者的方法，其包括给所述受试者施用GITR拮抗剂。
23.权利要求22的方法，其中所述方法包括施用GITR拮抗剂以维持受试者效应T细胞对由CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的敏感性。
24.权利要求22的方法，其中所述GITR拮抗剂选自中和抗GITRL抗体、中和抗GITR抗体、包含GITR的融合蛋白、包含GITR的活性片段的融合蛋白、拮抗性小分子、反义GITRL核酸分子和siRNA GITRL核酸分子。
25.权利要求22的方法，其中所述自身免疫疾病或炎症选自类风湿性关节炎、脑脊髓炎、骨关节炎、多发性硬化、自身免疫性胃炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣和其它炎性皮肤病、I型糖尿病、哮喘、过敏和炎性肠疾病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。
26.权利要求22的方法，其中所述自身免疫疾病是多发性硬化。
27.一种用于治疗经诊断具有癌症或感染性疾病或处于所述疾病风险中的受试者的方法，包括给受试者施用GITR激动剂。
28.权利要求27的方法，其中所述方法包括施用GITR激动剂以使GITR激动剂给受试者效应T细胞提供共刺激信号并使其不易受受试者的CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的影响。
29.权利要求27的方法，其中所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、包含GITRL的融合蛋白、包含GITRL活性片段的融合蛋白和激动性GITR抗体。
30.一种用于诱导包含效应T细胞的细胞群体增殖的方法，其包括给所述细胞群体施用GITR激动剂。
31.权利要求30的方法，其中所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、包含GITRL的融合蛋白、包含GITRL活性片段的融合蛋白和激动性GITR抗体。
32.权利要求30的方法，其中所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
33.一种用于抑制包含效应T细胞的细胞群体增殖的方法，其包括给所述细胞群体施用GITR拮抗剂。
34.权利要求33的方法，其中所述GITR拮抗剂选自中和抗GITRL抗体、中和抗GITR抗体、包含GITR的融合蛋白、包含GITR活性片段的融合蛋白、拮抗性小分子、反义GITRL核酸分子和siRNA GITRL核酸分子。
35.权利要求33的方法，其中所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
36.一种用于在CD4+CD25+调节性T细胞存在的情况下阻断包含效应T细胞的细胞群体的抑制作用的方法，其包括给所述细胞群体施用GITR激动剂。
37.权利要求36的方法，其中所述方法包括施用GITR激动剂以使GITR激动剂为所述效应T细胞提供共刺激信号并使其不易受由CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的影响。
38.权利要求36的方法，其中所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、包含GITRL的融合蛋白、包含GITRL活性片段的融合蛋白和激动性GITR抗体。
39.权利要求36的方法，其中所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
40.一种用于在CD4+CD25+调节性T细胞存在的情况下抑制包含效应T细胞的细胞群体的方法，其包括给所述细胞群体施用GITR拮抗剂。
41.权利要求40的方法，其中所述方法包括施用GITR激动剂以维持所述效应T细胞对由所述CD4+CD25+调节性T细胞产生的抑制作用的敏感性。
42.权利要求40的方法，其中所述GITR拮抗剂选自中和抗GITRL抗体、中和抗GITR抗体、包含GITR的融合蛋白、包含GITR活性片段的融合蛋白、拮抗性小分子、反义GITRL核酸分子和siRNA GITRL核酸分子。
43.权利要求40的方法，其中所述效应T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
44.用于在受试者中治疗癌症或感染性疾病的方法，所述方法包括获取效应T细胞群体、用GITR激动剂处理所述群体和将所述经处理的群体给患有癌症或感染性疾病的受试者施用的步骤。
45.权利要求44的方法，其中所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、包含GITRL的融合蛋白、包含GITRL活性片段的融合蛋白、激动性小分子和激动性抗GITR抗体。
46.权利要求44的方法，其中所述受试者患有癌症，并且其中所述经处理的群体用作肿瘤疫苗。
47.包含GITR激动剂和药物可接受载体的药物组合物。
48.权利要求47的药物组合物，其中所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、包含GITRL的融合蛋白、包含GITRL活性片段的融合蛋白、激动性小分子和激动性抗GITR抗体。
49.包含GITR拮抗剂和药物可接受载体的药物组合物。
50.权利要求49的药物组合物，其中所述GITR拮抗剂选自中和抗GITRL抗体、中和抗GITR抗体、包含GITR的融合蛋白、包含GITR活性片段的融合蛋白、拮抗性小分子、反义GITRL核酸分子和siRNA GITRL核酸分子。
51.一种疫苗佐剂，所述疫苗佐剂包含GITR激动剂和抗原，所述抗原选自病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、癌抗原、肿瘤相关抗原和其片段。
52.权利要求51的疫苗佐剂，其中所述GITR激动剂选自GITRL、GITRL的活性片段、包含GITRL的融合蛋白、包含GITRL活性片段的融合蛋白、激动性小分子和激动性抗GITR抗体。
53.一种疫苗佐剂，所述疫苗佐剂包含GITR拮抗剂和抗原，所述抗原选自自身抗原、淀粉样肽蛋白、同种抗原、移植抗原、过敏原和其片段。
54.权利要求53的佐剂，其中所述GITR拮抗剂选自中和抗GITRL抗体、中和抗GITR抗体、包含GITR的融合蛋白、包含GITR活性片段的融合蛋白、拮抗性小分子、反义GITRL核酸分子和siRNA GITRL核酸分子。
全文摘要
本发明提供了涉及糖皮质激素诱导的TNF受体的新配体的新的分离和纯化的多核苷酸和多肽(GITR)。本发明也提供了该GITR配体(GITRL)的抗体。本发明也涉及使用GITRL和/或GITRL的调节剂诊断、预测、监控和治疗免疫系统失调引起的疾病(例如自身免疫疾病、炎症和移植排斥，以及癌症和感染性疾病)的方法。本发明进一步涉及与GITRL和GITR相关的新的治疗剂和治疗靶标，也涉及筛选和评估测试化合物的方法，所述测试化合物用于干预(治疗)和预防由免疫系统失调引起的所述疾病。
文档编号A61K38/00GK1809589SQ200480017401
公开日2006年7月26日 申请日期2004年5月24日 优先权日2003年5月23日
发明者M·科林斯, E·M·舍维克, R·S·麦克休, J·M.维特斯, D·A·扬, M·C·伯恩, P·F·雷迪, G·L·斯蒂芬斯, B·M·卡雷诺 申请人:Wyeth公司, 由卫生与公众服务部代表的美利坚合众国政府