用于调节靶细胞上补体调节蛋白的活性的组合物和方法

专利名称：用于调节靶细胞上补体调节蛋白的活性的组合物和方法
用于调节靶细胞上补体调节蛋白的活性的组合物和方法交叉参考相关申请本申请要求2009年3月31提交的美国临时申请61/165，434和2009年10月27 日提交的美国临时申请61/255，450的利益，将所述临时申请通过引用整体并入本文。政府许可权的声明本发明是在由国立卫生研究院授予的基金号HL078836下由美国政府资助进行的。美国政府在本发明中具有一定的权利。背景补体系统是免疫系统的体液方面的主要效应器。补体激活的经典途径包括可溶性成分例如某些种类和亚类的抗体与体内的抗原靶的结合。此类结合的抗体的Fc区域中构象的变化将结合位点暴露给Cl (以其不活动状态存在的补体系统的可溶性成分)。在稳定结合后，Cl经历构象变化，从而导致Cl亚成分之一的活跃蛋白酶活性。该蛋白酶活性启动补体成分之间受到高度调节的相互作用的级联。级联的结果是靶细胞上膜攻击复合物 (membrane attack complex, MAC)的装配。补体激活的相互作用的级联中的重要步骤是将成分C3转变成活性C3b的步骤， 因为在该步骤中存在激活信号的大量扩增。具体地，单个C3转化酶能够将数百个C3分子转化成C3b。每一个C!3b成分转而形成C5转化酶的部分，产生C5b。每一个激活的rab分子启动MAC的形成。MAC是贯穿细胞膜以产生跨膜小孔的大分子结构。小孔破坏膜的完整性，从而允许离子和小分子自由地扩散穿过，从而导致补体依赖性细胞溶解(complement dependent cytolysis, CDC)0单克隆抗体(mAb)已成为许多疾病的新型治疗剂的潜在强有力种类。例如，在肿瘤学领域，存在数种用于治疗癌症的市售治疗性mAb，并且目前有数百种mAb处于临床开发中(参见 J. Castillo，等人，Experimental Hematology 36 :755-768 (2008)) 许多此类治疗性mAb通过激活补体级联(从而导致MAC在转化的肿瘤细胞上装配，从而引发CDC)来起作用。该治疗方法可以是有利的，因为抗体可被特异性靶向特异于转化的肿瘤细胞的抗原， 从而避免许多因既有治疗而引起的副作用。然而，由于患病细胞通过膜补体调节蛋白(CRP)例如⑶35、⑶46、⑶55和⑶59 的表达阻止通过⑶C导致的杀伤的能力，治疗性mAb的治疗潜能可能是有限的(D. Gancz 和 Z. Fishelson，Molecular Immunology 46:2794-2800(2009) ;J. Golay,等人，Blood 98 :3383-3389(2001) ；K. A. Gelderman 等人，Laboratory Investigation :A Journal of Technical Methods and Pathology 82:483—493(2002)；禾口 N. Donin 等人，Clinical and Experimental Immunology 131 :254-263 (2003))。CD46 和 CD55 在 C3 活化阶段阻断补体级联并且CD59阻止补体的MAC的装配(Z. Fishelson等人，Molecular Immunology 40 109-123(2003))ο因此，需要有减少⑶35、⑶46、⑶55和⑶59在靶细胞表面上的存在以减弱CRP介导的对补体MAC的抑制的组合物和方法。概要
本概要被提供用以以简化形式介绍将在下文详细描述中进一步说明的概念的选择。本概要无意鉴定所述主题的主要特征，也无意用作帮助确定所述主题的范围。本文中描述的本发明提供了能够减少靶细胞上补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度的组合物和试剂。本发明还提供了鉴定此类组合物和试剂的方法、其制备方法和其用途。此外，本发明还提供了增加靶细胞或组织对治疗剂介导的补体依赖性细胞溶解(CDC) 和治疗剂介导的靶细胞或组织上膜攻击复合物(MAC)的装配的易感性的方法。在一个方面，本文中描述的本发明提供了包含能够减少靶细胞表面上补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度的经修饰多肽的组合物，其中所述多肽包含非天然存在的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽引起CRP的内化或隔离(sequestration)。在另一个实施方案中，所述多肽结合CRP。在某些实施方案中，所述多肽以InM或更小的解离常数 (Kd)结合CRP或所述多肽以.65nM或更小的解离常数(Kd)结合CRP。在一个具体的实施方案中，所述多肽是分离的病毒蛋白质。在这样的实施方案中，所述多肽来源于腺病毒纤维钮蛋白(fiber knob protein)—例如，Ad35纤维钮蛋白。在一个相关实施方案中，所述多肽来源于在选自Asp207、Ilir245、Ile256的残基和其组合上包含至少一个氨基酸置换的Ad35 纤维钮蛋白。在具体的实施方案中，所述氨基酸置换为Asp207Gly、Thr245Ala、Ile256Leu 或其组合。在另一个实施方案中，所述多肽小于25，000道尔顿。在另一个实施方案中，所述组合物包含所述多肽的二聚体形式、所述多肽的三聚体形式或所述多肽的同源三聚体形式。在这些实施方案中，CRP为跨膜蛋白和/或为GPI连接蛋白(GPI-linked protein) 0 在具体的实施方案中，CRP为⑶46、⑶55、⑶59或⑶35。在一个非常具体的实施方案中， CRP为⑶46。在另一个具体的实施方案中，所述多肽结合⑶46。这些实施方案中提供的组合物还能使靶细胞对抗体介导的补体依赖性细胞溶解和/或膜攻击复合物的装配敏感。在本文中描述的实施方案中，靶细胞可以是肿瘤细胞。所述肿瘤细胞可选自获自癌的细胞、获自肉瘤的细胞、获自母细胞瘤(blastoma)的细胞、获自胚细胞癌的细胞和获自血液肿瘤的细胞。所述肿瘤细胞还可选自原发性淋巴瘤细胞、Raji-Burkitt' s淋巴瘤细胞、BJAB细胞、Farage细胞、BT474细胞、HT18M细胞、LoVo细胞、Η ^9细胞、Mino细胞、Jurkat细胞、 Κ562细胞、HeLa细胞、Α549细胞、SK0V3细胞、ΗΤ29细胞和MDA235MB细胞。在一个具体的实施方案中，靶细胞包含实体瘤的细胞表面标志。所述实体瘤可以是乳腺、肺、结肠直肠系统、胃、前列腺、卵巢、子宫、宫颈、肾、胰腺、肝、脑、头和颈、鼻咽系统或食管的肿瘤。在另一个具体的实施方案中，靶细胞包含肉瘤的细胞表面标志。肉瘤可以是平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤或尤因肉瘤(Ewing' s sarcoma)。在另一个具体的实施方案中，靶细胞包含血液肿瘤的细胞表面标志。血液肿瘤可以是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一个更具体的实施方案中，靶细胞是B细胞，可以是正常B细胞或恶性B细胞。靶细胞可表达选自CD3、 CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD35、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD70、 CD80、CD133、CD200、表皮生长因子受体1 (EGFR)、表皮生长因子受体2 (Her2/neu)、人乳脂肪球(HMFGl)、白细胞介素2受体(IL2R)、粘蛋白1和血管内皮生长因子中的一个或多个细胞标志。在一个具体的实施方案中，靶细胞表达CD20。在相关实施方案中，所述多肽还能够增加靶细胞表面上的补体激活和/或所述多肽能够增加靶细胞表面上膜攻击复合物(MAC) 的装配。在其他相关实施方案中，当与基线或未修饰的多肽相比较时，所述多肽能够减少补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度至少25% ；所述多肽能够减少补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度至少M小时；和/或所述多肽在约25ng/ml或更低的浓度下具有活性。在其他相关实施方案中，所述多肽不是抗体或抗体片段；所述多肽不是生长因子或细胞因子； 所述多肽不结合基因的转录调控区；所述多肽不结合基因的启动子区域、增强子区域、沉默子区域(silencer region)或绝缘子区域(insulator region)；和/或所述多肽不结合转录因子。在其他相关实施方案中，所述多肽在长度上为至少120个氨基酸；所述多肽包含天然存在的蛋白质或蛋白质结构域的至少一个突变；所述多肽包含与天然存在的蛋白质或蛋白质结构域至少90%的氨基酸序列同源性；和/或所述多肽不是天然存在的蛋白质或蛋白质片段。在其他相关实施方案中，所述多肽被进一步修饰以减少免疫原性。所述多肽的免疫原性可通过将所述多肽偶联至烷基-PEG，通过表位去免疫化作用，通过共施用免疫抑制剂， 通过加入耐受方案(tolerizing regimen)，通过糖基化所述多肽或通过共施用增强补体激活的试剂来进行减弱。在另一个实施方案中，该方面中提供的组合物包括经修饰的病毒或经修饰CRP-相互作用的微生物-例如奈瑟球菌属(Neisseria)或链球菌(Mr印tococcal) 菌株。在一个这样的实施方案中，病毒能够与CRP相互作用并且选自腺病毒、腺伴随病毒、 逆转录病毒、疱疹病毒、麻疹病毒(Edmonston株)、人疱疹病毒6、牛病毒性腹泻病毒和人柯萨奇病毒。在一个具体的相关实施方案中，该方面中提供的组合物不包括腺病毒。在另一个具体的相关实施方案中，该方面中提供的组合物包括腺病毒-例如，选自Adll、Adl6、 Ad21、Ad34、Ad35和Ad50腺病毒血清型。在一个非常具体的实施方案中，腺病毒为Ad35，并且Ad35腺病毒任选地包括突变的纤维钮蛋白。 在另一个方面，本文中描述的本发明提供了具有第一结构域和第二结构域的分离的多肽，其中所述第一和第二结构域结合CRP，其中所述第一结构域包含SEQ ID NO 15,SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、 SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 23,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 25,SEQ ID NO26,SEQ ID N0: 27、SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30 或 SEQ ID NO :31 所示的氨基酸序列，并且其中X1不是天冬氨酸，X2不是苏氨酸或1。不是异亮氨酸。在一个具体的实施方案中，X1 为甘氨酸或&为谷氨酸。在另一个具体的实施方案中， 为丙氨酸，或&为任意非极性氨基酸。在另一个具体的实施方案中， 为亮氨酸或任意非极性氨基酸。在一个相关实施方案中，第一结构域包含SEQ ID NO :19中所示的氨基酸序列，其中&不是天冬氨酸；SEQ ID N0:26，其中)(2不为苏氨酸；或SEQ ID NO :31，其中&不为异亮氨酸。在另一个相关的实施方案中，第二结构域包含SEQ ID NO :19中所示的氨基酸序列，其中&不是天冬氨酸；SEQ ID N0:26，其中)(2不是苏氨酸；或SEQ ID NO :31，其中&不是异亮氨酸。在另一个相关实施方案中，第一和第二结构域结合相同的CRP，或可选地，第一和第二结构域结合不同的CRP。在本发明的该方面中提供的实施方案中，CRP为⑶35、⑶46、⑶55或⑶59。在一个具体的实施方案中，CRP为CD46。在相关实施方案中，所述多肽引起CRP至细胞内的内化或隔离；和 /或所述多肽以约InM或更小或甚至约0. 65nM或更小的解离常数(Kd)结合CRP。在一些实施方案中，所述多肽不是抗体或抗体片段。所述多肽可以是分离的、经修饰的病毒蛋白-例如，来源于腺病毒纤维钮蛋白的多肽。此类来源于腺病毒的纤维钮结构域的多肽可以例如选自Adll、Adl6、Ad21、Ad34、Ad35*Ad50。在一个非常具体的实施方案中，所述多肽来源于在选自Asp207、Thrf45、Ile256和其组合的残基上包含至少一个氨基酸置换的Ad35纤维钮结构域；或，更具体地，所述氨基酸置换为Asp207Gly、Thr245Ala, Ile256Leu或其组合。在另一个实施方案中，所述多肽低于25，000道尔顿。在其他相关实施方案中，所述提供的多肽二聚化、三聚化或甚至同源三聚化。在一个相关实施方案中，所述多肽自发地同源三聚化。三聚化的这样的多肽还可具有三聚化结构域-例如，来源于病毒蛋白质的三聚化结构域。在一个具体的实施方案中，所述三聚化结构域是噬菌体T4弹力素(fibritin)结构域或逆转录病毒纤维蛋白σ 1结构域。在一个非常具体的实施方案中，三聚化结构域包含SEQ ID NO :32中所示的氨基酸序列。在本文中提供的一些实施方案中，所述三聚体具有三维结构，并且同源三聚体(homotrimer)的每一个多肽包含2个环，其中每一个环结合CRP。具体地，环之间的氨基酸序列是可置换的并且基本上不改变对CRP的结合。在另一个方面，本文中描述的本发明提供了包含本文中描述的多肽中任一种的多肽复合物。在一个实施方案中，所述多肽结合2个或更多个CRP分子。在一个相关实施方案中，CRP为⑶35、⑶46、⑶55或⑶59。在一个具体的实施方案中，CRP为⑶46。在另一个方面，本文中描述的本发明提供了包含治疗有效量的任何本文中描述的多肽的药物组合物。在一个具体的实施方案中，药物组合物还包含第二治疗剂。在这样的实施方案中，第二治疗剂可选自蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体 (hybrid antibody)、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体；或第二治疗剂可选自细胞毒性剂、细胞抑制剂(cytostatic agent)、化疗剂(chemotherapy agent)、 补体激活剂(complement activating agent)、CRP 表达调节剂、放射物(radiation)、 免疫调节剂、促细胞凋亡试剂、热激蛋白质的抑制剂、蛋白酶抑制剂、脱唾液酸化试剂 (desialyating agent)、MMP抑制剂和PKC抑制剂。在一个具体的实施方案中，第二治疗剂为抗体-例如，抗体选自表1中所列的那些抗体，或甚至更具体地，选自利妥昔单抗、Arzerra、爱必妥(Eribitux)、米罗他(吉妥单抗，Mylotarg)、Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁的抗体。在一个进一步的实施方案中，修饰抗体或抗体片段以例如通过Fc修饰的方式进一步增强补体激活。在另一个实施方案中，第二治疗剂为选自Lllb，IL4和 TGFbl的CRP表达调节剂。在另一个实施方案中，第二治疗剂为选自脱氧精胍菌素和 geldanamyctanespimycin 17-AAG的热激蛋白抑制剂。在另一个相关的实施方案中，第二治疗剂为蛋白酶抑制剂、脱唾液酸化试剂或MMP抑制剂。在另一个相关实施方案中，第二治疗剂为选自他莫昔芬、enzastaurin和UBN-01的PKC抑制剂。在一个具体的实施方案中， 第二治疗剂为化疗剂。在另一个具体的实施方案中，第二治疗剂为免疫调节剂-例如选自干扰素-α，干扰素-Y，GM-CSF, TLR 激动剂、NOD 受体激动剂，IL2、IL7、IL17、IL21、IL23、 TNF、IMiDs, RIG-I受体激动剂、天然杀伤细胞配体、天然杀伤细胞活化剂、NKG2P配体和天然抗体的免疫调节剂。在一个非常具体的实施方案中，天然杀伤细胞活化剂为抗-CD137抗体。在另一个非常具体的实施方案中，NKG2P配体选自MICa、MICb、RAEl和ULBPl。在另一个方面，本文中描述的本发明提供了包括将在其表面上表达CRP的靶细胞与本文中描述的任一种多肽接触的方法。在一个实施方案中，将所述多肽与靶细胞直接接触。在另一个实施方案中，所述多肽不是病毒载体的部分。在一个相关实施方案中，靶细胞与多肽的接触增加了靶细胞对利用抗体的治疗的易感性和/或增加了抗体介导的补体依赖性细胞溶解。在一个具体的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体-例如，所述抗体选自表1中所列的抗体，或更具体地，所述抗体选自利妥昔单抗、Arzerra、爱必妥、米罗他、 Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁。本发明的该方面描述的实施方案中，靶细胞与本发明的多肽的接触可以体外、体内和/或离体的。在这些实施方案中，CRP可以为⑶46、⑶55、⑶59或 ⑶35，在一个具体的实施方案中，CRP为⑶46。靶细胞可以为肿瘤细胞-例如，选自获自癌的细胞、获自肉瘤的细胞、获自母细胞瘤的细胞、获自胚细胞癌的细胞和获自血液肿瘤的细胞之中的肿瘤细胞。在本发明的该方面中描述的方法中，所述方法还可包括将靶细胞与第二治疗剂接触。与第二治疗剂的接触可在与本文中提供的任一种多肽接触的同时、之前或之后发生。在示例性实施方案中，第二治疗剂可选自细胞毒性剂、细胞抑制剂、化疗剂、补体激活剂、放射物、免疫调节剂、促细胞凋亡试剂、蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。在一个具体的实施方案中，第二治疗剂为抗体-例如，选自表1中所列的抗体，或更具体地，选自利妥昔单抗、 Arzerra、爱必妥、米罗他、Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁的抗体。在一个相关的具体实施方案中，修饰抗体或抗体片段以进一步增强补体激活-例如Fc修饰。在可选择的实施方案中， 第二治疗剂是化疗剂或免疫调节剂。这样的实施方案中的免疫调节剂可选自干扰素-α、 干扰素-Y、GM-CSF、TLR 激动剂、NOD 受体激动剂、IL2、IL7、IL17、IL21、IL23、TNF、IMiD, RIG-I受体激动剂、天然杀伤细胞配体、天然杀伤细胞活化剂和天然抗体。在该方面中提供的接触方法中，细胞表面上CRP的活性、量或密度在一些实施方案中减少至少25%。在另一个方面，本文中描述的本发明提供了治疗需要针对涉及免疫系统的病症进行治疗的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用本文中描述的任一种药物组合物。在一些具体的实施方案中，所述病症与天然杀伤细胞、τ细胞或B细胞的失调相关，所述病症为癌症、自身免疫病症、传染病或移植后病症。在一些具体的实施方案中，所述病症选自癌、 肉瘤、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤或胚细胞癌。在另一个方面，本文中描述的本发明提供了包含有效地连接至调控序列的编码多肽的核酸的载体，其中所述编码的多肽能够减少靶细胞表面上的CRP的活性、量或密度，其中所述编码的多肽包含非天然存在的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述编码的多肽包含天然存在的蛋白质或蛋白质结构域的至少一个突变；所述编码的多肽包含与天然存在的蛋白质或蛋白质结构域至少90%的氨基酸序列同源性；所述编码的多肽是非天然存在的蛋白质或蛋白质片段；所述编码的多肽不是抗体、抗体片段、生长因子、细胞因子或转录调控区；和/或所述编码的多肽在长度上为至少120个氨基酸。在一个相关实施方案中，CRP为⑶46、⑶55、⑶59或⑶35，或更具体地，CRP为⑶46。在相关方面中，本文中描述的本发明还提供了递送包含编码能够降低靶细胞表面上CRP活性之多肽的核酸的载体的方法，包括将靶细胞与本文中描述的任何载体接触。在另一个方面，本文中描述的本发明提供了用于筛选能够改变CRP活性的分子的方法，所述方法包括产生候选分子的文库；选择能够结合CRP的候选分子；和确定所述分子是否改变CRP的活性。在一个实施方案中，CRP为⑶46，⑶55，⑶59或⑶35。在一个具体的实施方案中，CRP为CD46。在一个相关实施方案中，所述分子以InM或更小的结合亲和力结合CRP。在相关实施方案中，所述分子选自蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、 杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。在一个具体的实施方案中，所述分子为小分子。在另一个具体的实施方案中，所述分子为多肽。在另一个实施方案中，所述分子通过CRP至细胞内的内化或隔离来修饰CRP的活性。在一个相关实施方案中，所述分子通过减少细胞表面上CRP的量或密度来修饰CRP的活性。
在另一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽包含选自Asp207Gly，Thrf45Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合⑶46的同源三聚体。在另一个方面，本发明提供了包含编码SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的至少 40个连续氨基酸的多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述多肽包括选自Asp207Gly， Thrf45Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合⑶46的同源三聚体。在另一个方面，本发明提供了用于降低CD46的细胞表面水平的组合物。根据本发明的该方面的组合物包含(a)有效地降低CD46的细胞表面水平的药剂的量，所述药剂包含多种经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成与从多个由SEQ ID NO :3组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言具有增强的对于 CD46结合的亲和力的同源三聚体；和(b)药学上可接受的载体。在另一个方面，本发明提供了用于减少靶细胞表面上CD46的量的方法。根据本发明的该方面的方法包括将在其表面上表达CD46的靶细胞与一定量的包含多个经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽的组合物接触，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成与从由SEQ ID NO :3组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言具有增强的对于⑶46结合的亲和力的同源三聚体。在另一个方面，本发明提供了用于诱导表达CD46的靶细胞的细胞溶解的方法。本据本发明的该方面的方法包含(a)将在其表面上表达⑶46的靶细胞与一定量的包含多种有效地减少存在于靶细胞表面上的CD46的量的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的试剂接触；和(b)将按照步骤(a)处理的靶细胞与结合靶细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段接触。在另一个方面，本发明提供了在有此需要的哺乳动物受试者中增强抗癌单克隆抗体的抗肿瘤作用的方法。按照本发明的该方面的方法包括(a)给所述哺乳动物受试者施用一定量的包含多种有效地减少存在于靶肿瘤细胞表面上的CD46的量的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的组合物至少一次；和(b)给该受试者施用治疗有效量的抗癌抗体至少一次，其中所述抗癌抗体结合在靶肿瘤细胞上表达的非CD46细胞表面抗原。在另一个方面，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括(a)包含SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的经修饰的纤维钮结构域多肽，其中所述多肽包含至少一个选自Asp207Gly、Thrf45Ala和Ile256Leu的氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合CD46的同源三聚体；和(b)结合哺乳动物细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段。在另一个方面，本发明提供了增强抗体治疗剂在治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病中的效应的方法。根据本发明的该方面的方法包括(a)给所述哺乳动物受试者施用一定量的包含多种有效地减少存在于靶细胞表面上的⑶46的量的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的药剂至少一次；和(b)给该受试者施用治疗有效量的抗体治疗剂至少一次，其中所述抗体治疗剂结合在靶细胞上表达的非CD46细胞表面抗原。本发明的多肽、核酸和组合物对于实施本发明的方法是有用的。附图概述
本发明的上述方面和许多伴随的有利方面将变得更容易领会，因为当与附图结合时，通过参考下列详细描述，本发明的上述方面和许多伴随的有利方面变得更好理解，其中图IA是标示N末端尾部结构域(aa 1-45)、柄结构域(shaft domain) (aa 46-133) 和C末端纤维钮(K)结构域(aa 134-323)的相对位置的全长野生型腺病毒血清型35 (Ad 35)纤维多肽(SEQ ID NO 2)的示意图；图IB举例说明野生型Ad35纤维多肽的钮结构域⑷(SEQ ID NO 3)的氨基酸序列，其中称为〃 DE" (SEQ ID NO :6)、“ FG" (SEQ ID NO :7)、“ HI" (SEQ ID NO :8) 和"IJ" (SEQ ID NO 9)的环区域加以下划线。其中已显示置换能消除⑶46结合的氨基酸位置以圆圈标示，并且其中已显示置换能增强⑶46结合的氨基酸位置由正方形标示；图 IC 为野生型 Ad35、突变型 Ad3^(++(Asp207Gly 和 Thr245Ala)和其他结合 CD46 的腺病毒的腺病毒钮结构域即Adll、Adl6、Ad21、Ad34、Ad35和Ad50的氨基酸比对；图2A图解说明在与Ad3^(-279 (消除CD46的结合),Ad35K (野生型),Ad45K++ (包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)或与抗_CD46mAb —起温育后不同时间点上HeLa 细胞表面上CD46的相对水平，其中通过流式细胞术分析CD46的水平，该水平表示为未处理细胞(N > 6)的CD46平均荧光强度的百分比，如实施例2中所描述的；图2B图解说明在用重组Ad3^((野生型)或Ad3^(++(包Asp207Gly和Thr245Ala 的双突变体)温育后第6或48小时，HeLa细胞表面上重组Ad35纤维钮蛋白的相对水平，其中利用抗_His6标签抗体，然后利用抗小鼠抗体-Alexa Fluor 488通过流式细胞术分析所述水平，其表示为未处理细胞(N > 6)的平均荧光强度的百分比，如实施例2中所描述的；图2C图解说明Ad35_GFP感染后HeLa细胞的转导水平，如通过在暴露于不断增加MOI的Ad35-GFP感染性病毒颗粒后M小时HeLa细胞的GFP平均荧光测量的，其中在用Ad35-GFP病毒颗粒感染前72小时用重组纤维钮蛋白Ad3^(-279 (消除⑶46的结合)、 Ad4^((野生型)或Ad4^(++(包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)预温育HeLa细胞，如实施例2中所描述的；图3图解说明在用磷酸缓冲盐溶液(PBS)、抗⑶46mAb或重组纤维钮蛋白 Ad35K (野生型)或Ad35K++(包含Asp207Gly和Hir245Ala的双突变体)预温育，然后用利妥昔单抗(抗⑶20mAb)或达珠单抗(抗_25mAb)温育，随后利用提供补体的正常人血清 (NHS)预温育后，活拉吉细胞(Raji cell) (CD20阳性，CD25阴性)的相对水平，作为补体依赖性细胞溶解(CDC)的量度，其中拉吉细胞活力水平表示为未处理细胞(N >6)的平均活力的百分比，如实施例2中所描述的；图4A图解说明由重组纤维钮蛋白Ad35K(野生型)或Ad35K++(包含Asp207Gly 和Thr245Ala的双突变体)预温育后产生的⑶20阳性细胞系BJAB、Farage和Mino中增强的利妥昔单抗介导的CDC，其中细胞活力水平表示为未处理细胞(N>6)的平均活力的百分比，如实施例2中所描述的；图4B图解说明在重组纤维钮蛋白Ad35K(野生型)或Ad35K++(包含Asp207Gly 和Thr245Ala的双突变体)预温育后，患有B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者的原代淋巴瘤细胞中增强的利妥昔单抗介导的CDC，其中细胞活力水平表示为未处理细胞(N > 6)的平均活力的百分比，如实施例2中所描述的；
图4C图解说明最抗Ad35K++/利妥昔单抗杀伤的细胞样品(CCL-3)具有最低百分比的⑶20+细胞和最低⑶20水平；图4D图解说明在低至25ng/ml的剂量上看到Ad3^(++对拉吉细胞的致敏效应；图5A图解说明利用Ad3^-279 (消除CD46的结合)或Ad3^++ (具有增强的CD46 结合的包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)的第一注射，然后PBS或利妥昔单抗(抗 CD20mAb)的第二注射处理的异种移植淋巴瘤小鼠的骨髓中人CD20阳性细胞的相对水平， 其中在第二注射后6小时测量CD20阳性细胞水平，其表示为骨髓中对于CD20呈阳性的细胞的百分比，如实施例3中所描述的；图5B图解说明利用Ad3^(-279 (消除CD46的结合)或Ad3^(++ (具有增强的CD46 结合的包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)的第一注射，然后PBS或利妥昔单抗(抗 ⑶20mAb)的第二注射处理的异种移植淋巴瘤小鼠(接受Raji细胞)的Kaplan-Meier存活研究的结果，其中一组小鼠在利妥昔单抗的第一注射后48小时接受Ad35K++/利妥昔单抗的第二处理，如实施例3中所描述的；图5C和5D图解说明通过Ad3^(-279 (消除CD46的结合)或Ad35K++(CD46结合增加的、包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)的第一注射，然后通过PBS或利妥昔单抗(抗-CD20mAb)的第二注射处理的异种移植淋巴瘤小鼠(接受Farage细胞)的存活研究的结果，如实施例3中所描述的；图5E图解说明的利用Farage细胞注射的，利用Ad3^(-279或Ad3^(++预处理的人异种移植小鼠模型的骨髓、淋巴结或脾中人CD20阳性细胞的百分比(如利用流式细胞测量的)，然后在施用PBS或利妥昔单抗后12小时杀死如实施例3中所描述的；图6图解说明在Ad3^(++反应性抗体存在(Ad3^(++接种的小鼠血清)或不存在 (对照小鼠血清)的情况下，在用重组纤维钮蛋白Ad35K(野生型)或Ad35K++(⑶46结合增强的、包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)预温育、然后进行利妥昔单抗处理后观察到的增强的CDC所介导之细胞杀伤效应，证明了抗Ad35K++抗体对CDC不存在抑制作用； 其中细胞存活水平表示为未处理细胞(N > 6)的平均存活的百分比，如实施例4中所描述的；图7A图解说明了在用磷酸缓冲盐溶液(PBS)、单独的利妥昔单抗、正常人血清 (NHS) >Ad35K++预处理加NHS、利妥昔单抗加NHS或Ad3^++预处理加利妥昔单抗加NHS温育后，来自人外周血单个核细胞(PBMC)(来自健康供体)的培养的活CD20阳性细胞百分比，如实施例8中所描述的；图7B图解说明在用磷酸缓冲盐溶液(PBS)、单独的利妥昔单抗、正常人血清 (NHS) >Ad35K++预处理加NHS、利妥昔单抗加NHS或Ad3^++预处理加利妥昔单抗加NHS培养的活人PBMC百分比，如实施例8中所描述的；图7C图解说明利用单独的Ad35K++、利妥昔单抗或NHS培养的原代人血管内皮细胞、角膜上皮细胞、卵巢上皮细胞或包皮成纤维细胞与PBS处理的对照细胞(N = O相比较的细胞存活百分比，如实施例8中所描述的；图8A图解说明，利用人拉吉细胞注射用Ad3^(-279或Ad35K++预处理的、然后在施用PBS或利妥昔单抗后12小时杀死的异种移植小鼠模型中骨髓或肠系膜淋巴结中人 CD20阳性细胞的百分比(如利用流式细胞术测量的(N = 5))，如实施例9中所描述；
图8B为按照实验处理方案#1处理的异种移植模型小鼠的Kaplan-Meier存活曲线图(N = 10)，所述方案包括将拉吉细胞注射至小鼠，用Ad3^(-279或Ad35K++预处理小鼠，然后施用PBS或利妥昔单抗，该曲线显示当用Ad35K++/利妥昔单抗处理小鼠时，与单独利妥昔单抗或Ad35K-279对照相比较而言，存活显著增加，如实施例9中所描述；图8C是按照实验处理方案#2 (所述实验方案包括两个循环的双Ad3^(++注射及随后利妥昔单抗注射)处理的异种移植小鼠的Kaplan-Meier存活曲线，其显示与PBS处理的对照小鼠相比较而言，接受2X (利妥昔单抗加Ad3^(++处理)的小鼠的长期存活，如实施例9中所描述的；图8D图解说明与野生型Ad35K蛋白相比较而言，Ad3^(++对利妥昔单抗疗法产生显著更强的增强作用；图9A图解说明利用Ad3^++的预温育增强了 Campath (抗CD52mAb)对Raji (CD52 阳性)细胞的CDC介导的杀伤，如实施例10中所描述的；图9B图解说明利用Ad3^(++的预温育在Campath (抗⑶52mAb)存在的情况下对 Jurkat细胞(CD52阴性)的存活没有影响，如实施例10中所描述的；图IOA图解说明利用Ad3^(++的预温育增强了赫赛汀(抗Her2/neumAb)对BT-474 乳腺癌(Herf/neu阳性)细胞的CDC介导的杀伤，如实施例10中所描述的；图IOB图解说明利用Ad3^(++的预温育在赫赛汀(抗Herf/neu mAb)存在的情况下对MDA-231细胞乳腺癌(Herf/neu阴性)的存活没有影响，如实施例10中所描述的；图IlA图解说明利用Ad3^(++的预温育增强了通过爱必妥(抗EGFRmAb)产生的 CDC介导的LOVO结肠癌(EGFR阳性)的杀伤，如实施例10中所描述的；图IlB图解说明Ad3^(++在爱必妥(抗EGFR mAb)存在的情况下对HeLa细胞 (EGFR阴性)的存活没有影响，如实施例10所描述的；

图12图解说明利用Ac^K++的预温育增强了米罗他(吉妥单抗)对AML HL60(⑶33-阳性细胞)的杀伤；图13图解说明利用Ad3^++的预温育增强Arzerra对Farage (CD20-阳性)细胞的杀伤；图14图解说明mAb增强Ad3^(++和来自不同供体(A血型和B血型)的正常人血清(NHS)增强mAb的杀伤作用图14A图解说明利用BT474细胞进行的实验的时间轴；图14B图解说明与PBS处理的细胞相比较而言活细胞的百分比；图14C图解说明利用Farage细胞和Arzerra进行的实验的时间轴。图14D，图解说明在不同NHS来源存在的情况下利用Arzerra进行的Farage细胞的杀伤；图15A举例说明在使用DNA2. 0软件进行最优化之前和之后Ad3^++的DNA序列；图15B图解说明在使用DNA2. 0软件进行最优化之前和之后Ad3^(++的氨基酸序列；图15C举例说明检查Ad35K++DNA序列中不想要的基序；图IOT举例说明在IPTG诱导后包含pEI^9-Ad3^(++的HMS174中Ad3^(++的检测；图16图解说明来自非人灵长类动物模型的数据；
图16A举例说明Ad3^(++增强利妥昔单抗的体外B细胞去除效应；图16B举例说明利用猕猴属(食蟹猴和豚尾猴)、狒狒属(橄榄狒狒(P. Anubis)) 和人的红细胞进行的Ad3^(++血凝集测定；和图17图解说明利用Ad3^(++和利妥昔单抗在针对人⑶46和⑶20为双转基因的转基因C57B1/6小鼠中进行的功效研究。详述除非在本文中专门定义，否则本文中使用的所有术语具有本发明所属领域内技术人员所理解的意义相同的意义。关于本领域的定义和术语，实施者具体地参考Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York(2001)；禾口 Ausubel 等人’ Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，New York(2002)。提供下列定义用以阐明这些术语在本说明书和权利要求B中用于描述本发明时的含义。如本文中所使用的，术语“序列同一性”或“同一性百分比”，当用于核酸分子时， 指在对齐各序列以获得最大同一性百分比并且不将任何核酸残基置换视为序列同一性的一部分后，候选核酸分子序列中与受试核酸分子序列(例如SEQ ID NO :4中所示的核酸分子序列)相同的核酸残基的百分比。为了获得最佳比对，不将缺口引入候选核酸序列。 核酸序列同一性可以以下列方式测定。使用程序BLASTN 2.1版(基于Altschul等人， Nucleic Acids Research 25 :3389-3402 (1997))将受试多核苷酸分子用于搜索核酸序列数据库，例如Genbank数据库。以无缺口模式(imga pped mode)使用该程序。使用缺省过滤(Default filtering)以除去因如 J. C. Wootton 禾口 S. Federhen，Methods in Enzymology 266 :554-571(1996)中定义的低复杂度区域而产生的序列同源性。利用BLASTN的缺省参数。如本文中所使用的，术语“同一性百分比”或“同一性百分比的”，当与用于实施本发明的多肽结合使用时，被定义为在对齐各序列以获得最大同一性百分比后，多肽序列中与指定的多肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO :3的氨基酸序列)相同的氨基酸残基的百分比。当进行比较时，为了获得最佳比对，不将缺口引入生物标志序列。可以例如以下列方式测定氨基酸序列同一性。使用BLASTP程序，将多肽的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO :3中所示的氨基酸序列)用于搜索蛋白质序列数据库，例如GenBank数据库。以无缺口模式使用该程序。使用缺省过滤以除去因低复杂度的区域而产生的序列同源性。利用BLASTP的缺省参数。如本文中所使用的，如下缩写氨基酸残基丙氨酸(Ala ；Α)、天冬酰胺(Asn ；N)、天冬氨酸(Asp ；D)、精氨酸(Arg ；R)、半胱氨酸(Cys ；C)、谷氨酸(Glu ；E)、谷氨酰胺(Gln ；Q)、 甘氨酸(Gly ；G)、组氨酸(His ；H)、异亮氨酸(lie ；I)、亮氨酸(Leu ；L)、赖氨酸(Lys ；K)、甲硫氨酸(Met ；Μ)、苯丙氨酸(Phe ；F)、脯氨酸(Pro ；P)、丝氨酸(Ser ； S)、苏氨酸(Thr ；T)、色氨酸(Trp ；W)、酪氨酸(Tyr ；Y)和缬氨酸(Val ；V)。如本文中所使用的，术语"亲和力"在蛋白质结合的背景中是指结合蛋白质之间的相互作用的强度。结合的强度通常由两个蛋白质之间更大的分子间力而产生并且导致它们之间更强的结合。
如本文中所使用的，缩写"Ad"是指腺病毒并且通常后跟表示腺病毒的血清型的数字。例如，“Ad35"是指腺病毒血清型35。如本文中所使用的，术语"纤维多肽"是指由腺病毒表达的全长纤维多肽(例如，SEQ ID NO :2)，其包含N末端尾结构域、柄结构域和C末端钮结构域。纤维多肽自发地装配成称为“纤维”的同源三聚体，其在衣壳的12个顶角中每一个的基部上位于腺病毒病毒体的外部。如本文中所使用的，术语"纤维"是指由3个单个的纤维多肽组成的同源三聚体蛋白质结构。腺病毒纤维介导与靶宿主细胞的接触和进入其中的内化。如本文中所使用的，术语“纤维钮结构域多肽”是指能够形成结合CD46的同源三聚体的纤维多肽的C末端结构域。实例是SEQ ID NO :3所示的野生型腺病毒血清型35钮结构域，其也按缩写被称为"Ad3^(多肽"。如图IB中举例说明的，纤维蛋白的C末端部分可三聚化并且形成结合CD46的纤维结构。如本文中所使用的，术语"经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽"是指包含野生型腺病毒钮结构域的变体的多肽，其中所述经修饰的多肽包含至少一个氨基酸的添加、缺失或置换或其组合，其中所述经修饰的多肽可形成能够结合CD46的同源三聚体。优选任何置换突变是保守的，因为其最低限度地破坏生物化学性质。因此，当引入突变以置换氨基酸残基时，优选用带正电荷的残基置换带正电荷的残基(H、K和R)；优选用带负电荷的残基置换带负电荷的残基(D和E)；优选用中性极性残基置换中性极性残基(C、G、N、Q、S、T和Y)； 和优选用中性非极性残基置换中性非极性残基(A、F、I、L、M、P、V和W)。在最广泛的意义上，可基于各氨基酸的侧链的化学特征将天然存在的氨基酸分组。“疏水性〃氨基酸意指 lie、Leu、Met、Phe, Trp, Tyr, Val、Ala、Cys 或 ftx)。“亲水性“氨基酸意指Gly、Asn、Gin、Ser, Thr, Asp、Glu、Lys、Arg或His。还可如下再细分氨基酸的该分组。“不带电荷的亲水性"氨基酸意指kr，Thr，ASn或Gin。“酸性"氨基酸意指Glu或Asp。“碱性〃氨基酸意指Lys，Arg或His。经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽的实例示于SEQ ID NO :5，其为具有置换 Asp207Gly和Thr245Ala的野生型腺病毒；35钮结构域序列(SEQ ID NO :3)。SEQ ID NO 5 中所示的具体的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽也以缩写"Ad3^(++多肽"表示。在本文中，通过参考全长野生型腺病毒35纤维多肽序列(SEQ ID NO 2)来描述特定氨基酸置换或替换突变的位置，首先是指出在野生型序列中发现的氨基酸残基，然后是在野生型序列中指定的氨基酸位置，然后指出突变型多肽中发现的氨基酸残基。例如，术语"Asp207Gly" 描述了野生型序列(SEQ ID NO 2)中氨基酸位置207上的置换，其中Asp被Gly替换。如本文中所使用的，术语“连续的”，在多肽的氨基酸序列的背景中，是指氨基酸残基的连续排序，如它们在参照序列中显示的那样。氨基酸的连续序列在参照序列中通常不包含添加、缺失或置换。然而，当在本文中具体指定时，氨基酸的连续序列可包含置换而不破坏序列的连续性。例如，短语"SEQ ID NO :3的连续氨基酸"是指无插入、缺失或大部分置换的氨基酸残基的连续排序，如它们在SEQ ID NO :3中显示的。然而，该短语允许包含其他描述的氨基酸置换(即，Asp207Gly、Thrf45Ala和Ile256Leu)而不破坏序列的连续性。如本文中所使用的，术语"补体来源"是指包含在诱导后引起细胞溶解和细胞死亡所必需的补体系统的一些或全部单个成分的混合物，例如人血清。
如本文中所 使用的，"膜攻击复合物"(“MAC")是指插入并且破坏细胞膜的终端5个补体成分(C5-C9)的复合物。如本文中所使用的，术语"抗体"包括来源于任何产生抗体的哺乳动物(例如， 小鼠、大鼠、兔、骆驼和灵长类动物，包括人)或者合成或重组地产生的抗体和其抗体片段， 所述抗体和其片段特异性结合目的靶或其部分。示例性抗体包括多克隆、单克隆和重组抗体；多特异性抗体(例如，双特异性抗体)；人源化抗体；鼠抗体；嵌合抗体、小鼠-人、小鼠_灵长类动物、灵长类动物_人单克隆抗体；和抗独特型抗体；并且可以是任何完整分子或其片段。如本文中所使用的，术语"抗原结合片段"是指来自全长抗体或与其相关的抗原结合区或可变区。抗体片段的举例说明性实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab‘片段、scFv片段、双价抗体、纳米抗体、线性抗体(linear antibody)、单链抗体分子，和从抗体片段形成的多特异性抗体。如本文中所使用的，"单链Fv"或"scFv"抗体片段包含抗体的Vh*八结构域，其中此类结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包含Vh与\结构域之间的多肽连接子，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。如本文中所使用的，“嵌合抗体"是一种重组蛋白，其中包含来源于非人种类 (例如，啮齿类动物)抗体的可变结构域和互补决定区，然而所述抗体分子的其余部分来源于人抗体。如本文中所使用的，“人源化抗体"是一种嵌合抗体，其包含符合移植入人抗体构架区的来源于非人免疫球蛋白的特定互补决定区的最小限度序列。人源化抗体通常是重组蛋白质，其中只有抗体互补决定区是非人来源的。如本文中所使用的，术语〃全身性递送〃和〃全身性施用〃意欲包括但不限于口服途径和胃肠外途径(包括肌内(IM)，皮下、静脉内(IV)、动脉内、吸入、舌下、含服、局部、 经皮、经鼻、经直肠、经阴道和有效地导致递送的试剂分散至期望治疗作用的一个或多个位置的其他施用途径。补体调节蛋白⑶46 (也称为膜辅因子蛋白MCP)、⑶55 (也称为衰变加速因子DAF)和⑶59 (也称为保护素)可互换地称为补体调节蛋白(CRPs)、膜结合补体抑制蛋白、补体调节剂等。大多数细胞通过一个或多个此类CRP而免受补体的破坏。⑶46和⑶55靶向C3/C5转化酶阶段上的起始途径。⑶59阻断终末补体途径并且通过在MAC装配期间结合C8和C9阻止MAC 形成(Meri等人，1990)。已例如在许多原发性肿瘤和肿瘤细胞系(Fishelson等人，Mol Immunol 40(2-4) 109-23 (2003) ；GeIderman 等人，Lab Invest 82(4) 483-93 (2002) ；Yan 等人，(2008))；自身免疫性疾病和感染性疾病中注意到CRP的过表达。CD46 ⑶46(MCP)为在有核细胞的膜上表达的1型跨膜糖蛋白。人⑶46蛋白序列在本文中提供为SEQ ID N0:14，其对应于Genbank登录号ABK81636。从其细胞外氨基酸末端开始， 人CD46蛋白具有4个串联的补体调控蛋白(CCP)模块CCPl (aa 35-88)、CCP2 (aa99_158)、 CCP3 (aal62-224)和CCP4 (aa 228-283)，随后为1或2个富含高度0-糖基化丝氨酸/苏氨酸/脯氨酸(STP)的结构域、跨膜结构域和胞质尾区。4个CCP模块形成CD46的细胞外结构域的主要部分。CCP包含3个 N联糖基化位点。STP结构域和细胞质尾结构域可各自经历选择性剪接，从而导致分子量在55至65kDa的范围内变化的CD46的4个主要人同种型 (BC1、BC2、C1 和 C2) (A. Gaggar 等人，Journal of Virology79 :7503_7513 (2005))。⑶46首先是由于其补体结合和调节性质而为人所知的(综述于M. K. Liszewski 等人，Advances in Immunology 61 :201_283 (1996)中)。在这一点上，CD46 保护细胞免受膜攻击复合物(MAC)在细胞膜上的形成。具体地，CD46结合与细胞膜相结合的补体因子 C4b和C3b，并且用作辅因子通过血浆丝氨酸蛋白酶因子I使它们的蛋白水解活性失活。该相互作用由⑶46CCP2、CCP3和CCP4结构域介导。蛋白质水解失活因阻止结合的补体因子的C3 (C3a、C3b)和C5 (C5a、C5b)转化酶活性而阻止了细胞上MAC的形成(A. Gaggar等人， Journal of Virology 79:7503-7513(2005))。此外，两种人同种型存在CD46细胞质结构域，其在调节T细胞诱导的炎症反应中具有相反作用(J.C.Marie等人，Nature Immunology 3 :659-666(2002))。除了其在免疫应答的调控中作用外，CD46还用作多种病原体包括麻疹病毒、人类疱疹病毒6型和两种类型的细菌一产脓链球菌(Str印tococcus pygogenes)和病原性淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的受体。麻疹病毒血凝素蛋白与CD46 CCPl和CCP2 相互作用。CCP2和CCP3充当人类疱疹病毒6型和链球菌的结合靶，而CCP3和STP结构域是奈瑟球菌附着所必需的(A. Gaggar 等人，Journal of Virology 79:7503-7513(2005))。 此外，已证明⑶46是一系列人腺病毒血清型的高亲和力受体(S. Tuve等人，Journal of Virology 80 12109-12120 (2006) ；A. Gaggar 等人，Nature Medicine9 :1408_1412 (2003)； 和 D. Sirena 等人，Journal of Virology78 4454-4462 (2004)) 此外，已显示⑶46是一系列人腺病毒血清型的高和力受体(S. Tuve等人， Journal of Virology 80 12109-12120 (2006) ；A. Gaggar 等 K, Nature Medicine 9 1408-1412(2003)；和 D. Sirena 等人，Journal of Virology 78:4454-4462(2004))。已显示⑶46CCP2结构域介导对腺病毒的两个血清型-Adll和Ad35的结合。具体地，CCP2结构域的天然构象对于Ad35附着是至关重要的，并且该结构域上氨基酸位置 130至135或152至156上的置换完全消除Ad35结合。已有人提出利用⑶46进行细胞附着的多种病原体就是这样做的，因为其为病原体提供了调节免疫应答的机会(R. Cattaneo, Journal of Virology 78:4385-4388(2004))。例如，已报导利用多价抗体或利用麻疹病毒在细胞表面上进行⑶46的交联可诱导以与巨胞饮(macropinocytosis)相似的过程吞噬配体，从而导致细胞表面C 46降解的伪足，这反过来保护细胞免受补体裂解 (B. Crimeen-Irwin ^A, Journal of Biological Chemistry 278 46927-46937 (2003)； J. Schneider-Schaulies 等人，Journal of Virology 70:255-263(1996))。腺病毒是非包膜双链DNA病毒。人腺病毒已被分类成6个亚组(A至F)，包括多至 51个血清型。B组腺病毒构成两个遗传簇(genetic clusters)-Bl (包括血清型Ad3，Ad7， Adl6，Ad21 和 Ad50)和 B2 (包括血清型 Adll，Adl4，Ad34 和 Ad35) (G. Wadell 等人，Annals of the New York Academy of Sciences 354 :16-42 (1980))。大多数Bl 腺病毒主要与急性呼吸道疾病相关，并且与C组腺病毒(例如，Ad5)不同，其不建立持久性(G. ffadell, Current Topics in Microbiology and Immunology 110 :191_220 (1984))。B2血清型Adllp，Ad34禾口 Ad35主要与肾和尿道的感染相关。B组血清型在腺病毒中是独特的，因为它们不使用柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)作为它们的主要附着受体。特别地，B2组I血清型，包括Adl6， Ad21，Ad35和Ad50，几乎只使用CD46作为受体；B2组II血清型，包括Ad3，Ad7p和Adl4， 使用仍未被鉴定的受体并且不使用⑶46 ；最后，B2组III，血清型Adllp，使用⑶46和该仍未被鉴定的受体二者(S. Tuve 等人，Journal of Virology 80 12109-12120 (2006)) 腺病毒病毒体是二十面体，其特征在于位于衣壳的12个顶角每一个的基部的纤维。病毒体上的纤维是由3个单个纤维多肽组成的同源三聚体结构。每一个腺病毒纤维多肽是不对称结构，其由以下所组成N末端尾(其与衣壳的五邻体基质蛋白(penton base protein)相互作用并且包含将蛋白质转运至细胞核所必需的信号)、柄(其包含多个15 个残基的重复单位)和包含用于受体结合的决定簇 的C末端钮结构域组成(J. S. Hong and J. A. Engler, Journal of Virology 70:7071-7078(1996))。来自所有组(无论是 CAR 相互作用还是B组腺病毒)的腺病毒通过纤维末端上的钮结构附着至它们的受体(A. Gaggar 等人，“CD46 Is a Cellular Receptor for Group B Adenoviruses, " Journal of Natatrual Medicines 9 :1408_1412 (2003))。纤维多肽的三聚化是腺病毒与其受体结合所必需的(J. S. Hong 和 J.A.Engler，Journal of Virology 70:7071-7078(1996) ；H. Wang 等人，Journal of Virology 81 :12785_12792 (2007))。突变型Ad2纤维的研究显示所述纤维多肽的三聚化只需要C末端钮结构域的部分和柄区域的C末端的较短的部分。似乎纤维的至少N端半部分可缺失而不影响三聚化(J. S. Hong and J. A. Engler, Journal of Virology 70 :7071-7078(1996))。已测定了 C组血清型Ad5 (结合CAR受体)(D. Xia等人，Structure 2 1259-1270(1994))、B 组血清型 Adll (结合 CD46 受体)(B. D. Persson 等人，Nature Structural&Molecular Biology 14 164-166 (2007))和 B 组血清型 Ad35 (结合 CD46 受体) (H. Wang 等人，Journal of Virology 81 12785-12792 (2007))的腺病毒钮结构域的具体结构。同源三聚体钮结构域似乎形成如三叶螺旋桨一样的结构，由此每一个叶片(即单个钮结构域)包含多个紧密堆叠的β折叠片(标记为A至J)。与⑶46结构域CCPl和CCP2 结合的重组Adll纤维钮的结晶揭示纤维钮结构域的F-G、H-I和I-J环内3个至关重要的接触区(B. D. Persson等人，Nature Structural&Molecular Biology 14:164-166(2007))。 该模型得到了证明Adll病毒与⑶46的结合可通过在Adll H-I环内引入单个氨基酸置换(Arg279Gln)而被消除的研究支持(D. J. Gustafsson 等人，Journal of Virology 80: 1897-1905(2006)[作者的修正，80 5101.])。结晶和突变研究已阐明Ad35纤维钮结合⑶46的关键区域，建立了 Ad35纤维钮结构域⑶46相互作用的模型，其中一个⑶46单位在钮同源三聚体结构内的每一对纤维钮结构域之间结合(H. Wang等人，Journal of Virology 81 12785-12792 (2007)，通过引用整体并入本文)。因此，单个纤维钮同源三聚体能够交联3个⑶46受体。已使用特异于钮蛋白的三聚体形式的抗体(abll87-100，批号134173 ；Abeam)确定了三聚化是Ad35纤维钮与可溶性 CD46 的结合所必需的，H. Wang 等人，Journal of Virology 81 12785-12792 (2007)。 如H. Wang等人中所描述的，使用诱变PCR产生Ad35纤维钮突变型多肽文库以便每个纤维钮结构域多肽产生平均1或2个氨基酸突变。对文库进行三聚化和与可溶性CD46结合的双重选择。破坏三聚化的突变都不能结合⑶46。鉴定了其中突变消除Ad35纤维钮结合⑶46 但不影响三聚化的4个残基氨基酸位置242上的Phe、氨基酸位置279上的Arg、位置282上的Ser和位置302上的Glu。此类残基位于相应于针对Adll纤维钮结构域报导的3个接触区的区域内。其他轮的筛选不覆盖其他区域，表明已找出了所有可检测的CD46关键相互作用区域。结晶学图像的迭加(Superimposition)显示Ad35与Adll之间的核心结构高度相似。此外，全部Ad35突变存在于球状Ad35纤维钮结构内的暴露的环区域内，这强调了它们在受体结合中的作用。具体地，存在于F-G和H-I环中的 接触残基位于Ad35单体的相对于I-J环中接触区域的对侧，表明一个⑶46单位结合在两个Ad35纤维钮单体之间。这获得了表示CD46分子与Ad35纤维钮单体之间以1 1相互作用的化学计量学数据的支持 (H. Wang 等人，Journal of Virology 81 12785-12792 (2007)) 因此，Ad35 纤维钮结构域 ⑶46相互作用不仅导致紧密结合，而且还交联数个⑶46分子。CD55 CD55(DAF)是一种70kDa蛋白质，在人中由CD55基因编码的(Medof ME，等人 (April 1987) “ Cloning and characterization of cDNAs encoding the complete sequence of decay-accelerating factor of human complement" . Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 84(7) :2007_11)。人 CD55 蛋白质序列相应于 Genbank 登录号 AAC60633。CD55 是调节细胞表面上的补体系统的70kDa膜蛋白。其阻止C3bBb复合物(旁路途径的C3转化酶)的装配或加速先形成的转化酶的解装配，从而阻止膜攻击复合物的形成。CD55糖蛋白广泛地分布在造血和非造血细胞中。所述蛋白与一些补体蛋白共有一些氨基酸重复基序和功能相似性。Osuka 等人，“Molecular Cloning and Characterization of Novel Splicing Variants of Human Decay-Accelerating Factor, " Genomics 88(3) 316-322，September 2006 ；已报导了许多种在几乎所有测试的组织中表达但在它们的表达模式上有变化的剪接变体。一些变体是在糖基化后分泌的⑶55的可溶性形式(M. A. Davitz 等人，“Release of Decay-Accelerating Factor(DAF)From the Cell Membrane by Phosphatidylinositol-Specific Phospholipase C (PIPLC)," Journal of Experimental Medicine 163(5) :1150_1161，May 1986)。CD55是在自身细胞的膜中固有地起作用以防止自体C3b在它们的表面上沉积的补体调节齐Ll (V. Nussenzweig 等人，“Inhibition of Complement Activation on the Surface of Cells After Incorporation of Decay-Accelerating Factor(DAF) Into Their Membranes, " Journal of Experimental Medicine 160(5) : 1558-1578, November 1984)。其用于加速生物分子C3转化酶(级联的中心扩增酶)的衰变-分角军(decay-dissociation) ο (A. Nicholson-WeIler 等人’ “Isolation of a Human Erythrocyte Membrane Glycoprotein With Decay-Accelerating Activity for C3 Convertases of the Complement System, " The Journal of Immunology 129(1) : 184-189，July 1982 ;M. K. Pangburn 等人， “Breakdown of C3 After Complement Activation !Identification of a New Fragment C3g, Using Monoclonal Antibodies, " Journal of Experimental Medicine 156(1) :205_216, July 1982 ； Τ· Fujita等人，〃 The Mechansism of Action of Decay-Accelerating Factor (DAF) :DAF Inhibits the Assembly of C3 Convertases by Dissociating C2a and Bb, " Journal of Experimental Medicine 166(5) 1221-1228, November 1987)。CD55 为 CD97 的细胞配体(J. Hamann 等人，“The Seven-Span TransmembraneReceptor CD97 Has a Cellular Ligan d(CD55, DAF), " Journal of Experimental Medicine 184(3) 1185-1189, September 1996)。阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)患者的红细胞缺乏CD55。此类患者的细胞不能附着至表达反受体(counterrec印tor)的细胞。⑶55的缺乏似乎不具有任何相关血液学异常或其他异常(D. M. Lublin 等人，“Molecular Basis of Reduced or Absent Expression of Decay-Accelerating Factor in Cromer Blood Group Phenotypes, " Blood 84(4) 1276-1282，August 1994)。阵发性睡眠性血红蛋白尿症中CD55的不存在导致患病细胞上增力口的C3b摄取(Μ· E. Medof 等人，"Amelioration of Lytic Abnormalities of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria With Decay-Accelerating Factor, " Proceeings of the National Academy of Sciences USA(PNAS)82(9) =2980-2984, May 1985)。CD55被一些柯萨奇病毒和其他肠道病毒例如艾可病毒和柯萨奇病毒B病毒用作受体(Karnauchow TM, Tolson DL, Harrison ΒΑ, Altman Ε, Lublin DM, Dimock K(August 1996). " The HeLa cell receptor for enterovirus 70 is decay-accelerating factor (CD55) “ . J. Virol. 70(8) 5143-52 ；Goodfellow 等人，J Gen Virol 81(5) 1393-401 (2000))。已在小鼠中测试了将重组可溶性⑶55_Fc作为心脏损伤的抗肠道病毒疗法(Yanagawa B, Spiller OB, Choy J, Luo H, Cheung P, Zhang HM, Goodfellow IG, Evans DJ, Suarez A, Yang D, McManus BM(January 2003). " Coxsackievirus B3_associated myocardial pathology and viral load reduced by recombinant soluble human decay-accelerating factor in mice" . Lab. Invest. 83(1) :75_85)。CD59 ⑶59为糖基化磷脂酰肌醇锚定的18_20kDa糖蛋白(GPi-锚定的)。人⑶59蛋白质序列相应于Genbank登录号CAG46523。⑶59在人外周血白细胞、红细胞和几种人细胞系上表达。所述蛋白也在内皮细胞上、周围神经纤维的施万细胞鞘、神经元、小神经胶质细胞、少突神经胶质细胞、星形细胞、室管膜细胞和某些上皮细胞例如唾液腺的腺泡细胞、支气管上皮、肾小管和鳞状上皮细胞上表达(Nose等人，〃 Tissue distribution of HRF20， a novel factor preventing the membrane attack of homologous complement, and its predominant expression on endothelial cells in vivo, " Immunology 70(2) 145-9, June 1990 ;Vedeler 等人，"The expression of CD59 in normal human nervous tissue, " Immunology 82(4) :542-7, August 1994 ;Hideshima 等人， "Expression of HRF20, a regulatory molecule of complement activation, on peripheral blood mononuclear cells, " Immunology 69(3) :396-401, March 1990)。CD59也被称为保护素或人白细胞表面抗原MICl 1，MINI，MIN2，MIN3，MSK21。该蛋白已被鉴定为HRF20 [同源限制因子(homologous restriction factor) _20kDa]和MACIF[膜攻击复合物抑制因子](MAC-IP，MAC-抑制蛋白)。其与小鼠Ly6抗原密切相关(Petranka等人，“Structure of the CD59_encoding gene further evidence of a relationship to murine lymphocyte antigen Ly-6 protein，" Proc Natl Acad Sci USA. 89 (17) :7876_9， September 1992)。人基因产生超过4种不同的mRNA分子(通过可选择的多聚腺苷酸化产生的)(Tone 等人，"Gene structure of human CD59 and demonstration that discrete mRNAs are generated by alternative polyadenylation,“ J Mol Biol 227(3) :971_6，October 1992)。其他名称为H19、MIRL[反应性裂解的膜抑制剂]，P18，1F5，16. 3A5，BRIC 229，YTH 53. 1。⑶59的功能是阻止膜攻击复合物(由激活的终末补体蛋白C5b至C9形成的)在细胞表面上的形成和保护细胞免受补体介导的细胞裂解(关于具有相似活性的因子也参见 CD55) ο Acosta 等人(“Molecular basis for a link between complement and the vascular complications of diabetes，" Proc Natl Acad Sci USA. 97 (10) 5450-5,May 2000)已报导人CD59在体内是糖基化的，并且糖基化的人CD59丧失其对膜攻击复合物的形成的抑制功能。CD59的失活增加膜攻击复合物诱导的生长因子从内皮细胞的释放。CD59在细胞膜上的表达限制了同源补体对细胞的裂解。所述蛋白可能不阻穿孔素对细胞的杀伤(Meri 等人，“Human protectin(CD59)，an 18-20-kD homologous complement restriction factor, does not restrict perforin-mediated lysis, " J Exp Med. 172(1) =367-70, July 1990)。细胞保持对由IL2活化的淋巴细胞(LAK细胞) 产生的细胞毒性攻击的敏感性，所述活化的淋巴细胞释放穿孔素(Okada等人，“HRF20， a membrane inhibit or of complement attack， does not protect cells from the cytotoxic reaction by lymphokine activated killer cells，“ Biochem Biophys Res Commun. 171(2) 717-21 September 1990)。Hahn等人(〃 Overlapping but nonidentical binding sites on CD2 for CD58 and a second ligand CD59，〃 Science 256(5065) 1805-7, June 1992)已将 CD59 鉴定为 ⑶2的生理配体。⑶2上用于⑶59和另一种⑶2配体即⑶58的结合位点有重叠但不相同。 CD58是人CD2的主要配体，从而在T细胞的细胞活化中起着共剌激作用。该效应牵涉共剌激抗原 CD58 (Menu 等人，“CD59 costimulation of T cell activation. CD58 dependence and requirement for glycosylation，〃 J. Immunol. 153(6) :2444_56，September 1994)。 人角质细胞中CD2介导的CD59剌激导致ILl- α、IL6和GM-CSF的分泌，它们可能参与角质细胞与表皮内T淋巴细胞的相互作用(Naderi等人，〃 CD2_mediated CD59 stimulation in keratinocytes results in secretion of IL—lalpha， IL—6， and GM-CSF amplications for the interaction of keratinocytes with intraepidermal T lymphocytes, “ Int J Mol Med. 3 (6) :609_14，June 1999)。已显示⑶59在许多恶性黑色素瘤细胞系中过表达(Simon等人， 〃 Identification of differentially expressed messenger RNAs in human melanocytes and melanoma cells， “ Cancer Res. 1996 Jul 1 ；56 (13) :3112_7 1996)。此类细胞还组成型地释放CD59的可溶性生物活性形式，该形式逆转其对补体介导的裂角军的作用(Brasoveanu 等人，“Melanoma cells constitutively release an anchor-positive soluble form of protectin(sCD59)that retains functional activities in homologous complement-mediated cytotoxicity, “ J Clin Invest. 100(5) 1248-55, September 1997)。这下调了人黑色素瘤细胞对同源补体的易感性(Coral 等人， 〃 Overexpression of protectin(CD59)down-modulates the susceptibility of human melanoma cells to homologous complement， “ J Cell Physiol. 185(3) :317_23，December 2000)。许多艾可病毒使用CD59作为细胞感染的细胞受体或附着蛋白(Goodfellow等人，“Echovirus infection of rhabdomyosarcoma cells is inhibited by antiserum to the complement control protein CD59, “ J Gen Virol.81 (Pt 5) 1393-401, May 2000)。CD35 ⑶35可互换地称为红细胞补体受体1 (CRl)、C3b/C4b受体和免疫粘附受体，其为人基因。人CD35蛋白序列相应于Genbank登录号NM_000651. 4 ；GI :86793108。由该基因编码的蛋白质是补体激活调节剂(RCA)家族的成员并且位于染色体1的'簇RCA'区域内。所述基因编码在红细胞、白细胞、肾小球上皮足突细胞(glomerular podocytes)和脾滤泡树突细胞上发现的单体单跨I型(single-pass type I)膜糖蛋白。Knops血型系统是位于该蛋白上的抗原的系统。所述蛋白介导与已活化补体成分的颗粒和免疫复合物的细胞结合。该蛋白表达的减少和/或其基因的突变与胆囊癌、膜毛细血管型肾小球肾炎 (mesangiocapillary glomerulonephritis)、系统性红斑狼疮和结节病相关。该基因的突变也与恶性疟原虫丛簇(rosetting)、赋予抗严重疟疾的保护作用的减少相关。已表征了编码不同同种型的选择性等位基因特异性剪接变体。其他等位基因特异性同种型包括分泌的形式已被描述，但未完全表征。在灵长类动物中，CD35用作加工和清除接受补体调理的免疫复合物的主要系统。 已显示CD35可用作补体级联的负调节剂，介导免疫粘附和吞噬作用，以及抑制经典和旁路途径。CRl分子的数量在正常个体中随红细胞的老化而减少，并且在病理状态例如全身性红斑狼疮(SLE)、HIV感染、某些溶血性贫血和其他涉及免疫复合物的病症中也减少。本发明的组合物、多肽和方法本文中提供了用于减少靶细胞上CRP活性的组合物和方法。这样的减少可通过下列方式来实现减少靶细胞上活性CD46、CD55、CD59或CD35受体的数目；减少靶细胞上活性⑶46、⑶55、⑶59或⑶35受体的密度；引起靶细胞上⑶46、⑶55、⑶59或⑶35受体的隔离；引起靶细胞上⑶46、⑶55、⑶59或⑶35受体的内化；结合靶细胞上的⑶46、⑶55、⑶59 或⑶35受体；封闭靶细胞上的⑶46、⑶55、⑶59或⑶35受体；和/或减少通过靶细胞上 ⑶46、⑶55、⑶59或⑶35受体进行的信号转导和信号。靶细胞上CRP的活性的此种调节和减少在用于治疗包括但不限于癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植相关病症的多种疗法中是有用的。本文中提供了经修饰的多肽或包含能够减少靶细胞表面上补体调节蛋白 (CRP)的活性、量、密度、隔离或内化的经修饰的多肽的组合物，其中所述经修饰的多肽包含非天然存在的序列。在一个实施方案中，本公开内容的多肽在长度上为至少5、10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、 180、200、250、300、350、400、450个或甚至至少500个氨基酸。在一个具体的实施方案中，所
述多肽在长度上为至少1 25个氨基酸。在一个相关实施方案中，本公开内容的多肽不是肽。 在另一个相关的实施方案中，本公开内容的多肽可采取三维结构。在一个实施方案中，本公开内容的多肽，在重量上为至少1000、2500、5000、7500、 10，000,15, 000,20, 000,25, 000,30,000,35,000,40,000,45,000,50,000,55,000,60,000、 65，000,70, 000,75, 000,80, 000,85, 000,90, 000,95, 000 或甚至 100，000 道尔顿。在一个实施方案中，本公开内容的多肽不是生长因子或细胞因子。
在一个实施方案中，本公开内容的多肽不结合转录调控区。在一个具体的实施方案中，所述多肽不结合基因的启动子区域、增强子区域、沉默子区域或绝缘子区域。在另一个具体的实施方案中，所述多肽不结合转录因子。在一个实施方案中，本公开内容的多肽包含天然存在的蛋白质或蛋白质结构域的至少一个突变。在另一个实施方案中，所述多肽包含与天然存在的蛋白质或蛋白质结构域至少 30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或 100% 的氨基酸序列同一性。在另一个实施方案，所述多肽不是天然存在的蛋白质或蛋白 质片段。在另一个实施方案中，本公开内容的多肽具有第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域和第二结构结合crp，其中所述第一结构域包含seq id n0:15、seq id no: 16、seq id no :17、seq id no :18、seq id no :19、seq id no :20、seq id no :21、seq id no :22、seq id no :23、seq id no :24、seq id no :25、seq id no :26、seq id no :27、seq id no 28,seq id no :29、seq id no :30或seq id no 31中所示的氨基酸序列，并且其中 x1不是天冬氨酸，x2不是苏氨酸或x3不是异亮氨酸。在一个具体的实施方案中，x1为除了天冬氨酸外的任意氨基酸，x1为甘氨酸，或x1为谷氨酸。在另一个具体的实施方案中，x2为除了苏氨酸外的任意氨基酸，x2为丙氨酸或x2为任意非极性氨基酸。在另一个具体的实施方案中，x3为除了异亮氨酸外的任意氨基酸，x3为亮氨酸或x3为任意非极性氨基酸。在一个相关实施方案中，所述第一结构域包含seq id no :19所示的氨基酸序列，其中x1不是天冬氨酸；seq id no :26，其中x2不是苏氨酸；或seq id no :31，其中x3不是异亮氨酸。在另一个相关的实施方案中，所述第二结构域包含seq id n0:19所示的氨基酸序列，其中&不是天冬氨酸；seq id no :26，其中x2不是苏氨酸；或seq id no :31，其中x3不是异亮氨酸。seq id no 15 至 seq id no 31 的描述seq id no 1.(ad35纤维钮结构域的de环的氨基酸序列)Dssgnlltx1EsDlkipl其中X1为任意氨基酸；其中&为0(野生型)；其中X1SG(突变型)；或其中X1 SE(保守置换)seq id n0:16.(ad35纤维钮结构域的de环的部分氨基酸序列)Gnlltx1Esdlk其中X1为任意氨基酸；其中&为0(野生型)；其中X1SG(突变型)；或其中X1 SE(保守置换)seq id n0:17.(ad35纤维钮结构域的de环的部分氨基酸序列)Nlltx1Esdl其中X1为任意氨基酸；
其中&为0(野生型)；其中X1SG(突变型)；或其中X1 SE(保守置换)SEQ ID NO: 18.(AD35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)LLTX1ESD其中X1为任意氨基酸；其中&为0(野生型)；其中X1SG(突变型)；或其中X1 SE(保守置换)SEQ ID NO: 19.(AD35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)LTX1ES其中X1为任意氨基酸；其中&为0(野生型)；其中X1SG(突变型)；或其中X1 SE(保守置换)SEQ ID NO 20.(AD35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)TX1E其中X1为任意氨基酸；其中&为0(野生型)；其中X1SG(突变型)；或其中X1 SE(保守置换)SEQ ID NO:21.(AD 35纤维钮结构域的DE环的部 分氨基酸序列)GNLLTX1ES其中X1为任意氨基酸；其中&为0(野生型)；其中X1SG(突变型)；或其中X1 SE(保守置换)SEQ ID NO:22.(AD 35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)GNLLTX1其中X1为任意氨基酸；其中&为0(野生型)；其中X1SG(突变型)；或其中X1 SE(保守置换)SEQ ID NO:23.
(AD35纤维钮结构域的TO环的氨基酸序列)TSETVASSKAFMPSTTAYPFNTX2TRDSENYIHGX3其中X2为任意氨 基酸；其中野生型)；其中突变型)；其中&为(，G，N，Q，S或 Y;或其中父2为卩，I，L，M，P，V或W其中X3为任意氨基酸；其中X3为1(野生型)其中X3为L (突变型)其中X3 为 A，F，M，P，V 或 WSEQ ID NO 24.(AD35纤维钮结构域的TO环的部分氨基酸序列)FNTX2TRDSENYIHGX3其中X2为任意氨基酸；其中野生型)；其中突变型)；其中&为(，G，N，Q，S或 Y;或其中父2为卩，I，L，M，P，V或W其中X3为任意氨基酸；其中X3为1(野生型)其中X3为L(突变型)其中父3为八，F，M，P，V或WSEQ ID NO:25.(AD35纤维钮结构域的TO环的部分氨基酸序列)FNTX2TRD其中X2为任意氨基酸；其中野生型)；其中父2为八(突变型)；其中X2 为 C，G，N，Q，S或 Y;或其中父2为卩，I，L，M，P，V或WSEQ ID NO 26.(AD35纤维钮结构域的TO环的部分氨基酸序列)NTX2TR其中X2为任意氨基酸；其中野生型)；其中突变型)；其中&为(，G，N，Q，S或 Y;或其中父2为卩，I，L，M，P，V或W
seq id no :27.(ad35纤维钮结构域的to环的部分氨基酸序列)tx2t其中x2为任意氨基酸；其中野生型)；其中x2sa (突变型)；其中x2 为 c，g，n，q，s或 y;或其中父2为卩，i，l，m，p，v或wseq id no 28.(ad35纤维钮结构域的to环的部分氨基酸序列)x2trdsenyihgx3其中x2为任意氨基酸；其中野生型)；其中x2sa (突变型)；其中x2 为 c，g，n，q，s或 y;或其中x2*f，i，l，m，p，v 或 w其中x3为任意氨基酸；其中x3为1(野生型)；其中x3为l(突变型)；或其中x3 为 a，f，m，p，v 或 wseq id no 29.(ad35纤维钮结构域的to环的部分氨基酸序列)Trdsenyihgx3其中x3为任意氨基酸；其中x3为1(野生型)；其中x3为l(突变型)；或其中x3 为 a，f，m，p，v 或 wseq id no 30.(ad35纤维钮结构域的to环的部分氨基酸序列)yihgx3其中x3为任意氨基酸；其中x3为1(野生型)；其中x3为l(突变型)；或其中x3 为 a，f，m，p，v 或 wseq id no 31.(ad35纤维钮结构域的to环的部分氨基酸序列)hgx3其中x3为任意氨基酸；其中x3为1(野生型)；
其中X3为L(突变型)；或其中X3SA, F，M，P，V 或 W
在另一个相关实施方案中，所述第一和第二结合域结合相同的CRP，或可选择地所述第一和第二结构域结合不同CRP。在本发明的该方面中提供的实施方案中，CRP为CD 35、 ⑶46、⑶55或⑶59。在一个具体的实施方案中，CRP为⑶46。在相关实施方案中，所述多肽弓丨起CRP至细胞中的内化或隔离；和/或所述多肽以约InM或更小的或甚至约.65nM或更小的解离常数(Kd)结合CRP。在一些实施方案中，所述多肽不是抗体或抗体片段。所述多肽可以是分离的经修饰的病毒蛋白质，例如来源于腺病毒纤维钮蛋白的多肽。来源于腺病毒的纤维钮结构域的此类多肽可以例如选自Adll、Adl6、Ad21、Ad34、Ad35和Ad50。在一个非常具体的实施方案中，所述多肽来源于Ad35纤维钮结构域，并且包含在选自Asp207、 Thr245、Ile256中的残基上的至少一个氨基酸置换或其组合；或更具体地所述氨基酸置换为Asp207Gly、Thr245Ala、Ile256Leu或其组合。在另一个实施方案中，所述多肽少于 25, 000道尔顿。本文中提供的多肽可以二聚化、三聚化、同源二聚化或同源三聚化。在一个实施方案中，所述多肽自发地二聚化、同源二聚化、三聚化或同源三聚化。二聚体、三聚体、同源二聚体或同源三聚体可具有三维结构，其中各单体包含具有结合CRP的亲和力的两个环。环之间的序列可以是可置换的并且不降低对CRP的结合。在一个相关实施方案中，本文中提供了包含非天然存在的序列的单体多肽，所述单体多肽在二聚化或三聚化之后能够结合补体调节蛋白(CRP)。可按照本领域技术人员已知的方法确定二聚体，三聚体，同源二聚体和同源三聚体形成。例如，多肽的三聚化可通过一些标准包括在蔗糖梯度中的沉降、对胰蛋白酶蛋白水解的抗性和聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率来评估(Hong 和 Engler，Journal of Virology 70:7071-7078(1996))。本发明的多肽还可包含三聚化结构域。在一个实施方案中，所述三聚化结构域来源于病毒蛋白质。例如，所述三聚化结构域为细菌噬菌体T4弹力素(fibritin)结构域或逆转录病毒纤维蛋白ο 1结构域。在一个实施方案中，所述三聚化结构域包含氨基酸序列 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEffVLLSTFL(SEQ ID NO :32)。同样地，本文中还提供了包含至少1个、2个、3个或更多个本文中描述的任何多肽的多肽复合物。在一个实施方案中，所述多肽复合物可结合两个或更多个CRP分子。CRP可以是⑶35、⑶46、⑶55或⑶59。在一个具体的实施方案中，CRP为⑶46。在一个实施方案中，本公开内容的多肽复合物在重量上为至少1000、2500、5000、 7500,10,000,15,000,20, 000,25, 000,30, 000,35, 000,40, 000,45, 000,50, 000,55, 000、 60，000,65, 000,70, 000,75, 000,80, 000,85, 000,90, 000,95, 000 或甚至 100，000 道尔顿。在一个具体的实施方案中，如实施例1中所描述的，与野生型Ad35纤维钮结构域多肽相比较，Ad35纤维钮结构域内的特定氨基酸置换(即，突变的或经修饰的Ad35纤维钮结构域多肽)增强同源三聚体纤维钮结构域多肽对CD46的结合亲和力。如实施例2中所显示的，将细胞与突变型Ad35纤维钮结构域多肽接触诱导了 CD46-Ad35纤维钮复合物的内化，从而减少细胞表面上⑶46的大量存在。此外，与对于野生型Ad35纤维钮结构域多肽所观察到的相比较，具有增强的对CD46的结合亲和力的突变型Ad35纤维钮结构域多肽 (Asp207Gly和Thr245Ala)引起细胞表面CD46的更多减少，并且这种减少持续更长时间。如实施例2和3中所显示的，表面CD46水平的短暂降低导致肿瘤细胞对由抗癌mAb产生的 CDC敏感性。这种致敏效应对于具有增强的对CD46结合的突变型Ad35纤维钮结构域多肽是最大的 ，然后是野生型Ad35纤维钮结构域多肽，其两者都具有比抗CD46mAb的致敏效应更大的效应。如实施例3中所显示的，在体内观察到该致敏作用的疗效，其中接受淋巴瘤异体移植物的小鼠在mAb治疗之前接受突变型Ad35纤维钮结构域多肽的致敏处理后，在它们的骨髓中具有更低水平的淋巴瘤细胞和延长的存活期。如实施例2中进一步所显示的，由突变型Ad35纤维钮结构域多肽诱导的CD46的表面水平的降低减少了 Ad35-GFP载体的细胞感染性。因此，突变型Ad35纤维钮结构域多肽(例如，Ad35K++)的高亲和力和它们交联几个CD46分子的能力一起导致短暂的CD46内化，这继而使淋巴瘤细胞在体外和在淋巴瘤的体内动物模型中对利妥昔单抗介导的CDC敏感。靶细胞表面上CRP活性的减少所述多肽、二聚体或三聚体与CRP的结合可根据本领域技术人员已知的方法来确定。例如，与⑶46，CD55, CD59或CD35的结合可通过简单的western印迹或Wang，H.，等人，Journal of Virology 81 12785-12792 (2007)及实施例 1 (对于 CD46)中描述的表面等离子体共振测定来确定。例如，可按照本领域技术人员公知的方法例如实施例1中描述的表面等离子体共振来定量同源三聚体对于CD46的结合亲和力。因此，在一个实施方案中，提供了包含非天然存在的氨基酸序列和至少2个能够结合CRP的结构域的经修饰多肽。所述多肽本身可结合CRP，或可二聚化，三聚化，同源二聚化或同源三聚体化以结合CRP。所述多肽还可以是可结合CRP的蛋白质复合物的部分。本文中提供了包含非天然存在的氨基酸序列的经修饰多肽、包含此类经修饰多肽的二聚体或三聚体，或者包含两个或更多个此类经修饰多肽的多肽复合物，其中所述经修饰的多肽、二聚体、三聚体或复合物可以以与未修饰的野生型或亲本多肽相比较而言更大的亲和力(例如为至少 1、1· 5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、23、25、30、35、40、45、50、75、100、 150、200、500或至少约1000倍)结合CRP。因此，CRP对所述经修饰的多肽、二聚体、三聚体或复合物的解离常数(Kd)不超过 10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、l. 5ηΜ、1ηΜ、0. 9ηΜ、0. 8ηΜ、 0. 7ηΜ、0· 65ηΜ、0· 63ηΜ、0· 6ηΜ、0· 5ηΜ、0· 4ηΜ、0· 3ηΜ、0· 25ηΜ、0· 2ηΜ、0· 15ηΜ、0· 1ηΜ、0· 05ηΜ、 0. 01ηΜ、0. 005ηΜ、0. 001ηΜ、0. 0005ηΜ或0. ΟΟΟΙηΜ。在一个具体的实施方案中，如实施例1 中所描述的，经修饰的纤维钮结构域多肽和⑶46的Kd为.63ηΜ。因此，在一个实施方案中，本文中提供的经修饰多肽能够形成三聚体或同源三聚体，所述三聚体结合在靶细胞表面上表达的CRP (⑶46、⑶55、⑶59或⑶35)并且诱导CRP至细胞内的内化。在另一个实施方案中，本文中提供的经修饰多肽能够形成三聚体或同源三聚体，所述三聚体结合在靶细胞表面上表达的CRP (⑶46、⑶55、⑶59或⑶35)并且诱导CRP 的隔离。在另一个实施方案中，本文中提供的经修饰的多肽能够形成三聚体或同源三聚体， 所述三聚体结合在靶细胞表面上表达的CRP (⑶46、⑶55、⑶59或⑶35)并且减小靶细胞上 CRP受体的密度。在另一个相关的实施方案中，本文中提供的经修饰的多肽能够形成三聚体或同源三聚体，所述三聚体结合在靶细胞表面上表达的CRP (CD46、⑶55、⑶59或⑶35)并且减少靶细胞上CRP的活性。在一个实施方案中，与经修饰的多肽一起温育或与其接触引起至少5%的细胞表面CRP水平的下降，优选至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%的细胞表面CRP水平的下降在另一个实施方案中，与经修饰的多肽一起温育或与其接触引起至少5%的细胞表面上CRP密度的减小，优选至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %或70 %的细胞表面上 CRP密度的减小。在另一个实施方案中，与经修饰的多肽一起温育或与其接触引起至少5%的细胞表面上CRP活性的减少，优选至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %或70 %的细胞表面上 CRP活性的减少。在另一个实施方案中，与经修饰的多肽一起温育或与其接触引起至少5%的细胞表面上CRP隔离或内化的增加，优选至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%的细胞表面上隔离或内化的增加。在一些实施方案中，在细胞表面CRP水平恢复至温育前水平之前，通过与经修饰的多肽温育产生的细胞表面CRP水平的下降，细胞表面上CRP密度的减小，靶细胞表面上 CRP活性的减小，CRP内化的增加，CRP隔离的增加持续至少2小时、4小时、6小时、8小时、 10小时，优选持续至少12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。在一个示例性实施方案中，包含SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的经修饰纤维钮结构域多肽包含促进CD46结合的支架基序。经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽在一个示例性实施方案中，经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽被用于减小细胞表面上CD46的活性。图IA是以SEQ ID NO :2 (其由以SEQ ID NO 1提供的cDNA编码)提供的全长野生型腺病毒血清型35 (Ad35)纤维多肽的示意图，其显示N末端尾结构域(aa 1-45)、柄结构域(aa 46-133)和C末端纤维钮(K)结构域(aa 134-323)的相对位置。先前已确定除了钮结构域(aa 134-323)外，柄结构域的C末端最末部分(aa 123-133)是纤维三聚化所必需的。Hong 和 Engler，J. Virology 70:7071-7078(1996)。因此，如图 IB 中所显示的，包含柄结构域的11氨基酸部分(aa 123-133)和完整钮结构域(aa 134-323)的野生型Ad35多肽提供为SEQ ID NO :3。本文中公开了相对于SEQ ID NO :2的第一氨基酸残基按顺序编号的氨基酸置换(图IA中显示的)。因此，存在于SEQ ID NO 3中的第一氨基酸残基相应于全长纤维多肽(SEQ ID NO 2)的氨基酸123。该编号方案也用于只包含SEQ ID NO 2的亚部分或变异的多肽序列中相应的氨基酸位置，以使序列的相对位置与全长序列相通。如本文中所使用，纤维多肽(SEQ ID NO 2)的钮结构域(SEQ ID NO 3)中的下列氨基酸置换氨基酸残基207 (其中Asp被Gly替代)、氨基酸残基245 (其中Thr被Ala替代)以及氨基酸残基256 (其中Ile被Leu替代)单个地或组合地导致经修饰Ad35纤维钮结构域多肽对于CD46的结合亲和力增强。参见表2和实施例1。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的经修饰纤维钮结构域多肽，其中所述多肽包含选自Asp207Gly、 Thr245Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合⑶46的同源三聚体。如本文中所使用的，术语"SEQ ID NO :3的连续氨基酸"是指氨基酸残基如它们出现在SEQ ID NO :3中一样的连续排序，而无插入、缺失或大多数的置换。然而，该短语允许掺入描述的氨基酸置换(即，Asp207Gly、Thr245Ala、Ile256Leu)。因此，在一个示例性实施方案中，所述多肽可包含SEQ ID NO :3的至少残基1-12 (相应于SEQ ID N0:2，氨基酸残基123-135)和一个或多个如下置换位置85上的Gly置换(相应于SEQ ID NO 2的位置207上的Asp)；位置120上的Thr置换(相应于SEQ ID NO 2的位置245上的Ala)；和 /或位置134上的Ile置换(相应于SEQ ID NO 2的位置134上的Leo)。在一些实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO :3的至少 20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200或至少300个连续氨基酸并且还包含选自 As p207Gly, Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换的至少一个置换。在一些实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO 3的至少12 至约20个连续氨基酸，包括选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换的至少一个置换。在其他实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO 3的至少20 至约50个连续氨基酸，包括至少一个选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换。在其他实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO 3的至少50 至约100个连续氨基酸，包括选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换的至少一个置换。在其他实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO :3的约100 个至全部连续氨基酸，包括选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换的至少
一个置换。在一个实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO 3的至少40 个连续氨基酸，其中所述多肽包含Asp207Gly和Thr245Ala。在一个实施方案中，所述多肽包含具有置换Asp207Gly和Thr245Ala的SEQ ID NO :3 JnSEQ ID NO :5中所示的，其由 SEQ ID NO 4所示的cDNA编码.在另一个实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO :6,SEQ ID NO :7,SEQ ID NO :8 和 SEQ ID NO :9 的至少一个。SEQ ID NO :6 为 Ad35 纤维钮结构域中 DE 环区域的连接D β折叠片与E β折叠片的氨基酸序列，并且相应于SEQ ID NO :2的从氨基酸位置199至氨基酸位置215的连续氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含含有氨基酸置换 Asp207Gly 的 SEQ ID NO 6 (DE 环)。SEQ ID NO :7为Ad35纤维钮结构域中TO环区域的连接F β折叠片与G β折叠片的氨基酸序列，并且相应于SEQ ID NO 2的从氨基酸位置223至氨基酸位置256的连续氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含含有氨基酸置换Thr245Ala和/或Ile256Leu 之一或任一个的SEQ ID NO :7 (TO环)。SEQ ID NO 8为Ad35纤维钮结构域中HI环区域的连接H β折叠片与I β折叠片的氨基酸序列，相应于SEQ ID NO :2的从氨基酸位置276至氨基酸位置287的连续氨基酸序列。SEQ ID NO :9为Ad35纤维钮结构域中IJ环区域的连接Ιβ折叠片与JP折叠片的氨基酸序列，相应于SEQ ID NO 2的从氨基酸位置297至氨基酸位置313的连续氨基酸序列。在一些实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽是包含SEQ ID N0S:5、6、7和8以形成结合CD46的结合结构域的支架多肽。
Ad35纤维钮结构域的晶体学分析已帮助证实了 TO环(SEQ ID NO 9)和HI环(SEQ ID NO 9)与IJ环(SEQ ID NO 9)中的接触区域相比较而言位于Ad35纤维钮结构域的对侧上(Wang 等人，Journal of Virology 81 12785-12792 (2007)) 这些环内的氨基酸残基对于CD46结合是非常重要的事实暗示着一个CD46单位在两个Ad35纤维钮结构域之间 (即，一个纤维钮结构域的re和HI环与另一个纤维钮结构域的IJ环之间)结合。此外， Wang等人，Journal of Virology 82 :10567_10579 (2008)和实施例1中描述的结果支持由 SEQ ID NOS :6和7包含的突变序列对于增强与⑶46的结合的重要性。晶体学分析表明DE 环(SEQ ID NO 6)中位置207上的Asp被Gly置换允许DE和HI环接近CD46。这是 因为在结合中，离氨基酸位置207最近的⑶46R-基团是疏水性Ile残基(Ilel3)。疏水性Gly 对极性Asp的置换可允许⑶46HI环移至更接近Ilel3残基。类似地，针对TO环(SEQ ID NO 7)内氨基酸位置245上的Thr引入疏水性Ala可能允许位置246上的Thr移至更接近 CD46上位置46的Tyr。因此，FG环能够移至更接近CD46。在一个实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含与SEQ ID NO :3至少 50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%同一或与其完全同一的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含突变型Ad35纤维钮结构域多肽的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含位置207上的氨基酸置换 (其中Asp被Gly替换)和位置245上的置换(其中Thr被Ala替换)，如SEQ ID NO 5所示的。钮结构域中这2个置换的组合导致突变型Ad35纤维钮结构域多肽(在本文中也称为Ad35K++)，所述多肽三聚体化以形成同源三聚体钮结构，所述结构对于结合CD46的亲和力是由野生型Ad35纤维钮结构域多肽(SEQ ID NO :3)(在本文中也称为Ad35K)形成的同源三聚体钮结构的亲和力的23. 2倍，如表2和实施例1中所显示的。根据本发明的该方面，所述经修饰的纤维钮结构域多肽能够形成可结合在细胞表面上表达的⑶46的同源三聚体钮结构。同源三聚体的形成自发地发生，并且不需要各纤维多肽的完整性。如由 Hong 和 Engler ,Journal of Virology 70 :7071_7078 (1996)(通过引用并入本文)所显示的，Ad2纤维蛋白的完整N端半部分的缺失不影响同源三聚化。因此， 至多纤维蛋白的C端半部分对于三聚化是足够的。具体地，研究人员发现C端上的小缺失 (SEQ ID NO 2 aa 123-134)破坏三聚化，然而保留残基电荷的选择的添加或置换导致相对稳定的同源三聚体。因此，纤维三聚化可利用完整的纤维钮结构域和柄的至少正好C端氨基酸(SEQ ID NO 2 aa 123-134)来实现。可根据本领域技术人员公知的方法确定同源三聚体形成。例如，纤维钮蛋白的三聚化可通过一些标准包括在蔗糖梯度中的沉降、对胰蛋白酶蛋白水解的抗性和聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率来评估(Hong和Engler，Journal of Virology 70: 7071-7078(1996))。关于电泳迁移率，纤维钮结构域同源三聚体是非常稳定的复合物，并且当在SDS-PAGE之前未煮沸样品时，其跑在与三聚体的分子量一致的分子量上。然而，在煮沸后，三聚体结构被破坏，蛋白质随后跑在与蛋白质单体一致的大小上。纤维钮蛋白的三聚化也可使用兔多克隆抗His6-HRP抗体来进行确定，如Wang，H.，等人，Journal of Virology 81 12785-12792 (2007)和实施例1中所描述的。可根据本领域技术人员熟知的方法确定同源三聚体与⑶46的结合。例如，可通过简单的 western 印变或如 Wang，H.，等人，Journal of Virology 81 12785-12792 (2007)和实施例1中描述的表面等离子体共振测定确定与CD46的结合。此外，可按照本领域技术人员公知的方法例如实施例1中描述的表面等离子体共振测定定量同源三聚体对于CD46的结合亲和力。通常可按照本领域技术人员公知的方法确定同源三聚体的形成。例如，可根据一些标准包括在蔗糖梯度中的沉降、对胰蛋白酶蛋白水解的抗性和聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率(H ong 和 Engler，Journal of Virology 70 7071-7078 (1996))来评估多肽的三聚化(Hong 和 Engler ,Journal of Virology 70:7071-7078(1996))。关于电脉迁移率，纤维钮蛋白同源三聚体是非常稳定的复合物，并且当在SDS-PAGE之前未煮沸样品时，其跑在与三聚体的分子量一致的分子量上。然而，在煮沸后，三聚体结构被破坏，蛋白质随后跑在与蛋白质单体一致的大小上。纤维钮蛋白的三聚化也可使用兔多克隆抗His6-HRP抗体来进行确定，如 Wang，H.，等人，Journal of Virology 81 12785-12792 (2007)和实施例 1 中所描述的。在一个具体的实施方案中，如实施例2中所描述的，经修饰的Ad35纤维钮结构域多肽(例如，Ad35K++)与细胞膜上表达的⑶46的结合诱导纤维钮结构域多肽/⑶46复合物至细胞内部的内化，如实施例2中所描述的。图2A举例说明了在加入20yg/ml PBS(对照)、野生型Ad35K(野生型)、Ad35K++(SEQ ID NO 5)或抗CD46mAb后在不同时间点上HeLa 细胞上⑶46的细胞表面水平。在15分钟后，与Ad35K++接触的细胞与用PBS处理的细胞相比较而言在其表面上具有约70%的⑶46水平降低。Ad35K++引起⑶46水平的最大下降以及最慢恢复至温育前水平。相反地，用抗⑶46mAb处理的细胞只显示约30%的细胞表面 ⑶46水平下降，并且更快地回复至温育前水平。图2B举例说明流式细胞术研究结果，显示细胞结合的Ad35K和Ad35K++的减少， 其表明纤维钮结构域多肽随CD46—起被内化。免疫荧光研究表明在将细胞与Ad35K和 Ad35K++接触后30分钟，在次级内体/溶酶体中检测到纤维钮结构域多肽和CD46。此外，在将细胞与纤维钮结构域多肽接触后第12小时，用Ad35K++处理的细胞主要显示细胞质CD46 染色，其强度表明CD46在溶酶体中降解。与实施例2的结果相似，对于下列淋巴瘤/白血病细胞拉吉、Jurkat, K562、Mo7e、Mino和Farage以及对于下列实体瘤细胞A549 (肺)， SK0V3 (卵巢)，HT29 (结肠)和MDA235MB细胞(乳腺)观察到Ad35K++介导的表面CD46水平的降低。与这些结果相一致，如图2C中显示的，在将细胞与Ad35纤维钮或Ad35K++接触后72小时尝试用Ad35-GFP (为了进行感染需要表面CD46)感染细胞导致相对抗性的细胞， 这表明表面CD46的不存在。对其他肿瘤细胞系例如红白血病Mo7e细胞和B淋巴瘤拉吉细胞进行的相似⑶46流式细胞术和Ad35-GFP测定产生相似的结果。鉴定能够减少靶细胞表面上CRP的活性、量或密度的分子在一个实施方案中，提供了用于筛选能够改变CRP活性的分子或化合物的方法。 所述方法包括产生候选分子文库，选择能够结合CRP的候选分子，并且确定所述分子是否改变CRP的活性。CRP可以为⑶46、⑶55、⑶59或⑶35。在一个具体的实施方案中，CRP 为CD46。在一个实施方案中，所述分子例如以InM或更小的结合亲和力结合CRP。待筛选的分子可选自蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体_药物缀合物、 siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。在一个示例性实施方案中，所述分子是小分子。在另一个示例性实施方案中，所述分子是多肽。在相关实施方案中，所述分子通过CRP至细胞内的内化或隔离，或通过减少细胞表面上CRP的量或密度来改变CRP的活性。可通过针对测试分子筛选表达CRP的细胞群或分级分离的细胞来鉴定能够改变 CRP的活性或结合CRP的分子。可使用结合至基质例如阵列或多个颗粒的已知组成的不同测试化合物分离或鉴定新型分子，所述基质可允许只使用一小部分空间充分获取大量的化学/结构空间样本。由于基质表面上每一种测试化合物的组成是已知的，因此这构成了对亲和成分(affinity element)的筛选。例如，测试化合物阵列在基质可定址位置上在指定的位置上包含测试化合物，并且可用于鉴定CRP的一种或多种结合剂。所述测试化合物基于核心序列或结构的较小变化可以是无关的或相关的。不同测试化合物可包括给定的测试化合物的变体(例如多肽同种型)、结构或组成上无关的测试化合物或其组合。
测试化合物可以是小分子、药物、类肽、多糖、有机化合物、无机化合物，聚合物、月旨质、核酸、多肽、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒、适体、蛋白质、多糖或其他化合物。测试化合物可以是天然的或合成的。测试化合物可包含基于任何数目的连接(例如，酰胺、酯、醚、硫醇、自由基加成、金属配合等)或连接的组合、树枝状结构、环状结构、空腔结构或用作在其上进行特定加成的支架的其他结构(具有多个附近连接位置)的线性或分支异聚体化合物或由其组成。可使用本领域内的标准方法将此类测试化合物点在基质上或原位合成。此外，可将测试化合物组合点样或原位合成以检测有用的相互作用例如协同结合。在一个实施方案中，所述测试化合物可以是具有已知氨基酸序列的多肽。例如，可将可溶性CRP用于载玻片上的打点阵列(spotted array)，所述阵列包含数个至1，000, 000 个具有可变氨基酸的长度的测试多肽。可将多肽通过C端连接至表面。多肽的序列可随机地从19种氨基酸(不包括半胱氨酸)产生。结合反应可包括非特异性竞争剂例如过量的用另一种染料标记的细菌蛋白质以便可测定对于每一种多肽结合靶的特异性比率。可选择具有最高特异性和结合的多肽。每一个点上多肽的身份是已知的，从而可被容易地鉴定。可通过肽阵列鉴定用作CRP活性的调节剂的抗体或合成抗体。另一个方法是使用通过抗体噬菌体展示的合成抗体产生。将抗体(例如，Fab)的M13噬菌体文库在噬菌体颗粒上展示为与外壳蛋白的融合物。每一个噬菌体颗粒展示唯一抗体并且也封装包含所述编码DNA的载体。可构建高度多样性的文库，所述文库表现为噬菌体库，其可用于结合固定抗原的抗体选择。通过固定的抗原保留结合抗原的噬菌体，并且通过洗涤除去非结合噬菌体。 可通过感染大肠杆菌(Escherichia coli)宿主扩增保留的噬菌体库，并且可将所述扩增的噬菌体库用于额外轮的选择以最终获得以结合抗原的克隆为主的群体。在该阶段，可分离单相克隆，将其经历DNA测序以解码展示的抗体的序列。通过使用噬菌体展示和本领域内已知的其他方法，可产生对于CRP的高亲和力设计者抗体。还可使用基于珠粒的测定鉴定能够结合或以其它方式调节CRP的活性的新型试剂。CRP结合剂或调节剂也可以是新型适体。可使用配体指数富集的系统进化技术 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)(SELEX)(Tuerk&Gold, Science 249 :505_510，1990 ；Ellington&Szostak, Nature 346 =818-822,1990)(例如美国专利No. 5，270，163中描述的)鉴定靶的适体。可将核酸的文库与靶CRP接触，将特异性结合至靶的此类核酸从文库中不特异性结合所述靶的其余核酸分离。扩增分离的核酸以产生配体富集的库。多轮的结合、分 离和扩增(即，选择)导致一种或多种具有所需活性的适体的鉴定。也可使用改进的方法，例如美国专利公开案No. 20090264508中描述的激光SELEX 或 deSELEX。用于减少靶细胞表面上CRP的活性、量或密度的经修饰多肽的鉴定蛋白质工程的进展和强大文库选择技术的可获得性使得能够开发许多设计用于实际上结合任何选择的蛋白质靶的变通蛋白质支架。支架文库基于展示不同结合特征的蛋白质构象基序。类型可包括α-Sandwich、α-Barrel、三螺旋束、重复蛋白质、肽结合剂、小支架、呈递限制性肽的支架(Scaffolds presenting constrained peptide), 具有固有荧光的支架(Scaffolds with intrinsic fluorescence)、具有内在酶促活性的支架、蛋白酶抑制剂和二硫键合的支架(Binz，H. K.和Pluckthun，Α.，“ Engineered Proteins as Specific Binding Reagents, " Current Opinion in Biotechnology 16 459-469(2005))。通常，可产生如上文中描述的噬菌体展示选择以产生已知蛋白质结合基序的许多变体。可选择结合特定靶的特定变异并且进行测序。在这方面，可将候选多肽的一个或多个结构域例如腺病毒钮结构域序列整合入所选择的支架基序，可利用技术例如噬菌体展示选择产生变体的文库，可使用本文的实施例中描述的示例性测定法就CRP(CD46、 ⑶655或⑶59)结合和疗效评估可选择的支架的功效。可使用对于本领域技术人员来说是常规的重组表达方法产生经修饰的多肽。例如，可以通过克隆编码具有或不具有整合入表达载体例如pQE-30Xa表达载体(Qiagen)的 His 标签的 Ad35K++(SEQ ID NO 4)的 cDNA 序列来产生包含 SEQ ID NO :5 (Ad35K++)的重组Ad35纤维钮结构域多肽。在转化入大肠杆菌后，通过加入异丙基_ α -D-硫代-半乳糖苷(IPTG)来诱导蛋白质表达，随后如由制造商所建议的纯化蛋白质，用因子Xa蛋白酶降解。在降解后，使用Xa清除树脂(Removal Resin)除去因子Xa蛋白酶。随后使用Ni-NTA 亲和层析捕获和除去已切割的His6标记的肽和未降解的His6标记的蛋白质，如制造商的说明书中所描述的。在一个实施方案中，本文中提供了鉴定可结合CRP的多肽的方法，其包括如下步骤将三维分子建模算法用于CRP的原子坐标以确定CRP的结合结构域的空间坐标；和针对CRP结合结构域的空间坐标电子筛选存储的一组候选多肽的空间坐标以鉴定可结合CRP 的多肽。在另一个实施方案中，本文中提供了鉴定可结合CRP的多肽的方法，其包括如下步骤提供CRP和候选多肽的晶体结构；将CRP和候选多肽的晶体结构叠加；和确定候选多肽与CRP之间是否存在结构基础亲和力。在另一个实施方案中，本文中提供了用于筛选能够结合CRP的高亲和力多肽的方法，所述方法包括产生候选多肽的文库；选择能够同源三聚化的候选多肽；选择能够结合 CRP的可溶形式的候选多肽；和鉴定能够以.65nM或更小的结合亲合力结合CRP的那些多肽。在另一个方面，本发明提供了编码包含突变的经修饰多肽的分离核酸分子。对于 Ad35纤维钮蛋白，所述突变选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ild245Leu。按照全长纤维多肽 (SEQ ID NO 2)的第一氨基酸残基依顺序给Ad35纤维钮结构域(SEQ ID NO 3)中的突变编号。
在一些实施方案中，提供了核酸。在一个示例性实施方案中，所述核酸还包含编码肽区域 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO 8 禾口 SEQ ID NO :9 的核苷酸序列。如上文中所描述的，这些肽片段分别相应于Ad35纤维钮结构域多肽的DE环、FG环、HI环和IJ 环。在一个实施方案中，提供了编码结合CD46的支架蛋白并且包含由间隔核酸残基分隔的编码肽区域SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8的核酸序列的核酸分子。在一个实施方案中，所述分离的核酸编码突变型Ad35纤维钮结构域 (Ad35K++Asp207Gly和Thr245Ala)，如SEQ ID NO 5中所示的。本领域技术人员理解由于遗传密码的简并性，多肽序列的 每一个氨基酸可由多个已知的三核苷酸密码子单位编码。编码每一个氨基酸的各种密码子是公知的。这样，多肽例如SEQ ID NO :5可预测地由许多核酸编码，每一个核酸在它们的序列中具有独特的变异。因此，可预期核酸的多样性通过遗传密码的简并性，全都编码SEQ ID NO :5的多肽。在另一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO :4。在另一个方面，提供了包含编码本文中描述的多肽的核酸的表达载体。表达载体是用于将基因引入靶细胞，使得细胞能够从所述基因产生大量稳定的信使RNA(mRNA)的构建体。商购可得的表达载体的非限定性实例包括PQElOO (Qiagen，Valencia，CA)，如实施例 1中使用的。表达载体包含编码多肽的核酸，所述多肽包含SEQ ID NO 3的至少12个连续氨基酸并且包括选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ild245Leu的氨基酸置换中的至少一个置换。无论载体的来源如何，本领域技术人员应理解，包含所述核酸的表达载体也具有有效地连接至所述核酸序列的表达控制序列。这样的表达控制序列可包括使得宿主细胞转录机器能够或促进其产生所述核酸的mRNA拷贝的启动子或增强子序列。具体地，所述启动子序列为细胞的RNA聚合酶提供了附着至被靶向以转录成mRNA的基因附近的DNA序列的位点。优选实施方案包括允许产生大量mRNA (这转而使得细胞翻译机器能够产生大量由所述核酸编码的多肽)的此类启动子或增强子区域。这样的表达控制序列的非限定性实例是Iac操纵子，其包含启动子和阻抑子序列。所述阻抑子序列可被乳糖类似物例如异丙基-a-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)阻遏，从而允许操纵子的启动子元件促进基因转录。本领域技术人员还应理解，所述表达载体可包含选择标记，例如赋予包含该载体和表达该抗性标记基因的细胞对抗生素试剂的抗性的基因。借助于该抗性标记基因，可将成功地接受所述载体和表达由其编码的基因的细胞与未接受所述载体的细胞分离开。此类选择标记的非限定性实例是赋予对抗生素例如卡那霉素或氨苄青霉素的抗性的基因。在另一个方面，提供了用包含编码上述多肽的核酸的载体转染的培养细胞。在这方面，当完整细胞的转录机器能接触核酸模板进行mRNA的产生时，细胞被载体成功转染。 促进载体转染进入细胞的方案在本领域内是公知的。在一个其他实施方案中，本发明包括用上述载体稳定转染的培养细胞的后代。这样的后代可包含载体的拷贝而无需经历转染方案，并且能够在表达控制序列的控制下转录载体中包含的核酸。利用用表达载体转染的培养细胞产生大量多肽的技术在本领域内是公知的。 Wang，H.，等人，Journal of Virology 81 12785-12792 (2007)(通过引用并入本文)提供了这样的技术的非限定性实例。简而言之，使用包括与靶基因克隆位点相邻的Iac操纵子的表达载体。所述载体序列还在目的基因的N端编码6个His残基重复基序。在转染入大肠杆菌细胞后，可用浓度为ImM的IPTG进行温育来诱导基因的表达。在足够长的时间例如 5小时后，收获细胞，使用缓冲液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，10mM咪唑)裂解细胞，然后在冰上用lmg/ml溶菌酶温育30分钟并且进行超声处理。通过离心除去细胞碎片，将上清液与Ni-次氮基三乙酸(NTA)琼脂糖珠在4°C下一起温育3小时。NTA琼脂糖结合His标签， 促进蛋白质纯化。收集珠粒，用50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，60mM咪唑和20%甘油洗涤。利用50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，250mM咪唑和20%甘油从NTA珠粒洗脱重组蛋白。

减少靶细胞表面上⑶46的量的方法在另一个方面，本发明提供了用于减少靶细胞表面上CD46的量的方法。所述方法包括将在其表面上表达⑶46的靶细胞与一定量的包含多种经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的组合物接触，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成同源三聚体，所述同源三聚体与从由SEQ ID N0:3(野生型Ad35纤维钮)组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言具有增强的对于CD46结合的亲和力。本文中描述了本发明的方法所使用的经修饰腺病毒35纤维钮结构域多肽。可使用常规诱变和筛选方法，例如实施例1中描述的方法， 从任何腺病毒血清型衍生本发明该方面的方法中所使用的另外的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽，所述腺病毒血清型能够通过其纤维钮结构域结合⑶46。例如，B组血清型11、16、 21、34、35和50产生可结合⑶46的纤维钮结构域多肽。此外，还涉及可充分修饰来自腺病毒纤维多肽的识别CAR受体的钮结构域以使得三聚体钮结构能够结合⑶46。可通过多种公知的方法进行CRP结合。关于CRP结合，示例性方法详细地描述于实施例1中，其中建立纤维钮结构域突变体文库，就强CD46结合筛选文库。简而言之，利用编码野生型腺病毒纤维钮结构域多肽序列作为模板实施随机诱变PCR。将扩增产物克隆进入表达载体，然后转化进入细胞，随后将所述细胞铺板于琼脂平板上。在诱导蛋白质表达后，将细菌菌落转移至滤膜，通过按顺序与可溶性⑶46、抗⑶46mAb和标记的抗Ig抗体进行温育来在所述滤膜上显现CD46结合。随后可容易地测定来自显示最强结合信号的集落的DNA，从而鉴定有利的突变。用于鉴定增强突变的其他高通量选择策略在本领域内是已知的。例如，可对大量变体(接近IO8)有效地实施噬菌体展示和肽展示选择。可将显示增强的结合能力的多肽变体物理连接至编码它们的基因，从而使得能够容易地确定有利突变的序列(论述于 Clackson, Τ. , and Wells, J. Α. , " In Vitro Selection From Protein and Peptide Libraries, “ TIbTech, 12 173-184(1994)中)。产生经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的其他方法包括利用标准技术操纵编码野生型纤维钮的DNA，例如限制性消化和基于合理设计的突变。优选多肽的人工合成也被涉及。在其中经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽来源于腺病毒血清型35的实施方案中，本文中描述的经修饰Ad35K多肽在根据本发明该方面的方法的实施中是有用的。在该方法的一些实施方案中，所述经修饰的腺病毒多肽包含SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸残基，其中所述多肽包含选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合。为了促进从单个多肽形成的同源三聚体结合CD46的能力，所述同源三聚体优选形成具有紧密堆积的β折叠片的纽结构。在一个优选实施方案中，所述多肽包含相应于β折叠片(I-J)并且保留β折叠片二级结构的序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含相应于F-G、H-I和I-J环的序列，所述序列连接β折叠片并且提供与⑶46的接触点。图IB 举例说明纤维钮结构域序列内的示例性β折叠片环结构域。在一些实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含与SEQ ID NO :6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8禾口 SEQ ID NO :9 具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%或甚至至少 80 %的同一性(例如，至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少100 %同一)的序列，并且还包含相应于SEQ ID NO 2氨基酸207 (其中Asp被Gly替换)和SEQ ID NO 2氨基酸245 (其中Thr被Ala替换)的氨基酸。整合进入所述经修饰的纤维钮结构域多肽的这些序列可以以任何顺序放置。在优选实施方案中，这些序列被展示β折叠片二级结构的多肽结构域分隔。根据本发明的该方面的方法，从所述经修饰纤维钮结构域多肽形成的同源三聚体与CD46的结合诱导CD46至细胞内的内化。检测CD46的内化的示例性方法描述于实施例 2中。根据提供的方法， 将靶细胞与包含经修饰的纤维钮结构域多肽的组合物接触，所述经修饰纤维钮结构域多肽包含的量和所接触的时间足以引起与将靶细胞与对照(例如PBS) 接触相比较而言至少40%的细胞表面上CD46水平的下降。在优选实施方案中，细胞表面上的⑶46水平的降低为至少50 %，优选60 %，更优选70 %，更优选80 %。在其他实施方案中，将靶细胞与充足的包含所述经修饰纤维钮结构域多肽的组合物接触引起与由野生型纤维钮结构域多肽或抗CD46mAb在相同条件下引起的减少相比较而言更大的细胞表面CD46 的减少。将细胞与能够减少CRP活性的多肽接触可使用在细胞表面上表达⑶46、⑶55、⑶59或⑶35 (CRP)的任何靶细胞(包括存在于哺乳动物受试者的体内或组织培养物中的靶细胞)实施所述方法。在一些实施方案中，如在本文中更详细描述的，所述靶细胞是癌细胞或肿瘤细胞。在一些实施方案中， 所述靶细胞易受附着至CD46、CD55、CD59或CD35的病原体例如腺病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、瘟病毒(pestivirus)、艾可病毒和柯萨奇病毒B病毒、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和淋病奈瑟球菌感染。本文中提供的方法减少由需要⑶46、⑶55、⑶59或⑶35 结合和附着至所述细胞的病原体产生的感染。由于靶细胞上⑶46、⑶55、⑶59或⑶35的减少的细胞表面水平，所述病原体具有减少的附着和侵入细胞的机会，因为靶细胞经历更少的病原体附着和与其的接触。在一个示例性实施方案中，如实施例2中所描述的，与未处理的对照细胞相比较， 利用重组Ad35K++(SEQ ID NO :5)预处理的细胞中⑶46的下调降低了通过Ad35_GFP病毒体进行的感染的GFP转导水平。关于在哺乳动物受试者中接触靶细胞，试剂的施用方法描述于下文中。关于接触体外培养的细胞，将试剂呈递至培养细胞的方法是常规的并且对于本领域技术人员来说是已知的。包含修饰多肽的组合物的具体量将根据本领域技术人员理解的许多因素而变化。 此类因素包括靶细胞的来源、⑶46、⑶55、⑶59或⑶35在靶细胞表面上的表达谱、细胞的生长环境和可及性、试剂的效力和稳定性以及同源三聚体多肽对于⑶46、CD55、⑶59或⑶35 的结合亲和力。
可将培养的、体内或离体细胞与范围在至少0. 001,0. 0025,0. 005,0. 0075,0. 01、 0.025,0.05,0.075,0.1,0.25,0. 5,0. 75、1、2，5、5、7，5、10、12，5,15,17. 5、20 和 25 μ g/ml 的培养基内浓度的任何经修饰多肽接触。 作为一个非限定实例，如实施例2中所描述的，可将培养的细胞与范围在0.025至 25 μ g/ml培养基之间的浓度的经修饰纤维钮结构域多肽接触。在一些实施方案中，⑶46，⑶55，⑶59或⑶35从靶细胞表面的内化在将靶细胞与包含经修饰多肽的试剂接触约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、45、60、75或长至120分钟的时间内是可检测的。在一些实施方案中，⑶46、⑶55、⑶59或⑶35的细胞表面水平仅在24小时后，优选36小时后，更优选48小时后，更优选72或甚至96小时后回复至接触前的细胞表面水平，或温育前水平。用于检测细胞表面标志例如⑶46、⑶55、⑶59或⑶35的方法在本领域内是公知的，例如流式细胞术和荧光染色。用于检测CD46的细胞表面水平的示例性方法描述于实施例3中。用于在表达CRP的靶细胞中诱导细胞溶解的方法在另一个方面，本发明提供了用于在其表面上表达⑶46、⑶55、⑶59或⑶35的靶细胞中诱导细胞溶解的方法。根据本发明的该方面的方法包括(a)将在其表面上表达 ⑶46、⑶55、CD59或⑶35的靶细胞与一定量的包含有效地减少存在于所述靶细胞表面上的 ⑶46、⑶55、⑶59或⑶35的量的多种经修饰多肽的试剂接触；和(b)将按照步骤(a)处理的靶细胞与结合靶细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段接触。已显示⑶46、⑶55、⑶59或⑶35的细胞表面表达保护细胞免受补体依赖性细胞溶解的破坏。根据本发明的该方面的方法，靶细胞上细胞表面CD46、CD55、CD59或CD3水平的降低使细胞对通过诱导补体依赖性细胞溶解(CDC)的试剂例如抗体或其片段产生的细胞溶解敏感。在一个示例性实施方案中，如实施例2中描述的和图2中举例说明的，与包含所述经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽Ad35K++(SEQ ID NO 5)的组合物接触的细胞经历达到 70%的表面⑶46水平的降低，持续至少48小时。作为⑶46，⑶55，⑶59或⑶35的补体抑制剂功能的减少的结果，靶细胞变得对结合靶细胞表面上的抗原或以其它方式诱导细胞溶解的试剂敏感。结合靶细胞或以其它方式诱导细胞裂解的试剂可被认为是第二治疗剂(能够减少CRP的活性的经修饰多肽为第一治疗剂)并且可以是本领域内已知的具有这类作用的任何试剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、 杂合抗体、抗体_药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。在其他实施方案中，第二治疗剂选自细胞毒性剂、细胞抑制剂、化疗剂、补体激活剂、CRP表达的调节剂、放射物、免疫调节剂、促细胞凋亡试剂、热激蛋白质的抑制剂、蛋白酶抑制剂、去涎酸化试剂、MMP抑制剂和PKC抑制剂。在另一个实施方案中，第二治疗剂为选自Lllb，IL4和TGFbl的CRP表达的调节剂；选自脱氧精胍菌素和geldanamyctanespimycinH-AAG的热激蛋白抑制剂；蛋白酶抑制齐[J、去涎酸化试剂或MMP抑制剂；选自他莫昔芬、enzastaurin和UBN-Ol的PKC抑制剂；化疗剂；或免疫调节剂。免疫调节剂的实例包括例如干扰素_ α、干扰素_、、GM-CSF, TLR激动剂、NOD受体激动剂、IL2、IL7、IL17、IL21、IL23、TNF、IMiD, RIG-I受体激动剂天然杀伤细胞配体/激活剂、NKG2P配体(例如MICa、MICb, RAEl和ULBP1)和天然抗体。天然细胞活化剂可以是抗CD137抗体。在一些实施方案中，所述试剂可以是凝集素或补体系统的可溶性成分例如C4b和C3b。如上文中所描述的，在一些实施方案中，诱导CDC的第二治疗剂为抗体或其片段。所述抗体可选自表1中所列的抗体，或更具体地可以是利妥昔单抗、Arzerra、米罗他、 Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁。还可修饰(例如利用Fc修饰)抗体或抗体片段以进一步增强补体激活。诱导CDC的抗体或其片段能够⑴结合细胞表面抗原例如癌症标志，和(ii)募集补体。因此，本发明的方法所使用的抗体片段通常保留抗原结合结构域和负责与补体相互作用的区域，所述结构域和区域在本领域内是已知的。例如，已显示对于CDC的诱导比较重要的抗体的区域包括Fc区域的特定部分，尤其是铰链结构域(Dall' AcqUa，W.，等人，The Journal of Immunology 177 1129-1138 (2006))和 / 或 CH2 结构域(Idusogie, Ε· E.，等人，The Journal of Immunology 166:2571-2575(2001))。作为另外的实例，抗体工程研究已鉴定了 Fc区域的CH2结构域中的增强利妥昔单抗结合Clq和介导CDC的能力的残基 (Wang, S. Y.，等人，Expert Opin. Biol. Ther. 8 :759_768 (2008))在一个实施方案中，靶细胞可与能结合所述细胞并且诱导补体依赖性细胞溶解的试剂例如抗体连续接触，包括在将所述细胞与包含经修饰多肽的组合物接触之前和之后。 在另一个实施方案中，可在一个同时的步骤中实施所述方法。在这一点上，可将包含经修饰多肽的组合物和结合靶细胞并且诱导补体依赖性细胞溶解的试剂(例如，抗体)基本上同时与靶细胞接触。在另一个实施方案中，将靶细胞与试剂接触，所述试剂在将靶细胞与包含经修饰多肽的组合物接触(步骤a)后约10分钟至72小时内结合靶细胞并且诱导补体依赖性细胞溶解(步骤b)。例如，可在实施步骤a后约15分钟至48小时，优选在步骤a后约 15分钟至12小时实施步骤b。在一个优选实施方案中，在步骤a后约8小时实施步骤b。细胞溶解可通过引入上文中描述的抗体依赖性补体途径发生。在优选实施方案中，所述试剂是单克隆抗体(mAb)，例如表1的示例性抗体，已知其特异性结合靶细胞上的细胞表面标志，例如细胞的表面疾病标志。根据本文中提供的方法，由抗体依赖性补体信号转导激活的肿瘤细胞溶解还可牵涉效应细胞的参与。除了起始细胞表面上MAC形成外，补体信号转导级联的诱导也产生在募集能够诱导癌细胞的细胞介导细胞溶解的效应细胞中有用的趋化试剂。具体地，补体成分C3a和C5a的释放导致将细胞例如NK细胞引入肿瘤的梯度。此外，沉积在肿瘤细胞表面上的iC3b分子激活效应细胞表面上的补体受体3 (CR3)， 并且在酵母细胞壁α -葡聚糖存在的情况下诱导CR3依赖性细胞毒性，从而提供激活抗肿瘤细胞的细胞毒性机制的潜在方法，所述细胞毒性机制对于酵母和真菌通常是保守的 (Adams, G. P.禾口 Weiner，L. Μ· ，Nature Biotechnology 23:1147—1157(2005))。根据本发明的该方面的方法，靶细胞的直接环境包含足以在诱导后引起细胞溶解的补体效应子系统的全部必需成分。如本文中所使用的术语"补体源"是指包含在诱导后引起细胞溶解和细胞死亡所必需的补体系统的一些或全部各成分的混合物。补体系统成分在本领域内是已知的，所述成分中的一些描述于本文中。此外，众所周知，从脊椎动物例如人或其他哺乳动物收获的血清是所有补体的成分的来源。在一些实施方案中，所述方法包括为靶细胞提供补体源，例如先前收获的血清。可按照本领域内已知的方法例如通过注射或输注补体成分来施用补体系统的成分。在其他实施方案中，可任选地将血浆与存在于组织培养基中的靶细胞接触，如实施例3中所举例说明的。在其他实施方案中，补体成分由所述细胞存在于其中的生物体提供。在其中由本方法的使用者给靶细胞提供补体源的实施方案中，基于具体情况，提供补体源的时间安排可以是可变的。在一些实施方案中，可在实施步骤b之前将靶细胞与补体源接触。在其他实施方案中，可在实施步骤b的同时将靶细胞与补体源接触。在其他实施方案方案中，可在实施步骤b之后将靶细胞与补体 源接触。在优选实施方案中，可在步骤b实施的30分钟内为靶细胞提供补体源。在一些实施方案中，所述方法使靶细胞对由特异性结合异常增殖细胞例如癌细胞的细胞表面标志的mAb诱导的CDC敏感。在本说明书中，术语癌细胞的使用是指展示失调或不受控制的细胞分裂并且在本领域内已被详尽表征的细胞。癌细胞可以是存在于动物受试者的体内的细胞，或可选择地，是人工培养物中的在适当培养条件下展示无限细胞分裂能力的转化细胞。潜在的癌细胞类型包括癌(来源于上皮细胞)、肉瘤(来源于结缔组织或间充质细胞)、淋巴瘤和白血病(来源于造血细胞)、母细胞瘤(其来源于未成熟细胞或胚胎细胞)或胚细胞癌。在其他实施方案中，所述靶细胞是癌症的体外模型， 其对于本领域技术人员来说显然是已知的。非限定性实例包括Raji-Burkitt' s淋巴 ^MMM (Lapalombella, R. A, “ A Novel Raji-Burkitt' s Lymphoma Model for Preclinical and Mechanistic Evaluation of CD52-Targeted Immunotherapeutic Agents, “ Clinical Cancer Research 14 :569_578 (2008))、BJAB 细胞(EBV-阴性 Burkitt' s淋巴瘤)、Farage细胞(非何杰金氏B细胞淋巴瘤)、Mino细胞(套细胞淋巴瘤)、Jurkat 细胞、562、HeLa (宫颈)、A549 (肺)、SK0V3 (卵巢)、HT29 (结肠)、MDA265MB (乳腺)。增强抗癌mAb在哺乳动物受试者中的抗肿瘤效应的方法FDA批准的用于恶性血液病的mAb中包括利妥昔单抗(也称为美罗华和利妥昔单抗)，其目前用于治疗B细胞非何杰金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、毛细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病。利妥昔单抗是抗⑶20的人源化未缀合IgGlmAb。⑶20在正常B淋巴细胞和B细胞淋巴瘤的表面上表达，但不在造血干细胞、祖B细胞和浆细胞上表达。体外和体内研究已显示利妥昔单抗可有效地在B细胞淋巴瘤细胞上诱导⑶C (Di Gaetano, N.，等人，J. Immunol 171 1581-1587(2003) ；Golay, J.，等人，Haematologica 91 :176_183 (2006) ；Reff, Μ. E.， 等人，Blood 83 435-445(1994) ；Bellosillo, B.，等人，Blood 98 :2771_2777 (2001)；以及，van der Kolk, L. Ε.，等人，British Journal of Haematology 115 :807_811 (2001))。 利妥昔单抗通过CD20与淋巴瘤细胞的结合导致经典补体途径的激活，从而最终导致 MAC 的形成(Di Gaetano，N.，等人，J. Immunol 171 1581-1587 (2003)) 对于奥法木单 ^L (ofatumumab, iii 禾尔力 HuMax CD20 ；Arzerra) ( CD20mAb) (Castillo, J. ， Winer, Ε.， &Quesenberry，P.，Experimental Hematology 36 :755_768 (2008))、用于治疗慢性淋巴细胞白血病的阿仓珠单抗(抗 CD52mAb) (Zent, C. S.，等人，Leukemia Research (2008))、 用于治疗急性髓样白血病(AML)的吉姆单抗(抗CD 33mAb) (Castillo, J.，Winer, Ε.， &Quesenberry，P. ,Experimental Hematology 36:755—768(2008))已报导了 CDC在月中瘤细胞杀伤中的相似作用。还可施用利妥昔单抗以治疗自身免疫性疾病，例如包括但不限于自身免疫性溶血性贫血、类风湿关节炎和自身免疫性神经学障碍(德维克病、重症肌无力、自身免疫性神经病(autoimmune neuropathies)禾口炎性肌病)。在另一个方面，本发明提供了增强抗癌单克隆抗体在有此需要的哺乳动物受试者中的抗肿瘤效应的方法。根据本发明的该方面的方法包括(a)给所述哺乳动物受试者施用一定量的包含多种有效地减少靶肿瘤细胞表面上存在的⑶46，⑶55，⑶59或⑶35的量的经修饰多肽的组合物至少一次；和(b)给所述受试者施用治疗有效量的抗癌抗体至少一次， 其中所述抗癌抗体结合靶肿瘤细胞上表达的非⑶46，⑶55，⑶59或⑶35细胞表面抗原。如本文中所描述的，包含多种经修饰多肽的试剂使靶细胞对由特异性结合靶细胞 (例如存在于哺乳动物受试者例如人的体内的癌细胞)的细胞表面标志的HiAb诱导的CDC 敏感。潜在的癌症类型包括癌(来源于上皮细胞)、肉瘤(来源于结缔组织或间充质细胞)、 淋巴瘤和白血病(来源于造血细胞)、母细胞瘤(其来源于未成熟细胞或胚胎细胞)或胚细胞癌。

在一些实施方案中，所述mAb特异性结合恶性血液病例如白血病(包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、 慢性粒细胞白血病(CML)和毛细胞白血病)的细胞表面标志。CLL亚型包括前体B急性淋巴细胞白血病(precursor B acute lymphoblastic leukemia)、前体T急性淋巴细胞白血病(precursor T acute lymphoblastic leukemia)、Burkitt‘ s 白血病禾口急性双表型白血病。CLL亚型包括B细胞幼淋巴细胞白血病。AML亚型包括急性早幼粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病和急性巨核母细胞白血病。CML亚型包括慢性单核细胞白血病。其他恶性血液病除了非何杰金淋巴瘤以外还包括多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、何杰金氏淋巴瘤，包括套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、NK/T淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、粘膜相关性淋巴样组织(mucosa-associated lymphoid tissue) (MALT)淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述mAb特异性结合实体瘤例如乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌，前列腺癌，卵巢癌，子宫癌，宫颈癌，肾癌，胰腺癌，肝癌，脑癌，头颈癌，鼻咽癌和食管癌的细胞表面标志。在一些实施方案中，所述HiAb特异性结合肉瘤例如平滑肌肉瘤，纤维肉瘤，横纹肌肉瘤和尤因肉瘤的细胞表面标志。在一些实施方案中，所述mAb特异性结合血液肿瘤例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤的细胞表面标志。癌细胞与它们所源自的细胞相比较而言通常高度异常。通常地，癌细胞展示许多对于所述细胞类型、细胞的环境是不适当的或在生物体发育的其他阶段中正常存在的罕见细胞表面抗原。可选择地，细胞表面蛋白表达的水平在癌细胞中可能发生了改变。因此， 存在可独特地鉴定来自正常细胞的癌细胞的不同细胞表面标志。按照提供的方法，细胞疾病的标志包括癌细胞的标志。癌细胞标志可包括病毒相关蛋白、以增加的水平在癌细胞上表达的已改变自身肿瘤抗原、只在癌细胞上表达的肿瘤特异性抗原(包括自身分子的突变形式)。在优选实施方案中，所述标志的表达水平在癌细胞中高于在正常细胞中，并且更优选，所述标记几乎只在癌细胞中表达。癌症靶细胞的有用的细胞表面标志的非限定性实例包括CD3、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD35、CD37、CD38、CD40、CD44、 CD52、CD70、CD80、CD133、CD200、表皮生长因子受体1 (EGFR)、表皮生长因子受体2 (Her2/ neu)、人乳脂肪球蛋白l(humanmilk fat globule 1，HMFG1)、白细胞介素2受体(IL2R)、粘蛋白1和血管内皮生长因 子。单克隆抗体已作为有前景的抗癌治疗剂的种类出现。归功于它们特异性结合癌细胞特征性的标志的能力，HiAb使得能够将患者自己的免疫系统靶向癌细胞的破坏。在本文中提供的方法中有用的单克隆抗体通常被修饰以包含人Fc结构域，从而减少抗体的免疫原性和增强募集人免疫效应子系统的能力。预期当此类方法用于非人受试者时，可修饰抗体的Fc结构域以匹配受试者。可将人抗体的不同同种型用作抗癌治疗性mAb的骨架。通常，IgM是用于补体激活的最有效同种型，然而其尚未被广泛用于临床肿瘤学中， 因为其不容易从血管结构外渗(Adams，G. P.和Weiner，L. M.，“ Monoclonal Antibody Therapy of Cancer, “ Nature Biotechnology 23:1147-1157(2005))。因此，IgM 同种型的适用范围可能更加局限于恶性血液病。IgGl和IgG3同种型在导向⑶C上都非常有效。 有用的抗癌mAb抗体的非限定性实例列于表1中，并且进一步描述于Campoli，Μ.，等人， Principles&Practice of Oncology 23(1&2) 1-19 (2009)(通过引用并入本文)中。表1 用于癌症治疗的肿瘤_抗原特异性mAb
权利要求
1.包含能够减少靶细胞表面上补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度的经修饰多肽的组合物，其中所述多肽包含非天然存在的氨基酸序列。
2.权利要求1的组合物，其中所述多肽引起CRP的内化或隔离。
3.权利要求1的组合物，其中所述多肽结合CRP。
4.权利要求3的组合物，其中所述多肽以InM或更小的解离常数(Kd)结合CRP。
5.权利要求4的组合物，其中所述多肽以0.65nM或更小的解离常数(Kd)结合CRP。
6.权利要求1的组合物，其中所述多肽是分离的病毒蛋白质。
7.权利要求6的组合物，其中所述多肽来源于腺病毒纤维钮蛋白。
8.权利要求7的组合物，其中所述多肽来源于Ad35纤维钮蛋白。
9.权利要求7的组合物，其中所述多肽来源于在选自Asp207、Thr245,Ile256和其组合中的残基处包含至少一个氨基酸置换的Ad35纤维钮蛋白。
10.权利要求9的组合物，其中所述氨基酸置换为Asp207Gly、Thr245Ala,Ile256Leu 或其组合。
11.权利要求1的组合物，其中所述多肽小于25，000道尔顿。
12.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述多肽的二聚体形式。
13.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述多肽的三聚体形式。
14.权利要求13的组合物，其中所述组合物包含所述多肽的同源三聚体形式。
15.权利要求1的组合物，其中所述CRP为跨膜蛋白。
16.权利要求1的组合物，其中所述CRP为GPI连接蛋白。
17.权利要求1的组合物，其中CRP为⑶46、⑶55、CD59或⑶35。
18.权利要求17的组合物，其中所述CRP为⑶46。
19.权利要求18的组合物，其中所述多肽结合⑶46。
20.权利要求1的组合物，其中所述组合物还能够使靶细胞对抗体介导的补体依赖性细胞溶解敏感。
21.权利要求1的组合物，其中所述靶细胞为肿瘤细胞。
22.权利要求21的组合物，其中所述肿瘤细胞选自获自癌的细胞、获自肉瘤的细胞、获自母细胞瘤的细胞、获自胚细胞癌的细胞和获自血液肿瘤的细胞。
23.权利要求1的组合物，其中所述靶细胞选自原发性淋巴瘤细胞、Raji-Burkitt's 淋巴瘤细胞、BJAB细胞、Farage细胞、BT474细胞、HT18M细胞、LoVo细胞、Η ^9细胞、Mino 细胞、Jurkat细胞、Κ562细胞、HeLa细胞、Α549细胞、SK0V3细胞、Η ^9细胞和MDA235MB细胞。
24.权利要求1的组合物，其中所述靶细胞包含实体瘤的细胞表面标志。
25.权利要求对的组合物，其中所述实体瘤是乳腺、肺、结肠直肠系统、胃、前列腺、卵巢、子宫、宫颈、肾、胰腺、肝、脑、头和颈、鼻咽系统或食管的肿瘤。
26.权利要求1的组合物，其中所述靶细胞包含肉瘤的细胞表面标志。
27.权利要求沈的组合物，其中所述肉瘤是平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤或尤因肉瘤。
28.权利要求1的组合物，其中所述靶细胞包含血液肿瘤的细胞表面标志。
29.权利要求观的组合物，其中所述血液肿瘤是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
30.权利要求1的组合物，其中所述靶细胞为B细胞。
31.权利要求30的组合物，其中所述靶细胞为正常B细胞。
32.权利要求30的组合物，其中所述靶细胞为恶性B细胞。
33.权利要求1的组合物，其中靶细胞表达选自下述的一个或多个细胞标志CD3、 CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD35、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD70、 CD80、CD133、CD200、表皮生长因子受体1 (EGFR)、表皮生长因子受体2 (Her2/neu)、人乳脂肪球蛋白(HMFGl)、白细胞介素2受体(IL2R)、粘蛋白1和血管内皮生长因子。
34.权利要求33的组合物，其中所述靶细胞表达⑶20。
35.权利要求1的组合物，其中所述多肽还能够增强靶细胞表面上的补体激活。
36.权利要求1的组合物，其中所述多肽还能够增加靶细胞表面上膜攻击复合物(MAC) 的装配。
37.权利要求1的组合物，其中当与基线或未修饰的多肽相比较时，所述多肽能够减少补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度至少25%。
38.权利要求1的组合物，其中所述多肽能够减少补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度至少24小时。
39.权利要求1的组合物，其中所述多肽在约25ng/ml或更低的浓度具有活性。
40.权利要求1的组合物，其中所述多肽不是抗体或抗体片段。
41.权利要求1的组合物，其中所述多肽不是生长因子或细胞因子。
42.权利要求1的组合物，其中所述多肽不结合基因的转录调控区。
43.权利要求42的组合物，其中所述多肽不结合基因的启动子区域、增强子区域、沉默子区域或绝缘子区域。
44.权利要求1的组合物，其中所述多肽不结合转录因子。
45.权利要求1的组合物，其中所述多肽在长度上为至少120个氨基酸。
46.权利要求1的组合物，其中所述多肽包含天然存在的蛋白质或蛋白质结构域的至少一个突变。
47.权利要求46的组合物，其中所述多肽与天然存在的蛋白质或蛋白质结构域有至少 90%的氨基酸序列同源性。
48.权利要求1的组合物，其中所述多肽不是天然存在的蛋白质或蛋白质片段。
49.权利要求1的组合物，其中所述多肽被进一步修饰以减少免疫原性。
50.权利要求49的组合物，其中所述多肽的免疫原性通过将所述多肽偶联至烷基-PEG，通过表位去免疫化作用，通过共施用免疫抑制剂，通过加入耐受方案，通过糖基化所述多肽或通过共施用增强补体激活的试剂来进行减弱。
51.权利要求1的组合物，其中所述组合物包括经修饰的病毒。
52.权利要求1的组合物，其中所述组合物包括经修饰CRP-相互作用微生物。
53.权利要求52的组合物，其中所述生物为奈瑟球菌属或链球菌菌株。
54.权利要求51的组合物，其中所述病毒能够与CRP相互作用。
55.权利要求M的组合物，其中所述病毒选自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、麻疹病毒(Edmonston株)、人疱疹病毒6、牛病毒性腹泻病毒和人柯萨奇病毒。
56.权利要求1的组合物，其中所述组合物不包括腺病毒。
57.权利要求55的组合物，其中所述组合物不包括腺病毒。
58.权利要求55的组合物，其中所述病毒为选自Adll、Adl6、Ad21、Ad34、Ad35和Ad50 中的腺病毒血清型。
59.权利要求58的组合物，其中所述腺病毒为Ad35。
60.权利要求59的组合物，其中所述Ad35腺病毒包含突变型纤维钮蛋白。
61.具有第一结构域和第二结构域的分离的多肽，其中所述第一和第二结构域结合 CRP，其中所述第一结构域包含 SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 30或SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列，其中\不是天冬氨酸，X2不是苏氨酸或1、 不是异亮氨酸。
62.权利要求61的多肽，其中&为甘氨酸。
63.权利要求61的多肽，其中&为谷氨酸。
64.权利要求61的多肽，其中&为丙氨酸。
65.权利要求61的多肽，其中)(2为任意非极性氨基酸。
66.权利要求61的多肽，其中&为亮氨酸。
67.权利要求61的多肽，其中)(3为任意非极性氨基酸。
68.权利要求61的多肽，其中所述第一结构域包含SEQID NO 19中所示的氨基酸序列，其中X1F是天冬氨酸；SEQ ID NO :26，其中)(2不为苏氨酸；或SEQ ID N0:31，其中)(3不为异亮氨酸。
69.权利要求61的多肽，其中所述第二结构域包含SEQID NO 19中所示的氨基酸序列，其中X1F是天冬氨酸；SEQ ID NO :26，其中)(2不是苏氨酸；或SEQ ID N0:31，其中)(3不是异亮氨酸。
70.权利要求61的多肽，其中所述第一和第二结构域结合相同的CRP。
71.权利要求61的多肽，其中所述第一和第二结构域结合不同的CRP。
72.权利要求61的多肽，其中所述CRP为⑶35、⑶46、CD55或⑶59.
73.权利要求61的多肽，其中所述CRP为⑶46.
74.权利要求61的多肽，其中所述多肽二聚化。
75.权利要求61的多肽，其中所述多肽三聚化。
76.权利要求75的多肽，其中所述多肽同源三聚化。
77.权利要求61的多肽，其中所述多肽还包含三聚化结构域。
78.权利要求77的多肽，其中所述三聚化结构域来源于病毒蛋白质。
79.权利要求78的多肽，其中所述三聚化结构域为细菌噬菌体T4弹力素结构域或呼肠孤病毒纤维蛋白ο 1结构域。
80.权利要求77的多肽，其中所述三聚化结构域包含SEQID NO :32中所示的氨基酸序列。
81.包含权利要求53-80所述多肽中任一种的多肽复合物。
82.权利要求81的多肽复合物，其中所述复合物包含2个或更多个权利要求61-80中所述多肽。
83.权利要求80的多肽复合物，其中所述复合物结合2个或更多个CRP分子。
84.权利要求83的多肽复合物，其中所述CRP为⑶35、⑶46、⑶55或⑶59。
85.权利要求84的多肽复合物，其中所述CRP为⑶46。
86.权利要求76的多肽，其中所述多肽自发地同源三聚化。
87.权利要求86的多肽，其中所述同源三聚体具有三维结构，并且同源三聚体的每一多肽包含2个环，其中每一个环结合CRP。
88.权利要求87的多肽，其中环之间的氨基酸序列是可置换的并且基本上不改变对 CRP的结合。
89.权利要求61的多肽，其中所述多肽引起CRP至细胞内的内化或隔离。
90.权利要求61的多肽，其中所述多肽以约InM或更小的解离常数(Kd)结合CRP。
91.权利要求61的多肽，其中所述多肽以0.65nM或更小的解离常数(Kd)结合CRP。
92.权利要求61的多肽，其中所述多肽不是抗体或抗体片段。
93.权利要求61的多肽，其中所述多肽是分离的、经修饰的病毒蛋白。
94.权利要求93的多肽，其中所述多肽衍生自腺病毒纤维钮蛋白。
95.权利要求94的多肽，其中所述多肽衍生自选自Adll、Adl6、Ad21、Ad34、Ad35和 Ad50之中的腺病毒的纤维钮结构域。
96.权利要求95的多肽，其中所述多肽衍生自在选自Asp207、Thr245,Ile256和其组合之中的残基处包含至少一个氨基酸置换的Ad35纤维钮结构域。
97.权利要求96的多肽，其中所述氨基酸置换为Asp207Gly、Thrf45Ala、Ile256Leu或其组合。
98.权利要求61的多肽，其中所述多肽小于25，000道尔顿。
99.包含治疗有效量的权利要求1至98中任一项所述多肽的药物组合物。
100.权利要求99的药物组合物，其中还包含第二治疗剂。
101.权利要求100的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。
102.权利要求100的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自细胞毒性剂、细胞抑制剂、 化疗剂、补体激活剂、CRP表达的调节剂、放射物、免疫调节剂、促细胞凋亡试剂、热激蛋白质的抑制剂、蛋白酶抑制剂、去涎酸化试剂、MMP抑制剂和PKC抑制剂。
103.权利要求101的药物组合物，其中第二治疗剂为抗体。
104.权利要求103的药物组合物，其中所述抗体选自表1中所列的那些抗体。
105.权利要求104的药物组合物，其中所述抗体选自利妥昔单抗、Arzerra、爱必妥、米罗他、Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁。
106.权利要求101的药物组合物，其中所述抗体或抗体片段被修饰以进一步增强补体激活。
107.权利要求106的药物组合物，其中所述修饰为Fc修饰。
108.权利要求102的药物组合物，其中所述第二治疗剂为选自Lllb、IL4和TGFbl之中的CRP表达调节剂。
109.权利要求102的药物组合物，其中所述第二治疗剂为选自脱氧精胍菌素和 geldanamyctanespimycin 17-AAG 的热激蛋白的抑制剂。
110.权利要求102的药物组合物，其中所述第二治疗剂为蛋白酶抑制剂、脱唾液酸化试剂或MMP抑制剂。
111.权利要求102的药物组合物，其中所述第二治疗剂为选自他莫昔芬、enzastaurin 和UBN-Ol的PKC抑制剂。
112.权利要求102的组合物，其中所述第二治疗剂为化学治疗剂。
113.权利要求102的药物组合物，其中第二治疗剂为免疫调节剂。
114.权利要求113的药物组合物，其中所述调节剂选自干扰素-α，干扰素-Υ， GM-CSF、TLR 激动剂、NOD 受体激动剂，IL2、IL7、IL17、IL21、IL23、TNF、IMiD, RIG-I 受体激动剂、天然杀伤细胞配体、天然杀伤细胞活化剂、NKG2P配体和天然抗体。
115.权利要求114的药物组合物，其中所述天然杀伤细胞活化剂为抗CD137抗体。
116.权利要求114的药物组合物，其中所述NKG2P配体选自MICa、MICb、RAE1和ULBP1。
117.包括将在其表面上表达CRP的靶细胞与权利要求1至98中任一项所述多肽接触的方法。
118.权利要求117的方法，其中将所述多肽与靶细胞直接接触。
119.权利要求117的方法，其中所述多肽不是病毒载体的部分。
120.权利要求117的方法，其中所述接触增加了靶细胞对利用抗体进行的治疗的易感性。
121.权利要求117的方法，其中所述接触增强抗体介导的补体依赖性细胞溶解。
122.权利要求120的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
123.权利要求120的方法，其中所述抗体选自表1中所列的抗体。
124.权利要求120的方法，其中所述抗体选自利妥昔单抗、Arzerra、爱必妥、米罗他、 Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁。
125.权利要求117的方法，其中所述接触是体外接触。
126.权利要求117的方法，其中所述接触是体内接触。
127.权利要求117的方法，其中所述接触是离体接触。
128.权利要求117的方法，其中所述CRP为⑶46、⑶55、⑶59或⑶35。
129.权利要求117的方法，其中所述CRP为⑶46。
130.权利要求117的方法，其还包括将靶细胞与第二治疗剂接触。
131.权利要求117的方法，其中所述靶细胞为肿瘤细胞。
132.权利要求131的方法，其中所述肿瘤细胞选自获自癌的细胞、获自肉瘤的细胞、获自母细胞瘤的细胞、获自胚细胞癌的细胞和获自血液肿瘤的细胞。
133.权利要求130的方法，其中与第二治疗剂的接触在与权利要求1至98中任一项所述多肽接触的同时、之前或之后发生。
134.权利要求130的方法，其中第二治疗剂选自细胞毒性剂、细胞抑制剂、化疗剂、补体激活剂、放射物、免疫调节剂、促细胞凋亡试剂、蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。
135.权利要求134的方法，其中所述第二治疗剂为抗体。
136.权利要求135的方法，其中所述抗体选自表1中所列的抗体。
137.权利要求136的方法，其中所述抗体选自利妥昔单抗、Arzerra、爱必妥、米罗他、Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁。
138.权利要求137的方法，其中所述抗体或抗体片段被修饰以进一步增强补体激活。
139.权利要求138的方法，其中所述修饰为Fc修饰。
140.权利要求130的方法，其中所述第二治疗剂是化疗剂。
141.权利要求130的方法，其中第二治疗剂是免疫调节剂。
142.权利要求141的方法，其中所述免疫调节剂选自干扰素-α、干扰素-Y、GM_CSF、 TLR 激动剂、NOD 受体激动剂、IL2、IL7、IL17、IL21、IL23、TNF、IMiD, RIG-I 受体激动剂、天然杀伤细胞配体、天然杀伤细胞活化剂和天然抗体。
143.权利要求117的方法，其中细胞表面上CRP的活性、量或密度在减少至少25%。
144.治疗需要针对牵涉免疫系统的病症进行治疗的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用权利要求99-116所述的任一种药物组合物。
145.权利要求144的方法，其中所述病症与天然杀伤细胞、T细胞或B细胞的失调相关。
146.权利要求144的方法，其中所述病症为癌症、自身免疫病症、传染病或移植后病症。
147.权利要求144的方法，其中所述病症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤或胚细胞癌。
148.包含有效地连接至调控序列的编码多肽的核酸的载体，其中所述编码的多肽能够减少靶细胞表面上CRP的活性、量或密度，其中所述编码的多肽包含非天然存在的氨基酸序列。
149.权利要求148的载体，其中所述编码的多肽包含天然存在的蛋白质或蛋白质结构域的至少一个突变。
150.权利要求148的载体，其中所述编码的多肽与天然存在的蛋白质或蛋白质结构域有至少90%的氨基酸序列同源性。
151.权利要求148的载体，其中所述编码的多肽不是天然存在的蛋白质或蛋白质片段。
152.权利要求148的载体，其中所述编码的多肽不是抗体、抗体片段、生长因子、细胞因子或转录调控区。
153.权利要求148的载体，其中所述编码的多肽在长度上为至少120个氨基酸。
154.权利要求148的载体，其中所述CRP为⑶46、⑶55、CD59或⑶35。
155.递送包含编码能够减少靶细胞表面上CRP活性之多肽的核酸的载体的方法，包括将靶细胞与权利要求148-154的载体接触。
156.用于筛选能够改变CRP活性的分子的方法，所述方法包括(a)产生候选分子的文库；(b)选择能够结合CRP的候选分子；和(c)确定所述分子是否改变CRP的活性。
157.权利要求156的方法，其中所述CRP为⑶46、⑶55、⑶59或⑶35。
158.权利要求156的方法，其中所述CRP为⑶46。
159.权利要求156的方法，其中所述分子以InM或更小的结合亲和力结合CRP。
160.权利要求156的方法，其中所述分子选自蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。
161.权利要求156的方法，其中所述分子为小分子。
162.权利要求156的方法，其中所述分子为多肽。
163.权利要求156的方法，其中所述分子通过CRP至细胞内的内化或隔离来改变CRP 的活性。
164.权利要求156的方法，其中所述分子通过减少细胞表面上CRP的量或密度来改变 CRP的活性。
165.包含SEQID NO :3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的经修饰纤维钮结构域多肽，其中所述多肽包含选自Asp207Gly，Thrf45Ala和Ile256Leu中的至少一个氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合⑶46的同源三聚体。
166.权利要求165的多肽，其包含Asp207Gly。
167.权利要求165的多肽，其包含Thr245Ala。
168.权利要求165的多肽，其包含Asp207Gly和Thr245Ala。
169.权利要求165的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :3所示氨基酸序列的至少40个连续氨基酸。
170.权利要求165的多肽，其中所述多肽还包含SEQID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9中的至少一个。
171.权利要求165的多肽，其中所述多肽包含与SEQID NO :3所示氨基酸序列有至少 80%同一性的⑶46结合结构域。
172.权利要求168的多肽，其包含SEQID NO :5。
173.权利要求165的多肽，其中3个多肽形成同源三聚体，所述同源三聚体与通过3个由SEQ ID NO :3组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言以至少约1.5倍的亲和力结合 CD46。
174.权利要求165的多肽，其中将从所述多肽形成的同源三聚体与包含CD46的细胞表面接触导致细胞表面上CD46水平的量减少。
175.包含编码经修饰纤维钮结构域多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的至少40个连续氨基酸，其中所述多肽包含选自 Asp207Gly、Thrf45Ala和Ile256Leu中的至少一个氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合CD46的同源三聚体。
176.权利要求175的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码SEQID NO :5所示的氨基酸序列。
177.权利要求176的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQID NO :4。
178.包含有效地连接至表达控制序列的权利要求175所述核酸的表达载体。
179.用权利要求178的载体转染的培养细胞或其后代，其中所述细胞能够表达所述多肽。
180.降低⑶46的细胞表面水平的组合物，其包含(a) 一定量的有效地降低CD46的细胞表面水平的试剂，所述试剂包含多种经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成与从多个由SEQ ID NO :3组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言对于⑶46结合的亲和力增强的同源三聚体；和(b)药学上可接受的载体。
181.权利要求180的组合物，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸，其中所述多肽包含选自Asp207Gly、 Thrf45Ala和Ile256Leu中的至少一个氨基酸置换或其组合。
182.权利要求180的组合物，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含 Asp207Gly 和 Thr245Ala。
183.权利要求182的组合物，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含SEQID NO :5。
184.权利要求181的组合物，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含与其连接的至少一个聚乙二醇聚合物。
185.权利要求181的组合物，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含减少所述多肽在哺乳动物受试者中的免疫原性的氨基酸插入、缺失或置换中的至少一个或其组I=I O
186.权利要求181的组合物，其还包含至少一种诱导补体依赖性细胞溶解的试剂。
187.用于减少靶细胞表面上⑶46的量的方法，所述方法包括将在其表面上表达CD46的靶细胞与一定量的包含多个经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的试剂接触，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成与从多个由SEQ ID NO 3组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言对于CD46结合的亲和力增强的同源三聚体。
188.权利要求187的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含SEQID NO :3所示的氨基酸序列的至少12个连续氨基酸，其中所述多肽包含选自Asp207Gly、 Thrf45Ala和Ile256Leu中的至少一个氨基酸置换或其组合。
189.权利要求188的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含 Asp207Gly 和 Thr245Ala。
190.权利要求188的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽与SEQID NO 3具有至少80%的同一性。
191.权利要求189的方法，其中所述经修饰的多肽包含SEQID NO :5。
192.权利要求187的方法，其中所述试剂使接触的表达CD46的细胞对由抗体诱导的细胞溶解敏感，所述抗体结合在所述接触的细胞上表达的非CD46细胞表面标志并且诱导补体依赖性细胞溶解。
193.权利要求187的方法，其中所述试剂降低所述接触的表达CD46的细胞对特异性结合CD46的病原体引起的感染的易感性。
194.权利要求193的方法，其中所述特异性结合CD46的病原体选自腺病毒、疱疹病毒、 麻疹病毒、瘟病毒、酿脓链球菌和奈瑟球菌。
195.用于在其表面上表达⑶46的靶细胞中诱导细胞溶解的方法，其包括(a)将在其表面上表达⑶46的靶细胞与一定量的包含多种有效地减少靶细胞表面上存在的CD46的量的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的试剂接触；和(b)将按照步骤(a)处理的靶细胞与结合靶细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段接触。
196.权利要求195的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成同源三聚体，所述三聚体与从多个由SEQ ID NO :3组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言对于CD46结合的亲和力有所增强。
197.权利要求195的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含SEQID NO 3所示的氨基酸序列的至少12个连续氨基酸，其中所述多肽包含选自Asp207Gly、 Thrf45Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合。
198.权利要求197的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含 Asp207Gly 和 Thr245Ala。
199.权利要求197的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽与SEQID NO 3具有至少80%的同一性。
200.权利要求195的方法，其中所述经修饰的多肽包含SEQID NO :5。
201.权利要求195的方法，其中所述靶细胞为B细胞。
202.权利要求195的方法，其中所述靶细胞为肿瘤细胞。
203.权利要求202的方法，其中所述肿瘤细胞选自癌、肉瘤、母细胞瘤、胚细胞癌和血液肿瘤细胞。
204.权利要求203的方法，其中所述抗体或其片段结合肿瘤细胞上的细胞表面抗原， 其选自CD20、CD52、CD33、CD22、CD23、CD3、CD80、CD30、CD33、CD25、白细胞介素 2 受体 (IL2R)、人乳脂肪球蛋白1 (HMFGl)、粘蛋白1、表皮生长因子受体2 (Her2/neu)和HLA-DR。
205.权利要求195的方法，其中在步骤(a)约48小时内实施步骤(b)。
206.权利要求195的方法，其还包括对按照步骤(b)处理的靶细胞提供补体源。
207.增强抗癌单克隆抗体在有此需要的哺乳动物受试者中的抗肿瘤效应的方法，所述方法包括(a)给哺乳动物受试者施用一定量的药剂至少一次，所述药剂包含多种有效地减少靶肿瘤细胞表面上存在的CD46的量的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽；和(b)给所述受试者施用治疗有效量的抗癌抗体至少一次，其中所述抗癌抗体结合在靶肿瘤细胞上表达的非CD46细胞表面抗原。
208.权利要求207的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成同源三聚体，所述同源三聚体与从多个由SEQ ID NO :3组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言具有增强的对于CD46结合的亲和力。
209.权利要求207的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含SEQID NO 3所示的氨基酸序列的至少12个连续氨基酸，其中所述多肽包含选自Asp207Gly、 Thrf45Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合。
210.权利要求207的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含 Asp207Gly 和 Thr245Ala。
211.权利要求207的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽与SEQID NO 3具有至少80%的同一性。
212.权利要求207的方法，其中所述经修饰的多肽包含SEQID NO :5。
213.权利要求207的方法，其中所述肿瘤细胞选自获自癌的细胞、获自肉瘤的细胞、获自母细胞瘤的细胞、获自胚细胞癌的细胞和获自血液肿瘤的细胞。
214.权利要求207的方法，其中所述抗体或其片段结合肿瘤细胞上的细胞表面抗原， 其选自 CD20、CD52、CD33、CD22、CD23、CD3、CD80、CD30、CD33、CD25、白细胞介素 2 受体 (IL2R)、人乳脂肪球蛋白1 (HMFGl)、粘蛋白1、表皮生长因子受体2 (Her2/neu)和HLA-DR。
215.权利要求207的方法，其中在步骤(a)约48小时内实施步骤(b)。
216.权利要求214的方法，其中所述抗体或其片段结合CD20。
217.权利要求216的方法，其中所述抗体为利妥昔单抗。
218.—种试剂盒，其包含(a)包含SEQID NO :3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的经修饰纤维钮结构域多肽，其中所述多肽包含选自Asp207Gly、Thrf45Ala和Ile256Leu中的至少一个氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合⑶46的同源三聚体；和(b)结合哺乳动物细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段。
219.增强抗体治疗剂在治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病中的效应的方法，所述方法包括(a)给所述哺乳动物受试者施用一定量的药剂至少一次，所述药剂包含多种有效地减少靶细胞表面上CD46的量的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽；和(b)给所述受试者施用治疗有效量的抗体治疗剂至少一次，其中所述抗体治疗剂结合在靶细胞上表达的非CD46细胞表面抗原。
220.权利要求219的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成同源三聚体，所述同源三聚体与从多个由SEQ ID NO :3组成的多肽形成的同源三聚体相比而言具有增强的对于CD46结合的亲和力。
221.权利要求219的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含SEQID NO 3所示的氨基酸序列的至少12个连续氨基酸，其中所述多肽包含选自Asp207Gly、 Thrf45Ala和Ile256Leu中的至少一个氨基酸置换或其组合。
222.权利要求219的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽包含 Asp207Gly 和 Thr245Ala。
223.权利要求219的方法，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽与SEQID NO 3具有至少80%的同一性。
224.权利要求219的方法，其中所述经修饰的多肽包含SEQID NO :5。
225.权利要求219的方法，其中所述靶细胞为T细胞。
226.权利要求219的方法，其中所述靶细胞为B细胞。
227.权利要求219的方法，其中所述抗体治疗剂结合选自⑶20、⑶25和⑶4的细胞表面抗原。
228.权利要求219的方法，其中所述自身免疫性疾病选自类风湿关节炎、糖尿病、甲状腺的病症、多发性硬化、移植器官的抗体介导的排斥、特发性膜性肾病、银屑病、免疫异常性神经病(即，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，多肌炎，皮肌炎，多病灶运动神经病或单克隆丙种球蛋白病)，重症肌无力，无菌硬脑脊膜炎、炎性肠病和自体免疫溶血性疾病 (AIHA)。
全文摘要
本发明涉及能够减少靶细胞上补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度的试剂。本发明还提供了此类试剂的鉴定方法、制备方法和用途。
文档编号C07K14/725GK102448982SQ201080022959
公开日2012年5月9日 申请日期2010年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者A·利伯, D·卡特, R·J·贝伦森, 汪宏杰 申请人:华盛顿大学, 赞誉公司