尿液铁蛋白轻链和重链的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种尿液铁蛋白及其轻链和重链的应用，具体为尿液铁蛋白在制备用于诊断或检测前列腺增生和前列腺癌的制剂中的应用。本发明通过研究证实与前列腺增生组相比，铁蛋白轻链在前列腺癌组患者的尿液中特异表达下调，铁蛋白重链在前列腺癌组患者的尿液中特异表达上调，从而提出检测尿液铁蛋白轻链及重链可用于前列腺增生和前列腺癌的鉴别诊断及前列腺癌的诊治。本发明发挥了尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便等独特的优势，利用随机尿标本检测前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的铁蛋白及其轻链和重链。
【专利说明】尿液铁蛋白轻链和重链的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及尿液铁蛋白的新用途，尤其涉及尿液铁蛋白及其轻链和重链在前列腺 增生和前列腺癌的鉴别诊断以及前列腺癌的诊治中的应用。
【背景技术】
[0002] 前列腺癌是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤，是前列腺腺泡细胞异常无序生 长的结果，是老年男性泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤之一。随着我国经济发展、生活水平 提高、饮食结构欧美化以及人口老龄化等因素影响，前列腺癌的发病率呈现上升趋势。
[0003]目前前列腺癌及前列腺增生确诊的金标准是前列腺穿刺活检组织病理检查，但该 检查有创、费用相对昂贵、技术要求高，不合时宜的前列腺穿刺不仅使患者承担发生并发症 的风险，增加患者的心理负担和医疗成本，而且阴性的活检结果并不能完全排除恶性肿瘤 的可能。前列腺特异性抗原（PSA)是目前公认的最有价值的前列腺癌的肿瘤标志物，在多年 的临床检验工作中，研究者发现PSA升高特别是在4ng/ml至lOng/ml之间时，前列腺增生 和前列腺癌难以鉴别，且没有比较好的鉴别诊断化验指标。临床上，当患者PSA大于4.Ong/ ml时高度怀疑为前列腺癌，需要进行前列腺穿刺活检确诊，但有研究表明约有25%的前列 腺增生患者PSA大于4.Ong/ml，这部分患者接受了不必要的穿刺活检以及治疗手段，造成 很大的精神及经济负担；约15. 2%的前列腺癌患者PSA小于4.Ong/ml，这部分患者因此而 延误了肿瘤治疗的最佳时期。因此PSA在前列腺增生与前列腺癌鉴别诊断方面存在着灰 区。
[0004] 铁蛋白（Ferritin)是一种分子量较大的含铁蛋白，由球形外壳和铁核心构成。它 是一个由24个多肽亚基围绕一个含有4000多个铁原子的核心组成的复合分子，相对分子 质量为4.5X105。铁蛋白分子的外壳即去铁蛋白，铁蛋白的亚基以重链（H链）和轻链（L 链）两种方式存在。H链和L链的结构相似，都是由5个a-螺旋组成，位于整个亚基长 轴的一端。H链和L链以不同比例聚合而成的纯聚合体或杂合体称为同工铁蛋白。铁蛋白 是机体细胞内铁储存蛋白，血清、肝、脾组织中的铁蛋白大多含L链，与矿化及铁贮存有关； 而肿瘤细胞中的铁蛋白大多为H链，含铁量低，铁储存作用很小，在胞内外铁运输和快速解 毒中起主要作用。研究表明，铁和铁蛋白的紊乱是包括肿瘤在内的许多疾病的重要病因之 一，在多数肿瘤组织中，铁蛋白水平高于正常组织，可存在于肿瘤相关的巨噬细胞内，抑制 巨噬细胞和单核细胞对肿瘤的杀伤力。铁蛋白重链可抵制免疫反应，有助于癌细胞的生长 和扩散，电镜下发现乳腺癌的恶性上皮细胞内铁蛋白丰富，而良性中则很少。ffia(双链高 分子量激肽原）是M(高分子量激肽原）的降解产物，可以通过分解内皮细胞中的缓激肽而 抑制血管再生，铁蛋白与HKa有高度的亲和力，从而促进血管再生及炎症反应，增强肿瘤细 胞的迁移。有研究表明，铁蛋白在前列腺癌患者体内的作用可能与该机制有关。
[0005] 尿液作为人体代谢产物之一，富含了蛋白质的各种剪切、修饰、翻译等生命活动过 程中的产物，其获取具有无创性、大规模重复取样性、保存方便等特点使其在动态的监测疾 病过程和判断疗效等方面有独特的优势，其组成与性状反映机体的代谢状态，更直接反映 了整个泌尿系统疾病发生、发展及预后的各种信息，奠定了其在临床检验尤其在分析泌尿 生殖系统疾病方面的重要地位。目前存在希望通过尿液检查建立一种对前列腺增生和前列 腺癌患者进行鉴别诊断及前列腺癌诊治的无创性检查的试剂盒及方法的需要，以弥补PSA 在前列腺增生与前列腺癌鉴别诊断方面的灰区，对前列腺癌的早期筛查、诊断、预防及治疗 均具有极其重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中存在的难题和需求，提供尿液铁蛋白在制备用于 诊断或检测前列腺增生和前列腺癌的制剂中的应用。
[0007] 优选地，在上述应用中，所述尿液铁蛋白的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所 示，所述尿液铁蛋白的重链的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0008] 优选地，所述制剂是一种试剂盒，其包括已包被兔抗人铁蛋白轻链或重链的多克 隆抗体的固相载体。
[0009] 优选地，所述酶为辣根过氧化物酶（HRP)。
[0010] 优选地,所述试剂盒还包括铁蛋白轻链或重链标准品溶液、鼠抗人铁蛋白轻链或 重链单克隆抗体浓缩液、酶标记的羊抗鼠IgG浓缩液、显色液A、显色液B、终止液和浓缩洗 涤液。
[0011] 优选地，所述试剂盒还包括盒体，所述固相载体为设置在所述盒体内的酶标板。
[0012] 优选地，所述酶标板由外框支撑架和放置在所述外框支撑架上的可拆的12条酶 标反应微孔条组成，所述每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔。
[0013] 优选地，所述试剂盒还包括盖板膜、放置试剂的下凹瓶位和自封袋。
[0014] 优选地，所述下凹瓶位共13个，且由塑料泡沫制成。
[0015] 优选地，所述酶标板由聚苯乙烯制成。
[0016] 本发明的目的还涉及检测尿液铁蛋白的制剂在制备用于诊断或检测前列腺增生 和前列腺癌的制剂中的应用。特别是可以采用兔抗人铁蛋白轻链或重链的多克隆抗体制备 用于诊断或检测前列腺增生和前列腺癌的制剂。该制剂可以是一种试剂盒。
[0017] 发明人首先收集了泌尿外科病理诊断明确的前列腺增生和前列腺癌患者的清洁 晨尿标本，离心后取上清，利用乙醇萃取尿蛋白，经双向电泳、考马斯亮蓝染色及脱色液脱 色后用扫描仪获取凝胶图像，roQuest2D软件分析扫描后的图像，将两组相差3倍以上界 定为差异点。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽经酶切及乙腈处理后点靶，进行 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assistedlaserdesorptionionization timeofflightmassspectrometry,MALDI-T0F-MS)鉴定，采集数据获得由不同质荷比 的蛋白峰构成的质谱多肽图。应用MASCOT搜索引擎及swiss-prot数据库进行检索，检索 条件：肽指纹图中的肽片段质量控制在700?4000。肽片段分子量最大容许误差控制在 ±0.IDa。酶解片段不完全选择为1个，离子选择[M+H]和AVERAGE。最少匹配肽片段规定 为5。HomoSapiens默认，masstolerance0.2Da，MS/MStolerance0.6Da。从数据库检索 得到前列腺增生和前列腺癌组间差异表达的铁蛋白轻链（ferritin,Iightpolypeptide, HTL，蛋白号：P02792,氨基酸序列：mssqirqnystdveaavnslvnlylqasytylslgfyfdr ddvalegvshffrelaeekregyerllkmqnqrggralfqdikkpaedewgktpdamkaamalekklnqa IldlhalgsartdphlcdfIethfldeevklikkmgdhltnlhrlggpeaglgeylferltlkhd)和铁 蛋白重链（ferritin,heavypolypeptidel，FTHl，蛋白号：P02794，mttastsqvrqnyhqdseaa inrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyfIhqsheerehaeklmklqnqrggriflqdikkpd cddwesglnamecalhleknvnqsllelhklatdkndphlcdfiethylneqvkaikelgdhvtnlrkmg apesglaeylfdkhtlgdsdnes)，并且与前列腺增生相比，铁蛋白轻链和重链均在前列腺癌 患者的尿液中呈高表达。
[0018] 本发明通过研究证实与前列腺增生组相比，铁蛋白轻链和重链在前列腺癌组患者 的尿液中特异表达上调，从而提出检测尿液铁蛋白轻链及重链可用于前列腺增生和前列腺 癌的鉴别诊断及前列腺癌的诊治。
[0019] 本发明发挥了尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便等独特的优势，利 用随机尿标本检测前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的铁蛋白及其轻链和重链。
[0020] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是前列腺增生和前列腺癌的双向电泳图谱。A为前列腺增生患者的电泳图，B 为前列腺癌患者的电泳图。
[0022] 图2是铁蛋白轻链在图1的前列腺增生和前列腺癌的双向电泳图谱中的点。A中 箭头所指为铁蛋白轻链在前列腺增生的双向电泳图谱中的点，B中箭头所指为铁蛋白轻链 在前列腺癌的双向电泳图谱中的点。
[0023] 图3是铁蛋白重链在图1的前列腺增生和前列腺癌的双向电泳图谱中的点。A中 箭头所指为铁蛋白重链在前列腺增生的双向电泳图谱中的点，B中箭头所指为铁蛋白重链 在前列腺癌的双向电泳图谱中的点。
[0024] 图4是铁蛋白轻链质谱图。
[0025] 图5是铁蛋白重链质谱图。
[0026] 图6是铁蛋白/肌酐在前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的表达。
[0027] 图7是WB(WesternBlot)验证铁蛋白轻链在前列腺增生和前列腺癌患者尿液中 的表达。
[0028] 图8是WB(WesternBlot)验证铁蛋白重链在前列腺增生和前列腺癌患者尿液中 的表达。
[0029] 图9是免疫组化验证铁蛋白轻链在前列腺增生和前列腺癌患者组织中的表达。A 为铁蛋白轻链在前列腺增生患者组织中的表达，B为铁蛋白轻链在前列腺癌患者组织中的 表达。
[0030] 图10是免疫组化验证铁蛋白重链在前列腺增生和前列腺癌患者组织中的表达。A 为铁蛋白重链在前列腺增生患者组织中的表达，B为铁蛋白重链在前列腺癌患者组织中的 表达。
[0031] 图11是设置在本发明所述的试剂盒的盒体内的酶标板的示意图，其中1为酶标反 应微孔条，2为酶标板的外框支撑架，3为包被有铁蛋白轻链或重链融合蛋白多克隆抗体的 孔。
【具体实施方式】
[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0033]实施例1尿蛋白的提取
[0034] 分别收集首都医科大学附属北京世纪坛医院体检中心2010年3月份9名（平均年 龄32岁）体检健康的正常人的新鲜晨尿；泌尿外科2010年11月份至2012年3月份32名 (平均年龄73岁)病理确诊为前列腺增生患者和9名（平均年龄76岁)病理确诊为前列腺癌 患者的新鲜晨尿。每份标本50ml，置于干燥洁净的250ml容器中，2小时内离心1500rpm， 5min，取上清，在显微镜下确认尿沉渣与上清尿液分离完全，将上清与预冷无水乙醇I:3体 积比混匀，4°C静置30min，-20°C过夜，4°C离心12000rpm，15min，去上清留取沉淀并将样品 溶于裂解液中。超声50Hz、7秒，冷却9. 9秒，循环17次，4°C离心12000rpm，20min，去沉淀 取上清，分装50iil/EP，-80°C冻存备用。应用BCA试剂盒测定各蛋白浓度，日立7080-ISE 生化分析仪测定尿液标本肌酐含量，BeckmancoulterUnicelDXI800Access免疫分析仪 测定尿液铁蛋白含量。
[0035] 前列腺增生和前列腺癌患者尿液中铁蛋白/肌酐比值见图6,从图6中很明显看出 铁蛋白/肌酐在前列腺癌患者尿液中显著高表达。
[0036]实施例2尿蛋白双向凝胶电泳
[0037] 从_80°C冰箱取出冻存蛋白，室温下复溶，根据蛋白浓度取适当体积的蛋白溶液， 使蛋白上样量达到2mg，将蛋白溶液与水化上样缓冲液混匀，总上样体积600yl，沿着聚焦 盘槽中的边缘从左至右线性加入样品，加完样后，用镊子去掉预制胶条上的保护层，将胶条 胶面朝下放置于聚焦盘中样品溶液上，其中胶条的正极对应聚焦盘的正极，盖上聚焦盘的 盖子，室温放置1小时后，将聚焦盘放入电泳仪中进行一向等电聚焦，具体参数参见表1。聚 焦结束的胶条，立即进行平衡、二向SDS-PAGE电泳。
[0038] 表1等电聚焦参数
【权利要求】
1. 尿液铁蛋白在制备用于诊断或检测前列腺增生和前列腺癌的制剂中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液铁蛋白的轻链的氨基酸序列如 SEQIDNO: 1所示，所述尿液铁蛋白的重链的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述制剂是一种试剂盒，其包括已包 被兔抗人铁蛋白轻链或重链的多克隆抗体的固相载体。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括铁蛋白轻链或重链标 准品溶液、鼠抗人铁蛋白轻链或重链单克隆抗体浓缩液、酶标记的羊抗鼠IgG浓缩液、显色 液A、显色液B、终止液和浓缩洗涤液。
6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括盒体，所述固相载体为 设置在所述盒体内的酶标板。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酶标板由外框支撑架和放置在所述 外框支撑架上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，所述每个可拆装酶标反应微孔条有8个 反应孔。
8. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括盖板膜、放置试剂的下 凹瓶位和自封袋。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述下凹瓶位共13个，且由塑料泡沫制 成。
10. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酶标板由聚苯乙烯制成。
【文档编号】G01N33/531GK104515847SQ201310447273
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】张曼, 赵旭宏, 苏强 申请人:张曼