成品血清白 蛋白30g和蒸馏水1000 mL混匀后用0. 45 μ m微孔滤膜过滤除菌制备而成，所述干扰剂溶液 中牛血清蛋白的质量分数为3 %。
3. 根据权利要求1所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其 特征在于，所述步骤（2)具体包括如下步骤： 各浓度碘伏的制备：取11个无菌试管分别编号A n，用注射器把编号A2~A n的 试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升碘伏原液加入&号试管中，所述碘伏原液中有效碘的 浓度为5000mg/l ;再取4毫升所述碘伏原液加入A2号试管混匀得到A 2碘伏液，其有效碘 的浓度为2500mg/l ;然后从^号试管取4毫升A 2碘伏液加到A 3号试管，其有效碘的浓度 为1250mg/l ;-次操作至Altl号试管，依此类推A 4号试管有效碘的浓度为625mg/l ;A 5号试 管有效碘的浓度为312. 5mg/l ;八6号试管有效碘的浓度为156. 25mg/l洫7号试管有效碘的 浓度为78. 13mg/l ;A8号试管有效碘的浓度约为39. 06mg/l ;A 9号试管有效碘的浓度约为 19. 53mg/l ;A1(I号试管有效碘的浓度为9. 77mg/l ;An号试管不加消毒液，只是4毫升蒸馏水 作为阳性对照； 各浓度溶葡萄球菌酶的制备：取9个无菌试管分别编号ai~a 9，用注射器把编号a2~ a9的试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升溶葡萄球菌酶原液加入a 1号试管中，所述葡萄球 菌酶原液中溶葡萄球菌酶的浓度为1000U/L ;再取4毫升所述溶葡萄球菌酶原液加入&2号 试管混匀得到a2溶葡萄球菌酶溶液，其浓度为500U/L ;然后取4毫升所述a 2溶葡萄球菌酶 溶液加到a3号试管中得到a 3溶葡萄球菌酶溶液，其溶葡萄球菌酶的浓度为250U/L ;依次操 作至a8号试管，依此类推&4号试管溶葡萄球菌酶的浓度为125U/L ;a5号试管溶葡萄球菌酶 的浓度为62. 50U/L仿6号试管溶葡萄球菌酶的浓度为31. 25U/L ;a 7号试管溶葡萄球菌酶浓 度为15. 63U/L ;a8号试管溶葡萄球菌酶的浓度，为7. 80U/L ;a 9号试管只加入4毫升蒸馏 水不含消毒液作为阳性对照； 各浓度含氯消毒液的制备：取11个无菌试管并编号B1-B11,首先制备有效氯为 5000.0 mg/1作为原液，用注射器把B2~B η的试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升浓度为 5000.0 mg/1有效氯原液加入81号试管中，有效氯的浓度为5000mg/l ;再取4毫升加入B 2 号试管混匀得到B2含氯消毒液，其有效氯的浓度为2500mg/l ;然后取4毫升所述B 2含氯 消毒液加到所述民号试管混匀的到83含氯消毒液，其有效氯的浓度为1250mg/l ;依次操 作至Bltl号试管，依此类推B 4号试管中有效氯的浓度为625mg/l ;B 5号试管中有效氯的浓 度为312. 5mg/l ;B6号试管中有效氯的浓度为156. 25mg/l ;B 7号试管中有效氯的浓度为 78. 13mg/l ;B8号试管中有效氯的浓度为39. 06mg/l ;B 9号试管中有效氯的浓度为19. 53mg/ I ;B1(I号试管中有效氯的浓度为9.77mg/l ;11号试管只加入4毫升蒸馏水，不含消毒液作为 阳性对照； 以所述制备好的含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液为原代，取样接种所需培养基斜 面，然后分别同所述配置好的各浓度碘伏、含氯消毒剂及溶葡萄球菌复合酶作用，所述碘伏 的作用时间为〇. 5min，所述含氯消毒剂的作用时间为5min，所述溶葡萄球菌复合酶的作用 时间为6min ;然后立刻转入含有相应的中和剂的肉汤管中中和10分钟，中和后转种计数平 皿，再从各自的计数平皿上取亚致死量的金黄色葡萄球菌，重复上述步骤至20代，比较所 述20代亚致死量金黄色葡萄球菌的抗药性得到所述亚致死量金黄色葡萄球菌对消毒剂的 抗药性变化； 在测定所述亚致死量金黄色葡萄球菌对消毒剂的抗药性变化的同时，采用K-B纸片试 验法，分别连续观察记录所述三种消毒液的亚致死量1-20代的金黄色葡萄细菌对抗生素 药敏的变化，所述抗生素为以下几种之一：青霉素、红霉素、万古霉素、庆大霉素、利福平、左 氧氟沙星、头孢西丁、SMZ-CO。
4. 根据权利要求1所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其 特征在于，所述步骤（4)具体包括如下步骤： 选取经消毒剂亚致死量筛选的第20代金黄色葡萄球菌作为原代菌，用接种环蘸取典 型的菌落，接种到血液增菌肉汤管中培养24h为一代；用所述接种环蘸取培养好的血液增 菌肉汤菌悬液，接种到分离平皿中，置于35°C -37°C培养18-24h ;用所述接种环蘸取所述分 离平皿中的典型菌落接种到营养琼脂斜面上，35°C -37°C培养18-24h得到菌苔；用质量分 数为3%磷酸盐缓冲液洗下菌苔，振荡均匀并经无菌脱脂棉过滤制备成所述血液增菌肉汤 菌悬液；按照所述步骤（3)进行药物敏感试验，记录每次药敏结果，连续重复传代从第20代 到第40代。
5. 根据权利要求3所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其 特征在于，所述亚致死量金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性的测定具体包括如下步骤： 分别用无菌棉签蘸取所述1-20代亚致死量的金黄色葡萄球菌的菌悬液，在试管内壁 液面上方旋转紧压，将多余的菌液挤去，然后在每个M-H培养基平板琼脂表面上均匀涂抹 接种3次，每次旋转平板60°C，以确保接种菌的均匀分布，最后沿着平板内缘涂抹一周，干 燥5分钟；然后在平板上贴放选取的直径5mm抗菌药物纸片，使其紧贴平板表面，每个平皿 贴4张，盖好平皿，置于35-37°C培养18-20h，用游标卡尺量取抑菌圈，记录每次药敏结果， 结果判定根据临床微生物标准化操作；连续做20代试验。
6. 根据权利要求5所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其 特征在于，所述增菌肉汤管中含有血液增菌肉汤，其组分为：蛋白胨10. 〇g/L ;牛肉浸出粉 3. Og/L ;氯化钠5. Og/L ;葡萄糖1.0 g/L ;枸橼酸钠3. Og/L ;磷酸氢二钾2g g/L ;对氨基苯 甲酸0. 05g/L ;硫酸镁2. 4g/L ;酚红0. 024g/L ;其余为蒸馏水；所述血液增菌肉汤pH值为 7. 4±0. 1 ;经121°C灭菌15min和35°C 24h无菌试验备用。
7. 根据权利要求4所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其 特征在于，所述步骤（3)具体包括如下步骤：是采用K-B纸片试验法，连续观察记录所述三 种消毒液的亚致死量1-20代金黄色葡萄细菌的每一代对抗生素药敏的变化。
【专利摘要】本发明公开了一种同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，包括如下步骤：(1)制备含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液；(2)测定抗药性；(3)测定耐药性；(4)敏感性恢复测定；(5)找出所述亚致死量金黄色葡萄球菌对所述消毒剂的抗性及其耐药性的变化规律。本发明同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法在一个实验中将细菌的抗药性、耐药性和药敏性恢复测定相结合，特别是能很直观看到抗药性、耐药性之间的变化规律及联系，具有准确、直接揭示二者的内部联系的优点。
【IPC分类】C12Q1-18, C12R1-445
【公开号】CN104651473
【申请号】CN201510046318
【发明人】邢浩莉, 赵淑海, 万莉, 倪宁, 杨洁, 田恒忠, 任忠, 李倩, 徐建军, 尹晓玲, 朱佰如, 贾丽洁
【申请人】淮南市妇幼保健院, 邢浩莉
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年1月29日