同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种同时测定细菌抗药性和耐药性测定方法，具体涉及一种同时测定 亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法。
【背景技术】
[0002] 自1961年jevons在英国首先发现MRSA，20世纪60年代中期扩展至欧洲许多国 家及加拿大，70年代末MRSA极具增多遍及全球，耐药范围日益扩大，耐药程度日益严重。 80年代后期已成为全球性的病原菌，居医院感染病原菌的首位，占教学医院分离金葡菌的 60-80%。20世纪90年代后期又出现了耐万古的MRSA。目前MRSA是超级细菌的重要组成 部分，其耐药性强、死亡率高已成为与HBV、AIDS并列世界范围内的3大难解决的感染性疾 病。因此探讨MRSA的来源及其耐药机制，寻找有效的控制方法，是遏制其感染流行的最有 效途径。
[0003]消毒剂与抗生素同属于具有特殊抑杀微生物作用的化学物质，它们对微生物的作 用机制也有很多相同或相似之处，某些耐药的微生物同样可能产生对消毒剂的抗性现象。 美国学者提出抗生素和消毒剂促成MRSA的选择和维持性的可能性，实验证明金葡菌含有 多种抗生素和消毒剂的抗药性质粒，并发现他们之间存在着一定的联系。大量的流行病学 数据也显示：金黄色葡萄球菌的耐药菌株对消毒剂的抗性升高。围绕金黄色葡萄球菌家族 qac基因和0-内酰胺酶的结构基因研宄显示，qac基因所在的质粒同时携带抗菌药物耐 药基因，而葡萄球菌0 -内酰胺酶的结构基因blaz和两个紧密连接的基因blai和blaR的 转座子Tn552和大质粒如pST6也在同一质粒上。也有报道指出qac基因、0-内酰胺酶和 latk基因同在多耐药质粒pMs62上，后者还携带ermc,frA,acAaphD，产生对红霉素、甲氧喃 啶等抗生素耐药，这些为金黄色葡萄球菌抗药性和消毒剂交叉耐药提供一些提示和参考。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性测定方法，本发明方 法具有将细菌的抗药性、耐药性和敏感性恢复三者结合，特别是能很直观看到抗药性、耐药 性之间的变化规律及联系，具有准确、直接地揭示二者的内部联系的优点。
[0005] 一种同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)制备含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液；
[0007] (2)配制不同种类不同浓度的消毒剂对所述含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液 进行杀菌试验并测定每一代亚致死量金黄色葡萄球菌的抗药性；同时测定所述每一代亚致 死量金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性；连续做20代；
[0008] (3)敏感性恢复实验：选取经消毒剂亚致死量筛选的第20代金黄色葡萄球菌作为 原代菌，接种到血液增菌肉汤管中培养并制备成血液增菌肉汤菌悬液，将所述血液增菌肉 汤菌悬液进行药物敏感试验；重复上述步骤至第40代。
[0009] (4)根据所述步骤（2)、（3)和（4)的测定结果，找出所述亚致死量金黄色葡萄球 菌对所述消毒剂的抗药性及其对所述抗生素的耐药性的变化规律及联系。
[0010] 本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所 述步骤（1)具体包括如下步骤：
[0011] 将所述金黄色葡萄球菌经过增菌培养和分离培养，经分离培养后将所述金黄色葡 萄球菌分成单个细菌，并使其独立分裂繁殖形成单独菌落；用接种针挑取所述分离培养得 到的典型菌落接种到营养琼脂斜面，在35-37°C条件下培养24h形成菌苔；用质量分数为 3%磷酸盐缓冲液洗下所述菌苔，经振荡均匀并经无菌脱脂棉过滤后得到滤液，用无菌水稀 释所述滤液制备成浓度为〇. 5麦氏标准的菌悬液；将所述菌悬液与干扰剂溶液做对倍稀释 配成l〇ml的浓度为7. 5X107cfu/ml含有干扰剂的菌悬液备用，所述干扰剂溶液时由成品 血清白蛋白30g和蒸馏水1000mL混匀后用0. 45ym微孔滤膜过滤除菌制备而成，所述干扰 剂溶液中牛血清蛋白的质量分数为3 %。
[0012] 本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所 述步骤（2)具体包括如下步骤：
[0013]各浓度碘伏的制备：取11个无菌试管分别编号心~An，用注射器把编号A2~A^ 的试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升碘伏原液加入八:号试管中，所述碘伏原液中有效碘 的浓度为5000mg/l;再取4毫升所述碘伏原液加入A2号试管混匀得到A2碘伏液，其有效 碘的浓度为2500mg/l;然后从^号试管取4毫升A2碘伏液加到A3号试管，其有效碘的浓 度为1250mg/l;-次操作至A1(l号试管，依此类推八4号试管有效碘的浓度为625mg/l45号 试管有效碘的浓度为312. 5mg/l;八6号试管有效碘的浓度为156. 25mg/l;A7号试管有效碘 的浓度为78. 13mg/l;A8号试管有效碘的浓度约为39. 06mg/l;A9号试管有效碘的浓度约为 19. 53mg/l;A1(I号试管有效碘的浓度为9. 77mg/l;An号试管不加消毒液，只是4毫升蒸馏水 作为阳性对照；
[0014] 各浓度溶葡萄球菌酶的制备：取9个无菌试管分别编号ai~a9，用注射器把编号 a2~a9的试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升溶葡萄球菌酶原液加入a:号试管中，所述葡 萄球菌酶原液中溶葡萄球菌酶的浓度为1000U/L;再取4毫升所述溶葡萄球菌酶原液加入 a2号试管混匀得到a2溶葡萄球菌酶溶液，其浓度为500U/L;然后取4毫升所述a2溶葡萄球 菌酶溶液加到a3号试管中得到a3溶葡萄球菌酶溶液，其溶葡萄球菌酶的浓度为250U/L;依 次操作至a8号试管，依此类推a4号试管溶葡萄球菌酶的浓度为125U/L;a5号试管溶葡萄球 菌酶的浓度为62. 50U/L仿6号试管溶葡萄球菌酶的浓度为31. 25U/L;a7号试管溶葡萄球菌 酶浓度为15. 63U/L;a8号试管溶葡萄球菌酶的浓度，为7. 80U/L;a9号试管只加入4毫升 蒸馏水不含消毒液作为阳性对照；
[0015]各浓度含氯消毒液的制备：取11个无菌试管并编号&~Bn，首先制备有效氯 为5000.Omg/1作为原液，用注射器把B2~Bn的试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升浓度 为5000.Omg/1有效氯原液加入81号试管中，有效氯的浓度为5000mg/l;再取4毫升加入 B2号试管混匀得到B2含氯消毒液，其有效氯的浓度为2500mg/l;然后取4毫升所述B2含 氯消毒液加到所述B3号试管混匀的到B3含氯消毒液，其有效氯的浓度为1250mg/l;依次 操作至B1(l号试管，依此类推B4号试管中有效氯的浓度为625mg/l;B5号试管中有效氯的 浓度为312. 5mg/l;B6号试管中有效氯的浓度为156. 25mg/l;B7号试管中有效氯的浓度为 78. 13mg/l;B8号试管中有效氯的浓度为39. 06mg/l;B9号试管中有效氯的浓度为19. 53mg/ 1 ;B1(I号试管中有效氯的浓度为9.77mg/l;11号试管只加入4毫升蒸馏水，不含消毒液作为 阳性对照；
[0016] 以所述制备好的含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液为原代，取样接种所需培养 基斜面，然后分别同所述配置好的各浓度碘伏、含氯消毒剂及溶葡萄球菌复合酶作用，所述 碘伏的作用时间为〇. 5min，所述含氯消毒剂的作用时间为5min，所述溶葡萄球菌复合酶的 作用时间为6min;然后立刻转入含有相应的中和剂的肉汤管中中和10分钟，中和后转种计 数平皿，再从各自的计数平皿上取亚致死量的金黄色葡萄球菌，重复上述步骤至20代，比 较所述20代亚致死量金黄色葡萄球菌的抗药