控制昆虫的组合物和方法

专利名称：控制昆虫的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及与控制昆虫有关的组合物，方法，细胞系和报告。
背景技术：
动物具有化学感受和机械感受系统，能够识别多种环境刺激，产生行为反应。已进行了行为学研究以了解这些系统的遗传学。嗅觉系统在一些物种，包括昆虫的生存和生活中具有重要的作用。
果蝇是研究感觉系统的一种模式生物，这是由于它能够通过分子技术进行突变分析，进行行为学分析和电生理学分析，并且它的嗅觉系统与哺乳动物的对应系统相当。
数年来已经研究了各种化学药物或混和剂的杀虫活性，其目的是得到一种对无脊椎动物例如昆虫具有选择性，但是对脊椎动物如哺乳动物、鱼、家禽和其它物种几乎没有或完全没有毒性，并且另外在环境中不存留也不破坏环境的产品。
大部分具有足够的杀虫活性的已知的和商业化的产品对于不是该产品的靶的哺乳动物、鱼、家禽或其它物种都具有毒性或有害作用。例如有机磷化合物和氨基甲酸酯在昆虫以及所有种类的动物中都可抑制乙酰胆碱酯酶的活性。杀虫脒和相关的甲脒已知可作用于昆虫的章鱼胺受体，但是由于它们使脊椎动物有心脏中毒的可能，对动物具有致癌性并且对不同的昆虫作用不同，因而已撤出市场。其它对哺乳动物和其它非靶定物种具有较小毒性的化合物往往难以鉴别。
发明概述本发明包括控制昆虫的组合物以及使用这些组合物的方法。本发明包括控制昆虫的组合物，其包括一种或多种植物香精油，以及使用这些组合物的方法。所述植物香精油当组合使用的时候具有协同效果。所述组合物可以包括不挥发性油，其是一种非挥发性的没有香味的植物性油。此外，这些组合物可由一般认为安全的(GRAS)化合物组成。
本发明包括含有一种或多种植物香精油和昆虫控制试剂的组合物，以及使用这些组合物的方法。昆虫控制试剂的实例包括DEET和D-丙烯除虫菊酯。所述植物香精油和所述昆虫控制试剂组合使用的时候具有协同效果。例如，29％DEET的昆虫控制效果在本发明的组合物中用5％的DEET就可以获得。
本发明包括筛选具有昆虫控制活性的组合物的方法。本发明包括用酪胺受体(TyrR)，Or83b嗅觉受体(Or83b)，或Or43a嗅觉受体稳定转染的细胞系，其可用于筛选具有昆虫控制活性的组合物。
本发明包括产生鉴别一种或多种具有昆虫控制活性的组合物的报告的方法。术语“报告”指存在于打印的文件，数据库，计算机系统或其它介质中的记录或说明。
为简单起见，本申请将通篇使用术语“昆虫”；但是，应当理解术语“昆虫”不仅指昆虫，还指蜘蛛纲动物，幼虫以及类似的无脊椎动物。而且为本申请的目的，术语“昆虫控制”是指具有驱除效果，杀虫效果或者同时具有两个效果。“驱除效果”是指这样的效果，其中与没有用所述组合物处理过的对照宿主或区域相比，有更多的昆虫被排除在用所述组合物处理过的宿主和区域之外。在一些实施方案中，驱除效果是指这样的效果，其中至少有大约75％的昆虫被排除在用所述组合物处理过的宿主和区域之外。在一些实施方案中，驱除效果是指这样的效果，其中至少有大约90％的昆虫被排除在用所述组合物处理过的宿主和区域之外。“杀虫效果”是指这样的效果，其中用组合物处理导致至少大约1％的昆虫死亡。在这一点上，LC1到LC100(致死浓度)或LD1到LD100(致死剂量)的组合物可引起杀虫效果。
在一些实施方案中，所述杀虫效果是这样的效果，其中用组合物处理导致至少大约5％的暴露的昆虫死亡。在一些实施方案中，所述杀虫效果是这样的效果，其中用组合物处理导致至少大约10％的暴露的昆虫死亡。在一些实施方案中，所述杀虫效果是这样的效果，其中用组合物处理导致至少大约25％的昆虫死亡。在一些实施方案中所述杀虫效果是这样的效果，其中用组合物处理导致至少大约50％的暴露的昆虫死亡。在一些实施方案中所述杀虫效果是这样的效果，其中用组合物处理导致至少大约75％的暴露的昆虫死亡。在一些实施方案中所述杀虫效果是这样的效果，其中用组合物处理导致至少大约90％的暴露的昆虫死亡。在本发明的一些实施方案中，用这种浓度或剂量处理可以将昆虫在数秒到数分钟之间击倒。
本发明的组合物可用于控制昆虫，或者直接处理宿主，或者处理宿主所位于的区域，例如室内的生活空间，室外的院子或花园。为本申请的目的，宿主定义为植物，人或其它动物。
附图简述

图1显示了用酪胺受体转染的Schneider细胞的受体特异性结合；图2显示了用能表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜在存在或不存在未标记的酪胺的条件下与不同浓度的3H-酪胺培育之后的3H-酪胺饱和结合曲线；图3显示了用能表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜在存在或不存在不同浓度的未标记的酪胺的条件下与3H-酪胺培育之后的3H-酪胺抑制结合曲线；图4显示了用能表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜在存在或不存在不同浓度的未标记的配体酪胺(TA)，章鱼胺(OA)，多巴胺(DA)，和血清胺(SE)的条件下的3H-酪胺抑制结合曲线；图5显示了用能表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜在存在或不存在不同浓度的公丁香油(LFO)和黑籽油(BSO)的条件下与3H-酪胺培育之后的3H-酪胺抑制结合曲线；图6显示了用能表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜在存在或不存在LFO或BSO的条件下或与不同浓度的未标记的酪胺(TA)的条件下与3H-酪胺培育之后，3H-酪胺(3H-TA)与所述膜的抑制结合；
图7显示了在存在或不存在forskolin和酪胺的条件下表达酪胺受体的Schneider细胞中cAMP水平依赖于酪胺的变化；图8显示了在存在或不存在forskolin和酪胺的条件下用公丁香油和黑籽油处理的能表达酪胺受体的Schneider细胞中cAMP水平依赖于酪胺的变化；图9显示了在存在或不存在酪胺，公丁香油和黑籽油的条件下用forskolin处理的能表达酪胺受体的Schneider细胞中cAMP水平依赖于酪胺的变化；图10显示了3H-酪胺与用能表达Or83b受体的Schneider细胞制备的膜的饱和结合曲线；图11显示了3H-酪胺与用能表达Or43a受体的Schneider细胞制备的膜的饱和结合曲线；图12显示了在能表达Or83b受体的Schneider细胞中cAMP水平依赖于forskolin的变化；图13显示了在能表达Or83b受体的Schneider细胞中胞内Ca2+水平依赖于ionomycin的变化；图14显示了在能表达Or43a受体的Schneider细胞中胞内Ca2+水平依赖于ionomycin的变化；图15显示了在对照Schneider细胞，能表达Or83b受体的Schneider细胞，和能表达Or43a受体的Schneider细胞中胞内Ca2+水平依赖于酪胺的变化；
图16显示了在能表达嗅觉受体的Schneider细胞与3H-酪胺培育之后其中各种植物香精油，包括，LFO，胡椒醛，酞酸二乙酯，和α-松油醇与Or83b和Or43a受体之间的相互作用；图17显示了在能表达嗅觉受体的Schneider细胞与3H-酪胺培育之后其中各种植物香精油，包括，BSO，奎宁，桧萜，α-侧柏酮，α-松萜，d-柠檬烯，和p-百里香素与Or43a受体之间的相互作用；图18显示了在能表达嗅觉受体的Schneider细胞与3H-酪胺培育之后其中各种植物香精油，包括，BSO，奎宁，桧萜，α-侧柏酮，α-松萜，d-柠檬烯，和p-百里香素与Or83b受体之间的相互作用；图19显示了在能表达嗅觉受体的Schneider细胞与3H-酪胺培育之后其中各种植物香精油，包括，香叶醇，邻氨基苯甲酸沉香酯，苯乙醛，沉香醇，α-松油醇，t-茴香脑，松油烯900，菩提醇，和丁香酚与Or83b和Or43a受体之间的相互作用；图20显示了在能表达嗅觉受体的Schneider细胞与3H-酪胺培育之后其中各种植物香精油，包括，百里香油，香芹酚，和百里酚与Or83b和Or43a受体之间的相互作用；图21显示了在能表达嗅觉受体的Schneider细胞与3H-酪胺培育之后其中各种植物香精油，包括，胡椒醛，胡椒醇，醋酸胡椒酯，和胡椒胺与Or83b和Or43a受体之间的相互作用；图22显示了在能表达Or43a受体的Schneider细胞中ionomycin，酪胺，和邻氨基苯甲酸沉香酯对于胞内Ca2+水平的效果；
图23显示了在能表达Or43a受体的Schneider细胞中沉香醇，紫苏子醇，t-茴香脑，香叶醇，苯乙醛和丁香酚对于胞内Ca2+水平的效果；图24显示了在能表达Or43a受体的Schneider细胞中胡椒醇，醋酸胡椒酯，和胡椒胺对于胞内Ca2+水平的效果；图25显示了在能表达Or43a受体的Schneider细胞中α-松油醇，菩提醇，和松油烯900对于胞内Ca2+水平的效果；图26显示了在能表达Or43a受体的Schneider细胞中百里香油，百里酚，和香芹酚对于胞内Ca2+水平的效果；图27显示了在能表达Or43a受体或Or83b受体的Schneider细胞中LFO对于胞内Ca2+水平的效果；图28显示了在能表达Or43a受体或Or83b受体的Schneider细胞中BSO，α-松萜，p-百里香素，d-柠檬烯，桧萜，奎宁，l-香芹酮，d-香芹酮，和α-侧柏酮对于胞内Ca2+水平的效果；图29显示了在存在或不存在酪胺，LFO和BSO的条件下在能表达Or83b受体的Schneider细胞中cAMP水平依赖于酪胺的变化；图30显示了在存在或不存在酪胺和forskolin的条件下在用LFO和BSO处理的能表达Or83b受体的Schneider细胞中cAMP水平依赖于酪胺的变化；图31A和31B显示了酪胺受体的核苷酸序列和肽序列；
图32A和32B显示了Or43a嗅觉受体的核苷酸序列和肽序列；以及图33A和33B显示了Or83b嗅觉受体的核苷酸序列和肽序列发明详述本发明涉及与控制昆虫有关的组合物，方法，细胞系和报告。所述昆虫的控制与一种或多种受体有关，包括酪胺受体(TyrR)，Or83b嗅觉受体(Or83b)，和Or43a嗅觉受体(Or43a)。
本发明包括筛选具有昆虫控制活性的组合物的方法。本发明包括被TyrR，Or43a，或Or83b稳定转染的果蝇Schneider细胞系，其可用于筛选具有昆虫控制活性的组合物。TyrR的核酸序列和肽序列如图31A和图31B所示。Or43a的核酸序列和肽序列如图32A和图32B所示。Or83b的核酸序列和肽序列如图33A和图33B所示。
可以通过检测表达TyrR，Or83b，和/或Or43a的细胞系中检测组合物与各受体的亲和力鉴别可能存在的昆虫控制活性。也可通过检测用检测组合物处理后的表达TyrR，Or83b，和/或Or43a的细胞系中胞内cAMP和/或Ca2+来鉴别可能存在的昆虫控制活性。不同的昆虫物种的TyrR受体，Or83b受体和Or43a受体之间具有相似性。同样地，表达这些受体的果蝇Schneider细胞系可用于筛选对不同的昆虫物种具有昆虫控制活性的组合物。
本发明包括控制昆虫的组合物以及使用这些组合物的方法。本发明包括控制昆虫的组合物，其包括一种或多种植物香精油，以及使用这些组合物的方法。植物香精油组合使用的时候具有协同效果。本发明的组合物可以包括下述油中的任何一种，或其混合物t-anthole白柠檬油 胡椒基黑籽油(BSO) d-柠檬烯 醋酸胡椒酯莰烯 邻氨基苯甲酸盐沉香酯胡椒醇香芹酚 沉香醇胡椒胺d-香芹酮 lindenol 苯醌l-香芹酮 柠檬酸甲酯桧萜1，8-桉树脑 二氢茉莉酮酸甲酯 α-松油烯p-百里香素 香叶烯松油烯900酞酸二乙酯 紫苏子醇 α-松油醇丁香酚 苯乙醛γ-松油醇香叶醇 α-松萜 2-叔丁基-p-苯醌枸橼酸异丙酯 β-松萜 α-侧柏酮柠檬草油 胡椒醛百里香油公丁香油(LFO) 麝香草酚本发明的组合物还可以包括下述油中的任何一种，或其混合物烯丙基硫β-榄香烯 水杨酸孟酯烯丙基三硫 γ-榄香烯 桃金娘烯醛烯丙基二硫 Elmol 乙酸橙花醛二甲酯茴香脑 草蒿脑 橙花叔醇乙酸蒿醇酯 2-乙基-2-己烯-1-醇 壬酮乙酸苄酯 丁香酚乙酸酯1-辛醇苯甲醇 α-法呢烯 E罗勒烯酮香柠檬烯 (Z，E)-β-法呢烯Z罗勒烯酮氧化红没药烯 葑酮罗勒烯α-红没药醇 呋喃二烯呋喃桉叶-1，乙酸辛酯氧化红没药醇 3-二烯 薄荷油氧化红没药醇β 呋喃桉叶-1，4-二烯 α-水芹烯醋酸冰片酯 呋喃大牻牛儿1，10(1 β-水芹烯β-波旁老鹳草烯 5)-二烯-6-酮胡椒醛α-杜松醇呋喃倍半萜烯 Prenal莰烯 香叶醇 胡薄荷酮α-龙脑烯乙酸香叶醇酯 桧萜α-龙脑烯乙醛大根香叶烯D 乙酸桧酯樟脑 大根香叶烯B α-檀香萜氧化丁香烯 α-古香油烯 檀香脑母菊兰烯 α-蛇麻烯Sativen肉桂醛 α-紫罗兰酮 δ-蛇床烯顺马鞭烯醇 β-紫罗兰酮 β-sesquphelandrene柠檬醛A 异冰片 斯巴醇柠檬醛B 异呋喃大根香叶烯 万寿菊酮香茅醛 异薄荷酮 α-松油烯香茅醇 异胡薄荷酮 4-松油醇乙酸香茅酯 茉莉酮α-异松油烯甲酸香茅酯 公丁香油 α-乙酸松油酯α-古巴烯 柠檬烯α-侧柏烯野薄荷油 沉香醇百里酚甲醚α-广木香醇乙酸沉香酯反丁香烯隐酮 香樟烯松香芹醇莪术酮 甲基烯丙基三硫化物反马鞭草烯醇d-香芹酮 薄荷醇马鞭草烯酮l-香芹酮 2-甲氧基呋喃二烯 Yomogi醇印蒿酮 薄荷酮姜烯二烯丙基三硫醚 乙酸孟酯 Dihydrotagentone二氢焦莪术酮 肉桂酸甲酯在那些含有多于一种油的组合物中，每种油按重量计构成所述组合物混合物的大约1％到大约99％。例如，本发明的一种组合物包括大约1％的百里酚和大约99％的香叶醇。任选地，所述组合物还可以含有不挥发性油，其是非挥发性的没有香味的植物性油。例如，所述组合物可以包括一种或多种下述不挥发性油蓖麻油 矿物油红花油玉米油 橄榄油芝麻油枯茗油 花生油大豆油例如，本发明的一种组合物包括大约1％的百里酚，大约50％的香叶醇和大约49％的矿物油。另外，这些组合物可由一般认为安全的(GRAS)化合物组成，例如百里香油，香叶醇，柠檬草油，公丁香油，黑籽油，白柠檬油，丁香酚，蓖麻油，矿物油，和红花油。
本发明包括的组合物含有一种或多种植物香精油和昆虫控制试剂，例如，DEET，和D-alletlirin，以及使用这些组合物的方法。所述植物香精油和所述昆虫控制试剂组合使用的时候具有协同效果。例如，29％DEET的昆虫控制效果在本发明的组合物中用5％的DEET就可以获得。
本发明的组合物可以含有两种或多种植物香精油化合物和/或其衍生物，天然的和/或合成的，包括其外消旋混合物，对映异构体，非对映异构体，水合物，盐，溶剂化物和代谢物，并且它们与适当的载体和任选的适当的表面活性剂混和在一起。
适当的载体可以包括本领域公知的适用于植物香精油的任何载体，只要该载体对本发明的组合物没有不良影响。这里所用的术语“载体”是指惰性或液体物质，其可以是无机物或有机物，合成的或天然的，它与活性化合物相混和或者它被制成适用于容器或硬纸盒或其它要处理的物体的形式，或者适于储存、运输和/或操作的形式。一般而言，通常用于制备驱除剂，杀虫剂，除草剂或杀真菌剂的任何物质都是合适的。本发明的组合物可以单独使用，或者与固体和/或液体分散剂载体和/或其它已知的合适的活性试剂例如其它驱除剂、杀虫剂、或杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、灭鼠剂、除草剂、肥料、生长调节剂混和使用，如果需要，也可以制成特定应用的特定制剂，例如制成溶液、乳剂、悬液、粉末、膏剂、和颗粒以备用。本发明的组合物可以与传统的惰性杀虫剂稀释剂或传统昆虫控制试剂中使用的稀释剂混和使用，例如传统的分散载体如气体、溶液、乳剂、悬液、浓缩乳剂、喷雾粉、膏剂、可溶性粉末、隔离剂、颗粒、泡沫、膏剂、片剂、气溶胶、充满活性化合物的天然和合成物质、微胶囊、用在种子上的包覆组合物，以及燃烧用制剂，例如熏蒸盒，熏蒸罐和熏蒸盘，以及ULV冷雾和暖雾制剂。
本发明的组合物进一步可以包括表面活性试剂。可用于本发明的表面活性试剂，即传统的载体助剂的实例包括乳化试剂，例如非离子和/或阴离子乳化试剂(例如脂肪酸的聚环氧乙烷酯，脂肪醇的聚环氧乙烷醚，烷基硫酸盐，烷基磺酸盐，芳基磺酸盐，清蛋白水解物等，特别是烷基芳基聚乙二醇醚，硬脂酸镁，油酸钠等)；和/或分散试剂例如木质素，亚硫酸盐废液，甲基纤维素等。
本发明的组合物可用于控制昆虫，可以直接用于处理宿主，或者用于处理宿主所在的区域。例如。可以直接用霜剂或喷雾处理宿主，可以外用或局部用于例如人的皮肤。组合物应用于宿主，例如人的时候，可以制成多种个人产品或化妆品以用于皮肤或头发上。例如，可以用下述物质香水，着色剂，色素，染料，古龙水，护肤霜，润肤液，除臭剂，滑石粉，沐浴油，肥皂，洗发剂，护发素以及定型剂。
对于动物，人或非人的宿主，也可以通过口服递送组合物制剂直接进行治疗。例如，组合物可以包裹在液体胶囊中吞咽。
可以用本发明的组合物处理某个区域，例如，通过喷雾剂，例如气溶胶或泵送喷雾剂，或者燃烧剂，例如蜡烛或含有所述组合物的熏香。当然，可以使用不同的处理方法而不会背离本发明的精神和范围。例如，组合物可以含于家用产品中，例如空气清新剂(包括“加热的”空气清新剂，其中驱昆虫剂通过加热，例如电加热，或燃烧而释放)；硬表面清洁剂；或洗衣用品(例如含有组合物的洗衣剂，调节剂)。
本发明通过下述特定的但非限制性的实施例作进一步举例说明。虽然在实施例中包括数值，结果和/或数据，但下述实施例都是预言性的。实施例1到5涉及能表达酪胺受体(TyrR)的细胞系的制备以及用该细胞系对组合物的筛选。实施例6到11涉及能表达Or83b受体的细胞系的制备，能表达Or43a受体的细胞系的制备，以及用这些细胞系对组合物的筛选。实施例l2到34涉及确定组合物的驱除效果和/或杀虫效果。
实施例1用酪胺受体(TyrR)稳定转染的Schneider细胞系的制备A.黑腹果蝇酪胺受体的PCR扩增和亚克隆从得自the Berkeley Drosophila Genome Project(Baumann，A.，1999，Drosophila melanogaster mRNA for octopamine receptor，splice variant 1B NCBI direct submission，AccessionAJ007617)的黑腹果蝇的头cDNA噬菌体文库GH中扩增酪胺受体。TyrR的核酸序列和肽序列如图31A和31B所示。从该文库的液体培养溶解产物中纯化噬菌体DNA。(Baxter，et al.，1999，Insect Biochem Mol Biol 29，461-467)。用于扩增果蝇酪胺受体(TyrR)的开放阅读框架(Han，et al.，1998，J Neurosci 18，3650-3658；von Nickisch-Rosenegk，et al.，1996.Insect BiochemMol Biol 26，817-827)的寡核苷酸为5′寡核苷酸5′gccgaattcgccaccATGCCATCGGCAGATCAGATCCTG 3′和3′寡核苷酸5′taatctagaTCAATTCAGGCCCAGAAGTCGCTTG 3′。大写字母表示与酪胺受体匹配。下划线的核苷酸表示加入的Kozak序列(Grosmaitre，X.，Jacquin-Joly，E.，2001 Mamestra brassicae putative octopamine receptor(OAR)mRNA，complete cds.NCBI direct submission，Accession AF43878)。5′寡核苷酸还包括一个EcoR I位点，3′寡核苷酸包括一个Xba I位点。用Vent聚合酶(New England Biolabs)在下述条件下进行PCR大约95℃，大约5分钟进行大约1个循环；大约95℃，大约30秒；大约70℃，大约90秒进行大约40个循环；大约70℃，大约10分钟进行大约1个循环。
将PCR产物用EcoR I和Xba I消化，亚克隆到pCDNA 3(Invitrogen)中，通过自动DNA测序(Vanderbilt Cancer Center)对两条链进行测序。由此开放阅读框架翻译的蛋白质能够正确匹配已经公开的酪胺受体序列(Saudou，et al.，The EMBOJournal vol 9 nol，6-617)。为了在果蝇Schneider细胞中表达，将此TyrR ORF从CDNA3切割出来，通过Eco RI和Xba I限制性位点插入到pAC5.1/V5-His(B)[pAc5(B)]中。
为了转染，将果蝇Schneider细胞用pAc5(B)-TyrR ORF通过如Invitrogen的果蝇表达系统(DES)的操作手册所述的磷酸钙-DNA共沉淀方法稳定转染。共沉淀方法对于暂时或稳定转染都是一样的，除了稳定转染时要使用有抗生素抗性的质粒。从中选择出至少十个稳定转染细胞的克隆并单独繁殖。用3H-酪胺进行全细胞结合/吸收以选择出表达所述受体的稳定克隆。在此检测中，将细胞洗涤并收集在昆虫盐水(170mM NaCl，6mMKCl，2mM NaHCO3，17mM葡萄糖，6mM NaH2PO4，2mM CaCl2，和4mM MgCl2)中。将大约1mL昆虫盐水中的大约3百万个细胞与4nM3H-酪胺在23℃共培育大约5分钟。将细胞离心大约30秒，吸去结合溶液。将细胞沉淀用大约500μL昆虫盐水洗涤，将细胞重悬并转至闪烁液中。反应中包含50μM未标记的酪胺以确定非特异性结合。用液体闪烁β-计数器(Beckman，Model LS1801)对结合进行放射性定量计数。
B.选择具有最高水平的功能活性酪胺受体蛋白的克隆进行酪胺受体结合/吸收以确定转柒的克隆中哪个具有最高水平的功能活性酪胺受体蛋白。用大约10个营养繁殖系进行酪胺受体实验，用大约2个pAc(B)作为对照。用3H-酪胺(大约4nM/反应)作为示踪剂，其中含有或不含50μM未标记的酪胺作为特异性竞争剂。在此检测中，在平皿上培养细胞，并收集在大约3ml介质中进行细胞计数，调整细胞数目至大约3×106个细胞/ml。同时使用大约两个pAcB克隆作为对照。每个反应中使用大约1ml细胞悬液。在特异性结合中，有大约3个克隆表达高水平的活性酪胺受体蛋白。选取具有最高的特异性酪胺受体结合的克隆进行进一步研究。使选取的克隆增殖并贮存在液氮中。培养选取的克隆的等分试样以进行全细胞结合，并制备质膜以进行动力学和筛选研究。对照pAcB与酪胺受体没有任何特异性结合。
C.用酪胺受体转染的Schneider细胞用于筛选能和酪胺受体相互作用的组合物的功效在多孔板上的每个孔内培养用酪胺受体(大约1×106个细胞/ml)转染的细胞。接种细胞后大约24小时，除去培养基，代之以大约1ml昆虫盐水(大约23℃)。加入不同浓度的3H-酪胺(大约0.1-10nM)，其中含有或不含10μM未标记的酪胺，并在室温(RT)培育。培育大约20分钟后，快速吸去盐水以终止反应，用大约2ml昆虫盐水(大约23℃)洗涤至少一次。在RT下将细胞溶解在大约300ml 0.3M的NaOH中大约20分钟。将溶解的细胞转至大约4ml液体闪烁溶液(Liquid Scintillation Solution)(LSS)中，剧烈旋转大约30秒，然后用液体闪烁β-计数器(Beckman，Model LS1801)(LSC)进行放射性计数。
参照图1，受体特异性结合数据表示为每1×106个细胞特异性结合的fmol量，并测定为3H-酪胺浓度的函数。缺乏10μM未标记的酪胺的条件下的值与存在10μM未标记的酪胺的条件下的值之间的差值即为特异性结合值。如图1所示，在大约5nM3H-酪胺下具有最大特异性结合。未转染的细胞即使在酪胺浓度高达大约100μM的时候也没有反应。
为了研究用pAcB-TyrR稳定转染的细胞中酪胺受体的动力学，从转染的细胞制备膜组分的粗提物，用于计算平衡解离常数(Kd)，最大结合能力(Bmax)，平衡抑制解离常数(Ki)和EC50(对结合有50％的抑制的有效浓度)。进行初步的研究以确定具有受体结合活性的最佳膜蛋白浓度。在此研究中，不同浓度的蛋白(大约10-50μg/反应)在大约1ml结合缓冲液(50mM Tris，pH7.4，5mM MgCl2和2mM抗坏血酸)中培育。加入大约5nM3H-酪胺以起始反应，其中含有或不含大约10μM未标记的酪胺。在室温培育大约1小时后，通过GF/C过滤器(VWR)过滤以终止反应，过滤器事先浸泡在大约0.3％的聚乙烯亚胺(PEI)中。用大约4ml冰冷却的Tris缓冲液洗涤过滤器一次，在用LSC测量残留的放射活性之前将其风干。用曲线拟合(GraphPad软件，Prism)分析结合数据。数据证明在酪胺受体的特异性结合上，大约10，20，30和50μg蛋白/反应之间没有差异。因此，使用大约10μg蛋白/反应。
为了测定表达WyrR的膜上酪胺受体(TyrR)的Bmax和Kd值，进行饱和结合试验。简短来讲，将大约10μg蛋白与不同浓度(大约0.2-20nM)的3H-酪胺一起培育。用曲线拟合(GraphPad软件，Prism)分析结合数据，确定酪胺与其受体结合的Kd。
为了确定几种配体对TyrR的亲和力，检测了几种化合物在浓度渐增时对大约2nM3H-酪胺结合的抑制的能力。对于饱和和抑制检测，分别在不存在和存在大约10μM未标记的酪胺的条件下确定总的结合和非特异性结合。受体结合反应是在限光条件下在室温(RT)培育1个小时。通过GF/C过滤器(VWR)过滤以终止反应，在用LSC测量残留的放射活性之前将其风干。用曲线拟合(GraphPad软件，Prism)分析结合数据。
参照图2，其中显示了3H-酪胺(3H-TA)与从表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜的饱和结合曲线，3H-酪胺对用pAcB-TyrR稳定转染的细胞中的酪胺受体具有高的亲和力，测定的Kd大约是1.257nM，测定的Bmax大约是0.679pmol/mg蛋白。
参照图3，其中显示了3H-酪胺(3H-TA)与从表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜在存在或不存在不同浓度的未标记的酪胺(TA)的条件下的抑制结合，酪胺对表达酪胺受体的Schneider细胞中的酪胺受体的EC50和Ki分别是大约0.331μM和0.127μM。
为了确定酪胺受体(TyrR)的药理学模式，检测了许多可能的神经递质代替表达酪胺受体的膜结合3H-酪胺(3H-TA)的能力。参照图4，其中显示了3H-酪胺与从表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜在存在或不存在不同浓度的未标记的配体(包括酪胺(TA)，章鱼胺(OA)，多巴胺(DA)，和血清胺(SE))的条件下的抑制结合。酪胺对果蝇TyR表现出最高的亲和力(Ki是大约0.127μM，EC50是大约0.305μM)。章鱼胺，多巴胺和血清胺在代替3H-酪胺结合上不如酪胺有效。
参照表A，列出了配体的Ki和EC50，其按能力排次序为酪胺＞章鱼胺＞多巴胺＞血清胺，这表明很可能稳定转染的Schneider细胞表达具有功能活性的酪胺受体。
同样地，表达酪胺受体的Schneider细胞可有效作为研究和筛选能和酪胺受体相互作用的组合物的模型。
实施例2表达酪胺受体的细胞的处理以及组合物对于胞内[cAMP]的效果细胞在平皿上培养，在处理前一天更换培养基。当细胞达到近似95％汇合的时候，吸去培养基，用5ml大约27℃的昆虫盐水(170mM NaCl，6.0mM KCl，2.0mM NaHCO3，17.0mM葡萄糖，6.0mM NaH2PO4，2.0mM CaCl2，4.0mM MgCl2；pH7.0)洗涤细胞一次。加入大约20ml昆虫盐水，轻刮收集细胞。用血细胞计数器对细胞的等分试样进行计数，然后将细胞1000RPM离心大约5分钟。将细胞重悬为3×106个细胞/ml。加入IBMX使之浓度为大约200μM。然后分出大约1ml细胞悬液进行处理。加入Forskolin(cAMP诱导试剂)，酪胺或不同的候选组合物，将细胞在大约27℃培育大约10分钟。
将处理的细胞在大约13000g离心大约10秒。吸去溶液，加入大约1ml大约-20℃的70％的乙醇。旋转打碎细胞沉淀，将样品置于-20℃过夜。用乙醇抽提后，在大约13000g离心大约5分钟以沉淀细胞碎片。将上清转至试管中，用旋转干燥仪冷冻干燥。将得到的提取物重悬于大约100μl TE中，用于cAMP检测。
cAMP检测是基于内源cAMP和3H-cAMP对cAMP结合蛋白的竞争性结合。用3H-cAMP Biotrak系统(Amersham Biosciences)进行该检测，根据制造商的说明操作。简短来讲，将大约50μl细胞提取物与大约50μl3H-cAMP和大约100μl cAMP结合蛋白冰浴培育大约2-4小时。然后加入活性炭(大约100μl)，将溶液在大约4℃离心大约3分钟。取大约200μl反应混合物，用闪烁计数测定3H-cAMP的水平。用大约每反应0到16pmol的冷cAMP的标准曲线计算细胞中内源cAMP的水平。
实施例3表达酪胺受体的细胞的处理以及组合物对于胞内[Ca2+]的效果用荧光指示剂呋喃-2的乙酰氧基甲基(AM)酯测定胞内钙离子浓度([Ca2+]i)(Enan，et al.，Biochem.Pharmacol vol 51，447-454)。在此研究中，在标准条件下培养能表达酪胺的细胞。周检测缓冲液(140mM NaCl，10mM HEPES，10mM葡萄糖，5mM KCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2)制备细胞悬液，调整细胞数目至每ml大约2×106个细胞。简短来说，将大约1.0ml悬液(大约2×106个细胞)与5μM呋喃2/AM在大约28℃一起培育大约30分钟。培育后，室温3700rpm离心大约10秒以沉淀细胞，然后重悬于大约1.5ml检测缓冲液中。在存在或不存在检测的化合药品的条件下用荧光分光光度计分析[Ca2+]i的变化。激发波长为大约340nm(由结合Ca2+的呋喃-2产生)和大约380nm(相应于不含Ca2+的呋喃-2)。监测大约510nm的发射波长的荧光密度。使用任何化合物的时候都没有观察到任何人工的荧光吸收。计算大约340/380nm的比值，并绘制成时间的函数。
实施例4在表达酪胺量体的细胞中公丁香油和黑籽油对于酪胺受体结合活性的效果为了确定特定的油，即，公丁香油(LFO)和黑籽油(BSO)是否能与酪胺受体相互作用以及是否能调节酪胺受体的功能性表达，用从稳定转染和未转染的Schneider细胞制备的膜分析3H-酪胺的结合。
对于在受体部位上与3H-酪胺的结合，使用上述的结合实验方案。进行了LFO和BSO(大约1-100μg/ml)的剂量反应实验以确定它们对于3H-酪胺与从能表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜的抑制结合的效果。参照图5，其中显示了3H-酪胺用用能表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜在存在或不存在不同浓度的LFO和BSO的条件下的抑制结合，证明了用LFO和BSO处理以剂量依赖的方式导致3H-酪胺与其受体的抑制。LFO和BSO的EC50值分别接近10μg/ml和20μg/ml。
现在看图6，其中显示了3H-酪胺与用能表达酪胺受体的Schneider细胞制备的膜在存在或不存在LFO或BSO的或与大约1和10μM未标记的酪胺一起的条件下的抑制结合，LFO(大约25μg/ml)单独即可抑制3H-酪胺与其受体的结合。这种效果对于大约10μM(大约1.74μg/ml)的未标记的酪胺的作用并不确定。除此之外，只有当使用的未标记的酪胺的浓度为大约1μM的时候，LFO才增强了未标记的酪胺抑制3H-酪胺结合的能力。从另一方面来讲，BSO(大约25μg/ml)抑制3H-酪胺结合的能力比LFO差。但是不管未标记的酪胺的浓度是多少，BSO都能显著增加未标记的酪胺抑制3H-酪胺结合的能力。这两种油对于未转染的Schneider细胞中的3H-酪胺结合没有任何效果。
同样地，LFO和BSO与酪胺受体的相互作用是不同的。不希望受到任何理论和机制的限制，很可能LFO和酪胺在同一个结合位点竞争，而BSO作用在与内源配体(酪胺)不同的受体位点。特定的其它油，包括那些明确在本申请中列出的油也可以和酪胺受体相互作用。
实施例5公丁香油和黑籽油对于能表达酪胺受体的细胞中胞内[cAMP]的效果为了研究酪胺受体依赖于检测化学物质的偶联，使pAcB-TyrR在Schneider细胞中稳定表达。用酪胺(大约10μM)，LFO(大约25μg/ml)和BSO(大约25μg/ml)在存在或不存在forskolin(FK)(大约10μM)的条件下处理转染和未转染的细胞。如上所述用3H-cAMP检测试剂盒(Amersham)测定cAMP的产生。
为了确保在此细胞模型中的cAMP级联是具有功能活性的，使用forslcolin，一种cAMP诱导剂作为标准试剂。如图7到9所示，其中显示了用LFO(大约25μg/ml)和BSO(大约25μg/ml)在存在或不存在酪胺(大约10μM)和forskolin(大约10μM)的条件下处理之后的表达酪胺受体的Schneider细胞中cAMP水平依赖于酪胺的变化，仅在转染的细胞中在用forskolin处理以后cAMP水平与仅用溶剂(乙醇)处理的细胞中cAMP的基线水平相比增加了大约19倍。
另一方面，酪胺使得cAMP的产生有轻微降低。但是，酪胺显著拮抗表达酪胺的细胞中forskolin刺激的cAMP水平，这表明酪胺受体在存在酪胺的条件下与Gαi/o偶联，如图7所示。仅在转染的细胞中在用LFO和BSO处理后发现cAMP水平分别降低了大约34％和25％(图8)。而酪胺增强了LFO对于酪胺受体转染细胞中的cAMP产生的作用，用BSO和酪胺一起处理的时候除了BSO自身的效果之外cAMP水平没有任何变化，如图8所示。在表达酪胺受体的Schneider细胞中LFO和BSO导致的cAMP水平降低的现象在存在forskolin的条件下减少了，如图9所示。
用其它特定的植物香精油，包括那些明确在本申请中列出的油处理都可以导致表达酪胺受体的细胞中的胞内cAMP水平的改变。
实施例6制备用嗅觉受体(Or83b和Or43a)稳定转染的Schneider细胞A.黑腹果蝇嗅觉受体Or83b和Or43a的RT-PCR扩增和亚克隆用Trizol试剂(Invitrogen)从野生型黑腹果蝇的头和触角中提取总RNA。将其连同Trizol在用马达驱动的特富龙杵和玻璃匀浆器中匀浆。然后根据制造商的说明书提取RNA，包括通过沉淀除去蛋白多糖和多糖。用oligo-dT作为引物用MuLV反转录酶(Applied Biosystems)对总RNA进行反转录。使用下述寡核苷酸进行开放阅读框架的PCR扩增Or83b有义方向5′taagcggccgcATGACAACCTCGATGCAGCCGAG 3′；Or83b反义方向5′ataccgcggCTTGAGCTGCACCAGCACCATAAAG 3′；Or43a有义方向5′taagcggccgcATGACAATCGAGGATATCGGCCTGG 3′；以及Or43a反义方向5′ataccgcggTTTGCCGGTGACGCCACGCAGCATGG 3′。大写字母表示与Or83b和Or43a受体序列完全匹配。有义方向的寡核苷酸包括Not I位点，反义方向的寡核苷酸包括SacII位点。两个限制性位点由下划线的核苷酸表示。反义方向的寡核苷酸不包括终止密码子，因此pAC 5.1质粒的V5表型与翻译蛋白相接。对于Or83b的PCR扩增，使用Vent聚合酶(New England Biolabs)，反应条件如下大约95℃，大约5分钟进行大约1个循环；大约95℃，大约30秒；大约70℃，大约90秒进行大约40个循环；大约70℃，大约10分钟进行大约1个循环。对于Or43a的PCR扩增，使用Failsafe PCR Premix Selection试剂盒(Epicentre Technologies)，反应条件如下大约95℃，大约5分钟进行大约1个循环；大约95℃，大约30秒；大约60℃，大约30秒和大约70℃，大约90秒进行大约40个循环；大约70℃，大约10分钟进行大约1个循环。Failsafe预混缓冲液F产生正确大小的产物。将PCR产物用Sac II和Not I消化，凝胶纯化并连接到pAC 5.1/V5 His B(Invitrogen)上。用自动荧光测序仪(Vanderbilt Cancer Center)对两条链上的插入物进行测序。Or83b开放阅读框架和Or43a开放阅读框架编码的的蛋白与PubMed上的和在网站上的基因组序列中找到的序列信息是相同的。Or43a的核苷酸序列和肽序列如图32A和32B所示。Or83b的核苷酸序列和肽序列如图33A和33B所示。
用磷酸钙-DNA共沉淀方法进行转染，如上述的InvitrogenDrosophila Expression System(DES)操作手册所述，用pAc5(B)-Or83b ORF或pAc5(B)-Or43a ORF稳定转染果蝇Schneider细胞。挑取至少大约十个Or83b或Or43a稳定转染细胞的克隆，分别培养。用RT-PCR方法对稳定的克隆进行分析以检测它们是否表达相应的mRNA。用Trizol从细胞中提取RNA，根据制造商的说明书操作。用MuLV反转录酶对总RNA进行反转录。用Vent聚合酶和下述引物进行PCROr83b有义方向引物和Or83b反义方向引物；Or43a有义方向引物和Or43a反义方向引物。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并与用于RT-PCR的对照Schneider细胞RNA比较。用一个高度表达Or83b-mRNA或Or43a-mRNA的克隆做进一步研究，以研究用酪胺和特定的植物香精油处理后的蛋白表达(Western blot)，和信号传导(cAMP产物和[Ca2+])。
用RT-PCR确定哪些克隆表达Or83b和Or43a基因。琼脂糖凝胶分析表明对于Or83b，在大约10个克隆中有大约4个克隆产生大约1.46kb的大小正确的产物。对于Or43a，大约2个克隆产生大约1.1kb的大小正确的产物。对对照Schneider细胞进行PCR的时候没有得到这些产物。选择能表达所述mRNA的克隆进行有关受体的其它研究。
B.用Or83b受体或Or43a受体转染的Schneider细胞系用于筛选能与Or83b和Or43a受体相互作用的组合物的能力为了研究Or83b受体和Or43a受体是否含有酪胺的特异性结合位点，如上所述从能表达两种受体的细胞制备能表达Or83b受体或Or43a受体的膜，用于与3H-酪胺竞争性结合。结合检测的方法与表达TyrR的细胞完全一样，如上所述。如图10所示，其中显示了3H-酪胺与从能表达Or83b受体的Schneider细胞制备的膜在存在或不存在大约20μM未标记的酪胺的条件下的饱和抑制曲线，以及图11中显示了表达Or43a受体的细胞同样的实验结果，3H-酪胺与Or83b和Or43a受体特异性结合。如表B中所示，酪胺与Or83b受体结合的Kd大约是96.90nM，Bmax大约是4.908pmol/mg蛋白。对于Or43a，相应的值是Kd为大约13.530nM，Bmax大约为1.122pmol/mg蛋白。
表B实施例7表达嗅觉受体的细胞中cAMP的产生为了确保在此细胞模型中的cAMP级联是具有功能活性的，用forskolin，一种cAMP诱导剂作为标准试剂。用上述实施例2中所述的cAMP检测测定环AMP水平。如图12所示，其中显示了表达Or83b受体的细胞中cAMP水平依赖于forskolin的变化，在用大约10μM的forskolin在室温处理了大约10分钟的细胞中比基线cAMP水平增加了大约13倍。表达Or43a受体的细胞也得到了类似的结果。同样地，表达嗅觉受体的细胞具有功能活性的cAMP级联。
实施例8表达嗅觉受体的细胞中Ca2+的胞内波动用上述实施例3中所述的方法测定胞内Ca2+水平。在表达Or83b或Or43a受体的细胞中用ionomycin(一种Ca2+诱导试剂)和酪胺处理以后发生钙波动。特别是，参照图13和14，当在表达Or83b或Or43a的细胞中加入大约2μM ionomycin的时候，340nm和380nm激发的荧光比与胞内钙水平相互关联，观察到胞内钙显著地增加。在表达Or83b和Or43a的细胞中，在用ionomycin处理以后，钙分别增加了大约3.8倍和7倍。参照图15，大约10μM的酪胺也能在表达Or83b和Or43a的细胞中分别诱导胞内钙增加大约1.18倍和3.5倍。
总体上，药理学分析数据证明这些用Or83b受体基因或Or43a受体基因转染的细胞模型能表达有功能的蛋白受体。
实施例9不同的植物香精油对于嗅觉受体的结合活性以及受体下游的信号传导途径的作用用表达一种嗅觉受体的细胞研究植物香精油与这些受体之间的相互作用以及每种受体下游的信号传导级联。
对于结合活性，将从每种细胞模型制备的膜用于研究植物香精油与受体结合位点之间的相互作用。参照图16，下述油与嗅觉受体发生相互作用公丁香油(LFO)，酞酸二乙酯，α-松油醇，和胡椒醛。
同样地，参照图17和18，下述油与嗅觉受体相互作用黑籽油(BSO)，α-松萜，苯醌，p-百里香素，桧萜，α-侧柏酮和d-柠檬烯。
类似地，参照图19到21，下述油也能与嗅觉受体相互作用香叶醇，邻氨基苯甲酸沉香酯，苯乙醛，沉香醇，α-松油醇，t-茴香脑，松油烯900，lindenol，丁香酚，百里香油，香芹酚，百里酚，胡椒醛，胡椒醇，醋酸胡椒酯，和胡椒胺。
特定的其它油，包括那些在本申请中明确指出的，也可以和嗅觉受体相互作用。
实施例10不同的植物香精油对于表达Or43a受体的细胞中的Ca2+的胞内波动的作用为了确定不同的植物香精油对于胞内钙波动的作用，用每种细胞模型的完整细胞进行检测，如上所述。根据处理之前和处理之后大约150秒的340/380荧光比值之差计算胞内Ca2+水平的变化。如图22所示，用ionomycin和酪胺处理可诱导对照细胞中Ca2+的波动，但在表达Or43a受体的细胞中只能很微小地增加胞内Ca2+的水平。
参照图22到28，下述油在表达Or43a受体的细胞中能够致使钙波动邻氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，紫苏子醇，t-茴香脑，香叶醇，苯乙醛，丁香酚，胡椒醇，醋酸胡椒酯，胡椒胺，α-松油醇，lindenol，松油烯900，百里香油，百里酚，香芹酚，LFO，BSO，α-松萜，p-百里香素，d-柠檬烯，桧萜，奎宁，l-香芹酮，d-香芹酮，和α-侧柏酮。最后，如图24所示，用胡椒醛处理会在表达Or43a受体的细胞中减少胞内Ca2+水平。
用特定的其它植物香精油，包括那些在本申请中明确指出的精油处理也能在表达Or43a受体的细胞中引起胞内Ca2+水平的变化。
此外，用特定的其它植物香精油，包括那些在本申请中明确指出的精油处理在表达Or83b受体的细胞中能引起胞内Ca2+水平的变化。
实施例11不同的植物香精油对于表达嗅觉受体的细胞中cAMP的产生的作用为了确定不同的植物香精油对于胞内cAMP产生的作用，以及在表达一种嗅觉受体的细胞中cAMP依赖于酪胺的变化，将每种细胞模型的细胞用LFO(大约50μg/ml)和BSO(大约50μg/ml)在存在或不存在酪胺(大约20μM)和forskolin(大约10μM)的条件下处理，然后用实施例2中所述的检测方法确定胞内cAMP。
如图29和30所示，用下述油处理在表达Or43a受体的细胞中能够导致cAMP水平增加酪胺；LFO；BSO；LFO和酪胺；BSO和酪胺；forskolin；酪胺和forskolin；LFO和forskolin；LFO，forskolin和酪胺；BSO；和BSO，酪胺和forskolin。
仍然参照图29和30，在用大约20μM酪胺，大约50μg LFO/ml和大约50μg BSO/ml处理以后表达Or83b受体的细胞中cAMP的产生分别增加了大约34％，32％和64％。用酪胺和LFO一起处理与用每一种单独处理的效果相比对cAMP的产生具有拮抗作用(大约24％)。另一方面，用BSO和酪胺一起处理对cAMP的产生具有协同作用(大约增加300％)。
在存在forskolin(大约10μM)的条件下，cAMP的产生增加了大约3000倍。当对用forskolin预处理的细胞给予酪胺或LFO的时候，除了forskolin自身的效果之外，cAMP的产生只增加了大约10-13％。向用forskolin预处理的细胞加入BSO，在这些细胞中除了forskolin诱导的cAMP产生之外，cAMP的水平只增加了大约22％。
还有，用某些其他植物精油处理，如包括在本申请中明确列出的植物精油，使得表达Or43a或Or83b受体的细胞中的细胞内cAMP的量变化。
实施例12组合物对于黑腹果蝇的毒性制备组合物的两种丙酮溶液(大约1％和10％)。向玻璃瓶(大约5ml)中加入检测浓度的丙酮溶液，在从瓶底面计大约3cm做标记。旋转玻璃瓶，使得除了标记处与瓶颈之间的区域以外的玻璃瓶的内表面上都留有检测溶液膜。将所有的玻璃瓶风干10秒以保证丙酮完全蒸发，然后将果蝇置于处理的玻璃瓶中。待丙酮完全蒸发了以后，向每个瓶子中加入大约10只成年的混和性别的果蝇，用棉塞塞住瓶子。大约24小时后观察到死亡。
实施例13公丁香油(LFO)和黑籽油(BSO)对于野生型果蝇和酪胺受体突变果蝇的毒性可以用野生型黑腹果蝇和酪胺受体突变果蝇作为模型确定LFO和BSO的毒性。用上述实施例12中所述的方法研究这些油的毒性。参照下面的表C和D，两种化学物质对于野生型果蝇都有毒性。LFO对果蝇的毒性是BSO的大约300倍。LFO的LC50大约是25-30ng/mm2，BSO的相应值是大约94μg/cm2。另一方面，LFO对于酪胺受体突变果蝇的毒性比BSO少大约1000倍。两种化学物质对于果蝇的毒性可以通过酪胺受体调节。酪胺受体的突变显著减少了LFO对于果蝇的毒性，而同一个突变体果蝇对于BSO却变得更易感。
表C
表D
实施例14组合物对于田蚁的驱除效果任意选择成年昆虫用于检测组合物的驱除效果，对昆虫不进行单独标记。每次进行重复的时候使用大约5个昆虫。每次处理大约重复3次。未处理的对照检测是在相同条件下进行的，只是对等量的群体/重复仅使用溶剂(丙酮)。用所述组合物(大约100mg，在300ml丙酮中)处理滤纸(大约80cm2)。风干大约3分钟后，将滤纸置于盘上，对昆虫进行驱除。将昆虫放置在盘上，一次在盘子的远端放置一个昆虫。用一个或多个秒表记录在每个滤纸或盘子的未处理表面上所用的时间，直至大约300秒。按如下公式计算驱除率(RR)RR＝[(对照表面上所用时间-处理表面上所用时间)/检测的总时间]。如果RR＞0，则视为所述组合物具有驱除效果，也就是说在处理表面上比对照表面上有更多的昆虫被驱除；如果RR＜0则所述组合物被视为没有驱除效果。
实施例15公丁香油(LFO)和黑籽油(BSO)对于田蚁的驱除效果用上述实施例14中所述的方法研究LFO(大约1.4mg/cm2)和BSO(大约1.4mg/cm2)对于田蚁的驱除效果。如表E和F所示，证明BSO对于田蚁比LFO驱除性更强。LFO和BSO对于田蚁的驱除性分别为90％和100％。此外，LFO和BSO在24小时内也可以导致田蚁有100％的死亡率。
表E
表F使用用BSO处理的盘研究BSO驱除蚂蚁的残余效果。根据上述的驱除方法每天时用五只蚂蚁。同时确定BSO的毒性的时程。在毒性实验中，将蚂蚁暴露于同一个处理表面大约10秒，然后转移到新鲜容器中，暴露后大约24小时记录死亡数据。每天用五只蚂蚁。如表G所示，BSO可以驱除蚂蚁达4天。
表G
实施例16d-柠檬烯，α-松萜，和p-百里香素单独或组合使用对于田蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
参照表16H，d-柠檬烯，α-松萜，和p-百里香素每种单独都具有驱除性。而将油混合成组合物A，一种包括d-柠檬烯，α-松萜和p-百里香素大约各三分之一的组合物，具有协同效果，驱除百分率大大增加。
表H同样地，参照表I，d-柠檬烯和α-松萜每种单独都有驱除性。而将这些油混合成组合物B，一种含有d-柠檬烯和α-松萜各一半的组合物，具有协同效果，驱除百分率大大增加。
表I实施例17沉香醇，d-柠檬烯，α-松萜，p-百里香素和百里香油单独或组合使用对于田蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
参照表J，虽然d-柠檬烯，α-松萜，p-百里香素和百里香油每种单独都具有驱除性，组合物C，一种包括每种油各大约25％的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。
表J同样地，如表K所示，虽然沉香醇，α-松萜，p-百里香素和百里香油每种单独都具有驱除性，组合物D，一种包括每种油各大约25％的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。
表K
类似地，如表L所示，虽然沉香醇，α-松萜，和p-百里香素每种单独都具有驱除性，组合物E，一种包括每种油各大约三分之一的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。
表L实施例18α-松萜，百里香油，α-侧柏酮，桧萜单独或组合使用对于田蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
虽然α-松萜，百里香油，α-侧柏酮和桧萜每种单独都具有驱除性，如表M所示，组合物F，一种其中包括每种油各大约25％的组合物，驱除性增强。
表M实施例19d-柠檬烯，p-百里香素，百里酚，香芹酚和香叶醇单独或组合使用对于田蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
如表N所示，虽然d-柠檬烯，p-百里香素，百里酚和香芹酚每种单独都具有驱除性，组合物G，一种包括每种油各大约25％的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。
表N类似地，如表O所示，虽然d-柠檬烯，p-百里香素和百里酚每种单独都具有驱除性，组合物H，一种包括每种油各大约三分之一的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。
表O
类似地，如表P所示，虽然d-柠檬烯，p-百里香素，百里酚和香叶醇每种单独都具有驱除性，组合物I，一种包括每种油各大约25％的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。
表P实施例20邻氨基苯甲酸沉香酯，α-松萜，d-柠檬烯，p-百里香素，和香叶醇单独或组合使用对于田蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
如表Q所示，虽然香叶醇，d-柠檬烯，p-百里香素和邻氨基苯甲酸沉香酯每种单独都具有驱除性，组合物J，一种含有大约40％香叶醇，大约30％d-柠檬烯，大约10％p-百里香素，大约10％α-松萜和大约10％邻氨基苯甲酸沉香酯的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。
表O实施例21d-柠檬烯，百里酚，α-松油醇，醋酸胡椒酯，胡椒胺，和胡椒醛单独或组合使用对于田蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
如表R所示，虽然d-柠檬烯，百里酚，α-松油醇，醋酸胡椒酯，胡椒胺和胡椒醛每种单独都具有驱除性，组合物K，一种含有大约20％d-柠檬烯，大约30％百里酚，大约20％α-松油醇，大约10％醋酸胡椒酯，大约l0％胡椒胺和大约10％胡椒醛的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。
表R实施例22香叶醇，d-柠檬烯，丁香酚，lindenol和苯乙醛单独或组合使用对于田蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
如表S所示，虽然香叶醇，d-柠檬烯，丁香酚，lindenol，和苯乙醛每种单独都具有驱除性，组合物L，一种含有大约50％香叶醇，大约20％d-柠檬烯，大约10％丁香酚，大约10％lindenol，和大约10％苯乙醛的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。
表S实施例23香叶醇，柠檬草油，丁香酚和矿物油单独或组合使用对于田蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
如表T所示，虽然香叶醇，柠檬草油和丁香酚每种都具有驱除性，组合物M，一种含有大约50％香叶醇，大约40％柠檬草油，和大约10％丁香酚的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。香叶醇，柠檬草油和丁香酚都是环境保护机构(EPA)和食品和药品管理局(FDA)一般认为安全的(GRAS化合物)，并且获得了EPA的杀虫剂注册豁免。
表T同样地，如表U所示，虽然香叶醇和柠檬草油每种都具有驱除性，组合物N，一种含有大约70％香叶醇和大约30％柠檬草油的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。
表U
此外，如表V所示，加入矿物油形成组合物O，一种包括大约60％香叶醇，大约30％柠檬草油，和大约10％矿物油的组合物，不会影响香叶醇和柠檬草油的协同作用。矿物油单独没有驱除性，但是可以使组合物稳定，限制了活性成分的挥发。矿物油与香叶醇和柠檬草油一样都是GRAS化合物。
表V实施例24香叶醇，百里酚，柠檬草油和矿物油单独或组合使用对于田蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
如表W所示，虽然香叶醇，百里酚和柠檬草油每种都具有驱除性，组合物P，一种含有大约50％香叶醇，大约20％百里酚，大约20％柠檬草油，和大约10％矿物油的组合物，的驱除性超过任何一种组分油单独使用的效果。香叶醇，百里酚，柠檬草油，丁香酚和矿物油都是环境保护机构(EPA)和食品和药品管理局(FDA)一般认为安全的(GRAS化合物)，并且获得了EPA的杀虫剂注册豁免。
表W实施例25黑籽油(BSO)，公丁香油(LFO)，香叶醇，百里酚，柠檬草油和矿物油单独或组合使用对于木蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
如表X所示，香叶醇，百里酚和百里香油每种都具有驱除性。如表Y所示，组合物Q到V，含有BSO，LFO，香叶醇，百里酚，百里香油，矿物油，红花油和蓖麻油的不同组合，驱除性都有所增强。
表X
表Y实施例26商品化的驱除剂29％DEET对于木蚁的驱除效果为了与由不同植物香精油组成的不同化合物的驱除效果相比较，检测了昆虫控制试剂，商品化的驱除剂29％DEET，商品名为REPEL(Wisconsin Pharmacal Company，Inc，Jackson，WY)，对于木蚁的驱除性，方法是用29％DEET处理滤纸。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。如表Z所示，29％DEET在第0天的驱除百分率为大约98.4％。LFO，BSO和本发明的组合物的驱除百分率相当，有时比29％DEET的驱除率高。
表Z
实施例27商品化的驱除剂DEET，单独或与香叶醇，百里酚，和柠檬草油或香叶醇，D-柠檬烯，丁香酚，LINDENOL，和苯乙醛组合使用对于木蚁的驱除效果用所检油处理滤纸以检测商品化的驱除剂DEET和不同植物香精油的驱除效果。室温放置5分钟后，将滤纸置于盘中，一次性放入蚂蚁。如上述实施例14所述确定驱除性。每种油单独检测。此外，还将各种油混合成组合物并进行检测。
如表AA和BB所示，用浓度为大约5-10％的DEET处理没有表现出驱除的迹象。但是，如表AA所示，当与组合物W，一种含有大约25％香叶醇，10％百里酚，10％柠檬草油和矿物油(45％到55％，取决于DEET的最终浓度)的组合物组合使用的时候，驱除性接近100。同样地，如表BB所示，当与组合物X，一种含有大约25％香叶醇，10％d-柠檬烯，5％丁香酚，5％lindenol，5％苯乙醛和矿物油(45％到55％，取决于DEET的最终浓度)的组合物组合使用的时候，驱除性接近97％到98％。而且，如图AA和BB所示，各种油与DEET组合使用的时候驱除性增加。
表AA
表BB实施例28组合物对于头虱的杀虫效果从生活在埃及亚历山大港Karmos地区的年龄在4到11岁之间的女童和男童身上收集活的成年头虱Pediculus humanus。用细密齿的探虱梳收集所述昆虫，聚集在一起。将收集到的虱子置于盘中，在收集后大约30分钟内用于本研究。
在水中制备用于检测的不同浓度的组合物。为了将这些组合物的杀虫效果与商业可获得的杀虱试剂的效果相比较，将伊维菌素溶于水。在盘上施用大约1ml的每种浓度的组合物，大约1ml的伊维菌素水溶液，在对照盘上施用大约1ml水。在每个盘中放入大约10只成年头虱。
持续观察处理和对照盘，并观察LT100。LT是指杀死给定百分比的昆虫所需要的时间；因此LT100是指杀死100％的虱子所需要的时间。如果头虱对于硬物没有反应则视为其死亡。
实施例29包括香叶醇，D-柠檬烯，苯甲醇，P-百里香素，和公丁香油的组合物对于头虱的杀虫效果用上述实施例28中所述的方法研究组合物Y，一种包括大约20％p-百里香素，大约40％公丁香油(LFO)，大约30％苯甲醇，和大约10％矿物油的组合物，的杀虫效果。将该组合物的LT100与商业可获得的杀虱试剂，伊维菌素相比。如表CC所示，用组合物Y处理的虱子比用伊维菌素处理的虱子死亡的更快。
表CC实施例30组合物对于蚊子的驱除效果A.口服递送用无毛的或刮过毛的小鼠和豚鼠检测口服递送的组合物的驱除效果。给大约10只啮齿动物口服给予检测油(例如公丁香油(LFO)或黑籽油(BSO))或检测组合物(例如含有香叶醇，d-柠檬烯，丁香酚，和lindenol的组合物)。给大约10只啮齿动物口服给予对照物质，例如矿物油。大约30分钟后，将每只啮齿动物置于封闭的容器内。向每个容器中放入大约20只蚊子。观察每个容器大约1小时。记录每只昆虫在啮齿动物身上停留的时间以及所述昆虫在啮齿动物的皮肤上留下的伤口的数目。所述昆虫在接受了检测组合物的啮齿动物身上停留的时间比在接受了对照物质的啮齿动物上停留的时间少。接受检测组合物的啮齿动物身上的伤口比接受对照物质的啮齿动物少。
B.局部递送用无毛的或刮过毛的小鼠和豚鼠检测局部递送的组合物的效果。给大约10只啮齿动物的皮肤局部给予检测油(例如公丁香油(LFO)或黑籽油(BSO))或检测组合物(例如含有香叶醇，d-柠檬烯，丁香酚，和lindenol的组合物)。给大约10只啮齿动物的皮肤局部给予对照物质，例如矿物油。大约30分钟后，将每只啮齿动物置于封闭的容器内。向每个容器中放入大约20只蚊子。观察每个容器大约1小时。记录每只昆虫在啮齿动物身上停留的时间以及所述昆虫在啮齿动物的皮肤上留下的伤口的数目。所述昆虫在接受了检测组合物的啮齿动物身上停留的时间比在接受了对照物质的啮齿动物上停留的时间少。接受检测组合物的啮齿动物身上的伤口比接受对照物质的啮齿动物少。
实施例31组合物对于蚊子的驱除效果大约三个笼子，每个装有大约100只大约7到10天龄的热带家蚊(culex quinquefasciatus)。使蚊子饿大约12个小时。每个笼子有四个容器，每个容器都充满了浸有糖水的棉花。
将四个容器中的三个用1000ppm(大约1mg/l)的检测组合物任意处理，另一个容器作为未处理的对照。将容器置于每个笼子中四个相对的角上，在向每个容器加入检测组合物后大约0，1，2，4，和6小时的时间区间中对蚊子的落下进行计数。在暴露的时间区间之间将容器从笼中移出。每次暴露的时间区间持续大约5分钟。
用此方法检测表DD中所述的组合物的驱除效果。
表DDLFO，枯茗油，香叶醇，百里香油，和柠檬草油都是环境保护机构(EPA)和食品和药品管理局(FDA)一般认为安全的(GRAS化合物)，并且获得了EPA的杀虫剂注册豁免。
在向每个容器加入检测组合物后大约0，1，2，4，和6小时的时间区间中对蚊子的落下进行计数，如表DD所示。落下的数目如表EE所示。用此数据和表FF中的数据计算驱除百分数。在每一个暴露的时间区间中，组合物EE，AA和BB都表现出几乎100％的驱除性。甚至在6个小时以后，所述组合物对蚊子还有100％的驱除性。
表EE
表FF实施例32含有植物香精油的组合物对于红蚁的驱除效果和杀虫效果的检测方法含有植物香精油的不同组合物对于红蚁的杀虫效果通过下述方法检测。用大约20μl的每种检测组合物处理纸板，处理后的纸板每个小瓶中放一张。将未处理的纸板放在对照瓶中。再用大约20μl的100％DEET处理纸板并放置在小瓶中以比较组合物和DEET，一种已知商品昆虫控制试剂的杀虫效果。在每个小瓶中放入大约三只红蚁，用棉花封住瓶口防止昆虫逃走。将昆虫暴露于所述组合物大约一个小时或更短时间并记录死亡率。
含有植物香精油的不同组合物对于红蚁的驱除效果通过下述方法检测。用大约200μl的每种检测组合物处理纸板并将纸板放在盘中。将未处理的纸板放在对照盘中。再用大约200μl的100％DEET处理纸板并放置在盘中以比较组合物和DEET的驱除效果。在每个盘中放入红蚁。对昆虫的行为和昆虫在处理过的纸板上逗留的次数监测大约5分钟。记录一只红蚁逗留的次数。
残余杀虫效果和驱除效果的检测是用检测组合物处理纸板，将处理过的纸板在实验室条件下保持预定的一段时间(例如0分钟，6小时，1天，3天，5天，7天)，用上述方法使红蚁暴露于处理过的纸板。
实施例33含有植物香精油的组合物对于红蚁的驱除效果和杀虫效果用实施例32中所述的方法检测组合物的杀虫效果和驱除效果，如表GG所示。未处理的盘既对红蚁没有毒性也没有驱除红蚁。
表GG在用所述组合物处理过纸板后，当暴露于纸板大约0分钟，6小时，1天，3天，5天，或7天时，每一种组合物都能导致100％的死亡率，与DEET相当。
如表HH所示，红蚁被用于处理纸板的组合物所驱除。此外，在残余能力方面，所述组合物优于DEET，它们在应用于纸板后驱除能力保持了至少一周，而DEET在1天后就失去了驱除能力。表HH显示了红蚁在处理过的纸板上逗留的次数。表中列出的时间，0分钟，6小时，1天，3天，5天，或7天，是指用所述组合物处理所述纸板与将红蚁暴露于所处理纸板之间经过的近似时间。
表HH
实施例34含有植物香精油的组合物对红蚁的驱除效果和杀虫效果用实施例32中所述的方法检测组合物的杀虫效果和驱除效果，如表JJ所示。用每种组合物处理都具有驱除效果和杀虫效果。
表JJ
本领域技术人员应当明白，可以对本发明进行各种修改和变化而不会背离本发明的范围和精神。说明书和实施例仅是示例，而并非是限制本发明的范围和精神。本文索引用的参考文献和出版物在此都引入作为参考。
应当理解，除非另外指出，说明书，实施例和权利要求中所使用的所有表示成分，特性如反应条件，等的数量的数字在所有的实例中通过引入术语“大约”都可以变化。相应地，除非另外指出，说明书，实施例和权利要求中出现的数字参数都是近似值，可以根据本发明所确定的所需特性而变化。
权利要求
1.一种控制昆虫的组合物，包括至少两种油，其中所述组合物靶定所述昆虫的选自酪胺受体，Or83b嗅觉受体，和Or43a嗅觉受体的至少一个受体，可使得所述昆虫的胞内cAMP，Ca2+，或二者的水平发生改变。
2.权利要求1的组合物，其中所述的至少两种油包括选自t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉树脑，p-百里香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香叶醇，枸橼酸异丙酯，柠檬草油，公丁香油，白柠檬油，d-柠檬烯，邻氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，柠檬酸甲酯，二氢茉莉酮酸甲酯，香叶烯，紫苏子醇，苯乙醛，α-松萜，β-松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎宁，桧宁，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，gamma-松油醇，2-叔丁基-p-苯醌，α-侧柏酮，百里香油，和百里酚。
3.如权利要求2所述的组合物，其中用所述组合物处理具有驱除效果。
4.如权利要求2所述的组合物，其中用所述组合物处理具有杀虫效果。
5.如权利要求2所述的组合物，进一步包括至少一种不挥发性油。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述的至少一种不挥发性油选自蓖麻油，玉米油，枯茗油，矿物油，橄榄油，花生油，红花油，芝麻油，和大豆油。
7.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括公丁香油；香叶醇，和百里香油。
8.如权利要求3所述的组合物，其中所述油包括公丁香油，香叶醇，和百里香油。
9.如权利要求6所述的组合物，其中所选择的油包括公丁香油，香叶醇，百里香油，和枯茗油。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所选择的油包括按重量计大约44％的公丁香油，按重量计大约10％的香叶醇，按重量计大约2％的百里香油，和按重量计大约44％的枯茗油。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯，百里香油，香叶醇，α-松萜，和p-百里香素。
12.如权利要求3所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯，百里香油，香叶醇，α-松萜，和p-百里香素。
13.如权利要求11所述的组合物，其中所述油包括按重量计大约20％的d-柠檬烯，按重量计大约20％的百里香油，按重量计大约20％的香叶醇，按重量计大约20％的α-松萜，和按重量计大约20％的p-百里香素。
14.如权利要求11所述的组合物，进一步包括苯乙醛。
15.如权利要求12所述的组合物，进一步包括苯乙醛。
16.如权利要求14所述的组合物，其中所选择的油包括按重量计大约10％的d-柠檬烯，按重量计大约30％的百里香油，按重量计大约35％的香叶醇，按重量计大约10％的α-松萜，和按重量计大约5％的苯乙醛。
17.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括香叶醇，百里香油，和柠檬草油。
18.如权利要求3的组合物，其中所选择的油包括香叶醇，百里香油，和柠檬草油。
19.如权利要求17所述的组合物，其中所选择的油包括按重量计大约50％的香叶醇，按重量计大约40％的百里香油，按重量计大约10％的柠檬草油。
20.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯，lindenol，丁香酚，苯乙醛，和香叶醇。
21.如权利要求3所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯，lindenol，丁香酚，苯乙醛，和香叶醇。
22.如权利要求20所述的组合物，其中所选择的油包括按重量计大约20％的d-柠檬烯，按重量计大约10％的lindenol，按重量计大约10％的丁香酚，按重量计大约10％的苯乙醛，和按重量计大约50％的香叶醇。
23.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯，香叶醇，α-松萜，p-百里香素，和苯乙醛。
24.如权利要求3所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯，香叶醇，α-松萜，p-百里香素，和苯乙醛。
25.如权利要求23所述的组合物，其中所选择的油包括按重量计大约15％的d-柠檬烯，按重量计大约50％的香叶醇，按重量计大约15％的α-松萜，按重量计大约15％的p-百里香素，和按重量计大约5％的苯乙醛。
26.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯和p-百里香素。
27.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯，p-百里香素，和α-松萜。
28.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯和α-松萜。
29.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯和百里香油。
30.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括α-松萜和百里香油。
31.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括p-百里香素，α-松萜和百里香油。
32.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括p-百里香素和α-松萜。
33.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括沉香醇，p-百里香素，百里香油，和α-松萜。
34.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括沉香醇，p-百里香素，和α-松萜。
35.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯，p-百里香素，和百里酚。
36.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯，p-百里香素，百里酚和香叶醇。
37.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括α-侧柏酮，α-松萜，桧萜，β-松萜，p-百里香素和柠檬烯。
38.如权利要求3所述的组合物，其中所选择的油包括α-侧柏酮，α-松萜，桧萜，β-松萜，p-百里香素和柠檬烯。
39.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括酞酸二乙酯，α-松油醇，胡椒醛，沉香醇，γ-松油醇，二氢茉莉酮酸甲酯，柠檬酸甲酯和枸橼酸异丙酯。
40.如权利要求3所述的组合物，其中所选择的油包括酞酸二乙酯，α-松油醇，胡椒醛，沉香醇，γ-松油醇，二氢茉莉酮酸甲酯，柠檬酸甲酯和枸橼酸异丙酯。
41.如权利要求2所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯和p-百里香素，α-松萜，百里香油，沉香醇，百里酚，和香叶醇。
42.如权利要求3所述的组合物，其中所选择的油包括d-柠檬烯和p-百里香素，α-松萜，百里香油，沉香醇，百里酚，和香叶醇。
43.如权利要求2所述的组合物，其中所述化合物包括至少两种选自下述物质的油d-柠檬烯，p-百里香素，α-松萜，百里香油，百里酚，香叶醇，柠檬草油，黑籽油，公丁香油，矿物油，和苯乙醛。
44.如权利要求3所述的组合物，其中所述化合物包括至少两种选自下述物质的油d-柠檬烯，p-百里香素，α-松萜，百里香油，百里酚，香叶醇，柠檬草油，黑籽油，公丁香油，矿物油，和苯乙醛。
45.一种控制昆虫的组合物，包括至少两种选自下述物质的油黑籽油，莰烯，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉树脑，枸橼酸异丙酯，柠檬草油，公丁香油，白柠檬油，邻氨基苯甲酸沉香酯，柠檬酸甲酯，二氢茉莉酮酸甲酯，香叶烯，紫苏子醇，苯乙醛，α-松萜，β-松萜，胡椒基，胡椒胺，奎宁，桧宁，α-松油烯，松油烯900，γ-松油醇，2-叔丁基-p-苯醌，和α-侧柏酮。
46.如权利要求45所述的组合物，进一步包括至少一种不挥发性油。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述的至少一种不挥发性油选自蓖麻油，玉米油，枯茗油，矿物油，橄榄油，花生油，红花油，芝麻油，和大豆油。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所选择的油包括公丁香油和枯茗油。
49.一种控制昆虫的组合物，包括选自下述的至少一种油黑籽油和公丁香油。
50.如权利要求49所述的组合物，进一步包括至少一种植物香精油。
51.如权利要求50所述的组合物，其中至少一种植物香精油包括选自下述的油t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉树脑，p-百里香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香叶醇，枸橼酸异丙酯，柠檬草油，公丁香油，白柠檬油，d-柠檬烯，邻氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，柠檬酸甲酯，二氢茉莉酮酸甲酯，香叶烯，紫苏子醇，苯乙醛，a-松萜，β-松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎宁，桧宁，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，γ-松油醇，2-叔丁基-p苯醌，α-侧柏酮，百里香油，百里酚，蓖麻油，玉米油，枯茗油，矿物油，橄榄油，花生油，红花油，芝麻油，和大豆油。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所选择的油包括公丁香油和枯茗油。
53.如权利要求51所述的组合物，其中所选择的油包括公丁香油；香叶醇，和百里香油。
54.如权利要求53所述的组合物，其中所选择的油包括公丁香油，香叶醇，百里香油，和枯茗油。
55.一种控制昆虫的组合物，包括至少一种植物香精油；和一种昆虫控制试剂，其中所述昆虫控制试剂的最终浓度小于所述昆虫控制试剂单独使用时具有昆虫控制活性所需的浓度。
56.如权利要求50所述的组合物，其中所述至少一种植物香精油包括选自下述的油t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉树脑，p-百里香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香叶醇，枸橼酸异丙酯，柠檬草油，公丁香油(LFO)，白柠檬油，d-柠檬烯，邻氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，柠檬酸甲酯，二氢茉莉酮酸甲酯，香叶烯，紫苏子醇，苯乙醛，a-松萜，β-松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎宁，桧宁，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，γ-松油醇，2-叔丁基-p苯醌，α-侧柏酮，百里香油，和百里酚。
57.如权利要求56所述的组合物，其中所述昆虫控制试剂是DEET。
58.如权利要求55所述的组合物，其中所述昆虫控制试剂是DEET。
59.如权利要求58所述的组合物，其中DEET的最终浓度至少低到10％。
60.如权利要求59所述的组合物，其中DEET的最终浓度至少低到5％。
61.如权利要求57所述的组合物，进一步包括不挥发性油。
62.如权利要求61所述的组合物，其中所述不挥发性油选自蓖麻油，玉米油，枯茗油，矿物油，橄榄油，花生油，红花油，芝麻油，和大豆油。
63.如权利要求62所述的组合物，其中所选择的油包括DEET，公丁香油，和枯茗油。
64.如权利要求63所述的组合物，其中所选择的油包括按重量计大约10％的DEET，按重量计大约45％的公丁香油和按重量计大约45％的枯茗油。
65.如权利要求57所述的组合物，其中所选择的油包括DEET，d-柠檬烯，百里香油，香叶醇，α-松萜，和p-百里香素。
66.如权利要求65所述的组合物，其中所选择的油包括按重量计大约10％的DEET，按重量计大约18％的d-柠檬烯，按重量计大约18％的百里香油，按重量计大约20％的香叶醇，按重量计大约20％的α-松萜，和按重量计大约18％的p-百里香素。
67.一种控制昆虫的方法，包括提供一种组合物，其含有选自下述的至少两种油t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉树脑，p-百里香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香叶醇，枸橼酸异丙酯，柠檬草油，公丁香油，白柠檬油，d-柠檬烯，邻氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，柠檬酸甲酯，二氢茉莉酮酸甲酯，香叶烯，紫苏子醇，苯乙醛，a-松萜，β-松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎宁，桧宁，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，γ-松油醇，2-叔丁基-p苯醌，α-侧柏酮，百里香油，和百里酚；将所述昆虫暴露于其浓度足以具有驱除效果的所述组合物。
68.如权利要求67所述的方法，其中所选择的油包括公丁香油；香叶醇，和百里香油。
69.如权利要求67所述的方法，其中所选择的油包括α-侧柏酮，α-松萜，桧萜，β-松萜，p-百里香素和柠檬烯。
70.如权利要求67所述的方法，其中所选择的油包括酞酸二乙酯，α-松油醇，胡椒醛，沉香醇，γ-松油醇，二氢茉莉酮酸甲酯，柠檬酸甲酯和枸橼酸异丙酯。
71.一种控制昆虫的方法，包括提供一种组合物，其含有至少一种选择下述的油黑籽油和公丁香油；将所述昆虫暴露于其浓度足以具有驱除效果的所述组合物。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述组合物进一步包括至少一种其它的植物香精油。
73.一种控制昆虫的方法，包括提供一种如权利要求52所述的组合物；将所述昆虫暴露于其浓度足以具有驱除效果的所述组合物。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述组合物的昆虫控制试剂是DEET。
75.一种控制昆虫的方法，包括提供一种组合物，其含有选自下述的至少两种油t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉树脑，p-百里香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香叶醇，枸橼酸异丙酯，柠檬草油，公丁香油，白柠檬油，d-柠檬烯，邻氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，柠檬酸甲酯，二氢茉莉酮酸甲酯，香叶烯，紫苏子醇，苯乙醛，α-松萜，β一松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎宁，桧宁，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，γ-松油醇，2-叔丁基-p苯醌，α-侧柏酮，百里香油，和百里酚；将所述昆虫暴露于其浓度足以具有杀虫效果的所述组合物。
76.一种控制昆虫的方法，包括提供一种组合物，其包括至少一种植物香精油；和一种昆虫控制试剂，其中所述昆虫控制试剂的最终浓度小于所述昆虫控制试剂单独使用时具有昆虫控制活性所需的浓度；并且将所述昆虫暴露于其浓度足以具有驱除效果的所述组合物。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述组合物的昆虫控制试剂是DEET。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述至少一种植物香精油包括选自下述的油t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉树脑，p-百里香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香叶醇，枸橼酸异丙酯，柠檬草油，公丁香油(LFO)，白柠檬油，d-柠檬烯，邻氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，柠檬酸甲酯，二氢茉莉酮酸甲酯，香叶烯，紫苏子醇，苯乙醛，a-松萜，β-松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎宁，桧宁，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，γ-松油醇，2-叔丁基-p苯醌，α-侧柏酮，百里香油，和百里酚。
79.一种筛选具有昆虫控制活性的组合物的方法，包括提供能表达选自下述受体的受体的昆虫细胞酪胺受体，Or83b嗅觉受体，和Or43a嗅觉受体；向细胞中加入所述组合物；检测所述组合物与所述受体的结合亲和力；并且选择与所述受体具有亲和力的组合物。
80.一种筛选具有昆虫控制活性的组合物的方法，包括提供能表达选自下述受体的受体的昆虫细胞酪胺受体，Or83b嗅觉受体，和Or43a嗅觉受体；向细胞中加入所述组合物；从细胞中提取胞内cAMP或Ca2+；检测胞内cAMP或Ca2+的水平；将用所述组合物处理过的细胞中的胞内cAMP或Ca2+水平与未处理细胞中的胞内cAMP或Ca2+水平相比较；并且选择用它们处理能够引起胞内cAMP或Ca2+或二者的水平变化的组合物。
81.一种由下述方法产生的报告，包括提供能表达选自下述受体的受体的昆虫细胞酪胺受体，Or83b嗅觉受体，和Or43a嗅觉受体；向细胞中加入所述组合物；检测所述组合物与所述受体的结合亲和力；并且选择与所述受体具有亲和力的组合物。
82.一种由下述方法产生的报告，包括提供能表达选自下述受体的受体的昆虫细胞酪胺受体，Or83b嗅觉受体，和Or43a嗅觉受体；向细胞中加入所述组合物；从细胞中提取胞内cAMP或Ca2+；检测胞内cAMP或Ca2+的水平；将用所述组合物处理过的细胞中的胞内cAMP或Ca2+水平与未处理细胞中的胞内cAMP或Ca2+水平相比较；并且选择用它们处理能够引起胞内cAMP或Ca2+或二者的水平变化的组合物。
83.一种Schneider果蝇，包括如图31A和31B所示的酪胺受体的核酸序列。
84.一种Schneider果蝇，包括如图32A和32B所示的Or43a嗅觉受体的核酸序列。
85.一种Schneider果蝇，包括如图33A和33B所示的Or83b嗅觉受体的核酸序列。
全文摘要
本发明包括与控制昆虫有关的组合物，方法和细胞系。组合物的一个实施方案包括植物香精油，其靶定昆虫的至少一个选自酪胺受体，Or83b嗅觉受体，和Or43a嗅觉受体的受体，其可以导致昆虫的cAMP，Ca2+或二者胞内水平的改变。
文档编号A61K36/00GK1809368SQ200480017369
公开日2006年7月26日 申请日期2004年4月26日 优先权日2003年4月24日
发明者伊塞姆·伊那恩 申请人:范德比尔特大学