专利名称：一种含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法
技术领域：
本发明涉及药物制剂技术领域，具体涉及一种含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法。
背景技术：
贝伐单抗即rhMAb VEGF, bevacizumab, Avastin是由罗氏公司研发，是抑制血管内皮生长因子VEGF的全长单克隆抗体，分子量为149kDa，对人的VEGF的所有亚型都具有特异性亲和力，能结合和阻断所有VEGF的异构体，通过抑制VEGF达到抑制新生血管生成的作用。美国FDA于2004年2月底获得了美国食品和药品管理局的批准，并于同年3月份在美国上市，商品名为Bevacizumab，这是目前全世界第一个被批准用于抑制血管生长的单克隆抗体药物。首次批准该药联合化疗用于一线治疗晚期的结直肠癌。Bevacizumab在眼科 中，对于角膜、虹膜、脉络膜、视网膜的新生血管及年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿等疾病的治疗具有很可观的应用前景。贝伐单抗玻璃体内的半衰期约为3-5天，很多患者需要重复注药以达到治疗效果，但是重复注药的时间间隔仍有争议。California Retina Consultants的RL Avery等于2006在Ophthalmology 113(3) :363-372提出起始治疗每月注射一次，需持续3个月，University Hospital of Coimbra 的RM RICH 于2006年在Retina (Philadelphia, Pa.)提出应持续到OCT检查结果显示没有黄斑水肿的表现才停止。多数研究表明，使用贝伐单抗玻璃体腔内注射在短期内是比较安全的，最大的不良反应多是由眼内注射这一有创操作引起。因此，如果药物能够在起始快速释放，随后控制释放则最为理想。多肽、蛋白质药物由于易被酯水解，在体内生物半衰期短.控制释放被认为是此类药物最有前景的给药途径。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，本发明提供了一种起始可以快速释放、随后释放可控的含贝伐单抗的长效缓释微球。为了实现上述目的，本实用新型采用了以下的技术方案
一种含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤
(1)配制浓度为25-2500mg/ml的贝伐单抗溶液；
(2)取步骤(I)中制得的贝伐单抗溶液，加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠浓度为0-15mg/ml的贝伐单抗溶液,作为内水相；配制浓度为10-500mg/ml的可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液，作为油相；配制含有l-1000mg/ml钙离子的乳化剂水溶液，乳化剂的百分含量为0. 25-15%，作为外水相；
(3)ff/0/ff复乳法缓释微球的制备
首先将作为内水相的海藻酸钠溶液分散到作为油相的可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液中，内水相与油相的体积比为1:3 1:20，分散速度为8000-100000rpm，形成初乳；将初乳分散到作为外水相的乳化剂水溶液中，其中添加比例按照内水相和乳化剂油相的体积比为1:3 1:20进行，分散速度为8000-50000rpm，形成复乳；
将复乳在0-10°C下减压蒸发l_4h，然后在30-40°C下减压蒸发1-4小时；
(4)将复乳进行离心抽滤干燥，得到含贝伐单抗的长效缓释微球。钙离子可与海藻酸钠反应生成海藻酸钙，海藻酸钙具有特殊的蛋箱结构，制备初乳时分散速度为8000-100000rpm，初乳的包封率和颗粒直径最佳，有利于下一步试剂的制备。此外，分段高低温减压蒸发可以使油相中的有机溶剂在短时间内充分挥发 作为优选，所述的可降解生物医用高分子材料为聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-乙交酯、聚己内酯、聚泾丁酸、聚泾戊酸、聚类酸、聚酸酐中的一种或几种。采用上述的优选方案后，上述可降解生物医用高分子材料的生物相容性较好，几乎不会因为材料问题而引起炎症问题。作为优选，所述的可降解生物医用高分子材料为聚丙交酯-乙交酯，所述的聚丙交酯-乙交酯中丙交酯与乙交酯的聚合比例为75/25或50/50，所述的聚丙交酯-乙交酯的分子量为30000-100000道尔顿。采用上述的优选方案后,聚乳酸-轻基乙酸共聚物即poly (lactic-co-glycolicacid,简写为PLGA，是由两种单体乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解高分子有机化合物，在体内首先被降解为羟基乙酸和乳酸，最终完全降解为0)2和H2O,排出体外，故人体对该聚合物的耐受性大，生物相容性好。此外，PLGA不仅具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，更重要的是PLGA的降解速率和药物的释放可通过聚合体的物理化学性质如分子量、亲水性和丙交酯与乙醇酸的比值来控制，这种生物降解材料被广泛应用于制药和生物医用材料领域。而聚合比例优选75/25或50/50后，这两个比例制备的缓释微球，首先在降解性能上能适配药物Avastin的释放周期；其次它们对该药物的包封率较高。作为优选，所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈中的一种或多种。采用上述的优选方案后，有机溶剂浓度对最后微球颗粒的直径和药物缓释效果有直接的影响，上诉有机溶剂均为生物医用高分子良溶剂，且易于挥发，采用上述的有机溶剂可以使最后微球颗粒和药物释缓效果达到最佳。作为优选，所述可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液中的可降解生物医用高分子材料的浓度为10-300mg/ml。采用上述的优选方案后，有机溶剂浓度对最后微球颗粒的直径和药物缓释效果有直接的影响，采用上述的优选的浓度后，微球颗粒的直径和药物释缓效果可以达到最优。作为优选，所述乳化剂为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆中的一种或多种。采用上述的优选方案后，上述乳化剂均为生物相容性较好的乳化剂，残留毒性较小。作为优选，所述乳化剂水溶液中的乳化剂浓度为0. 25-10%。乳化剂的浓度及乳化效果对包封率和粒径有影响，太大或太小均乳化效果不好，达不到要求。采用上述的优选方案后，可以使制得的释缓微球的包封率和粒径达到最优。作为优选，所述步骤(3)中的复乳在0. 0013MPa 1. 01325MPa、0_4°C下减压l_4h蒸发除去有机溶剂，再在0. 0013MPa 1.01325MPa、30_37°C下减压l_4h除去有机溶剂。采用上述的优选方案后，分高温段和低温端溶剂的挥发效果更好，低温段的主要目的是减缓微球表面的溶剂的挥发速度，以免表面凝固后，内层溶剂挥发不完全，低温减压蒸发一段时间后，升温的目的一方面是增加溶剂的挥发，另一方面加快微球表面的凝固成形，便于下步分离。本发明的含贝伐单抗的长效缓释微球将会成为治疗眼内新生血管性疾病的新剂型，可以单次注射缓慢释放，达到长期稳定的治疗浓度。本 由于大多数可降解生物医用高分子材料是人工合成的亲脂性多聚物材料，在应用中存在着一定局限性，与机体细胞缺少特异性的结合，微球及纳米粒的突释效应明显，对于水溶性药物或者蛋白多肽药物包封率低及药物释放不能平稳缓释的缺点也限制了其一些应用。而本发明采用海藻酸钠即sodium alginate,简称SA,作为药物缓控释载体。海藻酸钠是由海带中提取的天然聚阴离子多糖化合物，由古洛糖醛酸(G段)与其立体异构体甘露糖醛酸(M段)2种结构单元以3种方式(丽段、GG段与MG段)通过a (1_4)糖苷键链接而成的线性嵌段共聚物。海藻酸钠由于含有较多的羧酸根离子，亲水性较强具有生物相容性、生物降解、无毒等优点，已成为较理想的药物缓控释载体。本发明方法制备贝伐单抗缓释微球的过程中，通过调整海藻酸钠在内水相中不同的加入量，来增加内水相的粘度，同时药物蛋白分子也进入到海藻酸钠吸水后形成的水凝胶纤维网络中不和油相中的有机溶剂接触，最大程度的保持其生物活性，当形成复乳时，遇到外水相中的钙离子，海藻酸钠水凝胶会迅速形成海藻酸钙的蛋箱结构，降低内水相的损失，同时和油相中的固化的可降解生物医用高分子一起对内水相中的药物蛋白进行双重包裹。微球科技规则无粘连，粒径可控，一般小于10 ii m,载药量和包封率可控,载药量一般为
0.5-30%和包封率一般可达60%，缓释期可达2个月以上，突释率较低。所制备的微球可再加工成其他剂型，可应用于局部注射或静脉注射；贝伐单抗缓释微球能在2-3个月内维持药物的有效治疗浓度，提高生物利用度，即减少患者的用药次数，也降低了经济成本。本专利以海藻酸I丐和Bevacizumab为内水相,利用海藻酸I丐的蛋箱结构对药物蛋白进行有效的包载，同时不影响其生物相容性及药物蛋白结构，再用可降解生物医用高分子材料进行二次包裹，既能有效保护蛋白的活性，也可以有效提高包封率，通过W/0/W复乳方法制备含贝伐单抗的长效缓释微球，有效提高水溶性蛋白类药物的包封率，且不影响药物蛋白活性，并能有效延长水溶性蛋白释放时间，缓释期长达两到三个月及以上，减少了注射次数，方便临床使用。
图1为本发明含贝伐单抗的长效缓释微球的结构示意 图2为本发明含贝伐单抗的长效缓释微球的实施例1的5放大000扫描电镜照片；
图3为本发明含贝伐单抗的长效缓释微球的实施例5的粒径分布图片；
图4为本发明含贝伐单抗缓释微球实施例广5中药物蛋白溶出后电泳检测结果 图5为本发明含贝伐单抗缓释微球实施例广5中体外释药曲线 图6为本发明含贝伐单抗的长效缓释微球的蛋箱结构示意图。
具体实施方式
本发明制得的含贝伐单抗的长效缓释微球的结构如图1所示，其中，a为药物蛋白，b为海藻酸钙的蛋箱结构，c为PLGA，图6为本发明的含贝伐单抗的长效缓释微球的海藻酸钙的蛋箱结构。实施例1
含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，包括以下步骤
(1)配置浓度为200mg/ml的贝伐单抗溶液；
(2)取步骤(I)中制得的贝伐单抗溶液，加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠浓度为15mg/ml的贝伐单抗溶液，作为内水相；配制浓度为150mg/ml的PLGA的二氯甲烷溶液，作为油相，其中，PLGA的聚合比例为75/25，3W ;配制含有1000mg/ml钙离子的聚乙烯醇水溶液，聚乙烯醇的百分含量为0. 25%，作为外水相； (3)W/0/W复乳法缓释微球的制备
首先将作为内水相的海藻酸钠溶液分散到作为油相的可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液中，内水相与油相的体积比为1:3，分散速度为lOOOOOrpm，形成初乳；
将初乳分散到作为外水相，内水相和油相的总体积与外水相体积的体积比为1:20，的聚乙烯醇水溶液中，分散速度为，50000rpm，形成复乳；
将复乳在4°C、0. 0020MPa下减压蒸发3h，然后在35°C、1. OMPa下减压蒸发I小时；
(4)将复乳进行离心、水洗、在冷冻干燥36h，得到含贝伐单抗的长效缓释微球。将实施例1制备得到的含贝伐单抗的长效缓释微球进行电镜实验，获得实验电镜图，如图2所示，成球较光滑无粘连，粒径在10 u m。将贝伐单抗缓释微球加入pH=7. 4为磷酸盐缓冲液，一天后，采用SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量，结果如图3所示，与贝伐单抗注射液比较，见图4，条带相同，由于溶出量不同，所以条带的强度不高。贝伐单抗缓释微球体外释放情况如图4所示，实施例1所得样品的释放时间为10天左右。实施例2
含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，包括以下步骤
(1)将市售的贝伐单抗注射液浓缩得到浓度为50mg/ml的贝伐单抗溶液；
(2)取步骤(I)中制得的贝伐单抗溶液，加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠浓度为IOmg/ml的贝伐单抗溶液，作为内水相；配制浓度为300mg/ml的PLGA的二氯甲烷溶液，作为油相，其中，PLGA的聚合比例为50/50，IOff ；
配制含有1000mg/ml钙离子的聚乙烯醇水溶液，聚乙烯醇的百分含量为2%，作为外水
相；
(3)ff/0/ff复乳法缓释微球的制备
首先将作为内水相的海藻酸钠溶液分散到作为油相的可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液中，内水相与油相的体积比为1:20，分散速度为8000rpm，形成初乳；
将初乳分散到作为外水相的聚乙烯醇水溶液中，内水相和油相的总体积与外水相的体积比为1:3，分散速度为SOOOrpm，形成复乳，形成复乳；
将复乳放入旋转蒸发仪中，4°C、0. 053MPa下减压蒸发3h，然后在35°C、0. 0620MPa下减压蒸发I小时；
(4)将复乳进行离心、水洗、在常温下真空干燥72h，得到含贝伐单抗的长效缓释微球。实施例3含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，包括以下步骤
(1)将市售的贝伐单抗注射液浓缩得到浓度为500mg/ml的贝伐单抗溶液；
(2)取步骤(I)中制得的贝伐单抗溶液，加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠浓度为5mg/ml的贝伐单抗溶液，作为内水相；配制浓度为10mg/ml的PLGA的二氯甲烷溶液，作为油相，
配制含有lOOOmg/ml钙离子的聚乙烯醇水溶液，聚乙烯醇的百分含量为15%，作为外水
相；
(3)ff/0/ff复乳法缓释微球的制备
首先将作为内水相的海藻酸钠溶液分散到作为油相的可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液中，内水相与油相的体积比为1:10，分散速度为30000rpm，形成初乳；
将初乳分散到作为外水相的聚乙烯醇水溶液中，内水相和油相的总体积与外水相的体积比为1:5,分散速度为14500rpm,形成复乳,形成复乳；
将复乳放入旋转蒸发仪中，(TC、1. 0025MPa下减压蒸发3h，然后在40°C、0. 0245MPa下减压蒸发I小时；
(4)将复乳进行离心、水洗、在冷冻干燥36h，得到含贝伐单抗的长效缓释微球。将贝伐单抗缓释微球加入PBS即磷酸盐缓冲液，一天后，采用SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量，结果如图4所示，与贝伐单抗注射液比较，条带相同，由于溶出量不同，所以条带的强度不高。实施例3所得样品的释放时间为70天累计释放量为75. 04 ± 8. 63%,如图5中所示。实施例4
含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，包括以下步骤
(I)将市售的贝伐单抗注射液浓缩得到浓度为1000mg/ml的贝伐单抗溶液；
(2 )取步骤(I)中制得的贝伐单抗溶液，加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠浓度为2. 5mg/ml的贝伐单抗溶液，作为内水相；配制浓度为300mg/ml的聚丙交酯的二氯甲烷溶液，作为油相，
配制含有5mg/ml钙离子的聚乙烯醇水溶液，聚乙烯醇的百分含量为2%，作为外水相；
(3)ff/0/ff复乳法缓释微球的制备
首先将作为内水相的海藻酸钠溶液分散到作为油相的可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液中，内水相与油相的体积比为1:3，分散速度为20500rpm，形成初乳；
将初乳分散到作为外水相中，内水相和油相的总体积与外水相的体积比为1:3分散速度为9500rpm,形成复乳；
将复乳在4°C、0. 7834MPa下减压蒸发3h，然后在35°C、0. 4512MPa下减压蒸发I小时；
(4)将复乳进行离心、水洗、在冷冻干燥36h，得到含贝伐单抗的长效缓释微球。将贝伐单抗缓释微球加入PBS，一天后，采用SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量，与贝伐单抗注射液比较，条带相同，由于溶出量不同，所以条带的强度不高。贝伐单抗缓释微球体外释放情况。实施例5
含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，包括以下步骤
(1)将市售的贝伐单抗注射液浓缩得到浓度为25mg/ml的贝伐单抗溶液；
(2)取步骤(I)中制得的贝伐单抗溶液，作为内水相，配制成浓度为500mg/ml的聚乙烯醇水溶液，作为内水相；配制浓度为500mg/ml的PLGA的二氯甲烷溶液，作为油相，其中，PLGA的聚合比例为50/50，7. 5W ；
配制含有1000mg/ml钙离子的聚乙烯醇水溶液，聚乙烯醇的百分含量为10%，作为外水
相；
(3)ff/0/ff复乳法缓释微球的制备
首先将作为内水相的聚乙烯醇水溶液分散到作为油相的可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液中，内水相与油相的体积比为1:3，分散速度为30000rpm，形成初乳；
将初乳分散到作为外水相的聚乙烯醇水溶液中，内水相和油相的总体积与外水相的体积比为1:3,分散速度为14500rpm,形成复乳；
将复乳在4°C、0. 1354MPa下减压蒸发3h，然后在35°C、0. 3412MPa下减压蒸发I小时；·
(4)将复乳进行离心、水洗、在常温干燥72h，得到含贝伐单抗的长效缓释微球。将贝伐单抗缓释微球加入PBS，一天后，采用SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量，与贝伐单抗注射液比较，条带相同，由于溶出量不同，所以条带的强度不高。实施例3所得样品的释放时间最短，为7天左右，见图5。
权利要求
1.一种含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤(O配制浓度为25-2500mg/ml的贝伐单抗溶液；(2)取步骤(I)中制得的贝伐单抗溶液，加入海藻酸钠，配制成海藻酸钠浓度为 0-15mg/ml的贝伐单抗溶液,作为内水相；配制浓度为10-500mg/ml的可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液，作为油相；配制含有l-1000mg/ml钙离子的乳化剂水溶液，乳化剂的百分含量为O. 25-15%，作为外水相；(3)ff/0/ff复乳法缓释微球的制备首先将作为内水相的海藻酸钠溶液分散到作为油相的可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液中，内水相与油相的体积比为1:3 1:20，分散速度为8000-100000rpm，形成初乳；将初乳分散到作为外水相的乳化剂水溶液中，其中添加比例按照内水相和乳化剂油相的体积比为1:3 1:20进行，分散速度为8000-50000rpm，形成复乳；将复乳在0-10°C下减压蒸发l_4h，然后在30-40°C下减压蒸发1_4小时；(4)将复乳进行离心抽滤干燥，得到含贝伐单抗的长效缓释微球。
2.根据权利要求1所述的含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，其特征在于所述的可降解生物医用高分子材料为聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-乙交酯、聚己内酯、聚泾丁酸、聚泾戊酸、聚类酸、聚酸酐中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，其特征在于所述的可降解生物医用高分子材料为聚丙交酯-乙交酯，所述的聚丙交酯-乙交酯中丙交酯与乙交酯的聚合比例为75/25或50/50，所述的聚丙交酯-乙交酯的分子量为30000-100000 道尔顿。
4.根据权利要求1所述的含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，其特征在于所述可降解生物医用高分子材料的有机溶剂溶液中的可降解生物医用高分子材料的浓度为 10_300mg/ml。
6.根据权利要求1所述的含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，其特征在于所述乳化剂为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆中的一种或多种。
7.根据权利要求1或6所述的含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，其特征在于 所述乳化剂水溶液中的乳化剂浓度为O. 25-10%。
8.根据权利要求1所述的含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中的复乳在O. 0013MPa 1. 01325MPa、0_4°C下减压l_4h蒸发除去有机溶剂，再在.O.0013MPa L 01325MPa、30_37°C下减压 l_4h 除去有机溶剂。
全文摘要
本发明公开了一种含贝伐单抗的长效缓释微球的制备方法，将水溶性药物蛋白贝伐单抗包封入可降解生物医用高分子材料形成缓释微球的制备方法。该微球采用W/O/W溶剂挥发法制备，以贝伐单抗及其溶液和海藻酸盐为内水相，将其分散到可降解生物医用高分子材料为油相的溶液中形成初乳，再将初乳分散到含有乳化剂的水溶液为外水相中形成复乳，再通过搅拌减压蒸发、离心、洗涤及干燥，得到贝伐单抗缓释微球。本发明的制备得到的含贝伐单抗的长效缓释微球，有效提高水溶性蛋白类药物的包封率，且不影响药物蛋白活性，并能有效延长水溶性蛋白释放时间，缓释期长达两到三个月及以上，减少了注射次数，方便临床使用。
文档编号A61P35/00GK102988301SQ20121057941
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者孟永春, 郑钦象, 南开辉, 任月萍, 陈浩 申请人:温州医学院