专利名称：一种抗人baff单克隆抗体的重链和轻链可变区的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗人BAFF单 克隆抗体的重链和轻链可变区，包括其氨基酸序列及其核苷酸序列。
背景技术：
自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导 致自身组织损害所引起的疾病，是严重危害人类健康的疾病。常见的自身免疫性疾病有系 统性红斑狼疮(SLE)、口眼干燥综合征(SS)、类风湿性关节炎(RA)等。针对自身免疫性疾 病的治疗手段目前仍处于研究和探索阶段，主要依赖药物如免疫抑制剂、理疗及外科治疗 等手段，但是毒副作用较大且无法根治。因此结合基因工程和蛋白质工程技术的靶向抗体 药物治疗正成为新兴研究领域，有望为包括系统性红斑狼疮在内的自身免疫性疾病治疗提 供新的策略。B淋巴细胞刺激因子(B cell activating factor, BAFF)是1999年发现的新分 子，属于肿瘤坏死因子超家族成员(TNFSF)。BAFF分子在B细胞发育、功能调节和自身免 疫性疾病的发病中发挥重要作用，BAFF缺陷或过量表达均能引起机体免疫失衡，从而诱发 多种疾病，且可能与某些自身免疫性疾病的发生有关。实验表明(Yoshimoto K et al,Int Immunol. 18(7) :1189_96.)，在系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征和类风湿性关节炎等病人 血清中sBAFF水平明显升高，进一步实验证实了 BAFF分子过表达密切参与了系统性红斑狼 疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发生和发展。基于对BAFF 分子结构及其在生理和病理条件下所起作用的认识，人们已开始尝试以BAFF及其受体作 为靶点进而阻断BAFF的生物学活性来合理设计治疗某些相关疾病的新措施，为自身免疫 性疾病的治疗提供新方法或新型药物。目前阻断BAFF生物学活性的制剂主要有抗BAFF抗体和BAFF的可溶型受体两 大类，其中抗 BAFF 抗体包括 lymphostat-B、EGFP/scFv F8、anti-BAFFscFv、anti-BAFF scFv-Fc等，但是前三类抗体只能识别游离BAFF，不能识别细胞膜上的BAFF ；后一类抗体虽 然对游离的BAFF和细胞膜上的BAFF都能识别但是亲和力较低，阻碍其进一步应用。因此 制备新型的BAFF治疗性抗体具有十分重要的理论和实际意义。抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二 硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可变区 (V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。 重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR 是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区 不同可分为人源、鼠源等，鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性，易引起人体的免疫反 应，这些免疫反应可引起对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了克服 鼠源性抗体的缺陷，需要构建特异性的嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体等基因工程抗体。在构建特异性的嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体等基因工程抗体过程中，最为重要的是获得具有良好特异性、亲和力和中和活性的鼠源性亲本抗体，克隆其轻链和重链 可变区基因，然后将可变区基因克隆入相应载体构建相应的基因工程抗体重组DNA，进而表 达各种类型的基因工程抗体。因此，筛选出特异性的鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆， 从中克隆出抗体的重链和轻链可变区基因，分析其氨基酸序列，是进一步构建高亲和力、特 异性和具有中和活性的基因工程抗体的前提。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链可变区，包 括其基因及其氨基酸序列，为构建高亲和力、特异性和中和活性的抗人BAFF嵌合或人源化 基因工程抗体提供支持。本发明是通过以下技术方案来实现一种抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链的可变区，轻链可变区的3个互补决定区 (CDR)序列分别为CDR1:Lys-Ser-Leu-Leu-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr ；CDR2 :Arg-Met-Ser ；CDR3 :Met-Gln-His-Leu-Glu-Tyr-Pro-Phe-Thr ；重链可变区的3个互补决定区(⑶R)序列分别为CDR1:Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Asp ；CDR2 :IIe-Ser-Ser-Gly-Gly-Ser-Tyr-Thr ；CDR3 :Ala-Ser-Asp-Gly-Val-Trp-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr。所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重链可变区的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。所述的编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，编码重链可变区的基因 序列如SEQ ID NO. 4所示。抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链的可变区应用于以人BAFF分子为靶点的基因 工程抗体或疫苗的制备。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明所述的抗人BAFF单克隆抗体被命名为FMMU-BAFF-4，该抗体是具有高 度特异性的抗人BAFF单克隆抗体；经过间接ELISA检测、流式细胞仪检测证实单克隆抗体 FMMU-BAFF-4具有高效价，能够与BAFF分子具有高的亲和力；而且与可溶性的和细胞表面 表达的BAFF分子能够特异性的结合。2、本发明克隆了单克隆抗体FMMU-BAFF-4的轻链、重链可变区基因和氨基酸序 列，序列分析证实了该抗体序列的惟一性。3、分析获得轻链、重链可变区的⑶R区，在此基础上为构建高亲和力的抗人BAFF 嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。
图1是单克隆抗体FMMU-BAFF-1 7与sBAFF的间接ELISA检测结果图；图2是FMMU-BAFF-1 7单克隆抗体与转染BAFF-YFP质粒的293T细胞表面BAFF分子结合的流式细胞术检测结果图，其中，图2a为阴性对照结果图，图2b为空白对照，图2c 为单抗检测结果图；图3是FMMU-BAFF-4单克隆抗体轻链可变区基因同源性序列检测结果图；图4是FMMU-BAFF-4单克隆抗体重链可变区基因同源性序列检测结果图；图5是FMMU-BAFF-4单克隆抗体轻链可变区氨基酸同源性序列检测结果图；图6是FMMU-BAFF-4单克隆抗体重链可变区氨基酸同源性序列检测结果图。
具体实施例方式可变区基因的完整核苷酸序列，尤其是其功能性片段的核苷酸序列(如CDR等) 以及抗体可变区的氨基酸序列，是嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体构建的基础。为此，申 请人用重组人BAFF免疫BALB/c小鼠，制备小鼠抗人BAFF单克隆抗体，克隆并从中筛选出 能分泌特异性的人BAFF单克隆抗体FMMU-BAFF-N0. 4的杂交瘤细胞株，纯化制备了该单克 隆抗体并验证了其高亲和性和特异性。并克隆该单克隆抗体轻链和重链可变区基因，获得该单克隆抗体轻链和重链可变 区基因序列和氨基酸序列，以及可变区的CDR序列；并确认氨基酸序列和基因序列的惟一 性。所述的单克隆抗体可变区基因序列如SEQ IDN0.3和SEQ ID NO. 4所示；所述的单克隆 抗体可变区氨基酸序列如SEQ IDN0. 1和SEQ ID NO. 2所示。下面结合附图对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明 具体按以下步骤实施1、小鼠抗人BAFF分子单克隆抗体的制备1. 1单克隆抗体的制备、纯化重组人BAFF分子委托武汉三鹰生物技术有限公司制备。按单克隆抗体制备方法(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-17)，用重组人 BAFF免疫BALB/c小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)，初次免疫，使用福氏完全佐剂， 后续免疫使用福氏不完全佐剂，每次间隔3周，均为皮下多点注射，共免疫4次。末次免疫 7-10天后采血测其效价，检测免疫效果。间隔2-3周后，经静脉注射抗原再加强免疫，3天 后处死动物取脾进行细胞融合；具体过程为取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数，同时制备免疫脾细胞悬 液。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 10比例混合，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗 一次，1200rpm离心8min，然后弃上清，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略为松动，在室温下 融合，制备杂交瘤细胞株；融合后细胞悬液加入含有饲养细胞(正常BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔板， 37°C,5% 0)2孵箱培养；待克隆出现后，间接ELISA检测，挑选阳性克隆。对含有阳性克隆 孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化，直至获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(体外 连续培养超过6个月)。在获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，按小鼠腹水制备方法 制备包含单克隆抗体的腹水(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)；腹水经40%饱 和硫酸铵沉淀后，采用Protein A亲和层析法纯化。1. 2抗人BAFF单克隆抗体高亲和力测定实验按照上述单克隆抗体的制备过程，申请人构建了 7株能够分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞FMMU-BAFF-1 7，其对应分泌的抗体分别命名为单克隆抗体 FMMU-BAFF-1 7 ； 对于制备的小鼠抗人BAFF单克隆抗体FMMU-BAFF-1 7，用IgG业类检测 试剂盒(美国Sigma公司)检测其单克隆抗体的IgG亚类，并用间接ELISA方法测定 FMMU-BAFF-1 7杂交瘤细胞株的腹水效价(包被抗原为重组人BAFF蛋白，待测样品为 1 X 101 109系列梯度稀释的腹水，检测抗体为羊抗鼠-HRP酶标记抗体，底物使用ABTS)， 以筛选对BAFF高亲和力的单抗；具体的腹水效价检测如表1所示，其中，单抗FMMU-BAFF-4 效价最高，腹水效价为1 X 10_7，而一般采用间接ELISA检测腹水效价达1 X 10_5以上的抗体 即可使用。表1鼠源性抗人BAFF单抗单克隆抗体FMMU_BAFF_1 7的特性筛选鉴定 1. 3抗人BAFF单克隆抗体与sBAFF分子的特异性结合而对于单抗的特异性结合来说，在具有与抗原高亲和力的基础上，其特异性的识 别和结合更为重要，尤其是与细胞表面的活性分子的结合所反应的对抗原的特异性的结
1=1 o本发明首先以hlgG作为对照，在ELISA板孔中直接包被可溶性BAFF (sBAFF)，比较 7株抗BAFF抗体与sBAFF的特异性结合；具体操作步骤如下1)包被用pH 9. 0,0. 05M碳酸盐包被缓冲液稀释sBAFF，同时包被hlgG作为阴 性对照，包被浓度为5 u g/ml，每孔加入0. 1ml，4°C过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲 液洗3次，每次3min ；2)加样加1 500稀释的7株抗BAFF抗体于上述已包被的反应孔中，置37°C 孵育lh，然后洗涤；3)加酶标抗体于各反应孔中，加入新鲜稀释(1 1000)的HRP标记的羊抗小鼠 抗体0. 1ml，37 °C孵育lh，洗涤；
4)加底物液显色于各反应孔中加入新鲜配制的ABTS底物溶液0. lml，37°C孵育 10 30min ；5)终止反应于各反应孔中加入2M硫酸0. 05ml ；6)结果测定在ELISA读数仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔0D值。结果如图1所示，横坐标为7株抗BAFF抗体，纵坐标显示7株抗BAFF抗体与包被 分子结合的0D值，反应与sBAFF分子的结合情况；以与hlgG分子的结合作为对照，比较7株 单抗与sBAFF分子的特异性结合，通过0D值的变化来体现与sBAFF分子结合的特异性。从 图中可以很明显地看出单抗FMMU-BAFF-4与sBAFF分子结合的特异性在所有单抗中最高， 能够与sBAFF分子特异性结合。1. 4抗人BAFF单克隆抗体与细胞表面BAFF分子的结合本发明以IgGl作为阴性对照，用流式细胞术(细胞和分子免疫学实验技术，第一 版，P78-89)检测抗人BAFF单克隆抗体FMMU-BAFF-1 7与转染人BAFF-YFP质粒的293T 细胞系(Transfecting-293T-cells)细胞表面表达的BAFF分子的结合。流式细胞术检测结果如图2所示图2a为IgGl阴性对照，图2b显示BAFF-YFP 质粒可高效转染293T细胞，图2c中NO. 1 7分别表示单抗FMMU-BAFF-1 7与转染 BAFF-YFP质粒的293T细胞表面BAFF分子的特异性结合，横坐标为黄色荧光蛋白荧光强 度，表示BAFF-YFP质粒的转染效率；纵坐标为BAFF-PE的荧光强度，表示7株抗体与转染 BAFF-YFP质粒的293T细胞表面BAFF分子的特异性结合能力。从图2中可以看出，与其他 株单抗相比，NO. 4和No. 7所示的检测结果在右上角的区域具有明显的荧光强度，这表明单 抗FMMU-BAFF-4和FMMU-BAFF-7可特异性识别转染BAFF-YFP质粒的293T细胞系细胞表面 BAFF分子，单抗FMMU-BAFF-4和FMMU-BAFF-7具有与细胞表面BAFF分子特异性结合的能 力。通过以上检测表明，单克隆抗体FMMU-BAFF-4具有高效价，能够与BAFF分子具有 高的亲和力；而且与可溶性的和细胞表面表达的BAFF分子能够特异性的结合。而对于其他 株的单克隆抗体不能同时满足这些条件(如表1所示)。2、BAFF轻链和重链可变区基因的克隆2. 1分泌FMMU-BAFF-4单抗的杂交瘤细胞的培养按常规方法复苏(细胞培养，第一版，P88)杂交瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基于37°C，5% C02孵箱中培养至对数生长期。 2. 2总RNA的提取和cDNA第一链的合成采用TRIZOL Reagent (购自美国GIBC0公司)提取总RNA，具体操作步骤按说明书 进行；cDNA第一链合成试剂盒购自美国GIBC0公司，在得到总RNA后按产品说明书进行反 转录合成cDNA第一链。2.3PCR法扩增VL和VH基因PCR法扩增试剂盒购自Takara公司，以cDNA第一链为模板进行PCR扩增。反应 体积50 iil，反应条件为:94°C温育5min ；94°C变性45s，63°C退火45s，72°C延伸lmin，循环 30次；72°C延伸lOmin ；VL、VH的正、反向引物核苷酸序列为VlF :gatgt gagct cgtga tgacc cagac tccVlB :gcgcc gtcta gaatt aacac tcatt cctgt tgaa
VhF :tgagg agacg gtgac cgtgg tccct tggcc ccaga ggtgc aactg cagca gtcagVhB :aggts marct gcags agtcw gg(IUB 标准兼并碱基代码s:c/g ；m:a/c ；r:a/g ；w:a/t)2. 4PCR扩增产物的克隆和筛选 PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒(购自美国Axygen公司) 回收抗体重链和轻链可变区片段，用simple pMDIST试剂盒(购自日本Takara公司)将该 片段按说明书插入simple pMDIST载体中。转化W.coli XL-10 (购自北京中国普通微生物 菌种保藏中心)，在Amp抗性LB琼脂培养平皿中37 °C培养过夜。挑取LB琼脂培养平皿中克隆，在Amp抗性LB培养基中37°C摇菌过夜，以1 yl菌 液为模板，通过上述针对轻链、重链可变区设计的引物，用PCR法筛选重组阳性E. coli克 隆；轻链用限制性内切酶Xba I和Sac I，重链用Sal I和EcoR I限制性核酸内切酶(购自 Takara公司)消化筛选重组阳性克隆(酶切得到重链片段约375bp，轻链片段约750bp)。将所获得重组阳性E. coli克隆摇菌，菌体送交南京金斯瑞生物科技有限公司完 成基因序列测定，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，重链可变区的基因序列如 SEQ ID NO. 4 所示。3轻链和重链可变区的氨基酸序列及同源性分析3. 1确定测序无误后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源 性分析(Blastn)分析结果表明，单抗轻链可变区基因与小鼠杂交瘤4-1D2免疫球蛋白轻链基因部 分序列同源性最高，同源性为332/336，同源性百分比为98%，(如图3所示)；单抗重链可 变区基因与小鼠免疫球蛋白重链可变区部分mRNA(IGHV-A2Al gene)同源性最高，同源性为 305/320，同源性百分比为95% (如图4所示)。3. 2将可变区基因翻译成氨基酸序列，FMMU-BAFF-4单克隆抗体轻链可变区的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。在 non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF 蛋白质 数据库中，进行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。分析结果表明，单抗轻链氨基酸序列与酯水解抗体Ms6_12Fab复合物高清晰度晶 体结构 A 链(pdb 11MJJ | A)、L 链(pdb 11MJJ | L)、L 链(1. 22 埃晶体结构 pdb 11MJU | L)同源性 最高，同源性为106/112，同源性百分比为94% (如图5所示)；单抗重链氨基酸序列与小 鼠免疫球蛋白重链可变区(gb|AA018975.1|)同源性最高，同源性为97/106，同源性百分 比为91% (如图6所示)。编码mAb的轻链和重链可变区的基因核苷酸序列和蛋白质氨基酸序列同源性分 析结果表明末发现与本发明相同的序列。3. 3利用IMGT/V-QUEST分析可变区结构，确定⑶R区将测序所得抗体轻链和重链可变区序列，在IMGT/V-QUEST网站(http//imgt. cines. fr/IMGT_vquest/vquest)分析，得出其 CDR 区。轻链可变区的3个互补决定区(⑶R)序列，如SEQ ID NO. 1划线部分所示，具体 为CDR1:Lys-Ser-Leu-Leu-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr ；
CDR2 :Arg-Met-Ser ；CDR3 :Met-Gln-His-Leu-Glu-Tyr-Pro-Phe-Thr ；重链可变区的3个互补决定区(⑶R)序列，如SEQ ID NO. 2划线部分所示，具体 为CDR1:Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Asp ；CDR2 :IIe-Ser-Ser-Gly-Gly-Ser-Tyr-Thr ；CDR3 :Ala-Ser-Asp-Gly-Val-Trp-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr。4.基因工程抗体设计基于抗人BAFF单克隆抗体的克隆、纯化以及序列分析，设计构建以下生物制品(1)抗人BAFF单链抗体的构建将本发明的单克隆抗体的轻链和重链可变区基因插入表达载体pCONTAB 5E中， 获得的单链抗体基因转化表达菌株，通过诱导该基因的表达，制备对自身免疫性疾病有潜 在治疗作用的单链抗体。(2)人源化抗体的构建将本发明的单克隆抗体轻链和重链可变区的CDR区移植到人源可变区的FR中，形 成CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)也称重构抗体(reshapingantibody)或人源化 抗体(humanized antibody) 0利用⑶R移植技术改造抗体，可以获得保持鼠源性亲本mAb 的特异性，同时更加接近人抗体的新型抗体，用于制备对自身免疫性疾病有潜在治疗作用 的人源化抗体。(3)根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列，制备针对人BAFF功能表位的 如人鼠嵌合抗体、Fab抗体、疫苗或其他生物制品。
权利要求
一种抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链的可变区，其特征在于，轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为CDR1Lys-Ser-Leu-Leu-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr；CDR2Arg-Met-Ser；CDR3Met-Gln-His-Leu-Glu-Tyr-Pro-Phe-Thr；重链可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为CDR1Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Asp；CDR2IIe-Ser-Ser-Gly-Gly-Ser-Tyr-Thr；CDR3Ala-Ser-Asp-Gly-Val-Trp-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr。
2.如权利要求1所述的抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链的可变区，其特征在于， 所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.如权利要求1所述的抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链的可变区，其特征在于，编 码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 4 所示。
4.权利要求1或3所述的抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链的可变区应用于以人 BAFF分子为靶点的基因工程抗体或疫苗的制备。
全文摘要
本发明公开了一种抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链的可变区，该抗人BAFF单克隆抗体为FMMU-BAFF-4，其单克隆抗体可变区基因序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；其单克隆抗体可变区氨基酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明用重组人BAFF免疫BALB/c小鼠，制备小鼠抗人BAFF单克隆抗体，克隆并从中筛选出能分泌特异性的人BAFF单克隆抗体FMMU-BAFF-NO.4的杂交瘤细胞株，并克隆该单克隆抗体轻链和重链可变区基因，获得该单克隆抗体轻链和重链可变区基因序列和氨基酸序列，以及可变区的CDR序列；并确认氨基酸序列和基因序列的惟一性。
文档编号C07K16/24GK101851291SQ20101010843
公开日2010年10月6日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者宋朝君, 肖黎明, 金伯泉, 陈丽华, 龚玖瑜 申请人:中国人民解放军第四军医大学