专利名称：Fmu-epcam-4e4单克隆抗体的轻链和重链可变区的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗人EPCAM 的FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体的轻链和重链可变区，包括其氨基酸序列和核苷酸序列。
背景技术：
上皮细胞黏附分子(EPCAM)最初是作为结肠癌的优势表位被发现，当时认为其作 用是细胞黏附和治疗用抗体的可靠结合位点。目前研究认为，EPCAM是糖基化的I型跨膜 糖蛋白，分子量为30到40kD，其结构包括有一个表皮生长因子样和一个甲状腺球蛋白样的 胞膜外区，一段跨膜区和一段26个氨基酸的胞浆区。在正常细胞中EPCAM主要位于上皮细 胞间隙的紧密连接处。 由EPCAM表达的强度和频率显示，其基本上高表达于所有人类腺癌、 部分鳞状细胞癌、视网膜母细胞瘤和肝细胞癌。2007年以前对EPCAM功能方面的研究发现EPCAM在细胞增殖、迁移和信号转导中 具有重要作用。例如EPCAM在人和啮鼠动物细胞的增强表达，增强了细胞锚定和血清生长 因子非依赖的增殖并且增加了如c-myc和cyclins在内的各种靶基因的表达；在乳腺癌细 胞系，EPCAM信号经RNA干涉，可造成细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低。最近的研究证实=EPCAM可以作为一些实体肿瘤干细胞的表面标志物之一，也可 以作为正常干细胞表面标志物的组成部分。同时，研究结果还很好地解释了 EPCAM在肿瘤 细胞高表达的原因，并且发现其与一些肿瘤患者预后较差和生存率较低有关；并进一步解 释了 EPCAM与肿瘤的关系。此外，小鼠胚胎干细胞实验证实，EPCAM在肿瘤干细胞、正常干 细胞上的高表达和其自身正反馈的上调，对确保维持这些正常干细胞及以恶性干细胞的增 殖非常重要。抗EPCAM抗体用于肿瘤治疗的研究一直是抗体治疗研究的热点。早在1979年开 发的鼠源性抗EPCAM抗体17-1A，于1982年就用于对肿瘤的临床治疗。但是鼠源性抗体药 物在人体使用时，由于其具有免疫原性，会引起人体的免疫反应，从而造成对抗体药物的清 除或免疫复合物介导的超敏反应。对鼠源性抗体基因改造可以部分解决其免疫原性问题， 如构建嵌合抗体或人源化抗体等。抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二 硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可变区 (V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。 重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR 是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区 不同可分为人源、鼠源等，鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性，易引起人体的免疫反 应，这些免疫反应可引起对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了克服 鼠源性抗体的缺陷，需要构建高亲和力的特异性嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体。在改造过程中，最为重要的是首先必须获得具有良好特异性和亲和力鼠源性亲本 抗体，克隆其轻链和重链可变区基因，然后将这两条基因进行改造，构建重组抗体基因。针对这些问题，抗EPCAM治疗性抗体的研发不断取得进展，抗EPCAM的大鼠和小鼠双特异性抗 体Catumaxomab，单链抗体Proxinium，人源化抗体ING-I，人源化融合抗体EMD和完全人源 化抗体Adecatumumab (MT201)等先后进入临床治疗肿瘤的研究。目前在临床试验中，通过 改造的抗体Adecatumumab治疗乳腺癌取得了良好的效果。因此，筛选出高亲和力鼠源性抗 人EPCAM单克隆抗体，从中克隆出轻、重链可变区基因，对进一步改善以EPCAM为靶点的药 物制备和对肿瘤的治疗具有非常重要的意义。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体的轻链 和重链可变区，包括其氨基酸和核苷酸序列，为构建高亲和力的抗EPCAM嵌合或人源化基 因工程抗体提供支持。本发明是通过以下技术方案来实现FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体的轻链和重链可变区，所述轻链可变区的3个互补决 定区(CDR)序列分别为CDRl :Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr ；CDR2 =Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp ；CDR3 =Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr ；所述重链可变区的3个互补决定区(OTR)序列分别为CDRl.Gly-Tyr-Ser-Phe-Tyr-Ser-Tyr-Trp ；CDR2 Jle-Tyr-Pro-Gly-Asn-Thr-Asp-Thr ；CDR3 :Ile-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。所述的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1，重链可变区的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的编码单克隆抗体轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，编码重链可 变区的基因序列如SEQ ID N0. 4所示。所述的单克隆抗体应用于以人EPCAM为靶点的基因工程抗体或诊断试剂的制备。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明提供的FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体是一种抗人EPCAM的高亲和力单克 隆抗体，经过间接ELISA检测、流式细胞仪检测证实该单克隆抗体能够特异性地结合人 EPCAM ；
2、克隆该单克隆抗体轻链、重链可变区基因和氨基酸序列，序列分析证实了该抗 体序列的惟一性。3、分析获得轻链、重链可变区的⑶R区，在此基础上为构建高亲和力的抗人EPCAM 嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。
图1是抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体与C0L0205和SKBr_3细胞系表面 表达的EPCAM结合的流式细胞仪检测结果图；图Ia为与C0L0205细胞系结合检测结果图， 图Ib为与SKBr-3细胞系结合检测结果图；其中，FITC 异硫氰酸荧光素，横轴为荧光强度，纵轴为相对细胞计数，Ml表示阳性细胞范围；图2是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4E4单克隆抗体轻链可变区基因同源性序列检测 结果图；图3是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4E4单克隆抗体重链可变区基因同源性序列检测 结果图；图4是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4E4单克隆抗体轻链可变区氨基酸同源性序列检 测结果图；图5是抗人EPCAM的FMU_EPCAM_4E4单克隆抗体重链可变区氨基酸同源性序列检 测结果图。
具体实施方式
申请人用重组人EPCAM免疫BALB/c小鼠，制备了一组小鼠抗人EPCAM单克隆抗 体，筛选出能稳定分泌高亲和力抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体杂交瘤细胞株，制 备腹水获得高亲和力抗人EPCAM单克隆抗体。确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及 其CDR序列；为抗人EPCAM嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。下面结合附图对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明具体按以下步骤实施1小鼠抗人EPCAM高亲和力抗体的制备1. 1单克隆抗体的制备、纯化参照GENBANK NM_002354序列设计引物，并扩增编码人EPCAM胞膜外区蛋白的基 因；然后将此基因克隆入PGEX-4T-3载体中，构建原核表达载体并转化宿主细胞；再通过 IPTG诱导，冻融加超声裂解法获得重组人EPCAM胞膜外区的可溶蛋白。按单克隆抗体制备方法(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)，用重组人 EPCAM胞膜外区蛋白免疫BALB/c小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)；初次免疫，使用 福氏完全佐剂，后续免疫使用福氏不完全佐剂，每次间隔3周，均为皮下多点注射，共免疫4 次。末次免疫7-10天后采血测其效价，检测免疫效果。间隔2-3周后，经静脉注射抗原再 加强免疫，3天后处死动物取脾进行细胞融合。取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数，同时制备免疫脾细胞悬液。将骨髓瘤 细胞与脾细胞按1 10比例混合进行细胞融合。融合后细胞悬液加入含有饲养细胞(正常 Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔板，37°C、5% CO2孵箱培养。待克隆出现后，间接ELISA 检测，挑选阳性克隆。对含有阳性克隆孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化，直至获得能够 稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系(体外连续培养超过6个月)，并对其分泌的抗体进行常规核 型鉴定和Ig亚类测定，结果为IgG2a亚类。在获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，按小鼠腹水制备方法制备包含单克 隆抗体的腹水(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)。腹水经40%饱和硫酸铵沉 淀后，采用QFF阴离子交换层析法纯化。用SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度，纯化的单克隆 抗体FMU-EPCAM-4E4纯度达到95%。1. 2抗人EPCAM单克隆抗体效价测定用间接ELISA方法测定纯化前腹水以及纯化后单克隆抗体(mAb)的相对亲和力。其中包被抗原为重组人EPCAM胞膜外区的可溶蛋白，待测样品为系列梯度稀释(IXlO1 IO9的梯度稀释)的腹水以及纯化后mAb，检测抗体为羊抗鼠-HRP酶标记抗体，底物使用 ABTS。所筛选出的高亲和力FMU-EPCAM-4E4mAb，腹水效价为1 X IO"7,纯化后效价为0. 6ng/ ml，而一般采用间接ELISA检测腹水效价达1 X 10_5以上的抗体即可使用。1. 3流式细胞术荧光染色检测抗人EPCAM单克隆抗体FMU-EPCAM-4E4与细胞表面 EPCAM结合的活性以SED mAb作为阴性抗体对照，流式细胞术检测FMU-EPCAM_4E4mAb与C0L0205禾口 SKBr-3细胞系表面表达的EPCAM的结合；C0L0205和SKBr_3细胞系用10% FCS-RPMI1640培养基培养至对数生长期，调整 细胞浓度为5 X IO6 1 X 107/ml ；取50 μ 1细胞悬液并加入特异性FMU-EPCAM_4E4mAb腹水 1 μ 1，再加1 μ 1灭活正常兔血清，4°C孵育30min ；同样方法制备阴性对照组。然后用洗涤液(5% FCS-PBS-4% NaN3)洗涤孵育后的细胞2次，每次加洗涤液2ml， IOOOrpmX5min离心后弃上清；加入100 μ 1工作浓度的羊抗鼠荧光标记抗体，充分振摇， 4°C 孵育 30min ；再用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml，IOOOrpmX 5min离心后弃上清；加0. 5ml的 流式固定液(2 %葡萄糖，1 %甲醛，0. 02 % NaN3的DPBS溶液)，然后进行流式细胞术分析 FMU-EPCAM-4E4mAb与细胞表面EPCAM的结合情况；结果如图1所示，在C0L0205细胞系与阴性对照相比，结合了 FMU-EPCAM_4E4mAb 而落入Ml阳性细胞范围的C0L0205细胞达40% ；在SKBr-3细胞系与阴性对照相比，结合了 FMU-EPCAM_4E4mAb而落入Ml阳性细 胞范围的SKBr-3细胞达29% ；以上流式细胞术荧光染色检测表明FMU-EPCAM-4E4mAb可以识别并结合C0L0205 和SKBr-3细胞表面表达的天然EPCAM。通过上述2种FMU-EPCAM_4E4mAb结合实验，在不同水平的鉴定结果表明， FMU-EPCAM-4E4mAb既可以识别重组表达的EPCAM (间接ELISA检测)，又可以识别细胞表面 天然表达的EPCAM，说明FMU-EPCAM-4E4mAb与相应抗原EPCAM结合具有良好的特异性和亲 和力。2抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体轻链和重链可变区基因的克隆2. 1FMU-EPCAM-4E4杂交瘤细胞的培养按常规方法复苏(细胞培养，第一版，P88)FMU-EPCAM-4E4杂交瘤细胞，用含10% 小牛血清的RPMI 1640培养基于37°C,5% CO2孵箱中培养至对数生长期。2. 2总RNA的提取和cDNA第一链的合成采用TRIZOL Reagent (购自美国GIBCO公司)提取总RNA，具体操作步骤按说明书进行；cDNA第一链合成试剂盒购自美国GIBCO公司，在得到总RNA后按产品说明书进行反 转录合成cDNA第一链。2. 3PCR 法扩增 FMU-EPCAM_4E4mAb 的 VL 禾Π VH 基因PCR扩增试剂购自TakaRa公司，利用VL F (上游引物)和VL B (下游引物)以及VH F禾口 VH B两对引物，以反转录合成的cDNA第一链为模板进行PCR，扩增FMU-EPCAM_4E4mAb 的 VL 和 FMU-EPCAM-4E4mAb 的 VH 基因；
反应体积50μ 1，反应条件为94°C 5min ；95°C 30s，58°C lmin，72°C lmin，循环 35次；72 °C 7min;引物序列为:VL F:gttagatctc cagcttggtc cc22bp ；VL B:gacattcagc tgacccagtc tcca24bp ；VH F:tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34bp ；VH B:aggtsmarct gcagsagtcw gg22bp ；(IUB 标准兼并碱基代码:s :c/g ；m :a/c ；r :a/g ；w :a/t)
2. 4PCR扩增产物的克隆和筛选PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程 有限会司)回收PCR扩增片段，用DNA连接试剂盒(购自TakaRa公司)将该片段按说明书， 利用加A尾插入pMD-TIS载体(购自TakaRa公司)中，连接物转化E. coli (购自中国普通 微生物菌种保藏中心，CGMCC，北京)，在Amp抗性LB琼脂培养平皿中37°C培养过夜。挑取LB琼脂培养平皿中克隆，在Amp抗性LB培养基中37°C摇菌过夜，以1 μ 1菌 液为模板，通过上述针对轻链、重链可变区设计的引物，用PCR法筛选重组阳性Ε. coli克 隆；将所获得重组阳性Ε. coli克隆摇菌，菌体送交上海生物工程技术服务有限公司 完成基因序列测定，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，重链可变区的基因序列如 SEQ ID NO. 4 所示。3FMU-EPCAM-4E4mAb轻链和重链可变区的核苷酸序列及同源性分析3. 1确定测序无误后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源 性分析(Blastn)。FMU-EPCAM-4E4mAb轻链可变区基因与编号为GeneID =243420的小鼠Ig轻链可变 区基因同源性最高，达281/289(97% )，如图2所示；FMU-EPCAM-4E4mAb重链可变区基因与编号为GeneID =668469的小鼠Ig重链可变 区基因同源性最高，为276/296(93% )，如图3所示。同源性分析表明，编码FMU-EPCAM-4E4mAb的轻、重链可变区的核苷酸序列，尽管 与其它基因序列有一定同源性，但未发现与本发明完全相同的基因序列，表明本发明在基 因序列上具有惟一性。3. 2将可变区基因翻译成氨基酸序列，进行氨基酸序列分析单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1，重链可变区的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。在 non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF 蛋白质 数据库中，进行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。分析结果表明，FMU-EPCAM-4E4mAb轻链氨基酸序列与编号为ABR32168. 1 GI 149799217的小鼠IgK链同源性最高，达104/111 (93% )，如图4所示；FMU-EPCAM-4E4mAb重链氨基酸序列与编号为S55541GI 1363159的小鼠Ig重链 蛋白的同源性最高，为101/117(86% )，如图5所示。同源性分析表明，FMU-EPCAM_4E4mAb轻、重链可变区的氨基酸序列，尽管与其它蛋 白氨基酸序列有一定同源性，但未发现与本发明完全相同的氨基酸序列，表明本发明在氨基酸序列上也具有惟一性。3. 3利用IMGT/V-QUEST分析可变区结构，确定⑶R区。将测序所得FMU-EPCAM-4E4mAb轻链和重链可变区序列，在IMGT/V-QUEST网站 (http://imgt. cines. fr/IMGT_vquest/vquest)进行分析，得出其 CDR 区。轻链可变区的3个互补决定区(OTR)序列，如SEQ ID NO. 1划线部分所示，具体 为CDRl:Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr ；CDR2 =Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp ；CDR3 =Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr ；所述重链可变区的3个互补决定区(OTR)序列为CDRl.Gly-Tyr-Ser-Phe-Tyr-Ser-Tyr-Trp ；CDR2 Jle-Tyr-Pro-Gly-Asn-Thr-Asp-Thr ；CDR3 :Ile-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。4.基因工程抗体设计基于抗人EPCAM单克隆抗体FMU_EPCAM_4E4的表达、纯化以及序列分析，设计构建 以下生物制品1)单链抗体的构建可将本发明的FMU-EPCAM-4E4mAb轻、重链可变区基因通过 linker连接，插入原核或真核表达载体，转化宿主菌或转染真核细胞，用于制备可对乳腺 癌、结肠癌和胰腺癌等肿瘤有治疗作用的单链抗体。 2)人-鼠抗EPCAM嵌合抗体的构建可将本发明的FMU-EPCAM_4E4mAb轻、重链可 变区基因插入通用型嵌合抗体表达载体中，获得含嵌合基因的载体转染真核细胞，用于制 备可望对乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等肿瘤有治疗作用的嵌合抗体。3)人源化抗体的构建可将本发明的FMU-EPCAM_4E4mAb轻、重链可变区基因 的CDR区移植到人源抗体可变区的骨架区(FR)中，形成互补决定区(CDR)移植抗体 (CDR-grafted antibody)，也禾尔重构(reshapingantibody) ^iKMVcijiW (humanized antibody)。利用CDR移植技术改造抗体，可以获得既保持鼠源性亲本mAb特异性，又更加接近 人抗体的新型抗体，用于制备可对乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等肿瘤有治疗作用的人源化抗 体。4)可根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列，制备针对人EPCAM功能表位的其它生物制品。5)可利用本发明的抗人EPCAM的FMU-EPCAM-4E4特异性单抗作为区分上皮和 非上皮来源组织的工具，以确诊一些易于混淆的疾病。通过采用本发明的抗人EPCAM的 FMU-EPCAM-4E4特异性单抗染色，观察组织中EPCAM的表达强度，可能作为一些上皮来源肿 瘤预后及分化程度的判断标志。6)可应用本发明的高亲和力FMU-EPCAM-4E4mAb制备测定体液中EPCAM胞膜外区 蛋白的ELISA试剂盒，可望在肿瘤发生、发展及预后的临床诊断中具有广泛的应用价值。氨基酸及核苷酸序列表<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体的轻链和重链可变区<160>4<210>1
<211>111<212>PRT<213>人工合成<400>1Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Thr lie Gly Gln Pro Ala Ser1510 1520Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp2530 3540Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu lie Tyr Val Val Ser Lys Leu Asp4550 5560Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie6570 7580Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro8590 95100Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie105110<210>2<211>113<212>PRT<213>人工合成<400>2Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met15 10 1520Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Tyr Ser Tyr Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg2530 3540Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie Gly Gly lie Tyr Pro Gly Asn Thr Asp Thr Ser Tyr4550 5560Asn Pro Lys Phe Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Thr Tyr6570 7580Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asp Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys lie Arg Gly Gly8590 95100Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser105110<210>3<211>333<212>DNA
〈213〉人工合成<400>3gatgttgtgctgacccagtc tccagtcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60atgtcttgcaagtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120ttgttgcagaggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atgttgtgtc taaattggac 180cctggagtccctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240agcagagtggaggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300tggacgttcggtggagggac caagctggag ate333<210>4<211>339<212>DNA〈213〉人工合成<400>4gaggtccagctgcaggagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60tcctgcagggcttctggcta cagctttacc agctactgga tgcactggct aaaacagagg 120cctggacagggtctagaatg gattggtggt atttatcctg gaaatactga tacaagctac 180aacccgaagttcaaggacaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactacctac 240atggagctcagcagcctgac agatgaggac tctgcggtct attactgtat aagagggggt 300aactactggggccaagggac cacggtcacc gtctcctca339
权利要求
FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体的轻链和重链可变区，其特征在于，所述轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列为CDR1Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr；CDR2Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp；CDR3Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr；所述重链可变区的3个互补决定区(CDR)序列为CDR1Gly-Tyr-Ser-Phe-Tyr-Ser-Tyr-Trp；CDR2Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Thr-Asp-Thr；CDR3Ile-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。
2.如权利要求1所述的FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体的轻链和重链可变区，其特征在于， 所述的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDN0. 1所示，重链可变区的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。
3.如权利要求1所述的FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体的轻链和重链可变区，其特征在于， 编码单克隆抗体轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，编码重链可变区的基因序列 如 SEQ ID NO. 4 所示。
4.权利要求1或3所述的FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体的轻链和重链可变区应用于以人 EPCAM为靶点的基因工程抗体或诊断试剂的制备。
全文摘要
本发明公开了FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体的轻链和重链可变区，FMU-EPCAM-4E4单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过重组人EPCAM免疫BALB/c小鼠，制备了一组小鼠抗人EPCAM单克隆抗体，筛选出能稳定分泌高亲和力抗人EPCAM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水获得高亲和力的抗人EPCAM单克隆抗体。确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；为抗人EPCAM嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。
文档编号C12N15/13GK101817882SQ20101001366
公开日2010年9月1日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者孙元杰, 宋朝君, 张葵, 朱参胜, 杨琨, 谢鑫, 金伯泉 申请人:中国人民解放军第四军医大学