一种具有高稳定性及抗耐药活性的组合抗菌肽的制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学技术领域，涉及一种D型氨基酸的组合抗菌肽，尤其涉及一种 具有具有高稳定性及抗耐药活性的D型氨基酸组合抗菌肽及其制备合成方法。
【背景技术】
[0002] 感染性疾病的普遍发生严重威胁着人类健康，抗生素作为抵抗感染性疾病的一线 药物被广泛使用。但是，抗生素滥用导致了耐药问题的出现，因此新型抗菌药物的研发成为 近些年来的研究热点。抗菌肽(Antimicrobial peptides)是先天免疫效应中的重要成分， 广泛存在于原核生物、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物体内，具有抗菌谱广、特异性高等生 物活性特点，同时还具有调节宿主免疫的作用。抗菌肽的抗菌机制不同于普通抗生素，抗菌 机制一般包括①快速破坏菌膜，使菌体内容物泄露，细菌死亡;②抗菌肽与细菌细胞内容物 (如DNA或RNA)作用，干扰细菌细胞正常的合成和代谢，导致菌体死亡。因此，抗菌肽不易诱 导耐药性的产生。
[0003] 抗菌肽通常是由L型氨基酸构成的小分子多肽，由于体内含有多种降解酶，可与抗 菌肽序列中某些位点特异性结合导致抗菌肽在体内被降解而失活，而大大限制了其的应 用。有报道称抗菌肽序列中存在非对映体的D型氨基酸能使其在酶环境中稳定性增强，同时 不影响其抗菌活性。研究表明，局部D型氨基酸替换膜活性肽是一种增强体内稳定性而不影 响其二级结构和活性的有效方法(Hong S Y，Oh J E，Lee K H. Effect of D-amino acid substitution on the stability, the secondary structure, and the activity of membrane-active peptide.[J]. Biochemical Pharmacology, 1999，58(11):1775-1780)〇
[0004] 点击化学主要用于研发和制造可用于医学诊断和新药开发的新型生化标记物。目 前，它被认为是一项非常理想的技术，已经被应用于药物开发。点击化学的代表是Cu催化的 叠氮基和炔基的1，3_偶极环加成反应。产物中的1，4_二取代_1，2,3-三唑结构被认为是一 种新型的药效团，有极大地潜力可以将其运用到抗癌、抗菌、HIV酶抑制剂等研究中 (Agalave SG，Maujan SR, Pore VS，et al.Clickchemistry: 1,2,3-triazoles as pharmacophores[J] ·Chem Asian J，2011，6(10):2696-2718)D有报道将抗菌狀以点击化学 的方法进行侧链连接有助于提高抗菌肽对细胞膜的穿透能力（Christopher J, et al. Enhanced Membrane Pore Formation by Multimeric/01igomeric Antimicrobial Peptides, Biochemistry 2007, 46, 13437-13442)〇
[0005] 因此，我们采用对抗菌肽局部D型氨基酸替换，同时应用点击化学，用1，2，3-三唑 结构侧链链接抗菌肽，合成一种新型组合抗菌肽，以期增强抗菌活性和酶解稳定性，并具有 很好的临床药用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种具有具有高稳定性及抗耐药活性的D型氨基酸组合抗菌 肽。
[0007] 本发明的另一目的是提供这种上述具有高稳定性及抗耐药活性的D型氨基酸组合 抗菌肽的合成方法。
[0008] -、具有高稳定性及抗耐药活性的组合抗菌肽 本发明具有高稳定性及抗耐药活性的组合抗菌肽，是由一个1，4-二取代-1H-1，2，3-三 唑结构将N末端连接炔丙基甘氨酸的D型氨基酸前体肽和N末端连接叠氮基赖氨酸的D型氨 基酸前体肽链接而得。记为J-RR-1。其结构式如下所示：
[0009] 二、具有高稳定性及抗耐药活性的组合抗菌肽的制备 本发明具有高稳定性及抗耐药活性的组合抗菌肽的制备方法，是以N末端连接炔丙基 甘氨酸的D型氨基酸前体肽和N末端连接叠氮基赖氨酸的D型氨基酸前体肽为底物，以 CuS04 · 5H20为催化剂，以抗坏血酸钠为抗氧化剂，以水和N，N-二甲基甲酰胺的混合液为溶 剂，采用点击化学的1，3-偶极环加成反应24~28小时，产生一个1，4-二取代-1H-1，2，3-三唑 结构将上述两个前体肽链接而得。
[0010]所述N末端连接炔丙基甘氨酸的D型氨基酸前体肽的序列为Ac-Pra-D-Arg-Arg-Trp-Trp-D-Arg-Phe_NH2，记为 Ac-Pra-RW-1 〇
[0011]所述N末端连接叠氮基赖氨酸的D型氨基酸前体肽的序列为Ac-Lys(N3)-D-Arg-Arg-Trp-Trp-D-Arg-Phe_NH2,记为Ac_Nle(N3) - RW-1。
[0012] N末端连接叠氮基赖氨酸的D型氨基酸前体肽与N末端连接炔丙基甘氨酸的D型氨 基酸前体肽的摩尔比为1: 〇. 1~1:10。
[0013]所述催化剂CuS〇4 · 5H20的用量为N末端连接叠氮基赖氨酸的D型氨基酸前体肽摩 尔量的1~30倍。
[0014] 所述抗氧化剂抗坏血酸钠的用量为N末端连接叠氮基赖氨酸的D型氨基酸前体肽 摩尔量的2~50倍。
[0015] 所述水与N，N_二甲基甲酰胺的混合溶剂中，水与N，N_二甲基甲酰胺的体积比为 1000:1 ~1:1〇
[0016] 上述反应式如下所示： 图1为上述合成的D型氨基酸组合抗菌肽J-RR-1的质谱图。经计算为:J-RR-1的分子量 为2343,等于它们各自前体肽分子量之和。与我们理论计算的结果一致。证明我们合成的产 物与我们设计的抗菌肽结构一致。
[0017] 图2为上述方法合成的D型氨基酸组合抗菌肽J-RR-1的纯度分析图。由图2的结果 显示，本发明合成的组合抗菌肽J-RR-1的纯度为100.00%。
[0018] 三、目标肽J-RR-1的体外抑菌实验 1、对标准菌株的抑菌实验 采用常见的二倍稀释法测定药物的最小抑菌浓度，即MIC值。结果重复三次以上的平行 实验。结果见表1。
[0019] 2.对耐药菌株的抑菌实验 采用常见的二倍稀释法测定药物的最小抑菌浓度，即MIC值。结果重复三次以上的平行 实验。结果见表2。
[0020]表1、2的结果表明，新型组合抗菌肽J-RR-1与母肽RW相比，抗菌活性显著提高，同 时产生良好的对