性得到所述亚致死量金黄色葡萄球菌对消毒 剂的抗药性变化；
[0017] 在测定所述亚致死量金黄色葡萄球菌对消毒剂的抗药性变化的同时，采用K-B纸 片试验法，分别连续观察记录所述三种消毒液的亚致死量1-20代的金黄色葡萄细菌对抗 生素药敏的变化，所述抗生素为以下几种之一：青霉素、红霉素、万古霉素、庆大霉素、利福 平、左氧氟沙星、头孢西丁、SMZ-CO。
[0018] 本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所 述步骤（4)具体包括如下步骤：
[0019] 选取经消毒剂亚致死量筛选的第20代金黄色葡萄球菌作为原代菌，用接种环蘸 取典型的菌落，接种到血液增菌肉汤管中培养24h为一代；用所述接种环蘸取培养好的血 液增菌肉汤菌悬液，接种到分离平皿中，置于35°C-37°C培养18-24h;用所述接种环蘸取所 述分离平皿中的典型菌落接种到营养琼脂斜面上，35°C-37°C培养18-24h得到菌苔；质量 分数为3%的磷酸盐缓冲液洗下菌苔，振荡均匀并经无菌脱脂棉过滤制备成所述血液增菌 肉汤菌悬液；按照所述步骤（3)进行药物敏感试验，记录每次药敏结果，连续重复传代从第 20代到第40代。
[0020] 本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所 述亚致死量金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性的测定具体包括如下步骤：
[0021] 分别用无菌棉签蘸取所述1-20代亚致死量的金黄色葡萄球菌的菌悬液，在试管 内壁液面上方旋转紧压，将多余的菌液挤去，然后在每个M-H培养基平板琼脂表面上均匀 涂抹接种3次，每次旋转平板60°C，以确保接种菌的均匀分布，最后沿着平板内缘涂抹一 周，干燥5分钟；然后在平板上贴放选取的直径5_抗菌药物纸片，使其紧贴平板表面，每个 平皿贴4张，盖好平皿，置于35-37°C培养18-20h，用游标卡尺量取抑菌圈，记录每次药敏结 果，结果判定根据临床微生物标准化操作；连续做20代试验。
[0022] 本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所 述增菌肉汤管中含有血液增菌肉汤，其组分为：蛋白胨10.〇g/L ;牛肉浸出粉3. Og/L ;氯化 钠5. Og/L;葡萄糖1. Og/L;枸橼酸钠3. Og/L ;磷酸氢二钾2g g/L;对氨基苯甲酸0. 05g/L ; 硫酸镁2. 4g/L ;酚红0. 024g/L ;其余为蒸馏水；血液增菌肉汤pH值为7. 4±0. 1 ;经121°C 灭菌15min和35°C 24h无菌试验备用。
[0023] 本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所 述步骤（3)具体包括如下步骤：是采用K-B纸片试验法，连续观察记录所述三种消毒液的亚 致死量1-20代金黄色葡萄细菌的每一代对抗生素药敏的变化，所述抗生素为以下几种之 一：青霉素、红霉素、万古霉素、庆大霉素、利福平、左氧氟沙星、头孢西丁、SMZ-C0。
[0024] 本发明方法中0?5麦氏比浊管配制方法为：0?48mol/LBacl2 (1. 17 %w/v BaCl2.2H20)溶液0. 5ml;0. 18mol/LH2S04溶液99. 5ml;将两液混合，分置管内密封，用前混 匀；〇. 5麦氏标准：含菌量1. 5X108cfu/ml
[0025] 本发明所述亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性测定方法，执行本发明过程 中应注意问题如下：
[0026] 各种培养基的排污染技术：实验所用的营养肉汤管、记数平皿、营养琼脂斜面，于 实验前2天置于孵育箱内经35-37 °C培养48h，没有污染可以使用；
[0027] 实验用菌悬液的排污染技术：从斜面培养基洗下的菌悬液先涂片革兰氏染色，观 察是否为金黄色葡萄球菌，排除实验用菌悬液的污染后，再做杀菌实验；
[0028] 环境的排污染技术：即无菌操作技术的运用；
[0029] 实验前把实验用品备齐：高压灭菌的隔离衣，使用一次性口罩和帽子、无菌手套； 同时把以下放入净化台内的物品先用75%酒精擦拭除尘：血液增菌肉汤管等各种培养基 (预培养的）、酒精灯、接种环、接种针、一次性注射器、无菌试管、无菌硬水、三种消毒液、小 牛血清等；
[0030] 检查实验设备的完好性：35-37 °C孵育箱等；
[0031] 实验室大环境的准备：试验在生物安全实验室进行，每次实验前一天清洁房间各 种表面和地面，实验当天首先打开房间和超净台的紫外线消毒40分钟以上；
[0032] 操作环境的准备：洗净双手，穿灭菌隔离衣，带一次性口罩、帽子、带无菌手套；试 验前用75%酒精消毒擦拭超净工作台面；
[0033] 本发明中的杀菌和抗药敏试验均按照消毒技术规范操作。
[0034] 与现有技术相比，本发明同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方 法具有如下有点：
[0035] 本发明将细菌的抗药性、耐药性和药敏性恢复三个实验方法巧妙结合，能够准确、 清楚地测出三者之间的动态关系，测定结果可信度高，揭示出亚致死量消毒剂（相当于实 际工作中不规范使用消毒剂），不仅选择出对消毒剂耐受性增加的细菌，并且选择出的细菌 对抗生素也产生耐药性，说明两者之间有交叉耐药现象，因此本实验为将来的加强消毒剂 的使用管理（要像使用抗菌药物一样，要规范使用消毒剂，减少细菌耐药性和抗性的产生， 延缓消毒剂和抗生素的寿命）提供理论指导。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1
[0037] 一种同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，包括如下步骤：
[0038] (1)制备含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液；
[0039] (2)配制不同种类不同浓度的消毒剂对所述含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液 进行杀菌试验并测定每一代亚致死量金黄色葡萄球菌的抗药性；同时测定所述每一代亚致 死量金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性；连续做20代；
[0040] (3)敏感性恢复实验：选取经消毒剂亚致死量筛选的第20代金黄色葡萄球菌作为 原代菌，接种到血液增菌肉汤管中培养并制备成血液增菌肉汤菌悬液，将所述血液增菌肉 汤菌悬液进行药物敏感试验；重复上述步骤至第40代。
[0041] (4)根据所述步骤（2)、（3)和（4)的测定结果，找出所述亚致死量金黄色葡萄球 菌对所述消毒剂的抗药性及其对所述抗生素的耐药性的变化规律及联系。
[0042] 实施例2
[0043] 一种同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，包括如下步骤：
[0044] (1)将所述金黄色葡萄球菌经过增菌培养和分离培养，经分离培养后将所述金黄 色葡萄球菌分成单个细菌，并使其独立分裂繁殖形成单独菌落；用接种针挑取所述分离培 养得到的典型菌落接种到营养琼脂斜面，在35-37°C条件下培养24h形成菌苔；用质量分数 为3%磷酸盐缓冲液洗下所述菌苔，经振荡均匀并经无菌脱脂棉过滤后得到滤液，用无菌水 稀释所述滤液制备成浓度为〇. 5麦氏标准的菌悬液；将所述菌悬液与干扰剂溶液做对倍稀 释配成l〇ml的浓度为7. 5X107cfu/ml含有干扰剂的菌悬液备用，所述干扰剂溶液时由成 品血清白蛋白30g和蒸馏水1000mL混匀后用0. 45ym微孔滤膜过滤除菌制备而成，所述干 扰剂溶液中牛血清蛋白的质量分数为3%;
[0045] (2)各浓度碘伏的制备：取11个无菌试管分别编号Ai-An，用注射器把编号A2~ An的试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升碘伏原液加入A:号试管中，所述碘伏原液中有效 碘的浓度为5000mg/l;再取4毫升所述碘伏原液加入A2号试管混匀得到A2碘伏液，其有效 碘的